close

Enter

Log in using OpenID

Abington Presbyterian Life 032915

embedDownload
POSTĘPY
BIOCHEMII
TOWARZYSTWO
BIOCHEMICZNE
WARSZAWA 2007
TOM 53
NUM ER 1
Fullereny w biologii
Regulacja biosyntezyTPazymitochndrówG etylenu w roślinach
cngM
ałebikszoutrm
PL ISSN 0032-5422
Indeksowane w Medlirre /PubMed
www.postepybiochemii.pl
http://rcin.org.pl
NucliSENS
Przełom w ekstrakcji kwasów nukleinowych
w t» *A E K S 7
u
e
l i S
E
N
S
m in iM A C
Ekstrakcja NucliSENS
• technologia Boom'aR - ekstrakcja na magnetycznych cząstkach silikonowych
• jednoczesna ekstrakcja DNA i RNA
• jeden standardowy protokół izolacji dla wszystkich rodzajów próbek
• wysoka wydajność ekstrakcji
• ten sam zestaw odczynników dla każdego protokołu
• systemy posiadają certyfikat CE-IVD
B
I O
M
E
R
I E
U
X
bioMerieux Polska, ul. Żeromskiego 17, 01-882 Warszawa
569 85 54, www.biomerieux.pl
http://rcin.org.pl
tel. (22) 569 85 00, fax (22)
S
P
I
S
T
R
E
Ś
C
I
Postępy Biochem ii — vol. 53, nr 1, 2007
W Y D A R Z E N I A /O P I N IE /K O M E N T AR ZE
W ia d o m o ś c i k r a jo w e
pod red. Teresy Wesołowskiej
1
ARTYKUŁY PRZEGLĄDOW E
R o la i z n a c z e n i e s u r w iw in y w p r z e b ie g u m it o z y
Kamila Wolanin, Katarzyna Piwocka
10
M a łe b ia łk a s z o k u te r m ic z n e g o - r o la w a p o p t o z ie ,
k a n c e r o g e n e z ie i c h o r o b a c h z w ią z a n y c h z a g regacją b ia łe k
Ewa Laskowska
19
C h a r a k te r y sty k a b i a ł e k z r o d z in y H trA
Dorota Żurawa-Janicka, Joanna Narkiewicz, Barbara Lipińska
27
K o la g e n a z y t y p u IV (M M P -2 i M M P -9) i ic h su b s tr a ty - b ia łk a m a c ie r z y
p o z a k o m ó r k o w e j , h o r m o n y , c y t o k in y , c h e m o k i n y i ich r e c e p to r y
Elżbieta Hrabec, Julia Naduk, Małgorzata Stręk, Zbigniew Hrabec
37
R o la la m in i m u ta c ji g e n u L M N A w f i z j o lo g ic z n y m
i p r z e d w c z e s n y m sta r z e n iu
Małgorzata Alicja Śliwińska
W N A ST Ę PN Y M NUM ERZE:
ARTYK UŁY P R Z E G L Ą D O W E
46
R o la t r a n s b ło n o w y c h G T P a z w m o r f o lo g ii i a k t y w n o ś c i m it o c h o n d r ió w
Patrycja Pawlikowska, Arkadiusz Orzechowski
53
T u ft s y n a - n o w e a n a lo g i i w ła ś c i w o ś c i
Białka RasGRP
M ateusz Szamałek,
W anda Baer-Dubowska
K inazy receptorow e roślin
A nna Jakubowska,
Maciej Ostrowski,
Stanisław K owalczyk
Białka kotw iczące w ośro d k o w y m
uk ła d zie n erw o w y m
Małgorzata Beręsewicz
Anna Wardowska, Krystyna Dzierzbicka, Andrzej Myśliwski
60
B IO C H E M IA I B IO L O G IA M O L E K U L A R N A R O Ś L IN
R e g u la c ja b i o s y n t e z y e t y le n u u r o ś lin
Kamil Frankowski, Jacek Kęsy, Jan Kopcewicz
66
N o w e s p o j r z e n ie na p r o c es d e g r a d a c ji z ia r e n sk r o b i
w c h lo r o p la s t a c h A r a b i d o p s i s th a lia n a L.
Dorota Samojedny, Sławomir Orzechowski
74
R ó ż n o r o d n o ś ć i r eg u la c ja k a n a łó w w o d n y c h w ś w ie c ie r o ś lin
Paweł Mateusz Mordaka, Grażyna Dąbrowska
84
N O W E W B IO C H E M II
F u le r e n y w b i o l o g i i
Anita Krokosz
91
Rysunek na okładce:
Front cover im age „D ew D rops" by Robbie
K. Burger, h ttp ://c u sto m p o ste rw o rk s.c o m ,
w ith perm ission.
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
I
C
O
N
T
E
N
T
S
A D V A N C E S I N B IO C H E M IS T R Y V O L . 53, N O . 1, 2 0 0 7
EventVO pinions/Comm ents
1
R E V IE W S
Role of survivin in mitosis
10
Small heat shock proteins - role in apoptosis, cancerogenesis and diseases associated w ith protein aggregation
19
Characterization of the HtrA fam ily of proteins
27
Substrates of matrix m etalloproteinases
37
The role of lam ins and mutations of LMNA gene in physiological and premature aging
46
Role of transmembrane GTPases in mitochondrial m orphology and activity
53
Tuftsin - n ew analogues and properties
61
Regulation of ethylene biosynthesis in plants
66
N e w look at starch degradation in A rabidopsis thaliana L. chloroplasts
74
The high diversity and regulation of plant water channels
84
Fullerens in biology
91
KILKA SŁÓW OD REDAKTORA
S z a n o w n i P aństw o,
R o z p o c z y n a m y n o w y rok d z ia ła ln o ści naszej redakcji i jak z a w sz e n ie m o gę, n ie ste ty , ustrzec się m y śli o zagrożen ia ch , ja k ie m ogą
sp o tk ać c za so p ism o w przy szło ści. Jedno z nich to m o ż liw o ś ć , że sp a d n ie liczba prac, które P ań stw o n a d sy ła cie d o n aszej redakcji, a
d ru gie, ż e „P ostęp y B ioch em ii" m og ą przeżyć krach fin a n s o w y , k tórego n ie u d ź w ig n ie P o lsk ie T o w a r z y stw o B io ch em ic zn e,. N a tego
rodzaju m y śli je d y n y m lek arstw em jest analiza u b ie g łe g o roku p o d w z g lę d e m s p o s o b ó w r ad zen ia so b ie z ty m i za g ro żen ia m i.
W 2006 roku w y d r u k o w a liśm y 47 a rty k u łó w p r z eg lą d o w y ch i 1 artykuł sp o n so ro w a n y , z łą cz n ie 64 n a d esła n y ch prac, co sta n o w i
75 p rocen t a rtyk u łów przyjętych do druku. A u torzy w ię k s z o ś c i z w y d r u k o w a n y c h a r ty k u łó w (79,1 procent) w s p a n ia ło m y ś ln ie z e ­
c h c ie li pok ryć c zę śc io w e k o szty druku w ła sn y c h prac. N ie z a w ie d li też nasi sp onsorzy: M in ister stw o N a u k i i S z k o ln ic tw a W y ż sz e g o
oraz P re zy d iu m P olskiej A k a d e m ii N auk; d z ię k i p o m o c y fin an sow ej w s p o m n ia n y c h in sty tu cji u k a za ł się m . in. n u m er 4 (specjalny)
z 2006 roku, p o ś w ię c o n y sz la k o m p rzek a zy w an ia s y g n a łó w w kom órce i d ia g n o sty ce m o lek u larn ej. S z c z e g ó ln e p o d z ię k o w a n ia na­
leż ą s ię ta k że firm om b io m e d y c z n y m oraz firm om oferu jącym sp rzęt b a d a w c zy i o d c z y n n ik i, ta k im jak M erck Sp. z o.o., O ly m p u s,
B D B ioscien ce, Santa Cruz B io tech n o lo g y Inc, A b o G rażyna B oreysza, b io M erieu x P olska, oraz w y d a w n ic tw u n a u k o w e m u P W N za
w s p ie r a n ie d zia ła ln o ści w y d a w n ic z e j P o lsk ieg o T o w a r z y stw a B io ch em ic zn eg o . M am n ad zieję, ż e z p o d o b n ą w s p a n ia ło m y śln o ś c ią
sp o tk a m y s ię także w 2007 roku, bo b e z takiej p o m o cy b y t n a s z e g o c za so p ism a b y łb y n ie m o ż liw y .
Jako redaktor n a czeln y sz c z e g ó ln ie c en ię so b ie P aństw a u w a g i, które pom agają m i w c o d z ie n n ej pracy n ad u d o sk o n a la n ie m cza­
so p ism a . D la te g o bardzo proszę o k ie ro w a n ie P aństw a o p in ii na adres p oczty elek tron iczn ej s.p ik u la @ n e n c k i.g o v .p l. D z ię k u ję za
u w a g ę i zapraszam jak z w y k le do lek tury n a sz e g o c za so p ism a oraz d o o d w ie d z a n ia naszej strony in tern etow ej p o d ad r e se m w w w .
p o s te p y b io c h e m ii.p l.
Sławom ir Pikuła
PARTNERZY POSTĘPOW BIOCHEMII
OLYM PUS
Your Vision, O u r Future
,'iiwERCK
I
Redaktor naczelny: Sławom ir Pikuła; e-mail: s.pikula@ nencki.gov.pl, R edaktor senior: Zofia Z ielińska; e mail: postepy@ nencki.gov.pl
Redaktor d ziału krajowego: Teresa W esołowska; e-m ail: redbioch@ sci.pam .szczecin.pl, Redaktor d ziału „Forum M łodych B ioch em ik ów ”: G rzegorz Bartosz; e-m ail: gbartosz@ biol.uni.lodz.pl
Redaktorzy: Joanna B andorow icz-Pikuła, Jolanta Barańska, Andrzej Dżugaj, Krystyna Grzelak, Lilia H ryniew iecka, D a n u ta H ulanicka, Andrzej Jerzm anow ski, A ndrzej Kasprzak, W anda Kłopocka, Liliana K onarska,
Paweł Pom orski, A leksander F. Sikorski, A nna Szakiel, A dam Szewczyk, Tom asz T wardowski, M arek Z em bala, K rzysztof Zabłocki, Alicja Żylicz
Sekretarz redakcja: H anna Laskowska; e-m ail: h.laskowska@ nencki.gov.pl, tel. (022) 5892441
Skład i łamanie: M ałgorzata Basaj; e-mail: biochem @ nencki.gov.pl
Adres redakcji: “Postępy B iochem ii”, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa; e-m ail: postepy@ nencki.gov.pl; http://w w w .postepybiochem ii.pl
Wydawca: Polskie Towarzystwo B iochem iczne; ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa, tel/fax (022) 6582099, e-m ail: ptbioch@ nencki.gov.pl, h ttp://w w w .ptbioch.edu.pl
K w artalnik “Postępy Biochem ii” jest w ydaw any z p om o cą finansow ą M inisterstw a N auki i Szkolnictwa Wyższego, “Postępy B iochem ii” są indeksow ane w M edline i Agrolibrex. N akład 850 egz.
II
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
BIURO TECHNICZNO HANDLOWE
ul. R A c łA w ic k A 7 7 / 5 2
te
0 2 601 W arszawa
I/F a x : +
+ 4 8 22 8 4 4 7 4 67
t e I:
+ + 4 8 2 2 8 4 4 65 17
E 'M a í I: Í N U b @ Í N U b . c o M . p l
M IK R O S K O P Y INOWEJ G E N E R A C J I
ECLIPSE FIRMY
NIKON
- Unikalny okład optycny CFI60 z rewelacyjnymi
obiektywami o najwyższych parametrach.
- Orginalne rozwiązania mechaniczno-elektroniczne
zapewniające najwyższy komfort pracy.
- Perfekcyjna rejestracja i analiza obrazu przez kolorowe
i czarno-białe kamery cyfrowe oraz program NIS.
Imaging Software
^Elem ents
Oferujemy:
- doradztwo techniczne i handlowe
- kompleksową obsługę uwzględniającą dostawę,
instalację i szkolenie
- serwis gwarancyjny i pogwarancyjny
Posiadamy liczne referencje
Zapraszamy do współpracy
IN LAB BTH
dysTRybiiTOR M ik R o s k o p ó w
http://rcin.org.pl
FÍRMy
II
do H o t-M P
Chemicznie zmodyfikowana polimeraza
hot-start zapewnia wydajny i szybki
start reakcji PCR.
Wysoce wydajna amplifikacja złożonych
kompleksów matrycowego DNA.
Krótki czas aktywacji: tylko 4 minuty!
Wysoka specyficzność PCR:
zredukowanie do minimum tworzenie
dimerów przez primery oraz mispriming.
Podwyższona czułość rekacji PCR.
Dogodna pokojowa temperatura
przygotowywania PCR dzięki dodaniu
do reszt aminkwasowych specyficznych
termolabilnych grup blokujących.
Produkty reakcji zawierają końce 3'-dA.
Zastosowanie:
• Hot-start PCR,
• high throughput hot-start PCR
(Taq DNA TrueStart™),
• RT-PCR,
• real-time PCR,
• multiplex PCR,
• amplifikacja DNA typu „Iow copy”,
• generacja produktów PCR do klonowania TA.
EP0611
EP0612
EP0613
1 x 100 u (5u//ul)
1 x 500 u (5u/pl)
5 x 500 u (5u//ul)
EP0601
EP0602
EP0603
1 x 100 u (5u/pd)
1 x 500 u (5 u//j I)
5 x 500 u (5u/pl)
DYSTRYBUTOR: abo Grażyna Boreysza
ul. Podleśna 6a, 8 0 - 2 5 5 Gdańsk
Biuro: ul. Małachowskiego 1, 8 0 - 2 6 2 Gdańsk
tel.: (58) 341 21 4 3 ; fax: (58) 5 2 0 33 8 0
e-m ail: a b o @ ab o .com .p l; www.abo.com .pl
TrueStart’
0 M A P <%
http://rcin.org.pl
WYDARZENIA
-
OPINIE
-
KOMENTARZE
W IA D O M O ŚC I KRAJOWE
p o d redakcją T eresy W eso ło w sk iej
kilkunastu m iędzynarodow ych cza­
sopism naukow ych. Jest m.in. redak­
torem naczelnym prestiżow ego czaso­
pism a o zasięgu m iędzynarodow ym :
„Archives of C om putational M ethods
in Engineering". W latach 2001-2005
był m inistrem nauki i informatyzacji
oraz przew odniczącym Komitetu Ba­
d a ń N aukow ych. Obecnie pełni m.in.
funkcję społecznego doradcy Prezy­
denta RP, jest członkiem Europejskiej
Rady N auki, R ady Programowej Pol­
skiego Forum Strategii Lizbońskiej
oraz prezesem organizacji European
M aterials Forum . W 2001 roku prof.
Kleiber otrzym ał N agrodę Fundacji
na rzecz N auki Polskiej (tzw. Polskie­
go Nobla) w dziedzinie n auk technicz­
nych (wg PAP - N auka w Polsce).
Fot. 1. P rofesor M ichał Kleiber, P rezes P A N
Prof. Michał Kleiber (Fot. 1) w
d n iu 14 grudnia 2006 r. został w y b ra­
ny now ym prezesem Polskiej Akade­
mii Nauk przez Zgrom adzenie O gól­
ne PAN. Zastąpił na tym stanow isku
prof. A ndrzeja Legockiego. K ontrkan­
dy d atem prof. Michała Kłeibera był
prof. Andrzej Kajetan W róblewski.
Profesor Michał Kleiber (ur. 1946 r.)
jest specjalistą w zakresie zastosow ań
now oczesnych technik ko m pu tero ­
w ych w badaniach naukow ych, tech­
nice i medycynie. Ukończył W ydział
Inżynierii Lądowej Politechniki W ar­
szawskiej oraz W ydział M atematyki,
Inform atyki i Mechaniki U niw ersy­
tetu W arszawskiego. W 1995 r. został
dyrektorem Instytutu Podstaw ow ych
Problem ów Techniki PAN, w którym
od 1986 roku kieruje Z akładem M etod
K om puterow ych. Przez wiele lat był
w ykładow cą na W ydziale M atem aty­
ki i N auk Informacyjnych Politechniki
W arszawskiej. Jest także Sekretarzem
G eneralnym Europejskiego T o w arzy stw a M etod K om puterow ych w N a­
ukach Stosowanych oraz Prezesem
Środkow oeuropejskiego T ow arzys­
tw a M etod K om puterow ych i M echa­
niki. Zasiada w radach redakcyjnych
Prof. Wojciech Kostowski 1 stycz­
nia 2007 r. został now ym przewodni­
czącym W ydziału Nauk M edycznych
PAN. Zastąpił na tym stanow isku
prof. A ndrzeja Trzebskiego. Prof. Ko­
stow ski będzie pełnił w / w funkcję w
latach 2007-2010. Dotychczas był w i­
ceprzew odniczącym W ydziału N auk
M edycznych PAN. Prof. Kostowski
specjalizuje się w psychofarmakologii. Prow adził badania m iędzy inny­
mi nad przekaźnikam i nerw ow ym i,
w p ły w em noradrenaliny na działanie
leków przeciw depresyjnych. W yka­
zał, że serotonina i dopam ina pełnią
rolę w zachow aniach agresyw nych
m rów ek. W ostatnim dziesięcioleciu
skupił się na problem atyce działania
środków uzależniających, w tym alko­
holu, m orfiny i kokainy. Serotniona,
jego zdaniem , m oże mieć w pływ na to
działanie. O pracow ał w łasną koncep­
cję pow staw ania uzależnień opartą
na założeniu, że decydującą rolę w tej
kwestii m oże odgryw ać upośledzenie
zaspokajania popędów . Prof. K ostow­
ski pracuje m iędzy innym i w Instytu­
cie Psychiatrii i N eurologii w W arsza­
wie. Jest członkiem kilku komitetów
PA N - N au k Fizjologicznych, N auk
N eurologicznych oraz Neurobiologii.
D nia 9 listopada 2006 r. w M ini­
sterstw ie N auki i Szkolnictwa W yż­
szego odbyło się plenarne posiedze­
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
nie Rady N auki z udziałem prezesów
PA N i PAU, prezesa Fundacji na rzecz
N auki Polskiej, przew odniczących
Rady Głównej Jednostek BadawczoRozwojowych, Rady Głównej Szkol­
nictw a W yższego oraz przew odniczą­
cego Komisji do spraw Nauki KRASP.
W trakcie obrad M inister N auki i
Szkolnictwa W yższego, prof. Michał
Seweryński, przedstaw ił tezy progra­
mu prac resortu w zakresie polityki
naukowej państwa. Projektow ane
zm iany system u nauki mają służyć
d w ó m celom: skuteczniejszemu prze­
łożeniu badań na innowacyjność go­
spodarki, zautonom izow aniu procesu
organizow ania, finansowania i w d ra ­
żania b adań naukow ych. Do realizacji
tych celów mają być pow ołane dw ie
autonom iczne agencje. Rozdział b u ­
dżetow ych środków finansow ych na
badania naukow e ma być w yłączony
spod kompetencji Ministerstwa. D ys­
trybucja środków m a być niezależna
od instytucji politycznych. W pierw ­
szej połowie 2006 r. rozpoczęły się
prace nad opracow aniem koncepcji
N arodow ego C entrum Badań i Roz­
woju (NCBR). Projekt ustaw y p o w o ­
łującej C entrum przeszedł już przez
fazę uzgodnień m iędzyresortow ych i
został skierow any do Komisji P raw ­
nej, a potem zostanie przekazany Ra­
dzie M inistrów. Minister Seweryński
podziękow ał przedstaw icielom śro­
dow iska naukow ego za cenne u w a ­
gi i sugestie dotyczące N arodow ego
C entrum Badań i Rozwoju. Zadaniem
NCBR będzie organizow anie b adań
naukow ych i prac rozwojowych, p o ­
dejm ow anych w ram ach program ów
o strategicznym znaczeniu dla ro zw o­
ju cywilizacyjnego i gospodarczego
kraju, zlecanych do realizacji przez
ministra nauki oraz za jego zgodą
przez inne podm ioty. Minister za­
pewnił, że C entrum będzie instytucją
autonom iczną. Jej związek z m ini­
strem nauki będzie porów nyw alny
do relacji m iędzy ministrem a szkoła­
m i w yższym i. NCBR będzie dysp o n o­
w ało w łasnym budżetem . Kierowane
będzie przez dyrektora pow oływ ane­
go przez ministra, zaś Rada C entrum ,
1
w a n y m dotychczas przez u rząd m i­
nistra, będzie św iadczenie pom ocy w
kom ercjalizow aniu w yników bad ań
naukow ych. Z daniem M inistra Seweryńskiego, pow stanie NCBR zapew ni
intensyw niejsze „w chłanianie" w y n i­
ków b a d a ń przez gospodarkę. Prace
n a d d ru g ą agencją nie są jeszcze tak
zaaw ansow ane. Będzie ona nosiła n a ­
zw ę Agencji Badań Poznaw czych lub
Podstaw ow ych, a jej działalność bę­
dzie ograniczała się do finansow ania
badań, które nie mają bezpośredniego
przełożenia na gospodarkę czy inne
składająca się z przedstawicieli śro­
d o w isk nauki, gospodarki i finansów
oraz adm inistracji rządowej, będzie
pełniła funkcję opiniodaw czą. Dyrek­
tor, w zakresie realizacji zad ań agen­
cji, będzie mógł zasięgać opinii eks­
p ertó w zarów no z kraju, jak i z zagra­
nicy. W ram ach otrzym anego budżetu
c en tru m będzie ogłaszać konkursy na
projekty badaw cze, zawierać um ow y
ze zw ycięzcam i konkursów , n adzoro­
w ać przebieg realizacji projektów, a
także odbierać ukończone już prace.
N o w y m zadaniem NCBR, nie realizo­
O
G
1L
O
S
Z
E
E
1----------------------------------------------------------------------------------------- 1'
---wr--—33------- 1
F a r m a c j a XXI w ie k u
W y z w a n i a i N a d z ie je
Katowice-Spodek
X
X
2 5 - 2 8 . IX.2 0 0 7
Szanowni Państwo,
Mam zaszczyt zaprosić Państwa do czynnego udziału w obradach XX Naukowego
Jubileuszowego Zjazdu Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego, który odbędzie
się w Katowicach, w dniach 25 - 28 września 2007 roku. Organizatorami Zjazdu są
Oddział Katowicki Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego oraz Wydział Far­
maceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląskiej Akademii Medycznej.
Zjazd będzie okazją do prezentacji prac naukowych, jak również do uczestnictwa w
wykładach, sesjach posterowych i kursach z dziedzin farmaceutycznych, medycz­
nych i pokrewnych. Patronat honorowy nad XX Zjazdem Polskiego Towarzystwa
Farmaceutycznego objął Minister Zdrowia - prof. dr hab. Zbigniew Religa.
Konferencje i zjazdy farmaceutów - pomimo wszechobecnych, medialnych środ­
ków rozpowszechniania informacji naukowej, stwarzają niezastąpioną możliwość
osobistych spotkań przedstawicieli całego środowiska. Spotkania te są okazją do
zaprezentowania aktualnego stanu badań naukowych, prowadzonych we wszyst­
kich ośrodkach akademickich Polski, stanowiąc także forum dla dyskusji z przed­
stawicielami innych dziedzin i dyscyplin naukowych. XX Naukowy Zjazd Polskie­
go Towarzystwa Farmaceutycznego będzie sposobnością nie tylko do wymiany
wiedzy o postępach nauk farmaceutycznych, ale i omawiania koncepcji realizowa­
nia szeroko pojętej opieki farmaceutycznej, czy też dyskusji o dostosowywaniu do
unijnych standardów, metod i programu kształcenia przyszłych farmaceutów.
Czerpiąc inspirację z minionych Zjazdów Polskiego Towarzystwa Farmaceutycz­
nego, zawsze udanych i wysoko ocenianych przez ich uczestników, organizatorzy
XX Naukowego Zjazdu, szczególnie zaszczyceni honorem organizowania tego
przedsięwzięcia jako Zjazdu Jubileuszowego, gorąco zapraszają do udziału w tym
Zjeździe wszystkich, którym bliskie są zadania i problematyka polskiej farmacji.
Wyrażam głęboką nadzieję, iż XX Naukowy Zjazd Polskiego Towarzystwa Farma­
ceutycznego będzie nie tylko owocnym spotkaniem naukowym, ale i sposobnoś­
cią do podniesienia kwalifikacji zawodowych, sposobnością do miłego, wspólnego
spędzenia czasu, oraz okazją do rozwoju przyjacielskiej współpracy farmaceutów
naszego kraju.
Przewodnicząca Komitetu Organizacyjnego
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Dziekan Wydziału Farmaceutycznego
Śląskiej Akademii Medycznej
Więcej informacji na temat Zjazdu można uzyskać pod adresem:
h t tp : //w w w .p t f a r m z j a z d .p l/
2
dziedziny zastosow ań aplikacyjnych.
Ta agencja będzie także dysponow ała
w łasnym budżetem , choć z p ew noś­
cią nie tak w ysokim jak NCBR. Każda
instytucja akadem icka, czy pozaakademicka, będzie m iała praw o zgła­
szać swoje propozycje badaw cze do
obu agencji, jednak NCBR w znacznej
m ierze będzie realizować projekty
badaw cze przyjęte przez Rząd. Obok
opracow ania koncepcji obu agencji,
w M inisterstw ie przygotow ano także
projekt nowelizacji ustaw y o jednost­
kach badaw czo-rozw ojow ych (JBR)
oraz zm iany ustaw y o prow ad zen iu
działalności gospodarczej, w tym o
ograniczeniu praw a do prow adzenia
tej działalności, przez osoby pełnią­
ce funkcje publiczne. Rekonstrukcja
JBR m a pozw olić na ich lepsze fu n k ­
cjonowanie w zm odyfikow anym sy­
stemie b ad ań naukow ych. M inister
w idzi potrzebę oddzielenia spośród
JBR tych jednostek, które są przede
w szystkim instytutam i badaw czym i
od tych, które p ow in n y pełnić fu n k ­
cję u słu go w ą wobec tych instytutów
bądź wobec m inistra, który je p o w o ­
łał. N arzędziem służącym do takie­
go w yodrębnienia m oże być ocena
param etryczna. Te z jednostek, które
w ocenie param etrycznej w y p a d n ą
dobrze, zostaną włączone do sekto­
ra bad ań n au kow ych i będą m ogły
ubiegać się albo w agencji albo w sek­
torze przem ysłow ym o p rzyznanie
środków na badania. O trzym ają także
fun d usz statutow y, który pozw oli im
na zachow anie gotowości badawczej.
M inister Sew eryński sądzi, że jed ­
nostki badaw czo-rozw ojow e o cha­
rakterze czysto nau ko w ym zostaną z
czasem p o d p o rząd k o w an e m inistro­
wi do sp raw nauki. Inni, poza M ini­
strem N auki, m inistrow ie będą mogli
utrzym yw ać podległe ich resortom
jednostki badaw czo-rozw ojow e, o
ile przeznaczą na to w łasne środki
budżetow e. Z b u d ż e tu nauki będa
m ogły korzystać jedynie te jednostki,
które mają charakter nau k o w y oraz
mają potencjał, który u pow ażnia je do
p ro w ad zen ia tego rodzaju badań. N o ­
welizacja ustaw y da JBR m ożliw ość
dostosow ania się do nowej struk tu ry
nauki i pozw oli na zm ianę profilu
działalności, industrializację lub p ry ­
watyzację. Choć N arodow e C entrum
Badań i Rozwoju odegra znaczącą rolę
w kontaktach nauki z gospodarką, to
M inisterstw o nie poprzestanie na tej
w w w .p ostep ybiochem ii.p l
http://rcin.org.pl
formie współpracy. W iceministro­
w ie już teraz naw iązują bezpośred­
nie kontakty z dużym i przedsiębior­
stw am i i zachęcają je do finansow ania
b ad ań naukow ych. Planuje się też
pow ołanie regionalnych konsorcjów
naukow o-badaw czych. Ten typ p art­
nerstw a m iędzy n auką a gospodarką
p ow inien przybrać form ę sformalizo­
w aną, np. spółki albo fundacji, ew en­
tualnie innego trw ałego zw iązku
p artn eró w z pola nauki i gospodarki.
M inisterstw o będzie wspierać takie
przedsięw zięcia, które dają gwarancję
w d rażan ia w yników badań. Z asadni­
czym problem em w zacieśnianiu tej
w spółpracy jest niedobór potencjal­
nych partnerów ze strony gospodarki,
g dyż zw łaszcza w sektorze p ry w a t­
nym dom inują małe lub bardzo małe
przedsiębiorstw a. Innym problem em ,
dla którego nie tylko Ministerstwo,
ale i Rząd szukają rozw iązania, jest
niska atrakcyjność pracy naukowej.
W MNiSW rozpoczęto już w drażanie
program ów , których celem jest niw e­
low anie różnic płacow ych w sektorze
nauki m iędzy Polską a zagranicą. W
planach są także inne program y Mi­
nistra w tym zakresie. Źródłem w ięk­
szych środków jest aktyw ny udział
jednostek i zespołów badaw czych w
projektach badaw czych. W dalszej
przyszłości rozw ażana jest możliwość
uw olnienia siatki płac na uczelniach,
przy ustaw ow o zagw arantow anej
płacy minimalnej. Minister po d k re­
ślił także, że w najbliższych latach
finansow anie nauki znacząco w zroś­
nie, także dzięki środkom z funduszy
unijnych. M inister w ierzy w sukces
jednostek polskich w 7 Program ie Ra­
m o w y m Unii Europejskiej. Aby ten
sukces zwiększyć zachęca d uże insty­
tuty i uczelnie do tw orzenia w łasnych
jednostek do obsługi program ów ba­
daw czych. Zadaniem tych jednostek
byłoby świadczenie pom ocy uczo­
n y m i zespołom b adaw czym w poko­
n y w an iu barier adm inistracyjnych. W
p o d sum o w aniu M inister Seweryński
dodał, że projektow ane obecnie zm ia­
ny struktury nauki m ogą zacząć obo­
w iązyw ać najwcześniej jesienią 2007
roku. Zależy to przede w szystkim od
tem pa prac w Sejmie. Modyfikacja
system u w oczywisty sposób w pły­
nie na zm ianę finansow ania nauki.
Prace n ad nowelizacją ustaw y o za­
sadach finansow ania nauki są bardzo
zaaw am sow ane. M inister podkreślił
O
G
Ł
O
S
Z
Ę
E
Szanowni Państwo,
Dzięki dotacjom Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN, Instytutu Biologii Doświad­
czalnej im. Marcelego Nenckiego oraz II Wydziału PAN Polska bierze udział w pro­
gramie ESF (European Science Foundation) Genomika Funkcjonalna. W związku
z tym młodzi naukowcy przed lub tuż po doktoracie mogą ubiegać się o krótko i
długoterminowe (6 miesięcy) stypendia. Szczegółowe informacje o projekcie oraz
sposobie ubiegania się o pieniądze można znaleźć pod adresem: www.functionalgenomics.org.uk. Pod tym adresem zamieszczane są również bieżące informacje
o konferencjach i seminariach organizowanych w ramach projektu Functional Genomics.
Prof. dr hab. Joanna Rytka
Zakład Genetyki IBB PAN
ul. Pawińskiego 5A Warszawa
teł.: (022) 59212 21
e-mail: [email protected]
jednak, że nie w yobraża sobie fu n k ­
cjonow ania nowej struktury nauki
bez organu eksperckiego, jakim jest
Rada Nauki, przy czym nie w y k lu ­
cza modyfikacji jej roli. N atom iast z
całą pew nością zm ieni się rola M ini­
sterstw a, poniew aż część jego za d a ń
zostanie przeniesiona do agencji. W
nowej roli M inisterstw o będzie zaj­
m ow ać się trzem a kwestiami: kształ­
tow aniem polityki bad ań naukow ych,
przygotow aniem regulacji praw n y ch i
n ad zo ro w an iem w ykonania prac oraz
ew en tu aln y m dokonyw aniem w nich
korekt.
Mój talent dla Polski. W d n iu 18
g ru d n ia ub. roku Prezydent RP Lech
Kaczyński, spotkał się w Pałacu Pre­
zydenckim z w ybitnym i, m łodym i
ludźm i, którzy mają na sw oim koncie
znaczące osiągnięcia w różnych dzie­
dzinach. W grupie tej byli uczniow ie
liceów - uczestnicy przedm iotow ych
św iatow ych
olim piad, m łodzież
uzdolniona artystycznie (m uzyka,
plastyka, film), sportow o, w ty m m e­
daliści paraolim piad, których zm a g a ­
nia konkursow e w Polsce i poza nią
uw ieńczyły różne laury. W spotkaniu
uczestniczyła, obok uczniów, m ło­
dzież akademicka, w tym: dr D aniel
G ackowski, ad iu n kt Katedry i Z akła­
d u Biochemii Klinicznej Collegium
M edium im. L udw iga R ydygiera w
Bydgoszczy, stypendysta Szpitala
Królewskiego w K openhadze oraz
Fundacji na Rzecz N auki Polskiej; dr
Jarogniew Jacek Łuszczki, ad iu n k t
w K atedrze i Zakładzie Patofizjologii
AM w Lublinie, stypendysta Fundacji
na Rzecz N auki Polskiej, w ielokrotny
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
laureat nagrody M inistra Z drow ia;
dr Paweł Surowiak, adiunkt K atedry
Histologii i Embriologii AM w e W roc­
ław iu, stypendysta U niw ersytetu
H um bolta, laureat licznych n a g ró d i
w yróżnień; Tomasz W dowik, stu d e n t
I ro k u na W ydziale Chemii Politechni­
ki W arszawskiej, zdobyw ca I n a g ro d y
w Konkursie Prac Młodych N a u k o w ­
ców Unii Europejskiej, Sztokholm
2006 - za opracow anie m etody sy n te­
zy zw iązku chemicznego, który m ó g ­
łby być nieznanym dotychczas lekiem
na choroby serca, z grupy tzw. betablokerów; Michał M arcinkowski,
laureat II nagrody w Konkursie Prac
M łodych N aukow ców UE, Sztokholm
2006 - zyskał uznanie jurorów sw o ­
ją pracą na tem at geometrii trójkąta;
Piotr M ikulski, laureat I n ag ro d y w
Konkursie Inform atycznym Im agine
C u p 2006 w Indiach; Eryk Kopczyń­
ski, słuchacz II roku studiów d o kto­
ranckich z informatyki na W ydziale
M atematyki, Informatyki i M echaniki
U niw ersytetu W arszaw skiego - w y ­
grał prestiżow y konkurs algorytm icz­
ny Top Coder O pen 2005 A lgorithm
Com petition; Marcin M ichalski, Pa­
w e ł Parys, Arkadiusz Pawlik, Bar­
tłomiej Romański, Bartosz Walczak
- laureaci nagród w VII K onkursie
Inform atycznym The 2005 ACM C en­
tral European Program m ing C ontest
B udapeszt 2005 i na 30-tych A k ade­
mickich M istrzostw ach Świata w P ro­
gram ow aniu Zespołow ym w San A n ­
tonio 2006; Maciej Kulesza, d o ktoran t
W ydziału Elektroniki, Telekom unika­
cji i Informatyki Politechniki G d a ń ­
skiej i Paweł Żwan, laureaci dw ó ch
pierw szych miejsc w konkursie na
3
noworodków". Klinicyści z K rako­
wa, w ra z z m iędzynarodow ą g ru p ą
uczonych, ustalili jako pierw si na
świecie, że podając osobom chorym
na genetycznie u w aru n k o w an ą „cuk­
rzycę n ow orodków " doustne leki,
p o p u larn e w leczeniu innego ty p u
cukrzycy, m ożna w yelim inow ać ko­
nieczność p odaw ania insuliny w in­
iekcjach. W edług informacji udzielo­
nych przekazanych PAP przez doc.
Macieja M ałeckiego z K atedry i Kli­
niki Chorób M etabolicznych CM UJ,
„cukrzyca now orodków " pojaw ia się
p rzed upływ em szóstego m iesiąca
życia, ale trw a całe życie. „C uk rzy­
ca no w o rodków " to choroba rzadka,
dotyka jedno dziecko na milion. C ho­
roba ta jest inną odm ianą cukrzycy
niż cukrzyca ty p u 1 lub 2. N ależy do
g ru p y cukrzyc m onogenow ych czy­
li u w aru nk o w an y ch jedną mutacją
w ko nkretnym genie. W p rz y p a d k u
„cukrzycy now orodków ", mutacja w
jedn y m z genów pow oduje p ow ażne
zaburzenia w funkcjonow aniu białek,
najlepszy projekt studencki z dziedzi­
ny cyfrow ego przetw arzania sygna­
łu, podczas zakończonego n iedaw no
121-ego M iędzynarodow ego Kongre­
su A udio Engineering Society w San
Francisco; Agata Karska, studentka
II ro ku astronom ii na U niwersytecie
M ikołaja Kopernika w Toruniu, zd o ­
byw czyni nagrody specjalnej XVII
K onkursu Prac Młodych N aukow ców
Unii Europejskiej, M oskwa 2005. P re­
z y d e n t RP, gratulując utalentow anej
i pracowitej młodzieży, pow iedział
" n a m rzeczywiście niezw ykłe zależy
na tym , żeby nasz kraj odnosił sukce­
sy w sferze, która jest zw iązana z w ie­
dzą, sztuką, także sportem. Dlaczego?
Dlatego, że to przyspiesza rozwój, to
p odn o si prestiż państw a, to podnosi
prestiż kraju".
Tuż przed 14 listopada 2006 r.,
kiedy obchodzony jest Św iatow y
D zień W ałki z Cukrzycą, w m ediach
krajow ych ukazała się informacja pt.
Polski sukces w leczeniu „cukrzycy
O
G
Ł
O
S
Z
E
Ę
II EDYCJA KONKURSU N A NAJLEPSZĄ PRACĘ
DOKTORSKĄ Z BIOCHEMII W 2006 ROKU
Polskie Towarzystwo Biochemiczne i firma Merck Sp. z o.o. ogłasza drugą edycję
konkursu na najlepszą pracę doktorską z biochemii wykonaną w polskiej instytucji
naukowej. Warunkiem uczestnictwa jest przyznanie w 2006 roku autorowi pracy
tytułu doktora przez właściwą radę naukową lub radę wydziału. Nagroda obej­
muje premię pieniężną dla autora w wysokości 4 000 zł, ufundowaną przez firmę
Merck, oraz opublikowanie w 2007 roku tez doktoratu w 4 numerze kwartalnika
„Postępy Biochemii". Nagrodę przyznaje Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa
Biochemicznego w porozumieniu w firmą Merck.
Zgłoszenia kandydatów do Nagrody mogą dokonywać pracownicy naukowi ze
stopniem doktora habilitowanego lub tytułem profesora.
Zgłoszenia w formie listu przewodniego z dołączonym jednym egzemplarzem pra­
cy doktorskiej należy przesyłać pocztą w nieprzekraczalnym terminie do 31 maja
2007 roku z dopiskiem „Doktoraty 2006", na adres:
Prof. Sławomir Pikuła
Sekretarz Polskiego Towarzystwa Biochemicznego
Instytut Biologii Doświadczalnej PAN
im. Marcelego Nenckiego
ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa
Jednocześnie prosimy przesłać list przewodni wraz pracą doktorską w formacie pdf
drogą elektroniczną na adres: [email protected]
Rozstrzygnięcie konkursu nastąpi d o 31 sie r p n ia 2 0 0 7 r ok u , a uroczyste wręczenie
Nagrody odbędzie się na dorocznym Zjeździe Polskiego Towarzystwa Biochemicz­
nego w Szczecinie, we wrześniu 2007 roku.
Patronat medialny nad konkursem sprawuje redakcja kwartalnika „Postępy Bio­
chemii". Pytania dotyczące konkursu można uzyskać kierując je pod następujący
adres poczty elektronicznej: [email protected]
4
http://rcin.org.pl
które w ystępują w kom órkach w y ­
dzielających insulinę. C ukrzyca typu
1 w yw ołana jest zniszczeniem kom ó­
rek beta trzustki, odpow iedzialnych
za produkcję insuliny, która obniża
poziom cukru w e krwi. W cukrzycy
typ u 2, która rozpoczyna się w wieku
średnim lub późnym , p o w o d e m p o d ­
w yższonego poziom u cu k ru nie jest
całkowity brak insuliny, lecz jej nie­
praw idłow e działanie w organizmie.
Bardzo często cukrzycy ty p u 2 tow a­
rzyszy otyłość i nadciśnienie. Badacze
z UJ przypuszczają, że w Polsce jest
około 100 osób z „cukrzycą n o w o ro d­
ków". Polscy naukow cy przebadali
jedną z najw iększych n a świecie grup
chorych na tę odm ianę cukrzycy. N a­
ukow cy zidentyfikow ali i opisali już
40 przypadków , co w e d łu g doc. M a­
łeckiego, prow adzącego badania, jest
jednym z najw yższych w skaźników
na świecie. W grupie tej znalazły się
zarów no dzieci, jak i dorośli. Znale­
zienie m etody łatwiejszego leczenia
tej odm iany cukrzycy jest dla pacjen­
tów bardzo istotne. Leki doustne, k tó­
re w edług b ad ań krakowskiej grupy,
m ożna podaw ać osobom chorym na
„cukrzycę no w o ro d k ó w ", należą do
grup y pochodnych sulfonylom ocznika i są stosow ane w form ie tabletek od
w ielu lat wyłącznie w leczeniu cuk­
rzycy typu 2. N aukow cy prow adzą
już z pow odzeniem leczenie „cukrzy­
cy now orodków " pochodnym i sulfonylom oczników u 15 osób. Powolne
uw alnianie zawartej w tabletce, p rzy ­
jętej raz dziennie, substancji chemicz­
nej m oże w ystarczyć dla w yrów nania
poziom u glukozy w e krwi. W takiej
sytuacji chory nie będzie m usiał brać
zastrzyków z insuliny. Zastąpienie
tabletką zastrzyków robionych kilka
razy dziennie zrew olucjonizuje życie
chorych. Osiągnięcia w badaniach na
ten temat, p ro w ad zo n ych przez g ru ­
pę naukow ców , w której skład weszli
Polacy, opisano nied aw n o w prestiżo­
w ym piśm ie m edycznym , N ew Eng­
land Journal of M edicine. Najnowszy,
już wyłącznie polski artykuł na tem at
tych b adań m a się ukazać na p rze­
łomie grudnia i stycznia w znanym
m iędzynarodow ym piśm ie pośw ięco­
nym cukrzycy - Diabetes Care. G rupa
badaw cza doc. Małeckiego z Katedry
i Kliniki Chorób M etabolicznych CM
UJ, kierowanej przez prof. Jacka Sie­
radzkiego, rozpoczęła badania nad
now ym i m etodam i leczenia „cukrzyw w w .postepybiochem ii.pl
cy now orodków " przed d w om a laty.
Właśnie w ted y prof. A ndrew H attersley z U niw ersytetu Exeter (Wielka
Brytania) odkrył, że za rozwój cuk­
rzycy u niektórych dzieci poniżej szó­
stego miesiąca życia odpow iedzialna
jest mutacja w genie Kir6.2. K rakow ­
scy naukow cy dołączyli w ów czas do
zespołu badaw czego, kierow anego
przez H attersleya. Badania p ro w a d z i­
li w spólnie m iędzy innym i z Brytyj­
czykami, Francuzam i i Słowakami (na
podstaw ie informacji PAP - N auk a w
Polsce, 26 listopada 2006 r.).
Stwardnienie boczne zanikow e
(SLA, ang. sclerosis lateralis amyotrophica) jest najczęstszym schorzeniem paralitycznym ro zp oznaw an y m u osób
dorosłych. SLA jest rzadkim schorze­
niem. Co roku chorobę diagnozuje się
u 4-5 osób na 100 tysięcy łudzi, zw ykle
w 5-6 dekadzie życia. W Polsce ro zp o ­
znaje się ją u 2-3 tys. osób rocznie. Sta­
tystycznie jest przyczyną co osiem set­
nego zgonu. Już w 1869 roku francu­
ski lekarz, Jean M artin Charcot, opisał
charakterystyczną dla SLA postępują­
cą dysfunkcję neuronów ruchow ych,
unerw iających mięśnie, dzięki którym
poruszam y się. Stw ardnienie bocz­
ne zanikow e prow adzi do paraliżu,
zarów no mięśni kończyn, jak i tych
odpow iedzialnych za najbardziej
podstaw ow e funkcje życiowe - je­
dzenie (mięśnie gardła) i oddychanie
(przepona, m ięśnie m iędzyżebrow e).
D ostępne (bardzo drogie) leki jedynie
łagodzą objawy choroby i nieznacz­
nie w ydłużają okres przeżycia cho­
rych. Osoby, które zachorują na SLA
w przyszłości mają jednak szanse na
wyleczenie, ale pod w arunkiem , że do
tego czasu u d a się chorobę zrozum ieć
i opracować skuteczną terapię. Prof.
Hubert Kwieciński, kierow nik K lini­
ki N eurologii AM w Warszawie jest
koordynatorem polsko-niem ieckich
badań "G enetyka m olekularna i tera­
pia eksperym entalna chorób neurodegeneracyjnych: stw ardnienia bocz­
nego zanikow ego (SLA), zaniku wieloukładow ego (MSA) i postępującego
porażenia nadjądrow ego (PSP)". N a
podstaw ie w yników badań epidem io­
logicznych (obserwacji rodzin) przyj­
muje się, że około 10% p rzy p adk ó w
choroby m oże mieć charakter dzie­
dziczny. Poza nielicznymi w yjątkam i
nie w iadom o jednak, jakie mutacje ge­
netyczne są przyczyną choroby. U kil­
ku procent chorych w ykryto mutację
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
w genie dysm utazy p o nad tlenkowej,
„zmiatającej" nadm iar reaktyw nych
form tlenu. Zespół badaw czy poszu­
kuje innych m arkerów genetycznych
zw iązanych z SLA i ma nadzieję, że
znajdując kolejne m utacje n au k o w ­
cy zrozum ieją ogólny m echanizm
pow staw ania choroby, choć pew nie
nie w yjaśnią przyczyn wszystkich
p rzy p ad k ó w SLA. W śród „spraw ­
ców" choroby m ogą być geny odpo­
w iedzialne za detoksykację kom órek
(np. dysm utaza ponadtlenkow a), za
u suw anie zbędnych białek z kom ór­
ki i ich odkładanie się w tkankach w
postaci toksycznych złogów oraz za
tran spo rt w ew nątrzkom órkow y w
kom órkach nerw ow ych. R ozw ażany
jest także udział czynników zapal­
nych, infekcyjnych, a także innych
środow iskow ych (tytoń, pestycydy) w
etiologii choroby. Przyczyn choroby,
a zatem i m echanizm ów degeneracji
kom órek nerw ow ych, m oże być bar­
dzo dużo. We w spółpracy z zespołem
prof. Alberta L udolpha z Kliniki N eu­
rologii U niw ersytetu w U lm badano,
jaki zw iązek ze stw ardnieniem mają
aberracje genetyczne dw óch białek
- tau i d ynaktyny - zaangażow anych
w tran sp ort w ew nątrzkom órkow y.
Nie stw ierdzono pozytyw nych kore­
lacji pom iędzy częstością w y stęp o w a­
nia mutacji białka tau a zapadalnością
na SLA, ale nie oznacza to jednak, że
ich nie ma. W p rzy p ad ku dynaktyny
p otw ierdzono, iż niektóre m utacje ko­
dującego białko genu, u osób chorych
w ystępują częściej niż u zdrow ych.
N ie jest to rów noznaczne z ustale­
niem przyczyny choroby. Poszukiw a­
nie przyczyn choroby to nie jedyne
zainteresow anie polsko-niemieckiego
konsorcjum badaw czego. N au k o w ­
cy z Ulm pro w ad zą bad an ia nad
tzw. m ezenchym alnym i kom órkam i
m acierzystym i, różnicującym i się w
kom órki nerw ow e. Prof. Kwieciński
naw iązał w spółpracę z prof. Krystyną
Dom ańską-Janik z Instytutu M edycy­
ny D ośw iadczalnej i Klinicznej PA N w
W arszaw ie, której Zespół od lat bada
podobne kom órki macierzyste, ale po­
zyskiw ane z ludzkiej krw i pęp o w in o­
wej. W spółpraca m a doprow adzić do
po ró w n an ia potencjału terapeutycz­
nego obu rodzajów kom órek w ew en­
tualnej terapii stw ardnienia bocznego
zanikow ego. Mają je dostać zw ierzę­
ta ze schorzeniem spo w o d ow an ym
laboratoryjnie, p odobnym do SLA.
http://rcin.org.pl
Sam o podanie zaw iesiny kom órek
nie jest łatwe technicznie. W SLA d e ­
generują się neurony we w szystkich
odcinkach rdzenia kręgow ego oraz w
niektórych strukturach m ózgu. Chcąc
zastąpić je kom órkam i m acierzysty­
mi, podać je należy praw ie w szędzie,
a nie tylko w chore miejsce, jak to
czynili naukow cy w Korei i Chinach,
w ykorzystując zawiesinę kom órek
m acierzystych do regeneracji u szk o ­
dzonych struktur centralnego u k ład u
nerw ow ego. N aukow cy z W arszaw y
zdecydow ali się zawiesinę kom órek
p odać do tzw. zbiornika wielkiego
m ózgu, skąd w raz z płynem m ó zg o­
w o-rdzeniow ym m igrow ałyby po ca­
łym centralnym układzie nerw ow ym .
W ynik doświadczenia, zdaniem prof.
Kwiecińskiego, jest bardzo dobry, bo
po 24 godzinach kom órki były p ra k ­
tycznie wszędzie, i w ydaje się, że ten
sposób w prow adzenia do ustroju
kom órek macierzystych jest najw łaś­
ciw szy dla chorych z SLA. Pozostaje
nad al otw artym pytanie, czy kom órki
w p ro w ad zo n e do ustroju przekształ­
cą się w neurony i zastąpią te zdegenerow ane. W ydaje się raczej, że p o ­
daw an ie zaw iesiny kom órek m acie­
rzystych chorym z SLA będzie z a p o ­
biegać postępow i choroby. Bez b ad ań
i w ielu lat pracy nie osiągnie się b ar­
dziej precyzyjnego i optym istycznego
w nioskow ania. W edług określenia
prof. Kwiecińskiego SLA jest ty p o w ą
„chorobę sierocą". Jest na tyle rzad ka
i tak szybko prow adzi do tragicznego
końca, że nie m a szans, by pow stało
silne lobby dbające o postęp w b a d a ­
niach nad tym schorzeniem. Pew ien
postęp oczywiście jest, ale stanow czo
zbyt pow olny (wg PAP - N au k a w
Polsce).
Pięć młodych kobiet-naukowców,
które prow adzą badania dotyczące
raka płuc i krwi, u d aru m ózgu, cho­
roby A lzheimera i w irusow ego za­
palenie w ątroby ty p u C otrzym ało
stypendia naukowe L'Oreal Polska
dla Kobiet i Nauki (Fot. 2). U roczy­
stość rozstrzygnięcia K onkursu o d b y ­
ła się 4 grudnia 2006 r. w W arszaw ie.
K onkurs, organizow any przez firmę
L'O real przy w sparciu Polskiego
Kom itetu ds. UNESCO, m a na celu
promocję m łodych utalentow anych
Polek i w spieranie ich w pracy n a ­
ukowej. Jak pow iedział podczas cere­
m onii prof. Jerzy Kłoczkowski, p rz e ­
w odniczący Polskiego Kom itetu ds.
5
UNESCO, „w szystkie laureatki pro­
w a d z ą w wyspecjalizow anych insty­
tutach i zespołach badaw czych prace
n a d tem atam i w ażnym i, o wielkiej
użyteczności społecznej, w zakresie
ludzkiego zdrow ia i postępu w spół­
czesnej m edycyny". Stypendia habi­
litacyjne otrzym ały dw ie badaczki. W
d ziedzinie neurologii i genetyki wy-
chłoniaka grudkow ego lim focytów
B". W dziedzinie biologii m olekular­
nej w yróżniono mgr Katarzynę Sipę,
doktorantkę z Z akładu Chemii Bioor-
Fot. 4. Dr A n n a M. B og u sz ew sk a -C h a c h u lsk a
Fot. 2. S ty p e n d ia n a u k o w e L’O real P olska dla Ko­
b iet i N a u k i. O d lewej: dr A gn ieszk a S ło w ik , prof.
E w a Ł o jk o w sk a (p rze w o d n icz ą ca jury), dr A n n a M.
B o g u sz ew sk a -C h a c h u lsk a , m gr Joanna Skom m er,
m g r K atarzyn a Sipa
różniono dr Agnieszkę Słow ik (Fot.
3) z Kliniki N eurologii Collegium Med icum U niw ersytetu Jagiellońskiego
w Krakowie, a w dziedzinie bioche­
mii dr Annę Marię Boguszewską-
ganicznej, C entrum Badań M oleku­
larnych i M akrom olekularnych PA N
w Lodzi. Prow adzi ona badania do ­
tyczące modulacji zdolności krótkich
interferujących RNA do wyciszania
ekspresji genów. W dziedzinie im m u ­
nologii sty p en dium otrzym ała mgr
Kamila Wojas-Krawczyk (Fot. 5) z
Katedry i Z akładu Im m unologii Kli­
nicznej A kadem ii M edycznej im. prof.
F. Skubiszewskiego w Lublinie. Bada
ona w pływ w ybranych czynników
uw alnianych przez kom órki n ow o­
tw orow e na proces różnicowania, doj­
rzew ania i funkcję autologicznych ko­
m órek dendrytycznych. N a konkurs
w płynęło 70 prac. Oceniało je jury, w
którym pracowali wybitni przed sta­
wiciele św iata nauki. Trzy do k to ran t­
ki otrzym ają roczne stypendia w w y ­
sokości 18 tys. zł, a dw ie habilitantki
roczne stypendia w wysokości 22 tys.
Fot. 5. M gr K am ila W ojasK raw czyk
Fot. 3. D r A g n ie s z k a S ło w ik
Chachulską (Fot. 4) z Instytutu Bio­
chem ii i Biofizyki PAN w W arszawie.
Dr A gnieszka Słowik prow adzi ba­
d an ia dotyczące genetycznych czyn­
n ików ryzyka u d a ru m ózgu o różnej
etiologii. D r A nna Maria Boguszew­
ska-C hachulska została nagrodzona
za pracę z dziedziny biochemii, pt.
„H elikazy RNA jako potencjalny cel
terapii antyw irusow ej". Doktorant­
kę Joannę Skommer z University of
K uopio w Finlandii nagrodzono za
p racę z dziedziny biotechnologii pt.
„A naliza farm akologiczna i m oleku­
larna now ych induktorów apoptozy
w ludzkich liniach kom órkow ych
6
zł, w ypłacane w miesięcznych ratach.
Jak informuje M aria M ajdrowicz z
L'Oreal Polska, o stypendia ubiegać
się m ogą kobiety prow adzące b a d a ­
nia naukow e w zakresie m edycyny
i nauk biologicznych, których prace
mają charakter aplikacyjny, tzn. m ogą
być zastosow ane w praktyce. Ich prace
m uszą być już w końcow ym etapie re­
alizacji. Doktorantki przystępujące do
http://rcin.org.pl
konkursu nie m ogą mieć więcej niż 35
lat, a habilitantki nie więcej niż 45. Na
liście stypendystek L'Oreal P o lsk a /
UNESCO znajduje się 30 badaczek z
różnych ośrodków naukow ych z całej
Polski. Ź ródłem inspiracji dla kon­
k ursu była m iędzynarodow a u m o ­
wa, zaw arta w Paryżu m iędzy G rupą
L'Oreal i UNESCO „For W om en In
Science". W jej ram ach każdego roku
w paryskiej siedzibie UNESCO w ybit­
ne przedstaw icielki św iata nauki oraz
m łode doktorantki z pięciu ko n ty n en ­
tów otrzym ują stypendia i nag ro d y
pieniężne (wg informacji uzyskanej
od Marii M ajdrowicz). Po lekturze,
zresztą szalenie ciekawie, barw nie,
niejednokrotnie z hum orem nap isa­
nych życiorysów naukow ych, Sty­
pendystki jawią się czytelnikow i jako
nie tylko bardzo młode, co z rozu m ia­
łe, ale cieszące się aktyw nym życiem
kobiety, entuzjastki i uczestniczki
dalekich podróży, w yp raw w yso k o ­
górskich, żeglowania, także o zacięciu
społecznikowskim . Zakładają rod zi­
ny, związki partnerskie, mają, bądź
oczekują dziecka. O ptym istyczne.
Trzej Polacy, dr Andrzej D ziem ­
bow ski z Instytutu Genetyki i Biotech­
nologii U niw ersytetu W arszaw skiego
(UW), dr Krzysztof Ginalski z Z akła­
du Biofizyki UW i dr Marcin N o w o t­
ny z M iędzynarodow ego Instytutu
Biologii Molekularnej i Komórkowej
w W arszaw ie otrzymali prestiżowe
granty Europejskiej Organizacji Bio­
logii M olekularnej (EMBO). EMBO to
m iędzynarodow a instytucja n a u k o ­
wa. W śród jej członków znajduje się
43-ech laureatów nagrody N obla oraz
zdobyw cy innych w ażnych w y ró ż ­
nień. EMBO zrzesza około 1200 osób
z Europy (w tym pięciu Polaków),
oraz 70-ciu przedstaw icieli innych
części świata. W skład organizacji
w chodzą kraje europejskie: A ustria,
Belgia, Chorwacja, Czechy, Dania,
Estonia, Finlandia, Francja, N ie m ­
cy, Grecja, W ęgry, Islandia, Irlandia,
Izrael, Włochy, H olandia, N orw egia,
Polska, Portugalia, Słowenia, H iszp a­
nia, Szwecja, Turcja i Wielka Brytania.
Celem grantów jest umocnienie p o ­
ziom u b ad ań naukow ych w C h o rw a­
cji, Czechach, Estonii, Portugalii, T u r­
cji i w Polsce. G łów nym założeniem
tw órców p rog ram u p rzyznaw ania
grantów jest przeniesienie w ybitnych
talentów naukow ych z pań stw b a r­
dziej rozw iniętych do tych, w których
w w w .postepybiochem ii.pl
nauka stoi na nieco niższym poziom ie
(głównie ze w zględów finansowych).
Takie działanie przyczynić się m a do
ujednolicenia nauki w e w szystkich
europejskich krajach. G ranty b ędą w
całości finansow ane przez kraje człon­
kowskie EMBO. K ażdy w yróżniony
otrzym a 50 tys. euro rocznie przez
okres trzech do pięciu lat. Środki te
mają um ożliw ić zw ycięzcom stw o rze­
nie w łasnych zespołów badaw czych i
um ocnienie ich pozycji w naukow ej
społeczności europejskiej. G ranty
ułatwiają stw orzenie w łasnego d o ­
brze w yposażonego laboratorium i
realizację projektu badaw czego. Dr
N ow otny w ram ach grantu będzie
badał białka zaangażow ane w n a p ra ­
wę DNA. Dr Andrzej D ziem bowski,
ostatnio pracujący w N ational C en­
ter for Scientific Research (CNRS) w e
Francji, w ram ach g rantu po p row ad zi
w Instytucie Genetyki i Biotechnologii
U niw ersytetu W arszaw skiego prace
dotyczące białek biorących udział w
procesach obróbki RNA. Dr K rzysztof
Ginalski, przebyw ający dotychczas na
University of Texas w USA, w sw oim
macierzystym Z akładzie Biofizyki
U niw ersytetu W arszaw skiego zaj­
mie się proceduram i obliczeniow ym i
w ykorzystyw anym i do klasyfikacji
białek. N aukow cy, którym przy zn ano
granty, stają się członkam i p restiżo­
wej sieci Young Investigator (progra­
m u EMBO dla m łodych naukow ców ).
Um ożliwia to podjęcie w spółpracy ze
znakom itym i naukow cam i z Europy i
USA oraz udział w różnych w arszta­
tach. EMBO utw orzono w 1964 roku
w Szwajcarii. Z adaniem Organizacji
jest określenie kierunku rozw oju oraz
podniesienie poziom u europejskich
badań naukow ych w zakresie biologii
molekularnej. O d 1970 r. działa przy
niej Europejska Konferencja Biologii
M olekularnej (EMBC), która w sp ie­
ra i finansuje działalność EMBO. W
ram ach swojej działalności organi­
zacja prow adzi dw uletnie stypendia
doktoranckie, stypendia krótkoter­
m inowe, w spiera kursy praktyczne i
warsztaty, organizuje w ykłady w no­
w ych krajach członkowskich. Konfe­
rencja EMBC w ydaje też czasopism o
„EMBO Journal", prow adzi badania
nad w pływ em biologii m olekularnej
na społeczeństwo, w spom aga proces
oceny poszczególnych instytutów ba­
daw czych w krajach członkow skich i
organizuje stypendia dla naukow ców
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
z krajów Europy W schodniej (wg PAP
- N auka w Polsce).
Prof. Halina Abramczyk z Poli­
techniki Łódzkiej objęła od 1 stycznia
prestiżow e stanow isko kierownika
K atedry Marii Curie Unii Europejskiej
w Berlinie. Będzie pierw szym polskim
naukow cem kierującym tą katedrą. W
oparciu o Katedrę prof. Abramczyk
stw orzy Europejski U niw ersytet W ir­
tualny, który zajmie się laserami oraz
będzie budow ać europejską sieć naro­
dow ych laboratoriów i centrów uni­
wersyteckich. W Polsce, Prof. A bram ­
czyk kieruje L aboratorium Laserowej
Spektroskopii M olekularnej w Mię­
dzyresortow ym Instytucie Techniki
Radiacyjnej Politechniki Łódzkiej. Jest
to pierw sza Katedra Unii Europejskiej
dla polskiego uczonego w kilkunasto­
letniej historii tego program u. Kate­
d ra została stw orzona w Max Born In­
stitute for N onlinear Optics and Short
Pulse Spectroscopy (MBI) w Berlinie,
który jest w iodącym centrum lasero­
w y m w Europie. Unia Europejska po­
w ierzyła tem u Instytutow i koordyno­
w anie prac konsorcjum laserowego,
LASERLAB EUROPA, składającego
się z 17 europejskich centrów lasero­
w ych z 9 krajów. Jednym z najważniej­
szych celów K atedry Marie Curie jest
stw orzenie Europejskiego U niw ersy­
tetu W irtualnego - European Virtual
U niversity on Lasers. Katedra Marie
Curie będzie budow ać infrastrukturę
techniczną, adm inistracyjną i m eryto­
ryczną platform y internetowej Euro­
pejskiego U niw ersytetu W irtualnego
oraz będzie organizow ać sieć inte­
grującą naro d ow e centra laserowe w
Europie i uniw ersyteckie laboratoria
laserowe. K atedra zorganizuje kilka
konferencji m iędzynarodow ych na
tem at technologii laserow ych i teleko­
m unikacji św iatłow odow ej.
Nagrody „Kryształowej Bruk­
selki" 2006 dla najlepszych i najbar­
dziej aktyw nych uczestników 6-ego
P rogram u R am ow ego (2002-2006)
zostały ogłoszone i wręczone w W ar­
szawie, w listopadzie 2006 r. Laurea­
tów w yłoniła Kapituła „Kryształowej
Brukselki", pow ołana przez Ministra
N auki i Szkolnictwa Wyższego. W
kategorii Szkoły W yższe nagrodę
otrzym ał Uniwersytet Jagielloński,
a w kategorii N ag ro d a Indyw idual­
na nag ro dę otrzym ał d r Tomasz G o­
lec. UJ jest zaangażow any w 44 m ię­
http://rcin.org.pl
dzynarodow e projekty z dzied zin y
n au k biom edycznych, chem icznych
i hum anistycznych. Łączna kw ota
projektów realizow anych w ram ach
6-ego PR wyniosła praw ie dziew ięć
m ilionów euro. Dr Tomasz Golec z
Zakładu Procesów Cieplnych Insty­
tu tu Energetyki w W arszawie, w raz
ze sw oim zespołem prow adzi prace
badaw cze w zakresie procesów sp a ­
lania w urządzeniach takich jak kot­
ły i palniki pyłowe. Cztery pozostałe
nagrody trafiły: w kategorii Polska
Akadem ia N auk do Instytutu Fizyki
Jądrowej im. H. N iew odniczańskiego
z K rakowa (w ram ach 6-ego PR zre­
alizował 17 projektów), w kategorii
Jednostki Badawczo-Rozwojowe do
Instytutu M edycyny Pracy im. J. N ofera z Łodzi (zrealizował kilkadziesiąt
projektów sfinansow anych przez UE
na kw otę 14 m in euro). W kategorii
„D uże Przedsiębiorstw a" n ag ro d ę
uzyskał Com Arch S.A. (za u d ział w
projektach telekomunikacyjnych i
w spieranie mobilności osób starszych
i niepełnospraw nych), w kategorii
Małe i Średnie Przedsiębiorstw a n a ­
grodzony został Instytut Technik Tele­
kom unikacyjnych i Inform atycznych
Sp. z o.o. (za prow adzenie b a d a ń z
zakresu aplikacji mobilnych, e-biznesu i społeczeństw a informacyjnego).
W poszczególnych kategoriach n o m i­
now ane były również, m.in. Politech­
nika W arszawska, Politechnika W roc­
ławska, U niw ersytet W arszaw ski,
Instytut Chemii Bioorganicznej, In­
stytut Oceanologii, M iędzynarodow y
Instytut Biologii M olekularnej i Ko­
mórkowej, Instytut Ekologii T erenów
Uprzem ysłow ionych,
BioinfoBank
Institute, Innowacja Polska Sp. z o.o.,
a w kategorii N agroda In d y w id u aln a
- A ldona Dembińska-Kieć z UJ.
Marek Pawłowski i Jacek Rożynek, naukow cy z Instytutu Proble­
m ów Jądrow ych, reprezentowali
Polskę na I Europejskim Festiwalu
N auki WONDERS w H elsinkach.
Jury festiwalowe przyznało im p ie rw ­
sze w yróżnienie za najlepszy pok az
p opularnonaukow y. Laureaci p rezen ­
towali w łasny pokaz „Fizyczna Pia­
skownica" (Fot. 6), dem onstrując kil­
kadziesiąt zjawisk fizycznych, p rz y ­
gotow anych w sposób nie w ym agają­
cy żadnych specjalnych p rzy rząd ó w ,
a tylko tego, co każdy m a w k u ch en ­
nej szufladzie lub w kredensie. A d re­
satem pokazu są dzieci. W ubiegłym
7
roku p okaz dzisiejszych laureatów był
nom inow any w kategorii najlepsza
prezentacja festiw alow a w konkursie
„Popularyzator N auki", organizow a­
nym przez Polską Agencję Prasow ą i
ów czesne M inisterstw o N au k i i Infor­
matyzacji. W yróżnienie festiwalowej
publiczności odebrał Michał Surma,
naukow iec z U niw ersytetu W rocław ­
skiego, za pokaz izolow ania DNA
m etodą dom ow ą (H om e m a d e DNA).
Fot. 6. „F izy czn a p ia sk ow n ica"
Pokaz p rezentow any p odczas Dol­
nośląskiego Festiwalu N au k i realizo­
wali członkow ie Studenckiego Koła
N aukow ego Biotechnologów „Przy­
bysz" z W ydziału Biotechnologii U ni­
w ersytetu W rocławskiego. Europejski
Festiwal N auki o d b y w a się w ram ach
unijnego pro g ram u WONDERS, rea­
lizow anego przy w sp ó łp racy trzech
Europejskich stow arzyszeń EUSCEA
(stow arzyszenie Festiwali Nauki),
ECSITE (stow arzyszenie C entrów N a­
uki) i EUSJA (stow arzyszenie n auko­
w ych dziennikarzy). W jego pierwszej
edycji w zięło udział 21 zespołów po­
pularyzujących naukę, które repre­
zentow ały 19 europejskich krajów. II
Europejski Festiwal N au k i odbędzie
się w 2007 roku. W ezm ą w nim udział
także organizacje z Rosji i Turcji (wg
PAP - N au k a w Polsce).
W drugiej edycji konkursu „Po­
pularyzator nauki", zo rg an izo w a­
nego w spólnie w m inionym roku
przez serw is N au k a w Polsce, PAP
oraz M inisterstw o N au k i i Szkolni­
ctwa W yższego - laureatami zostali:
dr Jerzy Jarosz - fizyk, w kategorii
N aukow iec lub Instytucja N aukow a;
red. Wiktor N iedzicki - dziennikarz
TVP oraz Szkoła Festiwalu Nauki
w W arszaw ie w kategorii: D zienni­
karz, Redakcja lub Instytucja N iena­
ukow a; W yróżnienie za najbardziej
efektow ne i przystępne prezentacje
podczas tegorocznego w arszaw skie­
8
go Festiwalu Nauki otrzymał zespół
naukowców z Instytutu Biochemii
i Biofizyki PAN w Warszawie. Jury
doceniło zorganizow any przez nich,
w ram ach festiwalowej „Nocy Bada­
czy", happening n aukow y pośw ię­
cony drożdżom . Przyznano też trzy
wyróżnienia Serwisu Nauka w Pol­
sce PAP dla: prof. Ireny Celej owej
z W arszawskiej Szkoły Zdrow ia, dla
British Council oraz portalu inter­
netow ego Astronomia.pl. Prof. Celejową, która prow adzi WSZ od 19 lat,
w yróżniono „za całokształt długolet­
niej działalności popularyzatorskiej".
British Council otrzym ało w yróżnie­
nie „za szerokie w ykraczanie pod
w zględem popularyzacji nauki poza
stan d ard obowiązujący w śród po­
dobnych instytucji", zaś portal A stro­
nom ia.pl „za propagow anie trudnej
dziedziny w śród m łodzieży szkolnej
i um ożliw ienie m łodzieży dostępu do
najnowocześniejszych instrum entów
badaw czych". Szkoła Festiwalu Na­
uki to inicjatywa naukow ców - po ­
pularyzatorów i pasjonatów biologii.
Jej celem jest przybliżenie w spółczes­
nej w iedzy biologicznej uczniom, n a­
uczycielom i innym osobom zaintere­
sow anym tą dziedziną nauki. Z oferty
edukacyjnej i dydaktycznej Szkoły
Festiwalu N auki skorzystało od 2002
roku ponad 3 tys. uczniów gim na­
zjów i liceów oraz 1000 nauczycieli z
całej Polski. Inicjatorami pow ołania
Szkoły byli młodzi absolwenci biolo­
gii, których w sparło następnie kilka
instytutów naukow ych, tj. M iędzy­
narodow y Instytut Biologii M oleku­
larnej i Komórkowej U N E SC O /PA N ,
Instytut Biologii Doświadczalnej im.
M. Nenckiego PA N oraz Instytut
Biochemii i Biofizyki PAN, a także
w arszaw ski Festiwal Nauki, Szkoła
G łów na G ospodarstw a Wiejskiego i
Fundacja BioEdukacji. Decyzję jury
ogłoszono w siedzibie PAP w W ar­
szawie, w dniu 15 g ru d nia 2006 r.
A ktywność serw isu N auka w Polsce
PAP jest w kładem PAP w proces po­
pularyzow ania w iedzy w kraju. Wice­
m inister nauki i szkolnictwa w yższe­
go, Krzysztof Jan Kurzydłow ski, po­
wiedział, że konkurs „Popularyzator
nauki" pozwolił uhonorow ać osoby,
które na co dzień w ykonują jedno z
najważniejszych zad ań św iata nauki.
Dr Jerzy Jarosz (Fot. 7), fizyk z U ni­
w ersytetu Śląskiego w Katowicach,
kieruje Pracow nią D ydaktyki Fizyki.
http://rcin.org.pl
Laureat p row adzi zajęcia z m etody­
ki nauczania fizyki i przyrody oraz
technologii informacyjnej, a od po ­
nad 20 lat popularyzuje fizykę wśród
Fot. 7. Dr Jerzy Jarosz (z prawej)
uczniów, studentów i osób starszych.
Prow adzi cotygodniow y program
„Cogito" w TVP3 i w spółpracuje z
Radiem Katowice. Redaktor Wiktor
N iedzicki (Fot. 8), dziennikarz TVP i
w ykładow ca akademicki, ma za sobą
trzydziestoletnią działalność p o p u la­
ryzującą osiągnięcia polskiej nauki.
Jest autorem po nad 700 program ów
popularnonaukow ych. Stworzył m ię­
dzy innym i n ad aw an y od 1985 roku
przez TVP cykl program ów „Labora­
torium ", a ostatnio now y program pt.
„Dzień nauki", prezentujący osiąg­
nięcia nauki polskiej od poszukiw ań
życia w kosmosie, poprzez w y korzy­
stanie odpadów , po biotechnologię.
Na konkurs zgłoszono p o nad 60 k an ­
d y datur. W kategorii N aukow iec lub
Instytucja N aukow a, oprócz Jarosza,
Fot. 8. Redaktor W iktor N ied zick i
w w w .postepybiochem ii.pl
nominacje do nagrody uzyskali: dr
Stanisław Bajtlik z C entrum A strono­
micznego PA N w W arszaw ie razem z
d r hab. inż. A rkadiuszem O rłow skim
z Instytutu Fizyki PA N i SGGW, prof.
Jerzy J. Langer z UAM w Poznaniu,
d r Ryszard Kowalski z Akadem ii
Podlaskiej w Siedlcach, prof. dr hab.
Tomasz Tw ardow ski - Instytut Che­
mii Bioorganicznej PA N oraz Instytut
Problem ów Jądrow ych w Świerku.
W śród nom inow anych w kategorii
Dziennikarz, Redakcja lub Instytucja
N ienaukow a, oprócz N iedzickiego i
Szkoły Festiwalu Nauki, znaleźli się:
A nna M ioduszew ska - dziennikarka
i politolog z O lsztyna, M arian N ow y
- redaktor „D ziennika Polskiego",
Polska Fundacja U pow szechniania
N auki oraz Dział N auki „Rzeczpo­
spolitej". W kategorii Prezentacja p o d ­
czas Festiwalu Nauki, oprócz zespołu
naukow ców z Instytutu Biochemii i
Biofizyki PAN, nom inow ani byli: dr
Stanisław Bajtlik z C entrum A strono­
micznego PA N w W arszaw ie razem
z prof. Józefem Kaźm ierczakiem z
Instytutu Paleobiologii PAN, prof.
Krzysztof Dołow y ze Szkoły Głównej
G ospodarstw a Wiejskiego w W arsza­
wie oraz Takao Ishikaw a - doktorant
W ydziału Biologii U niw ersytetu (wg
PAP, N auk a w Polsce).
Medale Creativity Award p rzy ­
znaw ane są przez św iatow ą O rgani­
zację Własności intelektualnej (WIPO)
instytucjom zasłużonym dla prom o­
wania idei własności intelektualnej. W
Polsce wręczono je po raz pierwszy, a
otrzym ały je cztery uczelnie, na któ­
rych w latach 2003-2005 powstało naj­
więcej nagrodzonych przez U rząd Pa­
tentow y prac. Uroczystość odbyła się
18 grudnia 2006 r. w siedzibie U rzędu
Patentow ego RP w W arszawie. Lau­
reatam i medali Creativity A w ard są:
U niw ersytet W arszawski, Katolicki
U niw ersytet Lubelski, Uniwersytet
im. A dam a Mickiewicza w Pozna­
niu oraz A kadem ia Sztuk Pięknych
w W arszawie. Podczas uroczystości
przedstaw iciel WIPO Michał Svantner w yraził zadow olenie, że Polska,
kraj poszerzonej Unii Europejskiej,
aktyw nie zaangażow ała się w ochro­
nę własności intelektualnej. Zachęcał
też do aktywnej w spółpracy z WIPO
w dziedzinie ochrony własności inte­
lektualnej.
N ag ro d y dla najlepszych prac n a­
uk o w y ch i plak ató w z zakresu ochro­
ny w łasności przem ysłow ej przyznał
też prezes U rz ę d u Patentow ego RP.
K onkurs odbył się w trzech katego­
riach: studenckiej, uczniowskiej i ot­
wartej. W śród lau reató w znajdują się
m iędzy innym i: studenci Politechniki
W arszaw skiej, Politechniki R adom ­
skiej, A kadem ii Sztuk Pięknych w
W arszaw ie, G d ańsk u , W rocławiu,
K rakow ie i P o zn an iu oraz uczniow ie
Zespołu Szkół Plastycznych w G dyni,
G orzow ie W lkp. i Łodzi. Św iatow a
O rganizacja W łasności Intelektualnej
(WIPO) została u tw orzo n a w Sztok­
holm ie w 1967 roku, a siedzibą WIPO
jest G enew a. Jej celem jest pogłębianie
w ied zy na tem at ochrony p raw w łas­
ności intelektualnej na arenie m iędzy­
narodow ej, zap ew n ianie w spółpracy
adm inistracyjnej w zakresie egzekw o­
w ania p ra w autorskich, czuw anie nad
przestrzeg an iem u m ó w m iędzynaro­
do w y ch (na p o d staw ie PAP - N auka
w Polsce).
ZM ARŁA PROFESOR P A U L IN A W ŁO DAW ER, W LATACH SZEŚĆ D ZIESIĄ TY C H
KIEROW NIK PRAC O W N I BIOCHEM II LIPIDÓW W INSTYTUCIE BIO LO G II
D O ŚW IA D C ZA LA N EJ IM. M. NENCK IEGO PA N W W A R SZA W IE
Paulina Włodawer ukończyła studia biologiczne na Uniwersytecie Warszaw­
skim w 1939 roku. Pracę magisterską wykonywała pod kierunkiem prof. Włodzi­
mierza Niemierki, częściowo w przedwojennym Instytucie im. M. Nenckiego.
Początek wojny 1939 r. zastał Ją na wschodzie Polski, na terenach okupowanych
przez armię radziecką. Stamtąd w 1940 r. została wywieziona w głąb ZSRR, skąd
powróciła do Polski dopiero w 1946 r. Pod koniec 1948 r. rozpoczęła pracę w
Instytucie im. Marcelego Nenckiego, który wznowił swą działalność w Łodzi.
Była najbliższą współpracownicą prof. W. Niemierki, zajmując się wraz z nim, a
później samodzielnie, metabolizmem lipidów. W krótkim czasie uzyskała stopień
doktora, a następnie (w 1960 r.) - docenta. W 1966 r. została profesorem. W 1963
w Zakładzie Biochemii Instytutu Nenckiego utworzyła Pracownię Biochemii Li­
pidów, którą kierowała aż do wyjazdu z Polski w 1969 r. Pracownia ta zajmowała
się metabolizmem lipidów, głównie w aspekcie porównawczym, najpierw u owa­
Fotografia. P au lin a W ło d a w e r w r a z z p ro feso rem W ło d z im ie ­
dów, a w późniejszym okresie także u kręgowców. Prof. Włodawer wykształciła rzem N iem ierk o w d n iu Jej p rom ocji d oktorsk iej, 1951 rok.
grono współpracowników, z których w Instytucie pracuje jeszcze Jej pierwsza
doktorantka, prof. Jolanta Barańska. Współpracowała także z Pracownią Bioenergetyki, kierowaną przez prof. Lecha Wojtczaka. Wy­
darzenia 1968 roku skłoniły prof. Włodawer i Jej rodzinę do wyjazdu z Polski. Osiadła w Sztokholmie, gdzie wkrótce rozpoczęła pracę
w Karolińska Institutet w pracowni kierowanej przez prof. B. I. Samuelssona. Pracownia ta znana była już wówczas z osiągnięć w dzie­
dzinie prostaglandyn. Za badania te, w których uczestniczyła również prof. Włodawer, Samuelsson otrzymał w 1982 r. nagrodę Nobla.
Profesor W łodaw er zmarła w Sztokholmie 26 grudnia 2006 r. w wieku 92 lat.
prof. Lech Wojtczak
Instytut Biologii Dośw iadczalnej PAN
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
9
Rola i znaczenie surw iw iny w przebiegu m itozy
S T R E S Z C Z E N IE
Kamila Wolanin
Katarzyna Piwocka
Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia,
Zakład Biochemii, Instytut Biologii Doświad­
czalnej im. Marcelego Nenckiego
Pracownia Molekularnych Podstaw Starze­
nia, Zakład Biochemii, Instytut Biologii Do­
świadczalnej im. Marcelego Nenckiego, ul. Pa­
steura 3, 02-093 Warszawa; e-mail: k.wolanin@
nencki.gov.pl, tel.: (022) 589 22 50
Artykuł otrzymano 6 listopada 2006
Artykuł zaakceptowano 20 grudnia 2006
Słow a kluczowe: surwiwina, mitoza, mitotyczny punkt kontroli cyklu komórkowego,
apoptoza, cykl komórkowy
W ykaz skrótów: A P C /C (ang. Anaphase Pro­
moting Complex/Cyclosorne) - kompleks o ak­
tywności ligazy ubikwitynowej regulujący
przejście komórek z metafazy do anafazy; BIR
(ang. Baculoviral Inhibitor of apoptosis Repeat)
- dom ena białkowa charakterystyczna dla
białek z rodziny IAP; CPC (ang. Chromosomal
Passenger Complex) - kompleks wędrujący po
chromosomach w czasie mitozy; HBXIP (ang.
hepatitis B X-interacting protein) - białko od­
działujące z białkiem X wirusa Hepatitis B; IAP
(ang. Inhibitors of Apoptosis) - rodzina białek o
właściwościach antyapoptotycznych; INCENP
(ang. Inner Centromere Protein) - jedno z białek
kompleksu CPC; MCAK (ang. mitotic centrome­
re-associated kinesiń) - białko depolimeryzujące
mikrotubule w czasie procesu umocowywania
chrom osom ów do wrzeciona podziałowego;
MSAC (ang. mitotic spindle assembly checkpoint)
- punkt kontroli poprawności złożenia wrze­
ciona mitotycznego
Podziękow anie: Autorki dziękują Pani Profe­
sor Ewie Sikorze za dyskusje i cenne uwagi w
czasie pisania tej pracy
urwiwina należy do rodziny antyapoptotycznych białek IAP (ang. Inhibitors of Apoptosis).
W ysoką ekspresję tego białka w ykazano w w ielu typach n ow otw orów i jest ona zw iąza­
na ze wzrostem oporności na chemioterapię, zaostrzeniem się objaw ów i progresją choroby.
Surwiwina, oprócz udziału w h am ow aniu procesu śmierci komórek na drodze apoptozy, jest
zaangażowana w regulację przebiegu podziału komórki. Białko to jest składnikiem kom ­
pleksu CPC (ang. Chromosomal Passenger Complex), odpow iedzialnego za praw idłow y prze­
bieg segregacji chromatyd potom nych w czasie mitozy. Surw iw ina reguluje rów nież funk­
cjonowanie m echanizm u kontrolnego na etapie przejścia z metafazy do anafazy, zw anego
m itotycznym punktem kontroli cyklu kom órkow ego (ang. mitotic spindle assembly checkpoint).
W połączeniu z innym i białkami, uczestniczy w regulacji przebiegu cytokinezy.
Niniejsza praca jest z jednej strony próbą podsum owania roli surw iw iny w komórkach pra­
w idłow ych i now otworowych, ze szczególnym naciskiem na jej udział w mitozie, z drugiej
zaś w stępem do dyskusji o terapii skierowanej przeciw surw iw inie w walce z now otwora­
mi.
S
W P R O W A D Z E N IE
Surw iw ina kom órek człowieka jest niewielkim białkiem (ok. 16.5 kDa), n a­
leżącym do rodziny IAP (ang. Inhibitors of Apoptosis). O dkryta stosunkow o nie­
daw no [1], stanow i obecnie przedm iot badań wielu zespołów na całym świecie.
Z ainteresow anie tym białkiem zw iązane jest z jego niezwykłą, „podw ójną" rolą
w życiu komórki: jako inhibitora apoptozy z jednej strony, a regulatora prze­
biegu podziału kom órki z drugiej. Badania dotyczące roli surw iw iny w życiu
kom órki zyskują d odatkow e znaczenie, gdyż w ykazano, że jej nadekspresja jest
cechą w ielu ty p ó w n ow o tw o ró w [1].
Pierwsze badania dotyczące funkcji tego białka w komórce, zw iązane były
z jego rolą w regulacji procesu apoptozy, co miało ścisły zw iązek z dość szyb­
ko ustaloną przynależnością surw iw iny do rodziny antyapoptotycznych białek
IAP [1], W arto zaznaczyć, iż surw iw ina, pod w zględem strukturalnym nie jest
typow ym przedstaw icielem tej grupy. P odstaw ow ym elem entem struktury w y ­
różniającym białka należące do tej rodziny jest w ystępow anie w cząsteczce 2 lub
3 ok. 70-aminkowasowych, tzw. dom en BIR (ang. Baculoviral Inhibitor of apoptosis
Repeat), których obecność jest zw iązana z antyapototycznym i właściwościami
tych białek [2]; surw iw ina, w odróżnieniu od typow ych przedstaw icieli tej ro­
dziny u ssaków, posiada tylko jedną dom enę BIR [3] (Rye. 1). N astępną cechą,
w yróżniającą surw iw inę (i liw inę ML-IAP) spośród pozostałych białek człowieka
należących do rodziny IAP, są d uże różnice w jej ekspresji w kom órkach p ra w id ­
łowych, w poró w n aniu z n ow otw orow ym i [3]. Z unikalnych właściwości su rw i­
winy, w arto w spom nieć jeszcze o jej zdolności do tw orzenia hom odim erów , ob­
serw ow anych rów nież in vivo; jednakże żadne z dotychczas p rzeprow adzonych
b ad ań nie wyjaśniają fizjologicznej roli dim erów [4]. O statnie lata w skazały na
niezwykle istotną rolę su rw iw in y w regulacji mitozy, otwierając tym sam ym
now y rozdział w badaniach dotyczących jej funkcji. Co więcej, w świetle naj­
now szych odkryć w y ­
daje się, że regulacja
m itozy m oże
być
wręcz nadrzędną, w
stosunku do regula­
cji apoptozy, funkcją
surw iw iny.
R O L A S U R W IW I N Y
W A P O P T O Z IE
W ykazaną w krótce
po jej odkryciu, jed-
10
R y Ci na i . stru k tu ra d o m e n o w a su r w iw in y .
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
nakże dziś po d w ażan ą przez część badaczy właściwością
surw iw iny jest zdolność do h am ow ania apo p to zy na d ro ­
dze w iązania i blokow ania kaspaz efektorow ych 3 i 7 [5].
Przebieg apoptozy nie jest zasadniczym tem atem tej pracy,
pracę przeglądow ą dotyczącą m echanizm ów i regulacji
program ow anej śmierci kom órek m ożna znaleźć w jednym
z poprzednich n u m eru „Postępów biochem ii" [6], M echa­
nizm om ham ow ania aktyw ności k aspaz przez surw iw inę
pośw ięcono wiele uw agi, aczkolw iek w yniki otrzym yw ane
przez niezależne zespoły badaw cze, często wykluczają się
wzajem nie i w dalszym ciągu b u d zą gorące dyskusje. W ąt­
pliwości dotyczą samej m ożliwości w iązania kaspaz przez
surw iw inę, w naw iązaniu do jej struktury, porów nyw anej
z innym i antyapoptotycznym i białkam i z rodziny IAP.
Surw iw ina nie posiada bow iem obecnej w w ielu białkach
IAP i uw ażanej za niezbędną do zw iązania kaspaz do m e­
ny CARD (ang. caspase recruitment domaiń) [3]. Obecność
pojedynczej dom eny BIR w yklucza rów nież m echanizm , w
którym blokow ane są kaspazy w p rz y p a d k u XIAP, najlepiej
poznanego ludzkiego białka z rodziny IAP; gdzie zasad ni­
cze znaczenie w ham ow aniu aktyw nej kaspazy 3 i 7 o d g ry ­
w a region łączący dom eny BIR1 i BIR2 [7], W ykazano n ato ­
miast, że surw iw ina w kom pleksie ze sw oim kofaktorem ,
białkiem HBXIP (ang. hepatitis B X-interacting protein) wiąże
się z prokaspazą 9, ham ując w ew n ętrzny szlak apoptotyczny, zależny od m itochondriów [8]. Część badaczy sugeruje,
iż ham ow anie apoptozy z udziałem surw iw iny jest sku t­
kiem jej oddziaływ ań z proapoptotycznym białkiem S m ac/
DIABLO. Białko to, uw alniane z m itochondriów pod w p ły ­
w em sygnałów proapoptotycznych, w iąże się z typow ym i
przedstaw icielam i rodziny IAP. U niem ożliw ia w ten sposób
ich oddziaływ anie z kaspazam i, co prow ad zi do aktywacji
tych enzym ów , a w konsekwencji do apoptozy zależnej od
kaspaz. W iązanie Sm ac/D IA BLO przez surw iw inę obniża
jego poziom w cytoplazmie, a tym sam ym ogranicza dostęp
tego białka do pozostałych przedstaw icieli rodziny IAP,
które bez zakłóceń m ogą pełnić funkcje antyapoptotyczne
[9]. Spór wokół antyapoptotycznych właściwości su rw iw i­
ny i dywagacje dotyczące ich charakteru trwają nadal. W
jego tle p ro w adzon e są dośw iadczenia, które m im o tego, że
nie w skazują na dokładny m echanizm tego procesu, bez­
spornie w skazują na zdolność su rw iw in y do ham ow ania
program ow anej śmierci komórki. W ykazano, że obecność
zm utow anej form y surw iw iny, np. su rw iw iny C84A eksprym owanej w kom órkach linii HeLa, pow oduje w zrost aktyw ­
ności kaspazy 3 [10], a w ygaszenie jej ekspresji w kom ór­
kach raka płuc za pom ocą antysensow nych oligonukleotydów , ich podw yższoną śm iertelność oraz w zrost w rażliw o-
R y cin a 3. Lokalizacja k o m p lek su CPC w czasie m ito z y na p rzyk ład zie s u r w iw i­
ny. R ysu n ek p rze d r u k o w a n o z W h eatley SP, M c N eish A (2005) Survivin: a p ro­
tein w ith d ual roles in m itosis and ap op to sis. Int R ev C ytol 247: 35-88, z a z g o d ą
a u to ró w i w y d a w n ic tw a Elsevier.
ści na chem ioterapię [11]. Ponadto, dośw iadczenia z siRNA
skierow anym przeciw mRNA surw iw iny, w ykazały sp ad ek
przeżyw alności kom órek ludzkich m ięsaków [12], w zrost
wrażliwości na apoptozę indukow aną poprzez aktywację
receptora TRAIL w kom órkach czerniaka złośliwego [13] i
spontaniczną apoptozę w kom órkach linii HeLa [14]. R easu­
mując, nadekspresja surw iw iny spotykana w w ielu typach
now otw orów koreluje z podw yższoną opornością kom órek
na szereg bodźców proapoptotycznych, podczas gdy z a b u ­
rzenia ekspresji lub funkcji tego białka, skutkują w zrostem
podatności na apoptozę [15].
R O L A S U R W IW IN Y W M IT O Z IE
W ykazanie zależności pom iędzy ekspresją su rw iw in y
a fazą cyklu kom órkow ego (nie dotyczy to żadnego inne­
go białka należącego do rodziny IAP) [16] doprow adziło
do konkluzji, iż ekspresja tego białka w fazie G 2 /M m oże
być pow iązana z przebiegiem podziału komórki, co z ko­
lei mogłoby w skazyw ać na inną, niż dotychczas znana, rolę
surw iw iny. Do podobnych przypuszczeń doprow adziły
badaczy spostrzeżenia, że w ysoka ekspresja surw iw iny m a
miejsce w w ielu liniach now otw orow ych, w ykazujących
wysoce podw yższoną aktyw ność proliferacyjną; a białka
tego praktycznie nie spotyka się w kom órkach nie ulegają­
cych podziałom , tj. term inalnie zróżnicow anych i starych.
Dane te zapoczątkow ały now y etap badań zw iązanych z
rolą surw iw iny w mitozie.
SURWIWINA JAKO ELEMENT KOMPLEKSU
WĘDRUJĄCEGO PO CHROMOSOMACH
R y cin a 2. Sch em at id e o w y b u d o w y k o m p lek su CPC.
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
Badania im munofluorescencyjne jednoznacznie w y k a ­
zały, że surw iw ina jest elem entem kom pleksu CPC (ang.
Chromosomal Passenger Complex) - kom pleksu w ędrującego
po chrom osom ach [17]. Kompleks ten odgryw a zasadniczą
rolę w segregacji chrom atyd siostrzanych w czasie m itozy,
http://rcin.org.pl
11
regulacji funkcjonowania pu n k tu kontroli popraw ności zło­
żenia w rzeciona mitotycznego i cytokinezie. W jego skład
w ch o d zą ponadto białka: INCENP (ang. Inner Centromere
Protein), A urora B, posiadająca aktyw ność kinazy serynowo-treoninow ej, borealina oraz białko TD-60 [18] (Ryc. 2).
W ym ienione białka w literaturze anglojęzycznej określane
są term inem „chromosomal passengers", przez w zgląd na ich
charakterystyczną lokalizację w czasie m itozy (Ryc. 3). W
późnej fazie G2 i w profazie zlokalizowane są w postaci
w ielu rozproszonych pun k tó w na chrom osom ach; w czasie
prom etafazy i metafazy przemieszczają się do w ew n ętrz­
nego regionu centrom erow ego chrom osom ów . Podczas
gdy w anafazie chrom atydy siostrzane przemieszczają się
w kierunku przeciwległych biegunów wrzeciona podzia­
łowego, białka wchodzące w skład kom pleksu CPC zostają
w obszarze środkow ym m iędzy biegunam i w rzeciona p o­
działow ego, by ostatecznie w czasie telofazy i cytokinezy
znaleźć się w budow anych przez m ikrotubule strukturach
o zasadniczym znaczeniu dla przebiegu cytokinezy, okre­
ślanych w piśm iennictw ie anglojęzycznymi terminami:
m id b o dy i m idzone [18]. W ygaszenie ekspresji któregokol­
wiek ze składników kom pleksu CPC pow oduje zaburzenia
lokalizacji i funkcjonowania pozostałych jego elem entów,
co d odatkow o potw ierdza fakt istnienia wzajem nych o d ­
działyw ań i pow iązań pom iędzy poszczególnym i białkami
w ędrującym i po chrom osom ach w czasie m itozy [18,19].
W ykazano, że w dzielących się komórkach, pozbaw ionych
któregoś z białek budujących kom pleks CPC lub posiada­
jących zm utow ane formy tych białek, w ystępują liczne za­
b urzenia w przebiegu m itozy [18]. W ygaszenie lub obniże­
nie ekspresji surw iw iny w yw ołuje zaburzenia w segregacji
chrom osom ów , tw orzenie niepraw idłow ych jedno i wielobiegunow ych w rzecion podziałow ych (ang. odpow iednio:
monopolar i multipolar spindles), mikronukleację, n iepraw id ­
łowości w przebiegu cytokinezy oraz poliploidyzację w ko­
m órkach przewlekłej białaczki szpikowej [19], kom órkach
limfoidalnej linii HCW-2 [20] oraz HeLa [21].
Jednym z lepiej poznanych i opisanych w literaturze ele­
m entów kom pleksu CPC jest białko A urora B. Duże zain­
teresow anie tym białkiem w ynika m.in. z mnogości funk­
cji, jakie A urora B pełni w czasie podziału komórki. Jako
jedyny spośród składników kom pleksu CPC w ykazuje ak­
tyw ność enzymatyczną, przez co część badaczy podkreśla
jej szczególną rolę w funkcjonow aniu kom pleksu CPC. We
w czesnych etapach m itozy A urora B fosforyluje histon H3
na serynie 10. U w aża się, że ta modyfikacja jest niezbędna
do praw idłow ego przebiegu kondensacji chrom atyny, p o­
przedzającej podział kom órki [22].
A urora B kontroluje rów nież proces w iązania m ikrotubul do kinetochorów. W łaściwa segregacja chrom atyd sio­
strzanych w anafazie m ożliwa jest w ówczas, gdy do kine­
tochorów każdej z nich zostaną dołączone m ikrotubule p o ­
chodzące z przeciwległych biegunów w rzeciona podziało­
w ego (konfiguracja amfiteliczna), co określane jest m ianem
bioorientacji [23], Błędy w tym procesie m ogą skutkow ać
konfiguracją meroteliczną (m ikrotubule pochodzące z obu
biegunów wrzeciona zostają przyłączone do kinetochoru
jednej chrom atydy siostrzanej), synteliczną (kinetochory
obu chrom atyd zostają połączone z m ikrotubulam i biegną­
cym i od tego samego bieguna wrzeciona) czy monoteliczną
12
(tylko jeden z kinetochorów chrom atyd siostrzanych uzy­
skuje połączenie z m ikrotubulam i biegnącymi od jednego
z biegunów wrzeciona) [23]. N iesym etryczne rozejście się
chrom atyd siostrzanych do jąder potom nych w anafazie,
w yw ołane niew łaściw ą bioorientacją m ikrotubul na kinetochorach, m oże prow adzić do pow stania niestabilnych gene­
tycznie kom órek aneuploidalnych [22], Udział Aurory B w
k ontrolow aniu procesu w iązania m ikrotubul do kinetocho­
rów ma charakter pośredni i polega n a regulacji aktywności
białka MCAK (ang. mitotic centromere-associated kinesin) [24],
Białko to, w formie nieufosforylowanej ma zdolność depolim eryzow ania mikrotubul. N atom iast ufosforylowane przez
A urorę B białko MCAK traci tę aktyw ność i jest kierow a­
ne w obszar kinetochorów, gdzie ponow nie aktyw ow ane
p rzez fosfatazy, o dpow iada za depolimeryzację m ikrotubul
w n iepraw idłow y sposób przyłączonych do kinetochorów.
W kom órkach pozbaw ionych A urory B, białko MCAK nie
jest obecne w obrębie kinetochorów, a ich niewłaściwe połą­
czenia z m ikrotubulam i nie są usu w an e [24],
K om pleks CPC pełni rów nież funkcje regulacyjne na eta­
pie cytokinezy. A urora B, enzym atyczny rdzeń kompleksu,
fosforyluje m. in. w im entynę i białko MgcRacGAP. Białka
te w form ie ufosforylowanej są niezbędne do praw idłow e­
go przebiegu tego procesu. W przy pad k u braku regulacji
aktyw ności tych białek przez A urorę B, obserwuje się za­
burzenia przebiegu cytokinezy, łącznie z niedokończeniem
tego procesu, mogące prow adzić do śmierci komórki [22].
N ależy w yraźnie zaznaczyć, iż surw iw ina jest niezbędna
w procesie pow staw ania kompleksu. Badania, w tym ró w ­
nież pro w adzo n e przez nasz zespół na liniach kom órkowych
przewlekłej białaczki szpikowej wykazały, że w komórkach
pozbaw ionych surw iw iny m etodą siRNA, kompleks CPC
nie zostaje w ogóle utw orzony, a pozostałe białka w chodzą­
ce w jego skład, w tym A urora B, wykazują „rozproszoną"
lokalizację w kom órce [19] (Ryc. 4). Tego typu obserwacje
w skazują na rolę surw iw iny zarów no w form ow aniu kom ­
pleksu w ędrującego po chrom osom ach, jak i kierow aniu go
do miejsca jego działania w czasie mitozy - kinetochorów.
N ależy jednak zaznaczyć, że inaktywacja któregokolwiek
ze składników kom pleksu CPC prow adzi do zaburzeń loka­
lizacji pozostałych białek budujących ten kompleks, a tym
sam ym do problem ów z tw orzeniem kom pleksu CPC.
O prócz funkcji strukturalnych, surw iw ina pełni ró w ­
nież funkcje regulatorow e; jej obecność w kompleksie CPC
istotnie w p ły w a na aktyw ność A urory B. Stwierdzono, że
w drodze bezpośrednich o ddziaływ ań między tym i d w o ­
m a białkam i dochodzi do stymulacji aktywności kinazowej
A urory B. W badaniach in vivo w ykazano, że nadekspresja
genu kodującego surw iw inę znacząco w zm aga tę aktyw ­
ność, podczas gdy obniżeniu ekspresji genu surw iw iny,
poprzez zastosow anie antysensow nych oligonukleotydów,
tow arzyszy silne obniżenie tej aktywności [25].
O zasadniczej roli surw iw iny w regulacji praw idłow ego
podziału i życia komórki św iadczy rów nież fakt, że myszy
z u szkodzonym genem surw iw iny umierają we w czesnych
stadiach rozw oju [26]. N ależy wspom nieć, iż ostatnio suge­
ruje się istnienie więcej niż jednego typu kom pleksu w ę d ru ­
jącego po chromosomach: prócz „klasycznego" holokom -
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
[30] (Ryc. 5). Zachodząca przy udziale tego kom pleksu ubikwitylacja cykliny B i sekuryny, a w konsekwencji d e g ra d a ­
cja tych białek, prow adzi do uw olnienia i aktywacji zw iąza­
nej z sekuryną separazy. Separaza jest enzym em proteoli­
tycznym, który niszczy białkowe połączenia m iędzy chrom atydam i siostrzanymi, przez co inicjuje ich segregację do
przeciwległych biegunów w rzeciona podziałow ego [31].
N a pierw szy rzut oka w ydaw ać by się mogło, że procesy,
przebiegające z udziałem kom pleksu CPC oraz białek z a a n ­
gażow anych w funkcjonowanie m itotycznego p u n k tu k o n ­
troli cyklu kom órkowego, przebiegają niezależnie od siebie.
Do niedaw na uw ażano, że ew entualna aktywacja m echa­
nizm u kontroli MSAC jest zależna od efektów działania
kom pleksu CPC, nie zaś od udziału w tym procesie sam ych
białek wędrujących po chrom osomach. W ykazano jednak,
że praw idłow e funkcjonowanie MSAC w ym aga u d ziału 3
znanych już nam białek: surw iw iny, A urory B i IN C EN P
[32,33]. M ożna więc powiedzieć, że stanow ią one sw oisty
„łącznik" spajający oba m echanizm y regulacji przebiegu
mitozy w funkcjonalną całość, we w spólny system regulacji
organizacji i rozdziału materiału genetycznego w dzielącej
się komórce.
R y cin a 4. Z ab u rzen ia lokalizacji A urory B w k om órk ach p o z b a w io n y c h surw iw in y m eto d ą siR N A (w y n ik i w ła sn e ). M orfo logia jądra k om órk i p ra w id łow ej
barw ionej D A P I (A) oraz kom órk i, w której w y g a s z o n o ekspresję s u r w iw in y (a).
Lokalizacja A u rory B w cz a sie m ito z y w k om órce p ra w id ło w ej (B) i p ozb aw ion ej
s u r w iw in y m e to d ą s iR N A (b).
Problem sygnału generow anego przez zaktyw ow any mitotyczny p u n k t kontroli cyklu kom órkow ego jest p rzed m io ­
tem licznych sporów w śród badaczy. Część z nich u w aża,
że białka sensorow e BubRl i Mad2 działają niezależnie i
pleksu b ud o w an eg o przez INCENP, surw iw inę, A urorę B,
borealinę i TD-60, postuluje się istnienie mniejszych typu
A urora B / INCENP, przeprow adzającego w yłącznie fosforylację seryny 10 na histonie H3 [18].
UDZIAŁ SURWIWINY W REGULACJI FUNKCJONOWANIA
PUNKTU KONTROLI POPRAWNOŚCI
ZŁOŻENIA WRZECIONA MITOTYCZNEGO
P unkt kontroli popraw ności złożenia w rzeciona mitotycznego (ang. mitotic spindle assembly checkpoint; MSAC),
zw any rów nież m itotycznym p unktem kontroli cyklu ko­
m órkow ego, p u n ktem kontrolnym pow staw ania w rzeciona
czy po pro stu p un k tem kontrolnym w rzeciona jest kluczo­
w y m m echanizm em kontrolującym proces segregacji chro­
m osom ów w kom órkach eukariotycznych. A ktyw ow any w
czasie prom etafazy, opóźnia zajście anafazy do m om entu,
aż w szystkie chrom atydy potom ne, poprzez połączenia z
m ikrotubulam i, zostaną właściwie zorientow ane w zględem
biegunów w rzeciona podziałow ego w tzw. płytce metafazalnej [27], W funkcjonow anie tego m echanizm u zaangażo­
w an e są białka: Bub (Bubl-3), M ad (M adl, Mad2, BubRl),
CENP-E, kinaza MPS1 i oddziałujące z dyneiną białka ZwlO
i Rod [28]. W sytuacji, gdy nie w szystkie chrom atydy, m a­
jące ulec rozdzieleniu do kom órek potom nych, posiadają
w łaściw e połączenie z m ikrotubulam i (ang. attachment) lub
też układ tych połączeń jest niestabilny i jest źródłem nie­
praw id ło w y ch napięć (ang. tensions), w ym ienione wyżej
białka generują sygnał ham ujący rozpoczęcie anafazy i se­
gregację chro m aty d siostrzanych [29]. „Sercem" u k ład u są
białka M ad2 i BubRl wiążące i ham ujące aktyw ność białka
regulatorow ego Cdc20. Białko to pełni funkcje aktyw atora
kom pleksu A P C /C (ang. Anaphase Promoting Complex/ Cyclosome), który w ykazuje aktyw ność ligazy ubikw itylowej
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
R y cin a 5. U p r o sz czo n y sch em a t fu nk cjon ow an ia m ito ty c zn eg o p un k tu k on troli
(M SAC). A ktyw acja M SA C i u ru ch o m ien ie sy g n a łu p r o w a d z ą ceg o d o z a h a m o ­
w a n ia anafazy w sytuacji braku p ołą czen ia k in etoch oru z m ik rotu b ulam i (A); ak­
tyw acja A P C /C i przejście z m etafazy d o an afazy w k om órk ach z ch ro m o so m a m i
w konfiguracji am fitelicznej (B).
http://rcin.org.pl
13
generują sygnały płynące o d p o w ied n io od: niew łaściw ych
napięć w układzie m ik ro tu b ul i b rak u połączenia z mikrotubulam i [34]. D ruga część zaś u w aża, że dw ie „gałęzie
sygnałow e" nie istnieją, a oba białka ze sobą w spółdziałają,
wysyłając w spólny sygnał do zatrzy m an ia wejścia w anafazę [35], Badacze opow iadający się za słusznością pierwszej
tezy, w skazują na dośw iadczenia z no k o dazo lem i taksolem
- zw iązkam i zaburzającym i p ra w id ło w ą d yn am ik ę m ikro­
tubul w komórce. W ykazano, że k om pleks tw o rzo n y przez
surw iw inę, białko IN C E N P i A u rorę B jest niezbędny do
uruchom ienia odpow iedzi, wynikającej z braku o d p o w ie d ­
nich napięć m iedzy m ik rotub u lam i a kinetochorem , genero­
wanej z udziałem białka BubRl. O kazało się, że surw iw ina,
A urora B oraz białko IN CEN P uczestniczą w procesie loka­
lizacji białka BubRl na kinetochorach, jak rów nież w p ły w a ­
ją na jego stabilność i czas p o zo staw an ia na kinetochorach w
sytuacji przedłużonej aktywacji MSAC. M echanizm y tych
procesów pozostają niew yjaśnione. Z kolei, o d p o w ie d ź ko­
m órki na brak przyłączenia m ikro tu b u l do kinetochorów ,
w której pośredniczy białko sensorow e M ad2, o d b y w a się
bez u działu surw iw iny i jej p artn eró w [32,33], U dział surw iwiny, A urory B i białka IN C EN P w o d p o w ied zi kom órki
na w ystąpienie niep raw idłow y ch napięć na kinetochorach,
w ynika najpraw dopodobniej z w p ły w u su rw iw in y na mikrotubule. W badaniach in vivo w ykazano, że su rw iw in a
stabilizując układ m ikro tu b u l oraz w pływ ając na proces
nukleacji, reguluje dy nam ik ę tych stru k tu r w kom órce [36,
37],
E K S P R E S JA S U R W IW I N Y W K O M Ó R K A C H
NOW OTW OROW YCH
POZIOM EKSPRESJI SURWIWINY
Ekspresję surw iw iny w y k azan o w kom órkach em brio­
nalnych, płodow ych, silnie dzielących się oraz w w ielu ty­
pach now otw orów , w od różnieniu od kom órek term inalnie
zróżnicow anych, starych czy też k o m órek w fazie GO cyklu
kom órkow ego, w których nie stw ierd zo n o ekspresji tego
białka. N adekspresja su rw iw in y jest cechą w ielu ty p ów no ­
w otw orów , m oże też dotyczyć k o m órek z faz agresyw nych,
zw iązanych z progresją choroby i zaostrzeniem objaw ów
u pacjentów. Podw yższony poziom tego białka stw ierd zo ­
no m.in. w zm ienionych n o w o tw o ro w o kom órkach ukła­
d u krw iotw órczego oraz w n o w o tw o rach płuc, okrężnicy,
trzustki, w ątroby [1], żołądka, przełyku, macicy, prosta­
ty, piersi, jajników, n o w o tw o rach m ó zg u i innych [38]. W
p rz y p a d k u niektórych ty p ó w n o w o tw o ró w jak nerw iak
(zarodkow y w spółczulny), n o w o tw o ry złośliw e jelita g ru ­
bego, płuc i pęcherza m oczow ego, rak okrężnicy i odb y tn i­
cy czy niedrobnokom órkow y rak płuc, w y kazano korelację
p o m ięd zy w zrostem ekspresji su rw iw in y a niekorzystnym i
rokow aniam i w przebiegu choroby. Stąd też, poziom tego
białka proponuje się jako sw oisty m arker p rognostyczny w
p rzebiegu niektórych ty p ó w n o w o tw o ró w [38],
(120 am inokw asów ) [40] i surw iw iny-2a (74 aminokwasy)
[41] (Ryc. 6). W ykazano, że w szystkie spotykane formy tego
białka pow stają w d ro d ze różnicow ego cięcia i składania
(ang. splicing) pre-m RN A genu, zlokalizow anego na chro­
m osom ie 17 (17q25). P rzypuszcza się, że ekspresja poszcze­
gólnych izoform surw iw iny zależy od stanu, w jakim w d a ­
nym m om encie znajduje się kom órka, jak rów nież rodzaju
tkanki, w której się ten proces odbyw a, a tym samym, od
dostępności czynników edycyjnych (ang. splicing factors), re­
gulujących pow staw anie alternatyw nych form surw iw iny,
czy różnic w stabilności poszczególnych rodzajów mRNA
[42]. D okładne zależności m iędzy typem tkanki, w którym
ma miejsce ekspresja a izoformą, są obecnie przedm iotem
licznych badań. Obecność form y dzikiej, surw iw iny-2p i
surwiwiny-AEx3 w ykazano m.in. w ludzkich now o tw o­
rach pochodzenia nabłonkow ego oraz w liniach kom órko­
w ych HeLa, U 20S, MCF7. Jednakże w e wszystkich b a d a ­
nych przypadkach, w ogólnej puli dom inuje dzika forma
surw iw iny [39]. W ykazano, że surwiwina-AEx3 posiada
właściwości antyapoptotyczne, podczas gdy w p rz y p a d ­
ku form y 2p są one m ocno zredukow ane. Sugeruje się, iż
surw iw ina 2p m oże pełnić rolę naturalnego, endogennego
antagonisty form o właściw ościach antyapoptotycznych, tj.
dzikiej i surwiwiny-AEx3 i w sposób kompetycyjny wiązać
ich partnerów białkow ych [42], O statnio odkryta i jeszcze
dość słabo scharakteryzow ana na tle innych surw iw ina-2a,
rów nież oddziałuje z dziką form ą surw iw iny, osłabiając jej
antyapoptotyczne właściwości [41]. W ydaje się, że m am y tu
do czynienia ze zjaw iskiem znanym już wcześniej w kon­
tekście innych białek regulujących proces apoptozy: BclX, czy Bcl-Xs, czyli funkcjonalnym antagonizm em m iędzy
antyapoptotycznym i a pozbaw ionym i takich właściwości
izoform am i [42]. Stw ierdzono kolokalizację form y dzikiej
i surw iw iny 2p w cytoplazm ie, podczas gdy surw iw inaAEx3 obecna jest w jądrze kom órkow ym . W przy pad k u
izoform AEx3 i 2p nie w ykazano tak charakterystycznej dla
form y dzikiej lokalizacji na centrom erach i oddziaływ ań z
m ikrotubulam i w czasie mitozy. Jednakże nagrom adzenie
surwiwiny-AEx3 w jądrze w późnej fazie G l, S, G2, m oże
dodatkow o w skazyw ać n a jej nieznaną dotąd rolę w regula­
cji cyklu kom órkow ego [42].
FUKNCJE POSZCZEGÓLNYCH IZOFORM SURWIWINY
W kom órkach ludzkich, oprócz form y dzikiej (142 aminkw asy) stw ierdzono jak d o tą d obecność czterech innych izoform tego białka: tzw. surw iw iny-2p (165 am inokw asów ),
surwiwiny-AEx3 (137 am inokw asów ) [39], surw iw iny-3p
14
R y cin a 6. P o r ó w n a n ie stru ktu ry p o sz c z e g ó ln y c h iz o fo rm s u r w iw in y . R y su n ek
z m o d y fik o w a n y n a p o d s ta w ie [41].
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
REGULACJA EKSPRESJI SURWIWINY
Jak już w spom niano, obecność su rw iw in y uzn aw an a jest
za swoisty m arker kom órek em brionalnych, płodow ych i
wielu ty p ó w kom órek now otw orow ych. Poziom tego białka
w praw idłow ych, dzielących się kom órkach som atycznych
jest nieporów nyw alnie niższy (często na granicy detekcji),
zaś w kom órkach term inalnie zróżnicow anych i starych
nie stw ierdza się obecności surw iw iny. Próby wyjaśnienia
m echanizm ów odpow iedzialnych za tak istotne różnice w
poziom ie ekspresji tego białka m iędzy różnym i kom órkam i,
w połączeniu z regulacją na poziom ie cyklu kom órkow ego,
podejm ow ane są od lat.
Jedno z pierw szych pytań jakie postaw iono, dotyczyło
m echanizm ów odpow iadających za przyw rócenie pozio­
m u ekspresji surw iw iny typow ego dla kom órek em brio­
n a ln y c h / płodow ych w kom órkach n ow otw orow ych lub,
patrząc na zagadnienie od drugiej strony, jakie m echani­
zm y odpow iadają za zaham ow anie ekspresji surw iw iny
w praw idłow ych kom órkach som atycznych. M imo inten­
syw nych badań, w iedza na ten tem at jest wciąż niew ystar­
czająca. W ydaje się, że tak jak w p rz y p a d k u wielu innych
genów, których w zorzec ekspresji zm ienia się w kom órkach
now otw orow ych, istotną rolę m ogą tu odgryw ać zw iązane
z aktyw nością dem etylaz różnice w poziom ie i w zorze metylacji w obrębie prom otora genu surw iw iny w kom órkach
praw idłow ych i now otw orow ych [16,43],
U w aża się, że regulację transkrypcji genu surw iw iny,
która w ykazuje znaczne zróżnicow anie w różnych typach
tkanek czy stadiach now otw orów , zaangażow ane m uszą
być sygnały płynące z różnych szlaków sygnałow ych w
komórce. W ykazano, że w regulacji ekspresji surw iw iny w
ludzkich kom órkach raka okrężnicy uczestniczą białka szla­
ku sygnałow ego TCF/(3-katenina i czynnik transkrypcyjny
CBP (ang. Creb-binding protein) [44]. Farm akologiczne zah a­
m ow anie białka Stat3 lub obecność jego zm utow anej formy
w kom órkach now otw orow ych linii PEL, w których szlak
z udziałem tego białka jest ciągle aktyw ny, prow adzi do
zaham ow ania ekspresji surw iw iny na etapie transkrypcji
i indukcji apoptozy [45]. W ykazano rów nież, że ekspresja
surw iw iny może być regulow ana m.in. poprzez czynniki
w z ro stow e/cy to kiny horm ony czy inhibitory kinaz [38].
Równie ciekaw ym zagadnieniem jest regulacja ekspresji
surw iw iny w cyklu kom órkow ym . Silna ekspresja tego biał­
ka w fazie G 2 /M cyklu kom órkow ego (40-krotny w zrost
ilości m R N A w porów naniu z fazą G l) [16], a jej brak w fa­
zie G1 i S, jest w y p ad ko w ą kilku procesów zachodzących
na etapie transkrypcji, modyfikacji potranslacyjnych, jak i
proteasom alnej degradacji.
Analiza sekwencji w obrębie pro m o to ra genu surw iw iny
w ykazała obecność charakterystycznych sekwencji spoty­
kanych w obrębie prom otorów innych genów eksprym ow anych w fazie G 2 /M cyklu kom órkow ego, tj.: trzech sek­
wencji CDE (ang. cycle dependent elementś) i jednej sekwencji
CHR (ang. celi cycle homology region) [16]. Obecność sekw en­
cji CDE koreluje z nasileniem transkrypcji w fazie G 2 /M ,
a sekwencji CHR z h am ow aniem ekspresji w fazie G l cy­
klu kom órkow ego [46], W obrębie prom otora znajdują się
rów nież miejsca w iązania czynnika transkrypcyjnego S p l, a
mutacje w nich p ro w a d z ą do obniżenia ekspresji su rw iw in y
0 60-80% [47], Czynniki transkrypcyjne z rodziny S p l nale­
żą do kluczow ych m o d u lato ró w ekspresji w ielu genów za­
angażow anych w regulację cyklu kom órkow ego w dro dze
rekrutacji do p ro m o to ra RN A polim erazy II, generow ania
lokalnych zm ian stru k tu ry /o rg a n iz a c ji chrom atyny i u trz y ­
m ania regionów bogatych w reszty CpG w stanie hypom etylacji [47],
W obrębie p ro m o to ra g enu su rw iw iny w y kazano ró w ­
nież obecność miejsca w iązania białka p53, które częściowo
zachodzi na miejsce w iązania czynników transkrypcyjnych
z rodziny E2F. U d o w o d n io no , że zw iązanie dzikiej form y
białka p53 do prom otora, ham uje transkrypcję genu s u rw i­
winy, a efekt ten tłum aczy się w spółistnieniem kilku zja­
wisk. Pierw sze z nich to fakt, że zw iązanie p53 do p ro m o ­
tora u pośledza przyłączanie białek z rodziny E2F, znanych
transaktyw atorów genu surw iw iny. Drugie m a nieco b a r­
dziej złożony charakter i dotyczy przyłączania do zw iązan e­
go już z p ro m o to rem białka p53, represorow ego białka Sin3
1 dalszej rekrutacji do tw orzącego się kom pleksu deacetylaz
histonów (HDACs) [48]. Deacetylacja reszt lizynow ych na
N -końcow ych ogonach histonów rdzeniow ych, zachodząca
przy udziale w sp o m n ian y ch deacetylaz, zm ienia stru k tu rę
chrom atyny w obrębie p ro m o to ra genu, przez co, staje się
ona mniej d o stęp n a dla innych białek niezbędnych do zaj­
ścia procesu transkrypcji [49].
Regulację po zio m u ekspresji surw iw in y na poziom ie biał­
ka należy ro zp atry w ać rów nież w kategoriach jej stabilności
i procesów degradacji. W ykazano, że surw iw ina w iąże się z
białkiem o pieku ń czy m Hsp90, co w p ły w a na jej stabilność
w komórce. Z niszczenie o d d z ia ły w a ń między tym i białka­
mi pow oduje p roteasom alną degradację surw iw iny oraz za ­
burzenia w przebiegu m itozy lub apoptozę [50]. Rola tego
typu o d d ziaływ ań z ud ziałem białek opiekuńczych nabiera
dodatkow ego znaczenia w kontekście nadekspresji białek z
rodziny H sp w w ielu typach n o w o tw oró w [51].
D egradacja z u d ziałem p ro teaso m u jest niezw ykle istot­
nym m echanizm em regulującym p oziom białek w komórce;
znaczenie tego procesu jest szczególnie istotne w odniesie­
niu do białek zaan g ażo w an y ch w przebieg cyklu ko m ó rk o ­
wego. W d ro d z e ubikw itylacji regulow ane są m.in. cykliny
A, B, D, E, inhibitory cyklinozależnych kinaz, tj białka p21,
p27 i p57 [52] oraz szereg czynników transkrypcyjnych. W y­
kazano, że rów nież su rw iw in a jest u bikw itylow ana w ob rę­
bie kilku reszt lizynow ych i ulega proteasom alnej d e g ra d a ­
cji w w aru n k ach in vivo. A ktyw ność proteasom u w tym kie­
ru n k u zm ienia się w czasie cyklu kom órkow ego, osiągając
m aksim um w fazie G l, w czasie której poziom su rw iw iny
w kom órce drastycznie sp a d a [52], Ta sama g ru p a b a d a w ­
cza, analizując z m u to w a n e w obrębie dom eny BIR lub Ckońcowej sekwencji form y su rw iw in y ustaliła, że zaró w n o
zlokalizow ana na N -końcu d o m en a BIR, jak i fragm ent Ckońcow y istotnie w pływ ają na stabilność surw iw iny w fazie
G 2 /M cyklu k o m órkow ego [52].
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
15
UW AGI KOŃCOW E
Surw iw ina jest białkiem łączącym w sobie niesłychanie
istotne funkcje ham ow ania apoptozy i regulacji przebie­
gu podziału komórki. Podw yższona oporność na śmierć i
„u spraw nienie" podziałów kom órkow ych prom ują prze­
życie i ekspansję komórek, w których w ykazano p o d w y ż ­
szoną ekspresję surw iw iny, w tym kom órek w ielu typów
no w o tw oró w [53].
W yjątkow e zainteresow anie tym białkiem w ynika rów ­
nież z faktu, że w ydaje się ono być sw oistym „m olekular­
ny m ogniw em " łączącym ze sobą procesy życia i śmierci w
komórce. A ntyapoptotyczne właściwości surw iw iny ujaw ­
niają się w przebiegu samej mitozy. W ykazano bow iem , że
białko to chroni kom órki dzielące się przed śmiercią w cza­
sie podziału. Pew na część puli surw iw iny zlokalizowanej w
obrębie ap aratu m itotycznego w czasie podziału kom órki
jest fosforylow ana na treoninie 34 przez kom pleks p34cdc2cyklina B i w takiej formie w iąże się z kaspazą 9. Mutacja
tego miejsca w genie surw iw iny, w yrażająca się zam ianą
treoniny na alaninę i wynikający z niej brak fosforylacji, p o ­
w oduje utratę pow inow actw a do kaspazy 9 i zależną od niej
ap o ptozę w kom órkach dzielących się [54].
Ze w zg lęd u na silną ekspresję surw iw iny w wielu typach
now otw orów , stosunkow o szybko uznano ją za potencjalny
cel w terapii przeciw now otw orow ej. Terapie z zastosow a­
niem antysensow nych oligonukleotydów , skierow anych
przeciw surw iw inie, obecnie znajdują się w fazie badań
klinicznych. Ich w prow adzenie do lecznictwa w ydaje się
być kw estią niedalekiej przyszłości. W kontekście tego typu
przedsięw zięć w arto jednak mieć na uw adze, że ingerencja
w ekspresję białek na poziom ie kom órkow ym jest procesem
niezw ykle skom plikow anym , a jego konsekwencje nie za­
w sze dają się przewidzieć. W szeregu badań (w tym rów nież
p row ad zo ny ch przez nasz zespół) w ykazano, że w ygaszenie
ekspresji surw iw iny, może prow adzić do pow stania kom ó­
rek poliploidalnych i aneuploidalnych [19,21,55]. Zjawisko
to, m im o tego, że dotyczy zw ykle niewielkiej części kom ó­
rek, m oże mieć ogrom ne znaczenie w dalszym przebiegu
choroby. W świetle najnowszych teorii dotyczących genezy
now otw orów , niestabilne genetycznie kom órki poliploidalne i aneuploidalne m ogą stać się źródłem now ych klonów,
inicjując odnow ę now otw oru. Powstałe w ten sposób klony
stanow ią „now ą jakość" pod w zględem genetycznym . Zni­
kom a w iedza w zakresie tej problem atyki nie pozw ala na
udzielenie odpow iedzi na pytanie o to, czy p rzypadkiem te
n ow e klony nie okażą się dla pacjenta groźniejsze i bardziej
o p orne na leczenie niż komórki, z których się w yw odzą.
W bieżącym roku minie 10 lat od odkrycia surw iw iny
i 10 lat intensyw nych badań nad jej właściwościami i rolą
w komórce. Mimo tego, że badania te dostarczyły szeregu
fascynujących w yników , pozwoliły na zrozum ienie p ew ­
nych zagadnień, wiele pytań czeka jeszcze na odpow iedź.
N a przykład, ciągle nie m a pewności czy surw iw ina jest
w łaściw ym celem terapeutycznym w leczeniu n ow o tw o ­
rów . Poza wątpliw ościam i opisanym i powyżej (poliploidia,
aneuploidia, niestabilność genetyczna), istnieje obaw a w y ­
stąpienia efektów ubocznych zw iązanych z zaham ow aniem
proliferacji limfocytów. W ykazano bowiem, że surw iw ina
16
jest eksprym ow ana w kom órkach progenitorow ych ukła­
d u krw iotw órczego [56] i praw idłow ych lim focytach [57],
W iadom o, że ich proliferacja jest niezbędna do p raw id ło ­
wej odpow iedzi układu odpornościow ego na patogen. Tak
więc, czy w ygaszenie ekspresji surw iw iny nie spow oduje
efektów ubocznych w postaci osłabienia u k ładu o d p o rn o ś­
ciowego, tak typow ego przy radio- i chemioterapii? Nie bez
znaczenia pozostaje rów nież fakt, że su rw iw in a jest e kspry­
m ow ana w kom órkach macierzystych [58]. Czy zah am o ­
w anie jej ekspresji w tych kom órkach, jako skutek uboczny
terapii antysurw iw inow ej nie okaże się brzem ienne w skut­
kach dla całego organizm u? Jak widać, pom im o ciągle ros­
nącej ilości danych na tem at m echanizm ów zw iązanych z
ham ow aniem proliferacji i indukcją apoptozy kom órek no ­
w otw orow ych, w których znaczący udział m a surw iw ina,
ciągle jesteśm y dalecy od udzielenia odpow iedzi na zasad ­
nicze pytanie, dotyczące strategii terapeutycznych w w al­
ce z now otw oram i, m ianowicie czy broń, po którą chcemy
sięgnąć w „walce z surw iw iną" (terapie antysurw iw inow e)
nie okaże się bronią obosieczną.
P IŚM IE N N IC T W O
1. Am brosini G, A dida C, Altieri DC (1997) A novel anti-apoptosis gene,
survivin, expressed in cancer and lym phom a. N at M ed 3: 917-921
2. LaCasse EC, Baird S, Korneluk RG, MacKenzie AE (1998) The inhibi­
tors of apoptosis (IAPs) and their em erging role in cancer. Oncogene
17: 3247-3259
3. Deveraux QL, Reed JC (1999) IAP family proteins-suppressors of ap­
optosis. Genes Dev 13: 239-252
4. Song Z, Liu S, He H, Hoti N, W ang Y, Feng S, W u M (2004) A single
am ino acid change (Asp 53 --> Ala53) converts Survivin from antiapoptotic to pro-apoptotic. Mol Biol Cell 15:1287-1296
5. Tam m I, W ang Y, Sausville E, Scudiero DA, Vigna N, O ltersdorf T,
Reed JC (1998) IAP-family protein survivin inhibits caspase activity
and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer
drugs. Cancer Res 58: 5315-5320
6. G rądzka I (2006) M echanizm y i regulacja program ow anej śm ierci ko­
mórek. Postępy Biochem 52:157-165
7. Chai J, Shiozaki E, Srinivasula SM, Wu Q, Datta P, Alnemri ES, Shi Y
(2001) Structural basis of caspase-7 inhibition by XIAP. Cell 104: 769780
8. M arusaw a H, M atsuzaw a S, W elsh K, Zou H, A rm strong R, Tam m I,
Reed JC (2003) HBXIP functions as a cofactor of survivin in apoptosis
suppression. EMBO J 22: 2729-2740
9. Song Z, Yao X, W u M (2003) Direct interaction betw een survivin and
Sm ac/DIA BLO is essential for the anti-apoptotic activity of survivin
during taxol-induced apoptosis. J Biol Chem 278: 23130-23140
10. Xu X, G erard AL, H uang BC, A nderson DC, Payan DG, Luo Y (1998)
Detection of program m ed cell death using fluorescence energy trans­
fer. Nucleic Acids Res 26: 2034-2035
l l.O lie RA, Simoes-W ust AP, Baum ann B, Leech SH, Fabbro D, Stahel
RA, Zangem eister-W ittke U (2000) A novel antisense oligonucleotide
targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung
cancer cells to chem otherapy. Cancer Res 60:2805-2809
12. K appler M, Bache M, Bartel F, Kotzsch M, Panian M, W url P, Blumke
K, Schm idt H, Meye A, Taubert H (2004) K nockdow n of survivin ex­
pression by small interfering RNA reduces the clonogenic survival of
hu m an sarcom a cell lines independently of p53. Cancer Gene Ther 11:
186-193
13. Chaw la-Sarkar M, Bae SI, Reu FJ, Jacobs BS, L indner DJ, Borden EC
(2004) D ow nregulation of Bcl-2, FLIP or IAPs (XIAP and survivin) by
siRNAs sensitizes resistant m elanom a cells to A po2L/TRA IL-induced
apoptosis. Cell D eath Differ 11: 915-923
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
14. Ling X, Li F (2004) Silencing of antiapoptotic survivin gene by m ultiple
approaches of RNA interference technology. Biotechniques 36: 450454,456-460
36. Giodini A, Kallio MJ, Wall NR, Gorbsky GJ, Tognin S, M archisio PC,
Sym ons M, Altieri DC (2002) Regulation of m icrotubule stability and
m itotic progression by survivin. Cancer Res 62: 2462-2467
15. Altieri DC (2003) Validating survivin as a cancer therapeutic target.
N at Rev Cancer 3: 46-54
37. Rosa J, C anovas P, Islam A, Altieri DC, Doxsey SJ (2006) Survivin m od­
ulates m icrotubule dynam ics and nucleation throughout the cell cycle.
Mol Biol Cell 17:1483-1493
16. Li F, A m brosini G, C hu EY, Plescia J, Tognin S, M archisio PC, Altieri
DC (1998) Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by sur­
vivin. N ature 396: 580-584
17. Skoufias DA, Mollinari C, Lacroix FB, M argolis RL (2000) H um an
survivin is a kinetochore-associated passenger protein. J Cell Biol 151:
1575-1582
18. Vagnarelli P, E am shaw WC (2004) C hrom osom al passengers: the four­
dim ensional regulation of mitotic events. Chrom osom a 113: 211-222
19. W olanin K, M agalska A, M osieniak G, Klinger R, McKenna S, Vejda S,
Sikora E, Piwocka K (2006) C urcum in affects com ponents of the chro­
m osom al passenger complex and induces mitotic catastrophe in apoptosis-resistant Bcr-Abl-expressing cells. Mol Cancer Res 4: 457-469
20. M agalska A, Sliwinska M, Szczepanow ska J, Salvioli S, Franceschi C,
Sikora E (2006) Resistance to apoptosis of HCW -2 cells can be over­
come by curcum in- or vincristine-induced mitotic catastrophe. Int J
Cancer 119:1811-1818
21. Li F, A ckerm ann EJ, Bennett CF, Rotherm el AL, Plescia J, Tognin S,
Villa A, M archisio PC, Altieri DC (1999) Pleiotropic cell-division de­
fects an d apoptosis induced by interference w ith survivin function.
N at Cell Biol 1:461-466
22. Giet R, Petretti C, Prigent C (2005) A urora kinases, aneuploidy and
cancer, a coincidence o r a real link? T rends Cell Biol 15: 241-250
23. A ndrew s PD, Knatko E, M oore WJ, Sw edlow JR (2003) Mitotic m e­
chanics: the auroras come into view. C urr O pin Cell Biol 15: 672-683
24. Lan W, Z hang X, Kline-Smith SL, Rosasco SE, Barrett-Wilt GA, Shabanow itz J, H u n t DF, W alczak CE, Stukenberg PT (2004) A urora B phosphorylates centrom eric MCAK and regulates its localization and microtubule depolym erization activity. C urr Biol 14: 273-86
25. Chen J, Jin S, Tahir SK, Z hang H, Liu X, Sarthy AV, M cGonigal TP, Liu
Z, Rosenberg SH, N g SC (2003) Survivin enhances Aurora-B kinase ac­
tivity and localizes A urora B in hu m an cells. J Biol C hem 278: 486-490
26. U ren AG, W ong L, Pakusch M, Fowler KJ, Burrows FJ, Vaux DL, Choo
KH (2000) Survivin and the inner centrom ere protein INCENP show
sim ilar cell-cycle localization and gene knockout phenotype. C urr Biol
10:1319-1328
27. Nicklas RB (1997) H ow cells get the right chrom osom es. Science 275:
632-637
28. Lens SM, M edem a RH (2003) The su rv iv in / A urora B complex: its role
in coordinating tension and attachm ent. Cell Cycle 2: 507-510
29. M usacchio A, H ardw ick KG (2002) The spindle checkpoint: structural
insights into dynam ic signalling. N at Rev Mol Cell Biol 3: 731-741
30. Sudakin V, Chan GK, Yen TJ (2001) C heckpoint inhibition of the A P C /
C in HeLa cells is m ediated by a com plex of BUBR1, BUB3, CDC20,
and MAD2. J Cell Biol 154: 925-936
31. W asch R, Engelbert D (2005) A naphase-prom oting com plex-depend­
ent proteolysis of cell cycle regulators and genomic instability of can­
cer cells. Oncogene 24:1-10
32. C arvalho A, Carm ena M, Sam bade C, E am shaw WC, W heatley SP
(2003) Survivin is required for stable checkpoint activation in taxoltreated HeLa cells. J Cell Sci 116: 2987-2998
33. Lens SM, W olthuis RM, K lom pm aker R, Kauw J, Agam i R, Brumm elkam p T, Kops G, M edem a RH (2003) Survivin is required for a sus­
tained spindle checkpoint arrest in response to lack of tension. EMBO
J 22: 2934-2947
34. W aters JC, Chen RH, M urray AW, Salm on ED (1998) Localization of
M ad2 to kinetochores depends on m icrotubule attachm ent, not ten­
sion. J Cell Biol 141:1181-1191
35. Shannon KB, C anm an JC, Salmon ED (2002) M ad2 and BubRl func­
tion in a single checkpoint pathw ay that responds to a loss of tension.
Mol Biol Cell 13: 3706-3719
Postypy Biochem ii 53 (1) 2007
38. Li F (2003) Survivin study; w hat is the next wave? J Cell Physiol 197:
8-29
39. M ahotka C, Wenzel M, Springer E, G abbert HE, G erharz CD (1999)
Survivin-deltaEx3 and survivin-2B: tw o novel splice variants of the
apoptosis inhibitor survivin w ith different antiapoptotic properties.
Cancer Res 59: 6097-6102
40. B adran A, Yoshida A, Ishikawa K, Goi T, Yamaguchi A, U eda T, Inuzuka M (2004) Identification of a novel splice variant of the h u m an
anti-apoptopsis gene survivin. Biochem Biophys Res C om m un 314:
902-907
41. Caldas H, H onsey LE, Altura RA (2005) Survivin 2alpha: a novel Sur­
vivin splice variant expressed in hum an malignancies. Mol C ancer 4:
11
42. M ahotka C, Liebm ann J, W enzel M, Suschek CV, Schmitt M, G abbert
HE, G erharz CD (2002) Differential subcellular localization of func­
tionally divergent survivin splice variants. Cell Death Differ 9: 13341342
43. H attori M, Sakamoto H, Satoh K, Yamamoto T (2001) DNA dem ethylase is expressed in ovarian cancers and the expression correlates w ith
dem ethylation of CpG sites in the prom oter region of c-erbB-2 and su r­
vivin genes. Cancer Lett 169:155-164
44. Ma H, N guyen C, Lee KS, Kahn M (2005) Differential roles for the
coactivators CBP and p300 on T C F/beta-catenin-m ediated survivin
gene expression. Oncogene 24: 3619-3631
45. Aoki Y, Feldm an GM, Tosato G (2003) Inhibition of STAT3 signaling
induces apoptosis and decreases survivin expression in prim ary effu­
sion lym phom a. Blood 101:1535-1542
46. Zw icker J, Lucibello FC, W olfraim LA, Gross C, Truss M, Engeland K,
M uller R (1995) Cell cycle regulation of the cyclin A, cdc25C and cdc2
genes is based on a com m on m echanism of transcriptional repression.
EMBO J 14: 4514-4522
47. Li F, Altieri DC (1999) Transcriptional analysis of hum an survivin gene
expression. Biochem J 344: 305-311
48. H offm an W H, Biade S, Zilfou JT, Chen J, M urphy M (2002) T ranscrip­
tional repression of the anti-apoptotic survivin gene by w ild type p53.
J Biol C hem 277: 3247-3257
49. M urphy M, Ahn J, W alker KK, Hoffm an WH, Evans RM, Levine AJ,
G eorge DL (1999) Transcriptional repression by w ild-type p53 utilizes
histone deacetylases, m ediated by interaction w ith mSin3a. G enes Dev
13: 2490-2501
50. Fortugno P, Beltrami E, Plescia J, Fontana J, Pradhan D, Marchisio PC,
Sessa WC, Altieri DC (2003) Regulation of survivin function by Hsp90.
Proc N atl Acad Sci USA 100:13791-13796
51. Ciocca DR, Calderw ood SK (2005) H eat shock proteins in cancer: diag­
nostic, prognostic, predictive, and treatm ent implications. Cell Stress
C haperones 10:86-103
52. Z hao J, Tenev T, M artins LM, D ow nw ard J, Lemoine NR (2000) The
ubiquitin-proteasom e pathw ay regulates survivin degradation in a
cell cycle-dependent m anner. J Cell Sci 113:4363-4371
53. W heatley SP, McNeish A (2005) Survivin: a protein w ith dual roles in
m itosis a n d apoptosis. Int Rev Cytol 247: 35-8853
54. O 'C onnor DS, G rossm an D, Plescia J, Li F, Zhang H, Villa A, T ognin S,
M archisio PC, Altieri DC (2000) Regulation of apoptosis at cell division
by p34cdc2 phosphorylation of survivin. Proc Natl Acad Sci USA 97:
13103-13107
55. N quygen HG, Ravid K (2006) T etraploidy/aneuploidy and stem cells
in cancer prom otion: the role of chrom osom e passenger proteins. J Cell
Physiol 208:12-22
56. F ukuda S, Pelus LM (2006) Survivin, a cancer target w ith an em erging
role in norm al adult tissues. Mol Cancer Ther 5:1087-1098
http://rcin.org.pl
17
57. Xing Z, C onw ay EM, Kang C, W inoto A (2004) Essential role of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, in T cell developm ent, m aturation, and hom eostasis. J Exp M ed 199: 69-80
58. Zangem eister-W ittke U, Simon HU (2004) An IAP in action: the multipie roles of survivin in differentiation, im m unity and m alignancy. Cell
Cycle 3:1121-1123
Role of survivin in m itosis
Kamila Wolanin , Katarzyna Piwocka
L aboratory of M olecular Bases of A ging, D epartm ent of Biochem istry, The N encki In stitute of E xperim ental Biology, 3 P asteur St., 02-093
W arsaw , Poland
Be-mail: k.wolanin@ nencki.gov.pl
Key words: survivin, m itosis, m itotic spindle assem bly checkpoint, apoptosis, cell cycle
ABSTRACT
H um an survivin is a member of the IAP (Inhibitor of Apoptosis) fam ily. It w as reported that survivin expression is associated w ith drug resi­
stance, cancer progression and low patient survival rate in many cancers. Survivin is im plicated in both: inhibition of apoptosis and regulation
of cell d ivision. As a member of Chromosomal Passenger Complex (CPC) it is involved in sister chromatids segregation during m itosis. On the
other hand, survivin plays an important role in the surveillance m echanism called mitotic sp indle assem bly checkpoint (MSAC) w h ich regu­
lates metaphase to anaphase transition during mitosis. Additionally, survivin is necessary for cytokinesis progression. The present review is
a summary of survivin's functions, focused on its role in cell division in normal and cancer cells, as w ell as introduction to discussion about
anticancer therapies based on survivin depletion.
POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE
SKŁADKI CZŁONKOWSKIE I PRENUMERATA „POSTĘPÓW BIOCHEMII" W 2007 ROKU
W roku 2007 pełna składka członkowska wynosi 80 zł rocznie. Dotychczasowi członkowie-studenci oraz członkowie zwyczajni,
którym przyznano prawo do ulgowej składki, płacą składkę w wysokości 40 zł rocznie. Małżeństwa opłacają składki w wysokości
80 + 40 zł. Członkowie, którzy opłacą składkę członkowską do 31 marca 2007 roku, mają zapewnioną bezpłatną prenumeratę
kwartalnika „Postępy Biochemii". Członkowie, którzy opłacą składkę po tym terminie, będą otrzymywać kwartalnik do czasu
wyczerpania zapasów magazynowych. Członkowie honorowi zwolnieni są z opłacania składek członkowskich. Członkowie ho­
norowi otrzymują bezpłatnie „Postępy Biochemii". Członkowie emeryci nie płacą składek członkowskich. Członkowie emeryci
mogą zaprenumerować „Postępy Biochemii", płacąc za nie 30 zł rocznie. Osoby, które nie są członkami Towarzystwa mogą
zaprenumerować „Postępy Biochemii" w cenie 100 zł rocznie. Studenci mogą zaprenumerować „Postępy Biochemii" po ulgowej
cenie 40 zł. Konieczne jest przy tym udokumentowanie statusu studenta odpowiednim zaświadczeniem z Dziekanatu lub kopią
ważnej legitymacji studenckiej. Biblioteki i inne instytucje płacą za prenumeratę „Postępów Biochemii" 150 zł. Wyjaśniamy, że
ulgowa składka przysługuje studentom i uczestnikom studiów doktoranckich. Uprawnienia do ulgowej składki przyznaje Zarząd
Główny lub jego Prezydium na podstawie indywidualnego wystąpienia członka, udokumentowanego odpowiednim zaświad­
czeniem lub oświadczeniem. Uprawnienie ważne jest tylko na dany rok i wymaga ponownego wystąpienia w roku następnym,
z tym że ulgowa składka może przysługiwać nie dłużej niż przez okres 5 kolejnych lat, łącznie z rokiem jej przyznania. Osoby,
które zostały zawieszone w prawach członka z powodu niepłacenia składek więcej niż dwa lata, lecz nie zostały jeszcze formalnie
skreślone z listy członków, mają prawo stać się ponownie pełnoprawnymi członkami PTBioch po uregulowaniu wszystkich zale­
głych składek. Przypominamy, że w roku 2006 r. składki wynosiły 80 zł (ulgowa 40 zł). W latach 2002-2005 składki wynosiły 80 zł
dla członka zwyczajnego i 40 zł dla członka studenta. W roku 2002 r. składki wynosiły: 70 zł dla członka zwyczajnego i 35 zł dla
członka studenta. Wszelkie wątpliwości związane z opłacaniem składek prosimy wyjaśniać w każdy wtorek w godzinach 12:00
- 17:00 w biurze Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa, tel.: 022 58 92 352
lub 022 58 92 499, faks: 022 658 20 99, e-mail: [email protected] lub ze skarbnikiem Towarzystwa, dr Anną Dygas, tel. 022 58
92 225, faks: 022 822 53 42, e-mail: [email protected]
O płaty należy wnosić do banku:
BPH S.A. Oddział Warszawa, ul. Krucza 24-26
na konto: 94 1060 0076 0000 4010 5000 0341
Opłaty z zagranicy: IBAN: PL94 1060 0076 0000 4010 5000 0341
SWIFT Code: BPHKPLPK (Koszty przekazu i zam iany w aluty obciążają wpłacającego)
Przypominamy, że zmianie uległa deklaracja członkowska Towarzystwa. Informacje na ten temat można znaleźć na stronie in­
ternetowej pod adresem: http://www.ptbioch.edu.pl/. Jednocześnie prosimy osoby, których adres poczty elektronicznej uległ
zmianie, by poinformowały o tym fakcie dr Annę Dygas.
18
http://rcin.org.pl
w w w .postepy bio chem ii.pl
Małe białka szoku term icznego - rola w apoptozie, kancerogenezie
i chorobach zw iązanych z agregacją białek
ST R E S Z C Z E N IE
ałe b iałk a szo k u term icznego (sH sps, ang. small heat shock proteins) należą do b iałek
opiek u ń czy ch , k tóre ch ro n ią k o m ó rk i p ro k a rio ty c zn e i e u k ario ty czn e przed sz k o d li­
w ym i sk u tk a m i stresu. sH sp s z ap o b ie g ają in d u k o w a n e j przez stres, n ieodw racalnej agrega­
cji u sz k o d z o n y ch b iałe k i u m o żliw iają re n atu rac ję z w iązan y ch su b strató w , w spółpracując
z in n y m i b iałk a m i o p iek u ń czy m i. W n in ie jsz ej pracy p o d su m o w a n o ostatn ie b a d an ia d o ­
tyczące g łó w n ie u d z ia łu sH sp s w c horobach zw iąz an y c h z agregacją białek . sH sps są często
sk ła d n ik ie m agregatów białk o w y ch , któ re p o w sta ją w trakcie ro zw o ju chorób neu ro d eg en eracyjnych. Z id en ty fik o w an o szereg m u tacji w g en ach sH sps, k tóre są o d p o w ie d zia ln e za roz­
w ój zaćm y, d e sm in o p a tii i n e u ro p a tii. sH sp s c h ro n ią k o m ó rk i p rz ed stresem oksydacyjnym ,
k tóry jest w y n ik iem n ie d o k rw ie n i^ re p e rfu z ji w y w o łan ej u d a rem serca lu b m ózgu. Liczne
b a d an ia w sk azu ją, że sH sp s uczestniczą w reg u lacji ap o p to z y i są zaangażow ane w proces
kancerogenezy. P oznanie roli sH sp s w procesach c h orobotw órczych um o żliw ia opracow y­
w an ie n o w ych strategii terapeu tycznych.
M
Ewa Laskowska
K atedra Biochemii, Instytut Biologii, U n iw er­
sytet G dański, G dańsk
^-Katedra Biochemii, Instytut Biologii, U n iw er­
sytet G dański, ul. Kładki 24, 80-952 G dańsk;
e-mail: lasko@ biotech.univ.gda.pl,
teł.: (058) 301 57 41
A rtykuł otrzym ano 14 czerw ca 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 20 w rześnia 2006 r.
Słowa kluczowe: agregacja białek, białka opie­
kuńcze, choroby neurodegeneracyjne, a-k ry staliny, m ałe białka szoku term icznego
W P R O W A D Z E N IE - S T R U K T U R A I F U N K C J A
S H S P S JA K O B IA Ł E K O P I E K U Ń C Z Y C H
Małe białka szoku term icznego (sHsps) należą do gru p y białek opiekuńczych
(ang. molecular chaperones) w ystępujących w większości zbadanych do tej pory
organizm ów prokariotycznych i eukariotycznych. Rolą sH sps jest zapobieganie
nieodwracalnej denaturacji i agregacji białek uszkodzonych w w arunkach stre­
sowych. Kompleksy sH sp z substratam i są stabilne. Szereg dośw iadczeń in vitro
wykazało, że zw iązane p olipeptydy m ogą być uw olnione i reaktyw ow ane przez
zależny od ATP system białek opiekuńczych H sp 7 0 /H s p l0 0 (Rye. 1A) [1-4], W
kom órkach E. coli w ydajność renaturacji substratów przez białka opiekuńcze
H sp70-H spl00 (D n aK /D n aJ/G rp E - ClpB) znacznie spada przy braku sH sps
(IbpA i IbpB), zarów no in vitro, jak i in vivo [4,5].
W ykaz skrótów: Apaf-1 (ang. apoptosis protease
activating factor) - czynnik aktyw ujący p roteazy; CMT (ang. Charcot -Marie-Tooth disease)
- choroba C harcota-M arie-Tootha; DRM (ang.
desmin related myopathy) - desm inopatia; H sp s
(ang. heat shock proteins) - białka szoku term icz­
nego; ROS (ang. reactive oxygen species) - re ak ­
tyw ne form y tlenu; sH sps (ang. small heat shock
proteins) - m ałe białka szoku term icznego
Podziękowanie: Praca pow stała w trakcie re a ­
lizacji grantu MNiSW 0 4 0 1 /P 0 4 /2 0 0 5 /2 8
Ilość pro d u kow anych sH sps jest różna w zależności od organizm u: w kom ór­
kach E. coli i Saccharomyces cerevisiae zidentyfikow ano dw a sHsps, u Drosophila
melanogaster cztery [2]. Najliczniejszą grupę, zawierającą p onad 30 różnych bia­
łek, stanow ią ro­
ślinne sH sp obec­
ne w cytosolu, ją­
drze i organellach
komórkowych.
sH sps charaktery­
zują się niską masą
od 15 do 40 kDa
(stąd nazw a tej
g ru p y białek), oligom eryczną struk ­
turą i obecnością
dom eny a-krystaliny
zawierającą
około 90 reszt aminokw asow ych w
części karboksylo­
wej sHsps. a-kryR ycin a 1. Rola sH s p s w kom órce. (A) s H s p s zap o b ieg ają n ieod w racaln ej a g reg a­ staliny są jednym i
cji u sz k o d z o n y c h białek. Z d en a tu r o w a n e w w a ru n k a ch s tr e s o w y c h p o lip e p ty d y z głów nych białek
są w ią z a n e p rzez sH sp s, a n a stę p n ie ren a tu ro w a n e z u d z ia łe m z a le ż n y c h od A TP
soczewki oka ssa­
białek o p iek u ń czy ch H s p l0 0 - H s p 7 0 /H s p 4 0 . Brak s H s p s w k om ó rce u tru d n ia
ków,
ich rola w za­
u su w a n ie a g reg atów i m o ż e p ro w a d z ić d o ro z w o ju ch orób a gregacyjn ych . (B)
sH s p s stabilizują strukturę cyto szk ie letu , (C) ham ują p roces a p o p to z y i o b n iża ­ pobieganiu agrega­
ją p o z io m rea k ty w n y ch fo rm tlen u ora z (D) ham ują agregację p ły te k krw i. (E)
cji białek soczewki
s H s p s m o g ą być sk ła d n ik iem a g re g a tó w to w a r z y s z ą c y c h ch o ro b o m n e u ro d eg ezostanie
opisana
neracyjnym .
19
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
w dalszej części tej pracy. Obecność dom eny a-krystaliny
jest głów nym kryterium przynależności do sHsps, dlatego
zap ro p on o w an o drugą nazw ę dla tej grupy białek - a -H sp s
[6]. W p rzy p adk u wielu sH sps struktura oligom erów jest
dynam iczna. sH sps tw orzą hom o- i heterooligom ery, któ ­
rych podjednostki m ogą ulegać ciągłej w ym ianie. W ielkość
oligom erów m oże być zmienna, przy czym podw yższenie
tem p eratury pow oduje tw orzenie w iększych stru k tu r (np.
H sp25 u myszy) lub rozpad oligom erów na mniejsze ko m ­
pleksy lub dimery, które wiążą rozw inięte łańcuchy polip ep ty d o w e substratów (Hsp26 z drożdży) [2,6]. Z zastoso­
w an iem m etody krystalografii lub m ikroskopii elektronowej
poznano, do tej pory, strukturę jedynie kilku oligom erów
sH sps, które posiadają stałą ilość podjednostek: H sp l6 ,5 z
archea Methanococcus janashii, H spl6,9 z pszenicy T. aestivum, Hsp26 z drożdży Saccharomyces cerevisiae i H spl6,3 z
Mycobacterium tuberculosis [2,7,8], W szystkie w ym ienione
sH sps mają kształt sferyczny. W H spl6,5 dw adzieścia cztery
podjednostki tw orzą strukturę sferyczną o oktagonalnej sy­
metrii, z czternastom a otworami. W H spl6,5 i innych sH sps
o znanej konformacji dom ena a-krystaliny jest zw inięta w
d w a rów noległe arkusze [3 (Ryc. 2). Dzięki od d ziaływ an io m
do m en a-krystaliny powstają dimery, które są p o d sta w o ­
w ym i elem entam i strukturalnym i oligom erów. Za tw o rze­
nie w iększych kom pleksów odpow iedzialne są końce k a r­
boksylow e i / lub am inow e otaczające dom enę a-krystaliny
sH sps. Fragm enty poza d om eną a-krystaliny m ogą rów nież
w iązać substraty [2].
W genom ie człowieka znajduje się 10 genów kodujących
sH sps [9], Krótką charakterystykę ich funkcji p rzed staw io ­
no w tabeli 1. Większość sH sps człowieka jest p ro d u k o w an a
konstytutyw nie w tkance mięśniowej i jako białka o p ie k u ń ­
cze zapobiegją agregacji m odelow ych substratów w reak ­
cjach in vitro. Najlepiej poznane pod w zględem funkcji i
stru k tu ry są a-krystaliny, Hsp27 i Hsp22. W ciągu ostatnich
kilku lat zidentyfikow ano szereg mutacji w genach sH sps,
które odpow iedzialne są za rozwój zaćmy, desm inopatii i
neuropatii. Wiele badań wskazuje na to, że sH sps działa­
ją nie tylko jako typow e białka opiekuńcze, ale są rów nież
odpow iedzialne za rów now agę w ew nątrzkom órkow ego
potencjału redoks, regulację złożonych procesów apo p to zy
Rycina 2. Struktura monomeru Hspl6.5 M. jannaschii (1SHS, baza danych PDB). Zacho­
wana w ewolucji domena a-krystaliny tworzy dwa arkusze p.
i transformacji now otw orow ej oraz stabilizację cytoszkieletu (Ryc. 1). W ykazano, że Hsp27, Hsp20 i a-krystaliny
człowieka stabilizują mikrofilam enty aktyny w w arunkach
stresu term icznego i oksydacyjnego [11]. W odpow iedzi na
stres dochodzi do dezorganizacji cytoszkieletu i do fosfo­
rylacji sHsps, które oddziałują pośrednio lub bezpośrednio
z filamentam i aktyny ułatwiając ich reorganizację. HspB2 i
HspB3 uczestniczą w stabilizacji miofibryli w kom órkach
m ięśniow ych [11], natom iast HspBlO w chodzi w skład
gęstych w łókien zew nętrznych (ang. outer dense fibers) ota­
czających aksonem y w w itkach plem ników [12]. O statnie
badania w skazują, że sH sps m ogą rów nież działać poza
kom órką. Kozaw a i wsp. stwierdzili, że w w yniku stresu
m echanicznego aB-krystalina i Hsp20 są uw alniane z m ięś­
ni gładkich naczyń krw ionośnych i zapobiegają agregacji
płytek krw i [13]. Prezentow ana praca przedstaw ia najnow ­
sze informacje dotyczące u działu sHsps, m. in. w regulacji
apoptozy, kancerogenezy i rozw oju chorób zw iązanych z
agregacją białek.
R O L A s H s p s W R E G U L A C JI A P O P T O Z Y
I KANCEROGENEZY
Istnieje wiele danych wskazujących, że sH sps uczestni­
czą w procesach różnicow ania i proliferacji kom órek. Hsp27
chroni kom órki przed czynnikami, które w yw ołują apoptozę (program ow aną śmierć komórki): cy to kinami, lekami cytotoksycznym i, stresem oksydacyjnym i prom ieniow aniem
jonizującym [14]. A poptoza m oże być regulow ana dw om a
szlakami, w których jedną z kluczow ych ról odgryw ają
kaspazy - proteazy cysteinow e syntetyzow ane w formie
nieaktyw nych zym ogenów . N a tzw. drodze zew nętrznej
następuje w iązanie liganda do receptora (ang. death recep­
tor) znajdującego się na pow ierzchni kom órki i aktywacji
prokaspazy 8, a następnie prokaspazy 3. Droga w ew n ętrz­
na jest inicjowana przez uw olnienie cytochrom u c z mitochondriów . C ytochrom c w raz z czynnikiem aktyw ującym
proteazy Apaf-1 (ang. apoptosis protease activating factor) i
p rokaspazą 9 tw orzy apoptosom , który aktyw uje kolejne
prokaspazy. Proteoliza białek docelowych kaspaz w y w o ­
łuje apoptozę [14]. Szereg b adań sugeruje, że Hsp27 m oże
ham ow ać proces apoptozy na kilku etapach. W ykazano,
że Hsp27 praw d o po d o bn ie wiąże cytochrom c, uniem o ż­
liwiając tw orzenie lub praw idłow e działanie apoptosom u.
Ponadto, H sp27 m oże bezpośrednio oddziaływ ać z p ro k a­
spazą 3 i zapobiegać jej aktywacji przez kaspazę 9. Inne d o ­
św iadczenia w ykazały, że Hsp27 ham uje zew nętrzny szlak
apoptozy, oddziałując z białkiem Daxx i zapobiegając jego
w iązaniu z receptorem Fas. N ależy dodać, że apoptoza jest
ham o w an a rów nież przez inne białka opiekuńcze H sp70 i
Hsp90 [14]. Wiele czynników toksycznych pow oduje w zrost
poziom u reaktyw nych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen
species), które w zależności od stężenia m ogą w yw oływ ać
apoptozę lub nekrozę komórki. Stwierdzono, że H sp27 i
aB-krystalina chronią kom órki przed reaktyw nym i form a­
mi tlenu indukow anym i TN Fa (ang. tumor necrosis factor,
czynnik m artw icy now otw oru) nadtlenkiem w o d o ru lub
m enadionem . Przypuszcza się, że sH sps utrzym ują w ysoki
poziom zredukow anego glutationu, um ożliwiający detoksyfikację reaktyw nych form tlenu. Do redukcji utlenionego
glutationu w ykorzystyw any jest NADPH, który pow staje
w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę glukozo-6
20
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
fosforanu [15]. A utorzy sugerują, że sH sps m ogą chronić
dehydrogenazę przed inaktywacją. Interesującym przykła­
dem działania Hsp27 jest ochrona kom órek p odstaw nych
nabłonka oskrzeli u chorych na astmę. Tow arzyszący ast­
mie stan zapalny w yw ołuje stres oksydacyjny w nabłonku
oskrzeli, prow adząc do selektywnej apoptozy kom órek na­
błonka w alcowatego, które pozbaw ione są Hsp27. Komórki
podstaw ne, dzięki którym następuje o d b u d o w a uszkodzo­
nego nabłonka są chronione przed apo p to zą dzięki p o d ­
w yższonem u poziom ow i H sp27 [16].
Tow arzyszący udarow i serca lub m ózgu proces niedo­
krw ienia (ischem ii)/reperfuzji rów nież w yw ołuje stres
oksydacyjny. W w yniku ischem ii/reperfuzji następuje
uszkodzenie tkanek na drodze apoptozy lub nekrozy: w ie­
le białek jest denaturow anych, cytoszkielet i m itochondria
ulegają uszkodzeniu, a lipidy błon utlenieniu [17]. N a d p ro ­
dukcja sH sps u zw ierząt transgenicznych lub w hodow lach
kardiom iocytów chroni kom órki serca p rzed skutkam i nie­
d o k rw ienia/rep erfu zji, praw dopodobnie przez o d d ziały ­
w an ia z miofibrylami. W kom órkach serca i mięśni szkie­
letow ych niedokrw ienie pow oduje przemieszczenie pięciu
sH sps: aB-krystaliny, HspB2, Hsp27, Hsp20 i HspB7 z cytosolu do miofibryli [18]. M orrison i wsp. stwierdzili, że w
w a ru n k ach fizjologicznych u m yszy pozbaw ionych aB-krystaliny i HspB2 morfologia i praca serca były praw idłow e.
N ato m iast po indukcji niedokrw ienia obserw ow ano nie­
p ra w id ło w ą kurczliw ość serca, objawy apoptozy i nekrozy
oraz znaczne obniżenie poziom u glutationu w kardiom iocytach [19].
Z aburzenia regulacji apoptozy, w której uczestniczą
sH sps m ogą w yw ołać transformację now otw orow ą. W
w ielu tkankach now otw orow ych stw ierdzono p o d w y ższo ­
ny poziom H sp27 i innych białek opiekuńczych (Hsp70,
Hsp90, Hsp60) [20], W yraźny w zrost ilości Hsp27 obserw o ­
w ano, m.in. w rak u piersi, jajnika, przełyku, w ątrobow ok om órkow ym , płuc (drobno- i niedrobnokom órkow ym ),
T a b e la 1. Lokalizacja i funkcja s H s p s c z ło w iek a .
FUNKCJE
NAZWA*
H s p B l/H s p 2 7
L O K A L IZ A C JA
m ięśnie, serce [18]
o b ecn ość w
płytkach star­
czy ch 152 j
o c h r o n a cy to szk ieletu
in n e
stabilizuje m ikrofilam enty
aktyny [10] i neurofilam enty
[44], w iąże się do pasm a
I m iofibryli [18]
ham uje po w staw an ie
am yloidu Ap in vitro [50],
śm ierć k om órek indukow aną
poliQ [57] i apoptozę [14,15]
+
w iąże i aktyw uje kinazę
białek (ang. myotonic
dystrophy kinase; brak
aktyw nej kinazy w yw ołuje
dystrofię m iotoniczną) [66]
+
H spB 2/M K B P
(ang. myotonic
dystrophy kinase
binding protein)
m ięśnie, serce [11]
chroni stru k tu rę
m iofibryli [11,18]
HspB3
m ięśnie, serce [11]
chroni stru k tu rę
m iofibryli [11]
H spB 4/ aA-krystalina
soczew ka [21]
zap obieganie agregacji
białek w soczew ce oka [21]
H sp B 5 /a B -k ry sta lin a
soczew ka, m ięśnie,
serce, śledziona [27]
ham uje a p o p to zę i agregację
p łytek k rw i [13], opóźnia
p o w sta w a n ie agregatów
Ap [17], w iąże P r P [60]
+
H spB 6/H sp20
m ięśnie, serce [11]
stabilizuje m ikrofilam enty
aktyny [10], w iąże się do
p asm a I m iofibryli [18]
ham uje agregację
pły tek k rw i [13]
+
H spB 7/cvH sp
serce, m ięśnie
szkieletow e, tkanka
tłuszczow a [67]
w iąże a-filam inę (białko
inicjujące polim eryzację
aktyny) [67] oraz pasm o
I m iofibryli [18]
HspB8 /
m ięśnie,
serce, łożysko,
śledziona [68]
ro z p u sz cz a fragm ent
h u n tin g ty n y H tt43Q
[55], ham uje agregację i
toksyczność Ap E22Q [53]
+
plem niki [69]
oddziałuje z łańcuchem
lekkim dyn ein y [69]
plem niki [12]
sk ła d n ik gęstych w łókien
z ew n ętrzn y c h otaczających
ak so n em y w w itce
p lem nika [12], w iąże lekki
łańcuch kinezyny [70]
1 / H sp22
H sPB9
H spB lO /O D F P
(ang. outer dense
fibers protein)
CMT i
dziedziczna
neu ro p atia
ruchow a
[44,47,48]
zaćm a [17,30]
stabilizuje m ikrofilam enty
a ktyny [10], w iąże się
d o p asm a I m iofibryli
[18] stabilizuje filam enty
p ośrednie desm iny [40,41]
HI
C ho rob y w y ­
w o ła n e p rze z
m utacje w
g e n ie s H s p s
zaćm a [31,32]
desm inopatia
[37,39]
CMT [46] i
dziedziczna
neuropatia
ruchow a [45]
* P ogru b ion ą czcion k ą za z n a c z o n o n a z w y s H s p s u ż y w a n e w tek ście
21
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
podstaw nokom órkow ym skóry i niektórych now otw orach
ośrodkow ego układu nerw ow ego (glejaku wielopostaciow ym , gw iaździaku, nerw iaku zarodkow ym ). P odw yższe­
nie poziom u aB-krystaliny jest charakterystyczne dla raka
jasnokom órkow ego nerki i ośrodkow ego uk ład u n erw o w e­
go (szyszyniaka, nerw iaka osłonkowego, struniaka) [20], W
p rzy p adk u ostrej białaczki szpikowej i raka piersi, Hsp27
może być przyczyną oporności na chem ioterapię [20]. N ie­
które leki stosow ane w terapii now otw orów , np. doksorubicyna i lowastatyna, indukują syntezę Hsp27, pow odując
w ten sposób dodatkow e obniżenie wrażliw ości na leki [14].
Hsp27 (i inne Hsps) m ogą chronić kom órki now otw orow e,
hamując apoptozę lub, jako białka opiekuńcze, renaturując
polipeptydy uszkodzone czynnikam i cytotoksycznym i sto­
sow anym i w terapii. Obecność Hsp27 w ykryto w kom ór­
kach śródbłonka, co sugeruje, że H sp27 m oże rów nież chro­
nić łożysko naczyniow e guza now otw orow ego. W yniki te
wskazują, że w niektórych przypadkach terapia antynow otw orow a pow inna być uzupełniona czynnikam i obniżający­
mi poziom Hsp27. Takim czynnikiem w leczeniu raka płaskokom órkow ego jamy ustnej m oże być interferon y, który
ham ując syntezę Hsp27 pow odow ał w zrost w rażliw ości ko­
m órek n ow otw orow ych na lek [17]. Inną strategią m oże być
zastosow anie oligonukleotydów antysens. W ykazano, że
użycie oligonukleotydu blokującego syntezę H sp27 in d u ­
kowało apoptozę kom órek raka gruczołu krokow ego [20],
a -K R Y S T A L IN Y - B IA Ł K A O P IE K U Ń C Z E
W SO C Z E W C E O K A S S A K Ó W
W soczewce oka ssaków obecne są dw a rodzaje sHsps:
aA -krystaliny i aB-krystaliny, które w ykazują 57% p o d o ­
bieństw o sekwencji am inokwasowej i stanow ią aż 35%
w szystkich białek w soczewce [21]. aA-kryStalina w y stę p u ­
je praw ie wyłącznie w soczewce, natom iast aB-krystalina
rów nież w mięśniach szkieletowych, sercu i śledzionie. In
vitro aA -krystaliny i aB-krystaliny m ogą tw orzyć zarów no
hom o- jak i heterooligom ery, które różnią się właściw ościa­
mi, np. w iązaniem do błony plazmatycznej [22], aktyw noś­
cią opiekuńczą zależną od tem peratury [23,24], Masa oligo­
m erów a-krystalin jest zm ienna (300-1000 kDa, przy masie
m onom eru 20 kDa) i zależy od w ielu czynników: stężenia
białka, tem peratury, pH i siły jonowej. Stopień oligomeryzacji i aktyw ność a-krystalin zm ienia się w raz z wiekiem,
co m oże mieć zw iązek z licznymi modyfikacjami potranslacyjnymi tych białek: fosforylacją, utlenianiem , u su w an iem
g ru p am idow ych, glikacją (nieenzym atyczną glikozylacją)
i skracaniem łańcucha polipeptydow ego [19,25]. Pojaw ia­
jące się w raz z wiekiem modyfikacje potranslacyjne m ogą
ham ow ać aktyw ność a-krystalin, co prow adzi do agregacji
białek strukturalnych soczewki (3- i y-krystalin, m ętnienia
soczewki i rozw oju zaćmy. Z drugiej strony w ykazano, że
a-krystaliny, które uległy glikacji w ykazyw ały in vitro p o d ­
w yższoną aktyw ność opiekuńczą w porów naniu z sH sps
niem odyfikow anym i [17]. Być może, przynajmniej niektó­
re z modyfikacji potranslacyjnych mają na celu u trz y m a ­
nie aktyw ności opiekuńczej a-krystalin w p ó źn y m wieku.
Soczewka jest przezroczysta dzięki regularnem u ułożeniu,
w łóknistych, w przekroju heksagonalnych kom órek, które
są pozbaw ione jąder i organelli kom órkow ych. Stężenie
białka (450 m g /m l, ok. 30% całkowitej m asy soczewki) jest
d w ukrotnie w yższe niż w innych tkankach. Białka stru k tu ­
ralne, głów nie (3- i y-krystaliny, tw orzą ściśle upak ow an e
oligom ery, co dodatkow o zmniejsza rozpraszanie światła
[26]. Dojrzałe kom órki soczewki są m etabolicznie praw ie
nieaktyw ne, procesy degradacji i resyntezy białek (ang. pro­
tein turnover), a także w ym iany białek pom iędzy kom órka­
mi nie zachodzą. W tych szczególnych w arunkach działa­
nie aA -krystaliny jako białka opiekuńczego jest niezw ykle
istotne dla utrzym ania przezroczystości soczewki. Szereg
d ośw iadczeń in vivo i in vitro w ykazało, że a-kry staliny za­
pobiegają agregacji białek strukturalnych soczewki [27,28],
U m yszy pozbaw ionych genu CRY AA, kodującego aA -krystalinę, stw ierdzono rozwój zaćmy, w soczewce obserw o­
w ano obecność ciał inkluzyjnych zawierających głównie
aB- i y-krystalinę [29]. W 1998 roku zidentyfikow ano pierw ­
szą mutację typ u missens w genie CRY A A człowieka, k o d u ­
jącym aA -krystalinę, w yw ołującą dziedziczną zaćmę. Efek­
tem mutacji była zam iana reszt am inokw asow ych R116G
w dom enie aA -krystaliny białka [30], W dośw iadczeniach
in vitro w ykazano, że mutacja R116G czterokrotnie obniża
aktyw ność opiekuńczą a-krystaliny, pow oduje w zrost polidyspersji oligom erów i ham uje w ym ianę podjednostek p o ­
m iędzy oligom eram i aA -krystaliny niezm utow anej i R116G
[22]. W ciągu następnych kilku lat w ykryto kolejne mutacje
w genie a-krystaliny, które są przyczyną dziedzicznej za­
ćmy: mutację typ u nonsens W9X [21] i mutację missens R49C
znajdującą się w yjątkow o poza dom eną a-krystaliny zacho­
w an ą w ewolucji w białkach sH sps [17]. Stw ierdzono, że w
hodow li kom órek nabłonka soczewki aA -krystalina R49C
jest n iepraw idłow o zlokalizow ana w jądrze i w przeciw ień­
stwie do niezm utow anego białka nie chroni kom órek przed
apoptozą in d uk o w an ą staurosporyną [17]. Zaćm ę w yw ołują
rów nież m utacje w genie C RY AB, kodującym aB-krystalinę
- jedna z nich pow oduje przesunięcie ram ki odczytu i p ro ­
dukcję białka z niepraw idłow ym , 35 am inokw asow ym koń­
cem karboksylow ym [31]. W ynikiem innej mutacji D140N,
wywołującej zaćm ę jest zm iana trzeciorzędowej konformacji
białka, co sprzyja tw orzeniu większych oligom erów i p o w o ­
duje u tratę aktyw ności opiekuńczej aB-krystaliny [32], In­
formacje dotyczące roli i m echanizm u działania a-krystalin
w zapobieganiu agregacji białek um ożliw iają op raco w yw a­
nie leków zapobiegających zaćmie. Obiecujące w yniki u zy ­
skano stosując pochodną pantotenianu - disiarczan panteteiny [disiarczan D -bis-(N -pantotenylo-p-aminoetylu), ang.
pantethine]. W ykazano, że disiarczan panteteiny stym uluje
in vitro aktyw ność a-krystalin [33] oraz ham uje in d u k o w a ­
ne selenianem mętnienie soczewek u szczurów. Niestety,
badania kliniczne mające na celu sp raw dzenie działania
pochodnej pantotenianu u ludzi zostały przerw ane w 2001
roku z p o w o d u efektów ubocznych stosow ania leku [34].
Inne dośw iadczenia w skazują, że leki przeciwbólowe: aspi­
ryna, paracetam ol i ibuprofen m ogą zapobiegać zaćmie
ham ując modyfikacje potranslacyjne obniżające aktyw ność
a-krystalin [35]. In vitro aspirina i ibuprofen zapobiegają
karbamylacji i w iązaniu cukrów do a-krystaliny. Ibuprofen
rów nież ham uje glikację a-krystaliny, dodatkow o p ro d u kty
jego ro zp ad u praw d o po d o b nie w iążą się z resztą lizyny akrystaliny co uniem ożliw ia dalsze modyfikacje białka. Acetylacja krystalin z udziałem acetylo-L-karnityny rów nież
m oże zapobiegać glikacji i inaktywacji białek [35].
aB-krystalina w ystępuje w w ielu innych narządach
poza soczewką, jej inaktywacja w yw ołuje więc dodatkow e,
22
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
oprócz zaćmy, skutki. Zaskakujące, że po usunięcie genu
CRYAB, kodującego aB-krystalinę u myszy nie stw ierdzo­
no rozwoju zaćmy, natom iast zwierzęta, praw idłow o roz­
wijające się tylko do ok. 40 tygodnia życia, traciły w agę i
um ierały [36]. W 1998 roku w ykryto mutację R120G w genie
CRYAB człowieka odpow iedzialną za zaćmę i rozwój desm inopatii (DRM, ang. desmin related myopathy) [37], Desmina należy do charakterystycznych dla mięśni filamentów
pośrednich. W mięśniach prążkow anych filamenty desminy tw orzą połączenia pom iędzy miofibrylami, sarkolemm ą
i jądrem kom órkow ym [38]. Z arów no mutacje w genie desminy, które są głów ną przyczyna DRM, jak i mutacja R120G
w aB-krystalinie pow odują agregację filamentów desminy.
W agregatach oprócz desm iny i aB-krystaliny stw ierdzono
obecność innych filamentów pośrednich (nestyny i w imentyny) oraz ubikw ityny i białka prekursorow ego (3-amyloidu
(bAPP). Skutkiem agregacji desm iny jest uszkodzenie sieci
filam entów pośrednich i miofibryli. W p rzyp ad ku w ym ie­
nionych mutacji zm iany chorobow e ograniczone są naj­
częściej do m ięśnia sercowego. Dwie kolejne mutacje, które
w ykryto pow odują syntezę skróconych form aB-krystaliny
AC13 i AC25 i w yw ołują desm inopatię obejmującą mięśnie
prążkow ane [39], Znaczenie mutacji R120G w rozwoju desm inopatii potw ierdziły dośw iadczenia in vitro. W ykaza­
no, że aB-kryStalina R120G tw orzy nieregularne oligomery
znacznie w iększe w porów naniu z niezm utow anym sH sps
i w ykazuje obniżoną aktyw ność opiekuńczą w reakcjach
z m odelow ym i substratam i [40], Stw ierdzono również,
że aB-krystalina R120G wiąże in vitro kw aśne białko włókienkow e gleju GFAP (ang. glial fibrillary acidic protein) i
pow oduje agregację filamentów GFAP [41], Zastanaw iają­
ce jest, dlaczego efekt mutacji R120G nie jest w idoczny we
w szystkich tkankach, w których obecna jest aB-krystalina,
a objawy desm inopatii lub zaćm y pojawiają się dopiero w
w ieku dorosłym. W ytłum aczeniem może być częściowo za­
chow ana aktyw ność aB-krystalina R120G, obecność oprócz
aB-krystaliny R116G niezm utow anego białka u heterozygot oraz aktyw ność opiekuńcza innych sH sps obecnych w
m ięśniach [41], Potw ierdzają to, m. in. w yniki Ito i wsp. [42],
którzy w ykazali, że w ystępujące w dużej ilości w mięśniach
Hsp27, ham ow ało pow staw anie ciał inkluzyjnych w kom ór­
kach HeLa, produkujących aB-krystalinę R120G. W ykazano
rów nież, że Hsp22 zapobiegało agregacji i um ożliw iało za­
chow anie praw idłow ej struktury oligomerów aB-krystaliny
R120G [43].
ROLA sH sp s W C H O R O BA C H
N EU RO DEG ENERA CYJN YCH
W ciągu ostatnich dw óch lat zidentyfikow ano kilka m u ­
tacji w genach Hsp27 i Hsp22, które odpow iadają za rozwój
dziedzicznej neuropatii ruchowej lub jednej z najczęstszych
dziedzicznych neuropatii ruchow o-czuciow ych - choroby
Charcota-M arie-Tootha (CMT) [44-48]. Większość mutacji
znajduje się w dom enie a-krystaliny i p raw dopodobnie za­
pobiega praw id ło w ym oddziaływ aniom sH sps z filamentami pośrednim i, co prow adzi do uszkodzenia cytoszkieletu
n eu ro n ó w [47],
Z m iana konformacji i agregacja białek, jest zw iązana z
w ielom a chorobam i neurodegeneracyjnym i [49], W agre­
gatach zew nątrz- i w enątrzkom órkow ych często pojaw ia­
ją się sHsps. W p rzy p adk u choroby A lzheim era w m ózgu
pow stają zew nątrzkom órkow e płytki starcze zawierające
am yloid p (Ap), którego prekursorem jest bAPP (ang. amylo­
id ¡3 precursor protein). W ew nątrz neuronów tw orzą się splo­
ty neurofibrylarne, głównie z hiperfosforylow anego białka
tau. P raw dopodobnie w odpow iedzi na ich pojawienie się
w kom órce w zrasta poziom aB-krystaliny i Hsp27 [17]. Biał­
ka te obecne są rów nież w agregatach am yloidu p, co może
sugerow ać, że sH sps zapobiegają pow staw aniu płytek star­
czych. Potw ierdzają to dośw iadczenia in vitro, które w yka­
zały, że H sp27 ham uje agregację am yloidu p [50], Stege i
w sp. stw ierdzili, że aB-krystaliny rów nież opóźnia pow sta­
w anie w łókien am yloidu p i jednocześnie pow oduje w zrost
neurotoksyczności [51]. Z danych tych w ynika, że toksycz­
ną form ą są kom pleksy sH sps-am yloid p, które nie tw orzą
włókien, a nadprodukcja sH sps nie zaw sze m oże być ko­
rzystna dla komórki. W ilhelm us i wsp. w ykazali obecność
dodatkow ych sH sps w płytkach starczych: Hsp20, HspB2
i Hsp22 [52], Stw ierdzono ponadto, że Hsp22 zapobiega
śmierci kom órek wywołanej obecnością zm utow anej formy
am yloidu P(E22Q), występującej u pacjentów z dziedzicz­
nym krw otokiem m ózgow ym z am yloidozą (odm iana ho­
lenderska, ang. hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis-Dutch type - HCHWA-D) [52,53], A utorzy przypuszczają,
że Hsp22 zapobiega tw orzeniu arkuszy p w am yloidzie p
(E22Q) ułatwiających agregację am yloidu. Hsp22 nie w yka­
zuje podobnej aktyw ności w stosunku do am yloidu p.
W ew nątrzkom órkow e agregaty białek powstają w p rzy ­
p ad k u chorób poliglutam inow ych, m. in. choroby H u n ­
tingtona. Przyczyną tych schorzeń jest zw ielokrotnienie
liczby pow tórzeń kodonu CAG, kodującego glutam inę w
genach odpow iednich białek [49], Liczne badania p rzepro­
w adzone, m in. na m odelow ych organizmach: drożdżach i
Caenorhabditis elegans wykazały, że zależne od ATP systemy
białek opiekuńczych H sp 7 0 / Hsp40 i HsplOO zapobiega­
ją agregacji nad pro d u ko w an y ch pep ty d ów poliQ [54,55],
Spośród badanych do tej pory sH sps człowieka, podobną
funkcję pełni tylko Hsp22. W hodow lach kom órek człowie­
ka Hsp22 ham uje pow staw anie agregatów Htt43Q - N-końcowej części h untingtyny z sekwencją 43 reszt glutam iny
oraz AR65Q receptora androgennego z 65 resztam i gluta­
m iny [56]. A utorzy sugerują, że Hsp22 utrzym uje Htt43Q
w formie rozpuszczalnej, umożliwiającej szybką degradację
p ep ty d u przez proteasom . W yttenbach i wsp. wykazali, że
Hsp27 nie zapobiega agregacji poliQ, ale ham uje śmierć ko­
m órek in d uk o w an ą poliQ [57], W iadom o, że huntingtyna
ze zw iększona ilością reszt glutam iny pow oduje po d w y ż­
szenie reaktyw nych form tlenu, które są przyczyną śmierci
neu ro n ó w [58], O chronne działanie Hsp27 polegałoby na
obniżaniu poziom u reaktyw nych form tlenu i ham ow aniu
apoptozy. sH sps m ogą działać podobnie w p rzyp ad ku in­
nych chorób neurodegeneracyjnych. Coraz więcej danych
wskazuje, że za ich rozwój odpow iedzialny jest stres ok­
sydacyjny i w zrost poziom u reaktyw nych form tlenu. W
istocie czarnej chorych na chorobę Parkinsona stw ierdzono
obniżenie poziom u zredukow anego glutationu, obecność
p ro d u k tó w peroksydacji lipidów i 8-hydroksyguanozynę,
która powstaje w w yniku oksydacyjnego uszkodzenia DNA
[58]. W korze mózgowej u pacjentów z chorobą Parkinsona
n a d p ro d u k o w a n e są Hsp27 i aB-krystalina [59], W ykazano,
że aB-krystalina m oże zapobiegać agregacji białek, głów ­
23
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
nie a-synukleiny, tworzących ciała Lewy'ego towarzyszące
chorobie Parkinsona. Braak i wsp. wykazali, że w w iększo­
ści neuronów kresom ózgowia, w których w ykryto aB-krystalinę nie pow staw ały ciała Lewy'ego [60]. N atom iast w
neuronach zawierających ciała Lewy'ego nie stw ierdzono
obecności aB-krystaliny.
Danych na tem at potencjalnej roli sH sps w chorobach
prionow ych jest niewiele. Podw yższony poziom aB-kry­
staliny stw ierdzono w neuronach u pacjentów z chorobą
Creutzfeldta-Jakoba [17]. Sun i wsp. wykazali in vivo i in
vitro oddziaływ ania aB-krystaliny z kom órkow ą izoformą
białka prionu u krów PrPc (ang. cellular). A utorzy sugeru­
ją, że sH sps m ogą chronić PrPc przed zm ianą konform a­
cji, która prow adzi do pow stania patologicznej izoformy
PrPd (ang. disease), łatwo ulegającej agregacji i w yw ołują­
cej pasażow alną encefalopatię gąbczastą [61]. Hsp27 i aBkrystalina pojawiają się rów nież w e w łóknach Rosenthala
- agregatach zawierających kw aśne białko włókienkow e
gleju (GFAP). W łókna Rosenthala powstają w astrocytach
uszkodzonej istoty białej m ózgu u pacjentów z chorobą
Alexandra. Przypuszcza się, że fizjologiczną funkcją sHsps
w astrocytach jest kontrola organizacji filamentów pośred­
nich zb udow anych z kw aśnego białka włókienkow ego gle­
ju (GFAP) [62] oraz ochrona kom órek w w arunkach stre­
sowych. U nieruchom ione sHsps w e w łóknach Rosenthala
ham ow ałoby antyapoptotyczną aktyw ność tych białek. Po­
dobny efekt m oże pow odow ać wiązanie Hsp27 i Hsp70 do
zm utow anej dysm utazy ponadtlenkow ej (SOD1). Mutacje
w genie kodującym dysm utazę ponadtlenkow ą są przyczy­
ną niektórych przypadków rodzinnej formy stw ardnienia
zanikow ego bocznego, związanego ze zw yrodnieniem n e u ­
ronów ruchow ych [63]. aB-KryStalina rów nież rozpoznaje
i wiąże zm u to w an ą dysm utazę ponadtlenkow ą [64]. Pod­
w yższony poziom tego białka stw ierdzono w astrocytach
i oligodendrocytach u chorych na stw ardnienie rozsiane,
które jest chorobą o podłożu autoim m unologicznym [17].
aB-krystalina jest głów nym autoantygenem osłonki mielinowej. Stw ierdzono również, że miejsce prom otorow e genu
CRY AB charakteryzuje się polimorfizmem, a rodzaj allelu
decyduje o przebiegu choroby [65].
PODSUMOWANIE
Badania ostatnich kilku lat dostarczają coraz więcej infor­
macji o strukturze i złożonej roli sH sps w ochronie organi­
zm ów przed stresem. sH sps wiążą uszkodzone polipeptydy, zapobiegając ich nieodwracalnej denaturacji. U w olnie­
nie zw iązanych substratów jest m ożliwe dzięki aktywności
zależnych od ATP białek opiekuńczych. Jeżeli system białek
opiekuńczych nie działa w ydajnie uszkodzone polipeptydy
ulegają nieodwracalnej agregacji. Tworzenie agregatów biał­
kow ych zawierających sH sps jest w spólną cechą w ielu cho­
rób neurodegeneracyjnych. Z aburzenie funkcji sH sps przez
modyfikacje potranslacyjne lub mutacje m oże prow adzić
do rozw oju zaćmy, m iopatii lub neuropatii. Z jednej strony
sH sps chronią kom órkę przed niedokrw ieniem , skutkam i
szoku oksydacyjnego i apoptozą. Z drugiej strony, nieko­
rzystnym skutkiem indukow anej przez stres nadprodukcji
sH sps jest ham ow anie apoptozy, ułatwiające transformację
now otw orow ą. Mimo, że procesy te nie są jeszcze w pełni
poznane, m ożliwe jest opracow yw anie m etod diagnostycz­
nych i strategii terapeutycznych, których celem są sHsps.
PIŚMIENNICTWO
1. Mayer MP, Bukau B (2005) Hsp70 chaperones: cellular function and
molecular mechanism. Cell Mol Life Sci 62:670-684
2. Haslbeck M, Franzm ann T, W einfurtner D, Buchner J (2005) Some like
it hot: the structure and function of sm all heat-shock proteins. N ature
Struct Mol Biol 12: 842-846
3. Kędzierska S (2005) Rola białek opiekuńczych Escherichia coli w ochro­
nie kom órki bakteryjnej przed nieodw racalną agregacją białek in d u ­
kow aną termicznie. Postępy Biochem 51:146-153
4. M atuszew ska M, Kuczyńska-W iśnik D, Laskowska E, Liberek K
(2005) The small heat shock protein IbpA of E. coli cooperates w ith
IbpB in stabilization of therm ally aggregated proteins in a disaggrega­
tion com petent state. J Biol Chem 280:12292-12298
5. K uczyńska-W iśnik D, K ędzierska S, M a tu sz ew sk a E, L u n d P,
T aylor A, L ipińska B, L askow ska E (2002) The Escherichia coli small
heat-shock proteins IbpA and IbpB prevent the aggregation of endog­
enous proteins denatured in vivo d uring extrem e heat shock. Microbi­
ology 148:1757-1765
6. N arberhaus F (2002) a-Crystallin-type h eat shock proteins: socializing
m inichaperones in the context of a m ultichaperone N etw ork. Micro­
biol Mol Biol Rev 66: 64-93
7. Kim KK, Kim R, Kim SH (1998) Crystal structure of a small heat-shock
protein. N ature 394: 595-599
8. van M ontfort RLM, Basha E, Friedrich KL, Slingsby C, Vieriing E
(2001) Crystal structure and assem bly of a eukaryotic small heat shock
protein. N ature Struct Biol 8:1025-1030
9. K appe G, Franck E, Verschuure P, Boelens WC, Leunissen JAM, de
Jong WW (2003) The hum an genom e encodes 10 a-crystallin-related
small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones 8: 53-61
10. M ounier N, Arrigo A-P (2002) Actin cytoskeleton and small heat shock
proteins: how do they interact? Cell Stress Chaperones 7:167-176
11. Sugiyam a Y, Suzuki A, Kishikawa M, A kutsu R, Hirose T, W aye MMY,
Tsui SKW, Yoshidai S, O hno S (2000) Muscle develops a specific form
of sm all heat shock protein complex com posed of MKBP/HSPB2 and
FISPB3 during m yogenic differentiation. J Biol Chem 275:1095-1104
12. Fontaine J-M, Rest JS, W elsh MJ, Benndorf R (2003) The sperm outer
dense fiber protein is the 10th m em ber of the superfam ily of m am m a­
lian sm all stress proteins. Cell Stress Chaperones 8: 62-69
13. K ozawa O, M atsuno H, N iw a M, H atakeyam a D, Kato K, U em atsul T
(2001) a|3-crystallin, a low -m olecular-w eight heat shock protein, acts as
a regulator of platelet function. Cell Stress Chaperones 6: 21-28
14. C oncannon CG, G orm an AM, Samali A (2003) O n the role of Hsp27 in
regulating apoptosis. A poptosis 8: 61-70
15. A rrigo AP (1998) Small stress proteins: chaperones that act as regula­
tors of intracellular redox state and p rogram m ed cell death. Biol Chem
379:19-26
16. M erendino AM, Paul C, Vignola AM, Costa AM, Melis M, C hiappara
G, Izzo V, Bousquet J, Arrigo A-P (2002) H eat shock protein-27 prote­
cts hum an bronchial epithelial cells against oxidative stress-m ediated
apoptosis: possible implication in asthm a. Cell Stress Chaperones 7:
269-280
17. Sun Y, MacRae TM (2005) The small heat shock proteins and their role
in hum an disease. FEBS J 272: 2613-2627.
18. Golenhofen N, Pem g MD, Q uinlan RA, D renckhahn D (2004) Com ­
parison of the small heat shock proteins alphaB-crystallin, MKBP,
HSP25, HSP20, and cvHSP in heart and skeletal muscle. Histochem
Cell Biol 122:415-25
19. M orrison LE, W hittaker RJ, Klepper RE, W aw rousek EF, Glembotski
CC (2004) Roles for aB-crystallin and HspB2 in protecting the m yo­
cardium from ischem ia-reperfusion-induced dam age in a KO m ouse
model. A m J Physiol H eart Circ Physiol 286: H847-H855
20. Ciocca AR, Calderw ood SK (2005) H eat shock proteins in cancer: diag­
nostic, prognostic, predictive, and treatm ent implications. Cell Stress
Chaperones 10: 86-103
21. H orw itz J (2003) Alfa-crystallin. Exp Eye Res 76:145-153
24
w w w .postępy biochem ii .pi
http://rcin.org.pl
22. Cobb BA, Petrash JM (2000). Characterization of alpha-crystallin-plasma m em brane binding. J Biol Chem 275: 6664-6672
of aggresom es by the m uypathy-causing R120G alphaB-crystallin m u­
tant. H u m Mol G enet 12:1609-1620
23. Rajaraman K, Ram an B, Ram akrishna T, M ohan Rao Ch (2001). Inte­
raction of hum an recom binant aA- and rtB-crystallins w ith early and
late unfolding interm ediates of citrate synthase on its therm al denaturation. FEBS Lett 497:118-123
44. Evgrafov OV, M ersiyanova I, Irobi J, Van D en Bosch L, Dierick I, Leu­
n g CL, Schagina O, V erpoorten N, Van Im pe K, Fedotov V, Dadali E,
A uer-G rum bach M, W indpassinger C, W agner K, Mitrovic Z, HiltonJones D, Talbot K, M artin J-J, Vasserm an N, Tverskaya S, Polyakov A,
Liem RKH, Gettem ans J, Robberecht W, De Jonghe P, T im m erm an V
(2004) M utant sm all heat-shock protein 27 causes axonal Charcot-Marie-Tooth disease and distal hereditary m otor neuropathy. N at Genet
36: 602-606
24. Reddy GB, Das KP, Petrash JM, Surewicz WK (2000) Tem peraturedependent chaperone activity and structural properties of hum an alphaA- and alphaB-crystallins. J Biol Chem 275: 4565-4570
25. H oehenw arter W, Klose J, Jungblut PR (2006) Eye lens proteomics.
Amino Acids 30:369-389
26. Francis PJ, Berry V, Moore AT, Bhattacharya S (1999) Lens biology.
D evelopm ent and hum an cataractogenesis. Trends G enet 15:191-196
27. H orw itz J (1992) A lpha-crystallin can function as a m olecular chapero­
ne. Proc Natl Acad Sci USA 89:10449-10453
28. Pigaga V, Q uinlan RA (2006) Lenticular chaperones suppress the ag­
gregation of the cataract-causing m utant T5P yC-crystallin. Exp Cell
Res 312: 51-62
29. Brady JP, G arland D, Douglas-Tabor Y, Robinson G Jr, Groom e A,
W aw rousek EF (1997) Targeted disruption of the m ouse alfa A-crystallin gene induces cataract and cytoplasmic inclusion bodies containing
the sm all heat shock protein alfa B-crystallin. Proc N at Acad Sci USA
94: 884-889
30. Litt M, Kram er P, LaMorticella DM, M urphey W, Lovrien EW, Weleber RG (1998) A utosom al dom inant congenital cataract associated
w ith a m issence m utation in the hum an alpha crystallin gene CRYAA.
H um Mol Genet 7: 471-474
31. Berry V, Francis P, Reddy MA, Collyer D,Vithana E, MacKay I, D aw ­
son G, Carey AH, Moore A, Bhattacharya SS, Q uinlan RA (2001) Alpha-B crystallin gene (CRYAB) m utation causes dom inant congenital
posterior polar cataract in hum ans. A m J H um G enet 69:1141-1145
32. Liu Y, Z hang X, Luo L, W u M, Zeng R, Cheng G, H u B, Liu B, Liang
JJ, Shang F (2006) A novel alphaB-crystallin m utation associated w ith
autosom al dom inant congenital lam ellar cataract. Invest O phthalm ol
Vis Sci 47:1069-75
33. Clark JI, M uchowski PJ (2000) Small heat-shock proteins and their po­
tential role in hum an disease. C urr O pin Struct Biol 10: 52-59
34. H arding JJ (2001) Can drugs or m icronutrients prevent cataract? Drugs
Aging 18: 473-486
35. Crabbe MJC, H epbum e-Scott HW (2001) Small heat shock proteins
(sHsp) as potential d ru g targets. C urr Pharm Biotechnol 2: 77-111
36. Brady JP, G arland D, G reen DE, Tam m ER, Giblin FJ, W aw rousek EF
(2001) Alfa B-crystallin in lens developm ent and m uscle integrity: a
gene knockout approach. Invest O phtalm ol Vis Sci 42: 2924-2934
37. Vicart P, Caron A, Guicheney P, Li Z, Prevost M-C, Faure A, Chateau
D, C hapón F, Tomé F, D upret J-M, Paulin D, Fardeau M (1998) A missense m utation in the aB-crystallin gene causing a desm in - related
m yopathy. N ature Genet 20: 92-95
38. K um arapeli ARK, W ang X (2004) Genetic m odification of the heart:
chaperones and the cytoskeleton. J Mol Cell Cardiol 37:1097-1109
39. Selcen D, Engel AG (2003) Myofibrillar m yopathy caused by novel do­
m inant negative aB-crystallin m utations. A nn N eurol 54: 804-810
40. Bova MP, Yaron O, H uang Q, Ding L, Haley DA, Stew art PL, H orw itz
J (1999) M utation R120G in aB-crystallin, which is linked to a desm inrelated m yopathy, results in an irregular structure and defective chaperone-like function. Proc Natl Acad Sci USA 96: 6137-6142
41. P em g MD, M uchowski PJ, van den Ijssel P, W u JSG, H utcheson AM,
C lark JI, Q uinlan RA (1999) The cardiom yopathy and lens cataract
m utation in aB-crystallin alters its protein structure, chaperon activity
and interaction w ith interm ediate filaments in vitro. J Biol Chem 274:
33235-33243
42. Ito H, Kamei K, Iw am oto I, Inagum a Y, Tsuzuki M, Kishikawa M, Shim ada A, H osokaw a M, Kato K (2003) Hsp27 supresses the form ation
of inclusion bodies induced by expression of R120G a-crystallin, a cau­
se of desm in-related m yopathy. Cell Mol Life Sci 60:1217-1223
43. Chávez-Zobel AT, Lorangel A, M arceau N, Theriault JR, Lam bert H,
L andry J (2003) Distinct chaperone mechanisms can delay form ation
45. Irobi J, Van Im pe K, Seeman P, Jordanova A, Dierick I, V erpoorten N,
M ichalik A, De Vriendt E, Jacobs A, Van G erw en V, Vennekens K, Mazanec R, T oum ev I, Hilton-Jones D, Talbot K, Kremensky I, Van Den
Bosch L, Robberecht W, V andekerckhove J, Van Broeckhoven C, Get­
tem ans J, De Jonghe P, Tim m erm an V (2004) H ot-spot residue in small
heat-shock protein 22 causes distal m otor neuropathy. N at Genet 36:
597-601
46. Tang B-S, Zhao G-H, Luo W, Xia K, Cai F, Pan Q, Z hang R-X, Z hang
F-F, Liu X-M, Chen B, Z hang C, Shen L, Jiang H, Long Z-G, Dai H-P
(2005) Small heat-shock protein 22 m utated in autosom al dom inant
Charcot-M arie-Tooth disease type 2L. H um Genet 116: 222-224
47. Kijima K, N um akura C, Goto T, Takahashi T, Otagiri T, U m etsu K,
H ayasaka K (2005) Small heat shock protein 27 m utation in a Japanese
patient w ith distal hereditary m otor neuropathy. J H um Genet 50:473476
48. Tang B, Liu X, Zhao G, Luo W, Xia K, Pan Q, Cai F, H u Z, Z hang C,
Chen B, Zhang F, Shen L, Z hang R, Jiang H (2005) M utation analysis of
the small heat shock protein 27 gene in Chinese patients w ith CharcotMarie-Tooth disease. Arch N eurol 61:1201-1207
49. Bąk D, Milewski M (2005) Choroby zw iązane z agregacją białek.
Postępy Biochem 51: 297-307
50. K udva YC, H iddinga HJ, Butler PC, M ueske CS, Eberhardt NL (1997)
Small heat shock proteins inhibit in vitro A p ^ , amyloidogenesis. FEBS
Lett 416:117-121
51. Stege GJJ, Renkawek K, O verkam p PSG, V ersschuure P, van Rijk AF,
Reijnen-Aalbers A, Boelens WC, Bosman GJCGM, de Jong WW (1999)
The m olecular chaperone aB-crystallin enhances am yloid p neurotoxi­
city. Biochem Biophys Res C om m un 262:152-156
52. W ilhelm us MMM, Boelens WC, Otte-H oller I, Kamps B, Kusters B,
Maat-Schieman MLC, de Wall RMW, Verbeek MM (2006) Small heat
shock protein HspB8: its distribution in A lzheim er's disease brains
and its inhibition of am yloid-p protein aggregation and cerebrovascu­
lar am yloid-p toxicity. Acta N europathol 111: 139-149
53. Bornebroek M, H aan J, M aat-Schieman ML, Van D uinen SG, Roos RA
(1996) H ereditary cerebral hem orrhage w ith amyloidosis-Dutch type
(HCHWA-D): I--A review of clinical, radiologic and genetic aspects.
Brain Pathol 6:111-114
54. N ollen EAA, Garcia SM, van H aaften G, Kim S, Chavez A, M orim oto
RI, Plasterk RHA (2004) G enom e-w ide RNA interference screen iden­
tifies previously undescribed regulators of polyglutam ine aggrega­
tion. Proc Natl Acad Sci USA 101: 6403-6408
55. Leźnicki P (2005) Agregacja a toksyczność białek z pow tórzeniam i polyQ. Postępy Biochem 51: 215-222
56. C arra S, Sivilotti M, Chavez Zobel AT, Lam bert H, Landry J (2005)
HspB8, a small heat shock protein m utated in hum an neurom uscular
disorders, has in vivo chaperone activity in cultured cells. H um Mol
Genet 14:1659-1669
57. W yttenbach A, Sauvageot O, Carmichael J, Diaz-Latoud C, Arrigo AP,
Rubinsztein DC (2002) H eat shock protein 27 prevents cellular poly­
glutam ine toxicity and suppresses the increase of reactive oxygen spe­
cies caused by huntingtin. H um Mol Genet 11:1137-1151
58. Pong K (2003) Oxidative stress in neurodegenerative diseases: thera­
peutic im plications for superoxide dism utase mimetics. Expert Opin
Biol Ther 3:127-139
59. R enkaw ek K, Stege GJ, Bosman GJ (1999) Dementia, gliosis and ex­
pression of the sm all h eat shock proteins H sp27 i aB-crystallin in Par­
kinson's disease. N euroreport 10: 2273-2276
25
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
60. Braak H, Del Tredici K, Sandm ann-Kiel D, Rub U, Schultz C (2001)
Nerve cells expressing heat-shock proteins in Parkinson's disease.
Acta N europathol (Berl) 102:449-54
61. Sun G, G uo M, Shen A, Mei F, Peng X, Gong R, G uo D, W u J, Tien P,
Xiao G (2005) Bovine P rP directly interacts w ith alphaB-crystalline.
FEBS Lett 579: 5419-5124
62. M ignot C, Boespflug-Tanguy O, Gelot A, D autigny A, Pham -D inh D,
Rodriguez G (2004) Alexander disease: putative m echanism s of an as­
trocytic encephalopathy. Cell Mol Life Sci 61: 369-385
63. Okado - M atsum oto A, Fridovich I (2002) A m yotrophic lateral sclero­
sis: a p roposed m echanism. Proc N atl Acad Sci USA 99: 9010-9014
64. Shinder GA, Lacourse MC, Minotti S, D urham H D (2001) M utant C u /
Zn-superoxide dism utase proteins have altered solubility an d interact
w ith heat shock/stress proteins in m odels of am yotrophic lateral scle­
rosis. J Biol Chem 276:12791-12796
65. van Veen T, van W insen L, Crusius JB, Kalkers NF, Barkhof F, Pena
AS, Polm an CH, U itdehaag BM (2003) aB-crystallin genotype has im ­
pact on the m ultiple sclerosis phenotype. N eurology 61:1245-1249
small heat shock protein family, binds and activates the myotonic d ys­
trophy protein kinase. J Cell Biol 140:1113-1124
67. Krief S, Faivre JF, Robert P, Le D ouarin B, Brum ent-Larignon N, Lefrere I, Bouzyk MM, A nderson KM, Greller LD, Tobin FL, Souchet M,
Bril A (1999) Identification and characterization of cvHsp. A novel h u ­
m an small stress protein selectively expressed in cardiovascular and
insulin-sensitive tissues. J Biol Chem 274: 36592-36600
68. Chow dary TK, Ram an B, R am akrishna T, Rao CM (2004) M am m alian
Hsp22 is a heat-inducible sm all heat-shock protein w ith chaperone­
like activity. Biochem J 381: 379-387
69. de Wit NJ, V erschuure P, K appe G, King SM, de Jong WW, van Muijen
GN, Boelens WC (2004) Testis-specific hu m an small heat shock protein
HSPB9 is a cancer/testis antigen, and potentially interacts w ith the dynein subunit TCTEL1. Eur J Cell Biol 83: 337-345
70. Bhullar B, Z hang Y, Junco A, Oko R, van der H oorn FA (2003) Associa­
tion of kinesin light chain w ith outer dense fibers in a m icrotubule-in­
dependent fashion. J Biol C hem 278:16159-16168
66. Suzuki A, Sugiyam a Y, Hayashi Y, Nyu-i M, Yoshida M, N anaka I,
Ishiura S, A rahata K, O hno S (1998) MKBP, a novel m em ber of the
Small heat shock proteins - role in apoptosis, cancerogenesis
and diseases associated w ith protein aggregation
Ewa Laskowska
D epartm ent of Biochem istry, U niversity of G dańsk, 24 Kładki St., 80-952 G dańsk, Poland
e-mail: lasko@ biotech.univ.gda.pi
Key words: a-crystallin, m olecular chaperones, n e urodegenerative diseases, protein aggregation, sm all heat shock proteins
ABSTRACT
Small heat shock proteins (sHsps) belong to molecular chaperones, w hich protect prokaryotic and eukaryotic cells against deleterious effects
of stress. sH sps prevent stress induced, irreversible aggregation of damaged proteins and facilitate renaturation of bound substrates coop­
erating w ith other molecular chaperones. This review summarizes recent studies focused m ainly on the involvem ent of sH sps in diseases
related to protein aggregation. sH sps are often a com ponent of protein aggregates form ing during progress o f neurodegenerative disorders.
Mutation in sH sps genes have been identified, w h ich are responsible for developm ent of cataract, desm in related myopathy and neuropathies.
sH sps protect cells against oxidative stress resulting from ischem ia/reperfusion during heart or brain stroke. Several studies indicate that
sHsp participate in regulation of apoptosis and are involved in cancerogenesis. Uncovering the sH sps role in diseases enable to develop n ew
therapeutic strategies.
26
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
Charakterystyka białek z rodziny HtrA
STRESZCZENIE
Dorota Żurawa-Janicka
iałk a H trA tw orzą ro d z in ę zachow anych w ew olucji proteaz serynow ych, będących hom ologam i b iałk a H trA z m odelow ej b ak terii Escherichia coli. Są szeroko ro zp o w szech ­
n io n e zaró w n o w śró d o rganizm ów prokario ty czn y ch jak i eukariotycznych. S tan o w ią lin ię
o b ro n y kom ó rek b a k te ry jn y ch przed sk u tk a m i stresów pow odujących u sz k o d z e n ia stru k ­
tu ry b iałe k , np. stresu term icznego i oksydacyjnego. D otychczas z id e n ty fik o w an o cztery
hom o lo g i H trA człow ieka, k tóre uczestniczą nie ty lk o w o d p o w ie d zi na stres, ale też w reg u ­
lacji w z ro stu i ró żn ico w an ia k om órek oraz in d u k cji apoptozy, a z a b u rz en ia w ich p ra w id ło ­
w ym d z ia ła n iu m ogą p row adzić do ro zw o ju procesu now otw orow ego i chorób artretycznych
oraz neu ro d eg en eracy jn y ch . N in iejszy arty k u ł p rzeg ląd o w y p o d su m o w u je dotychczasow ą
w ie d zę na tem at b iałe k z ro d z in y H trA , ich stru k tu ry , regulacji i fu n k c ji, ze szczególnym
u w z g lę d n ie n ie m b iałe k człow ieka. P rzed staw ia ró w n ież p raktyczne z asto so w an ie b a d ań
n ad b iałk a m i z ro d z in y H trA oraz p e rsp e k ty w y ich w y k o rzy stan ia w przyszłości.
B
Joanna Narkiewicz
Barbara Lipińska
K atedra Biochemii, Instytut Biologii, U niw er­
sytet G dański, G dańsk
"Katedra Biochemii, In sty tu t Biologii, U niw er­
sytet G dański, ul. Kładki 24, 80-822 G dańsk;
e-mail: zuraw a@ biotech.univ.gda.pl,
tel.: (058) 523 63 85
WPROWADZENIE
N a poziom ie m olekularnym o d pow iedź kom órki na stres wiąże się z in d u k ­
cją syntezy białek należących do rodziny białek szoku term icznego (hsp, ang.
heat shock proteins). Do białek hsp zalicza się białka opiekuńcze oraz proteazy.
Pierw sze z nich uczestniczą w p raw idłow ym zwijaniu białek now osyntetyzow anych i refałdow aniu białek niepraw idłow o zwiniętych, drugie degradują białka
nieodw racalnie uszkodzone, zapobiegając tw orzeniu w kom órce toksycznych
agregatów i dostarczając am inokw asów dla syntezy białek de novo.
Białko H trA , zidentyfikow ane po raz pierw szy u gramujemnej bakterii Escheri­
chia coli, należy do gru p y proteaz szoku termicznego. H trA E. coli jest proteazą
serynow ą, zlokalizow aną w przestrzeni periplazm atycznej, gdzie uczestniczy
w degradacji nieodw racalnie uszkodzonych białek pojawiających się na skutek
działania czynników stresowych, takich jak tem peratura podw yższona ponad
w artość fizjologiczną, zm iana pH, obecność czynników utleniających czy re d u ­
kujących. Istnieją prace sugerujące, iż obok aktywności proteolitycznej H trA
w ykazuje właściwości opiekuńcze. Z aproponow ano hipotezę, że w niskich tem ­
p eraturach aktyw ność proteolityczna H trA zostaje zastąpiona przez aktyw ność
opiekuńczą wobec białek niepraw idłow o zw iniętych [1].
A rtykuł otrzym ano 12 m aja 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 15 w rześnia 2006 r.
Słowa kluczowe: białka szoku term icznego,
białko H trA Escherichia coli, białka H trA czło­
w ieka, proteazy serynow e
W ykaz skrótów: BSA (ang. bovine serum al­
bumin) - album ina surow icy bydlęcej; £. coli
- Escherichia coli; H u m H trA - białko H trA
człow ieka; IAP (ang. inhibitor of apoptosis pro­
teins) - białka inhibitorow e apoptozy; IL (ang.
interleukin) - interleukina; MBP (ang. maltose
binding protein) - białko w iążące m altozę; PDZ
(ang. PSD95, Dig, Z O l) - dom ena w ystępująca
m. in. w białkach PSD95, Dig, Z O l; TNF (ang.
tumor necrosis factor) - czynnik m artw icy now o­
tw oru
Podziękowania: Praca pow stała podczas
realizacji projektu badaw czego KBN 1074/
P 0 4/2004/26 oraz została dofinansow ana ze
środków B adań W łasnych UG 1460-5-0348-6
Do tej pory zidentyfikow ano około 180 hom ologów białka H trA E. coli, za­
ró w n o w śród organizm ów prokariotycznych jak i eukariotycznych, począw szy
od proteobakterii, poprzez cyjanobakterie, drożdże, rośliny, aż po ssaki. Białka
H trA tw orzą rodzinę zachow anych w ewolucji białek będących, poza nieliczny­
mi w yjątkam i, endoproteazam i serynow ym i o aktywności niezależnej od ATP.
N ależą do subklanu proteaz PA(S) i stanow ią część rodziny SI. Charakterystycz­
ną cechą struktury białek H trA jest obecność zachowanej w ewolucji dom eny
proteazow ej z triadą katalityczną reszt am inokw asow ych His-Asp-Ser i p rzy ­
najmniej jednej dom eny PDZ na końcu karboksylow ym (Ryc. 1). Kom órkow a
lokalizacja białek H trA zw iązana jest z przedziałam i pozacytoplazm atycznym i,
takim i jak periplazm a bakterii gram ujem nych czy błona kom órkow a bakterii
gram dodatnich. W kom órkach eukariotycznych homologiczne białka H trA zlo­
kalizow ane są w siateczce śródplazm atycznej, m itochondriach i chloroplastach,
bądź podlegają w ydzielaniu [2],
Bakterie pozbaw ione funkcjonalnego białka H trA charakteryzują się termow rażliw ością oraz obniżoną odpornością na stres, m iędzy innym i term iczny i
oksydacyjny. W p rzy p ad ku bakterii patogennych obserwuje się obniżoną zdol­
ność szczepów htrA do przeżyw ania w m akrofagach i tkankach zwierzęcych.
Pow yższe fakty skłoniły do w ykorzystania atenuow anych szczepów bakterii
pozbaw ionych genu htrA w konstrukcji szczepionek [1,3].
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
27
Dotychczas zidentyfikow ano u człowieka cztery homologi białka H trA E. coli, które pełnią istotne funkcje nie tylko
w odpow iedzi na stres, ale rów nież w regulacji w zrostu i
różnicow ania komórek, w procesach zw iązanych z indukcją
apoptozy, a zaburzenia ich funkcji w ydają się przyczyniać
do rozw oju chorób now otw orow ych, artretycznych i neurodegeneracyjnych [1].
CHARAKTERYSTYKA BIAŁKA HtrA
BAKTERII ESCHERICHIA COLI
Gen htrA (ang. high temperature requirement A) gram ujemnej bakterii Escherichia coli został zidentyfikow any jako
niezbędny dla w zrostu w tem peraturze powyżej 42°C [4],
Równolegle gen ten został zidentyfikow any jako zaangażo­
w any w degradację białek periplazm atycznych i n azw any
degP (ang. degradation of extracellular proteins) [5].
Gen htrA jest zlokalizowany w ok. 3.7 m inucie chrom o­
som u Escherichia coli. Bezpośrednim p ro du k tem genu jest
białko prekursorow e o masie cząsteczkowej 51 kDa, ulega­
jące modyfikacji potranslacyjnej, polegającej na usunięciu
p ep ty d u sygnałow ego obejmującego 26 reszt am inokw asow ych z końca aminowego. Dojrzałe białko H trA , zb u d o ­
w ane z 448 reszt am inokw asow ych, zlokalizow ane jest w
przestrzeni periplazm atycznej i jest białkiem peryferyjnym
błony w ew nętrznej. Składa się z dom eny proteolitycznej z
triadą katalityczną H is105, A sp |3S i Ser21Q/ charakterystyczną
dla proteaz serynowych, oraz dw óch dom en PDZ na koń­
cu karboksylow ym , które uczestniczą w oddziaływ aniach
białko-białko [6,7,8].
IGF
SS TM BP KI
HtrA (DegP)
E. coli
HhoA (DegQ)
E. coli
HhoB (DegS)
E. coli
HtrA
S. typhimurium
YkdA
B. subWIs
DegP1
A. tha liana
Nma111p
S. caraviaiae
Q9VFJ3
D. małanogastar
HtrA1 (PRS311)
H. aaplans
HtrA2 (Omi)
H. aaplans
HtrA3
H. aaplans
HtrA4
H. aaplans
CHARAKTERYSTYKA AKTYWNOŚCI
PROTEOLITYCZNEJ PROTEAZY HtrA
Białko H trA w ykazuje aktyw ność en do p ep ty d azy serynowej, której aktyw ność nie zależy od obecności ATP oraz
jonów d w u w artościow ych (Mg2+, M n2+, Z n2+) [9],
W śród substratów H trA znajdują się białka zdenaturow ane termicznie, takie jak syntaza cytrynianow a, d eh y­
drogenaza malonianow a; białka periplazm atyczne błędnie
zwinięte, takie jak MBP, PhoA i MalS; białka hybrydow e i
zrekom binow ane o niepraw idłow ej lokalizacji komórkowej,
m iędzy innym i TreF i O m pF [1], Co więcej, H trA nie d e­
graduje białek MalS, BSA i insuliny będących w natyw nej
konformacji [1],
D otychczas poznano jedynie d w a białka, które w for­
mie natyw nej stanow ią fizjologiczne substraty dla proteazy
H trA E. coli. Pierw szym białkiem jest acylow any prekursor
białka lizy kolicyny A (pCalm), lipoproteiny, która uczestni­
czy w w ydzielaniu kolicyny A przez kom órki E. coli niosące
plazm id ColA [10]. D rugim jest białko CpxP, będące elem en­
tem system u regulującego transkrypcję genów zw iązanych
z odpow iedzią na stres w obrębie otoczki kom órkowej [11].
G łów ną fizjologiczną funkcją H trA jest degradacja nie­
praw idłow ych białek pojawiających się w obrębie otoczki
kom órkowej w odpow iedzi na różne w arun k i stresowe.
W ykazano, że proteaza H trA jest odpow iedzialna za u s u ­
w anie termicznie zdenaturow anych białek kom órkow ych
[12]. Ponadto, w badaniach in vitro stw ierdzono, że w raz ze
w zrostem tem peratury aktyw ność proteolityczna H trA roś­
nie i osiąga m aksym alną w artość w przedziale 50-55°C, co
koreluje z częściowym rozluźnieniem stru k tu ry p rzestrzen ­
nej proteazy [8],
Domena
proteazy
PDZ
R ycin a 1. D o m e n y strukturalne białek z ro d zin y H trA. SS - sek w en cja sy g n a ło w a ; TM - d o m en a tran sbłonow a; IGF BP - d o m en a w ią żą c a in s u lin o w e czynn ik i w zro stu ;
KI - d o m e n a in h ib itorow a ty p u Kazał; PD Z - d o m en a u czestn iczą ca w o d d z ia ły w a n ia c h białko-białko.
28
w w w .postepybiochem ii .pi
http://rcin.org.pl
Domeny PDZ
R y cin a 2. M o d el b u d o w y przestrzennej białka H trA Escherichia coli na p o d s ta w ie struktury krystalicznej [17], D o m e n y p ro teo lity czn e trim erów tw orzą p o d s ta w y w e ­
w nętrzn ej k o m o ry , w której z lo k a lizo w a n e są m iejsca a k ty w n e p roteazy. W asocjacji trim erów u cze stn ic zą p ętle LA tw o rzą ce filary w o k ó ł k o m ory. D o m en y PD Z są w y ­
ek s p o n o w a n e na ze w n ą trz struktury i sta n o w ią jej ru ch o m e elem en ty. R ysu n ek p r ze d sta w ia strukturę h ek sam eryczn ą H trA w konform acji „otwartej", w której d o m en y
PD Z n ie blokują d o stę p u d o w ew n ętrzn ej kom ory. P o s z c z e g ó ln e m o n o m ery o zn a cz o n o o d m ie n n y m i koloram i. R y su n ek zo sta ł w y k o n a n y w oparciu o d a n e zaw a rte w
plik u p d b lK 9 Y d o stę p n y m w b azie d anych NCBI (w w w .n c b i.n ih .g o v ) z w y k o r zy sta n iem p rogram u RasTop.
H trA uczestniczy także w ochronie kom órki przed skut­
kami stresu oksydacyjnego indukow anego jonami Fe(II). W
obecności jonów Fe(II) komórki pozbaw ione funkcjonalne­
go białka H trA w ykazują zaham ow any w zrost, a poziom
utlenienia białek błonowych w kom órkach h trA jest w y ż­
szy w porów naniu ze szczepem dzikim [13], co wskazuje
na udział H trA w degradacji oksydacyjnie uszkodzonych
białek otoczki komórkowej.
AKTYWNOŚĆ OPIEKUŃCZA BIAŁKA HtrA
U w aża się, że białko H trA E. coli obok aktywności p ro­
teolitycznej w ykazuje aktyw ność opiekuńczą wobec białek
błędnie zwiniętych. Po raz pierw szy funkcja opiekuńcza
H trA została w ykazana dla periplazm atycznego białka
MalS, będącego elem entem regulonu m altozow ego E. coli.
Stw ierdzono, że H trA uczestniczy w procesie praw idłow e­
go fałdow ania MalS w tem peraturach poniżej 28°C, podczas
gdy w podw yższonej tem peraturze aktyw ne proteolitycznie
białko H trA degraduje błędnie zw inięte MalS [14]. W ykaza­
no rów nież, że aktyw ność proteolityczna H trA nie w pływ a
na właściwości opiekuńcze tego białka. N ieaktyw ne prote­
olitycznie H trA (HtrAS210) w ykazuje aktyw ność opiekuńczą
wobec błędnie zwiniętego MalS [14] oraz białka błony ze­
w nętrznej O m pC [15]. Ponadto nadprodukcja H trA S210 znosi
term ow rażliw y fenotyp m utantów pozbaw ionych peripla­
zm atycznego białka opiekuńczego Sur A [16]. N a podstaw ie
pow yższych faktów w ysunięto hipotezę o istnieniu m echa­
nizm u, który w zależności od tem peratury um ożliw ia prze­
łączanie aktywności proteolitycznej na opiekuńczą [14-17],
STRUKTURA PRZESTRZENNA HtrA
A REGULACJA AKTYWNOŚCI BIAŁKA
Poznanie struktury krystalicznej H trA E. coli przyczyni­
ło się do pełniejszego zrozum ienia m echanizm u działania
proteazy. H trA m oże tworzyć w komórce w w arunkach
fizjologicznych struktury oligomeryczne, od trim erów po
dodekam ery [18]. P odstaw ow ą funkcjonalną strukturą oligom eryczną H trA jest heksam er, utw orzony przez asocja­
cję dw óch trim erów [17] (Ryc. 2). Struktura trimeryczna o
kształcie przypom inającym lejek (ang. 'funnel-like shape') jest
stabilizow ana przez o ddziaływ ania reszt am inokw asow ych
dom en proteolitycznych m onom erów , natom iast dom eny
PDZ stanow ią jej elem enty ruchom e, w yeksponow ane na
zew nątrz struktury. Dw a trim ery są połączone głównie
dzięki pętlom LA, zlokalizow anym w częściach am inow ych
polipeptydów HtrA. Pętle LA przeciwległych trimerycznych pierścieni są owinięte w okół siebie tworząc filary w o ­
kół wew nętrznej kom ory, w której zlokalizow ane są centra
aktywne. D odatkow o struk tu ra heksam eryczna stabilizo­
w ana jest dzięki o ddziaływ aniu dom en PDZ należących do
naprzeciw ległych m onom erów (Ryc. 2). Ze w zględu na fakt,
iż H trA nie w ykorzystuje ATP podczas w iązania i uw alnia­
nia substratów uw aża się, że rola dom en PDZ jest w tym
procesie kluczowa. W zap rop o n ow an ym m odelu działania
H trA dom eny PDZ rozpoznają substraty, a dzięki swej ru ­
chliwości w yłapują je i translokują do centrów aktyw nych
[17].
Poznanie struktury krystalicznej H trA zaow ocowało za­
proponow aniem m odelu, w którym w zależności od tem pe­
ratury aktyw ność proteolityczna m oże ulegać przełączeniu
na opiekuńczą. Każda z pętli LA trim erycznego pierścienia
zw rócona jest w kierunku miejsca aktyw nego m onom eru
należącego do naprzeciw ległego pierścienia. Co więcej, o d­
działuje z pętlami LI i L2 tego m onom eru. U tw orzona w
ten sposób triada L1-L2-LA* ((*) oznacza pętlę należącą do
m onom eru naprzeciw ległego pierścienia) całkowicie bloku­
je dostęp do centrum aktyw nego. U w aża się, że w niskich
tem peraturach, gdy H trA w ykazuje aktyw ność opiekuńczą,
dom ena proteazow a przybiera konformację nieaktyw ną,
która w yklucza możliwość w iązania substratu i katalizę.
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
29
Podw yższenie tem peratury pow oduje zm iany konform acyjne prow adzące do ro zp ad u triady L1-L2-LA* i w łączenia
aktywności proteolitycznej [1,17].
REGULACJA EKSPRESJI GENU htrA Escherichia coli
Podw yższony poziom syntezy białka H trA o b serw u ­
je się w w arunkach stresu term icznego [6], oksydacyjnego
indukow anego jonami Fe(II) [13], w obecności czynników
redukujących [19], po podw yższeniu pH p o n ad w artość
fizjologiczną, w efekcie zaburzeń w składzie fosfolipidów
błonowych [20], oraz w kom órkach zawierających m u ta ­
cje w genach dsbA, dsbC, trxB (geny te zaangażow ane są w
tw orzenie m ostków disiarczkowych, a więc w form ow anie
struktury trzeciorzędowej białek) [21]. Sygnałem do in d u k ­
cji ekspresji genu htrA jest także nadprodukcja białek błony
zewnętrznej Om pC, OmpF, O m pT i OmpX [22], lipoproteiny błony zewnętrznej, NlpE oraz lipoproteiny błony w e ­
wnętrznej, YafY [23].
Podsum ow ując, w zm ożona ekspresja genu htrA jest efek­
tem pojawienia się w obrębie przestrzeni periplazm atycznej
i błon otoczki komórkowej białek o niepraw idłow ej konfor­
macji, a więc zdenaturow anych termicznie, uszkodzonych
oksydacyjnie, niepraw idłow o zwiniętych. Regulacja pozio­
m u H trA odbyw a się na poziomie transkrypcji i zachodzi z
udziałem czynnika transkrypcyjnego a 24. Regulacja ta zosta­
ła opisana szczegółowo w pracach przeglądow ych [24,25] i
z tego w zględu nie będzie tu przedstaw iana.
H O M O L O G I B IA Ł K A H trA E S C H E R IC H IA C O L I
Homologi białka H trA E. coli zostały zidentyfikow ane w
komórkach w ielu gatunków organizm ów , zarów no prokariotycznych jak i eukariotycznych, począw szy od proteobakterii, poprzez cyjanobakterie, aż po drożd że i człowieka.
W yróżnia się dw a rodzaje hom ologów H tr A /h tr A w zależ­
ności od ich gatunkowej przynależności oraz pochodzenia:
(1) paralogi - homologi zlokalizowane w obrębie tego sam e­
go genom u, pow stałe w w yniku duplikacji genu, np. htrA
(degP), degQ (hhoA), degS (hhoB) w genom ie E. coli; (2) ortologi - homologi w kom órkach różnych gatunków , pochodzące
od w spólnego ich przodka, np. geny htrA w kom órkach E.
coli i Salmonella typhimurium [3].
P R O K A R IO T Y C Z N E B IA Ł K A H trA
KOMÓRKOWE PARALOGI HTRA ESCHERICHIA COLI
Homologi htrA w komórce E. coli, degQ (hhoA) i degS
(hhoB) sąsiadujące ze sobą w genomie, leżą w znacznej o d ­
ległości od genu htrA i znajdują się pod kontrolą osobnych
prom otorów . Transkrypcja ich nie jest ind u k o w an a term icz­
nie i nie jest zależna od podjednostki a 24 [26]. DegQ i DegS
są serynow ym i endoproteazam i działającymi w przestrzeni
periplazmatycznej. Wyniki badań in vitro pokazały, iż H trA
oraz DegQ mają bardzo podobną specyficzność substrato­
w ą i degradują białka częściowo lub całkowicie zdenaturow ane [18]. N adprodukcja DegQ łagodzi skutki mutacji w
genie htrA, natom iast nadprodukcja DegS nie daje supresji
mutacji w genie htrA [26], Delecyjne m utanty degQS nie w y ­
kazują term ow rażliw ego fenotypu charakterystycznego dla
m utantów htrA. Białko DegS w w arunkach stresu pozacyto-
30
plazm atycznego inaktyw uje proteolitycznie białko RseA, co
w konsekwencji pow oduje indukcję ekspresji genów regulonu a 24, w tym genu htrA. W p odsum ow aniu, funkcje H trA
i DegQ częściowo się nakładają, podczas gdy funkcje H trA
i DegS są różne.
PROKARIOTYCZNE ORTOLOGI HtrA
Do tej pory ortologi H trA E. coli zidentyfikow ano u
wszystkich analizow anych organizm ów prokariotycznych.
Analiza porów naw cza sekwencji am inokw asow ych p o z w a ­
la przypuszczać, iż białka te pełnią funkcje proteolityczne.
U większości białek tej grupy zidentyfikow ano reszty aminokw asow e mogące tworzyć triadę katalityczną charaktery­
styczną dla centrum aktyw nego proteaz serynow ych. W y­
jątki stanow ią hom ologi H trA z kom órek Rickettsia tsutsugamusi, Rhizobium melitori, Azotobacter vinelandii, które mogą
pełnić inne, nieznane dotąd funkcje [3]. Mutacje w genach
htrA tw orzą grupę nakładających się fenotypów . N ależą do
nich: term ow rażliw ość oraz obniżona odporność na szok
oksydacyjny i osmotyczny. M utanty h tr A w ykazują obni­
żoną zdolność do przeżyw ania w m akrofagach i kom órkach
organizm ów zw ierząt laboratoryjnych.
W śród bakterii gram ujem nych najlepiej dotychczas p o­
znanym ortologiem H trA E. coli jest białko H trA bakterii
Salmonella typhimurium. H trA S. typhimurium jest w 88,7%
identyczne z białkiem E. coli i w ykazuje aktyw ność proteazy
serynowej. Prom otor genu htrA z S. typhimurium jest p o d o b ­
ny do prom otora htrA z E. coli odczytyw anego przez Ecr4,
ale m utanty pozbaw ione funkcjonalnego H trA nie są w ra ż ­
liwe na szok termiczny. Są natom iast w rażliw e na czynniki
utleniające, co czyni je podatnym i na zabijanie oksydatyw ne z udziałem m akrofagów i neutrofili. Ekspresja genu htrA
w yraźnie w zrasta po wniknięciu S. typhimurium do kom ó­
rek eukariotycznych, z m akrofagam i w łącznie [27],
P rodukty genów htrA z Brucella abortus i Klebsiella pneunoniae są także proteazam i serynow ym i. Ekspresja hom olo­
ga htrA u B. abortus jest, podobnie jak u E. coli, zależna od
szoku tem peraturow ego. Prom otor tego genu jest podobny
do prom otorów rozpoznaw anych przez a 24. Skutkiem bra­
ku H trA w kom órkach om aw ianych gatunków bakterii jest
zw iększona wrażliw ość na czynniki utleniające (H ,0,) oraz
obniżona wirulencja [28,29], Przypuszcza się, że pierw szorzęd o w y m m echanizm em eliminacji w ew n ątrzk o m ó rko ­
wej Brucella przez fagocyty gospodarza jest zabijanie oksydatyw ne. Biorąc pod uw agę fakt, że H trA jest elem entem
obrony przed skutkam i stresu oksydacyjnego, uw aża się, że
m oże odgryw ać istotną rolę w p rzetrw an iu kom órek Bru­
cella w fagosomach gospodarza. W p rz y p a d k u bakterii K.
pneumoniae w ykazano, że kom órki pozbaw ione białka H trA
w iążą więcej składnika C3 dopełniacza i są znacznie b ar­
dziej w rażliw e na zabijanie z udziałem białek dopełniacza
i fagocytozę [30],
Geny kodujące hom ologi H trA E. coli zidentyfikow ano
rów nież u bakterii gram dodatnich. Mutacje w genach htrA
większości bakterii g ram dodatnich pow odują w zrost w ra ż ­
liwości na podw yższoną tem peraturę oraz czynniki utlenia­
jące, a w niektórych p rzypadkach także na stres osm otyczny
i purom ycynę (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
Lactococcus lactis). Mutacja w genie htrA obniża wirulencję
bakterii patogennych m iędzy innym i z rodzajów Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, a w p rzyp ad ku bakterii
gatunku L. monocytogenes oraz niektórych szczepów S. pneumoniae całkowicie ją znosi. Stosując mysi m odel zapalenia
płuc i bakterem ii stw ierdzono, iż m utanty S. pneumoniae
htrA"są niezdolne do przeżycia w tkankach płuc i krwi, i nie
w yw ołują zapalenia płuc i bakterem ii u myszy, rów nież w
m niejszym stopniu indukują o dpow iedź zapalną mierzoną
poziom em IL-6 i TNFa niż bakterie H trA +. Białko H trA u w a ­
ża się za kluczow y czynnik wirulencji S. pneumoniae [31].
Proteaza H trA uczestniczy także w biogenezie białek
pozacytoplazm atycznych i pow staw aniu biofilmu. H trA ,,
Lactococcus lactis uczestniczy w dojrzew aniu białek sekrecyjnych oraz w degradacji białek niepraw idłow ych otoczki
kom órkowej [32]. Inaktywacja genu htrA L. monocytogenes
redukuje p ow staw anie biofilmu [33], natom iast inaktywacja
genu htrA Streptococcus mutans w p ły w a na poziom szeregu
białek pozakom órkow ych i pow ierzchniow ych enzym ów
glikolitycznych oraz zmienia morfologię biofilmu [34]. U
bakterii z g atu n ku Streptococcus pyogenes H trA jest białkiem
błonow ym i stanow i część unikalnej m ikrodom eny ExPortal, będącej elem entem błony komórkowej. ExPotral o dp o ­
w iada za biogenezę białek sekrecyjnych i koordynuje od ­
działyw ania pom iędzy niezw iniętym i polipeptydam i bia­
łek sekrecyjnych, a białkami opiekuńczym i zw iązanym i z
błoną kom órkow ą [35]. Mutacje w hom ologicznych genach
h trA p htrA , Staphylococcus aureus zaburzają ekspresję genów
kodujących czynniki wirulencji. Co więcej, białka H trA S.
aureus będące pow ierzchniow ym i proteazam i serynow ym i
w pływ ają na sekrecję szeregu białek, w tym należących do
czynników wirulencji hem olizyn [36].
W kom órkach gram dodatniej eubakterii Bacillus subtilis
zidentyfikow ano aż trzy potencjalne homologi htrA E. coli:
ykdA, yvtA, yycK, z których ykdA, yvtA ulegają p odw yższo­
nej ekspresji w w arunkach stresu termicznego oraz stresu
indu k ow an eg o nadprodukcją białek sekrecyjnych oraz ich
akum ulacją w obrębie otoczki komórkowej. Inaktywacja
jednego z genów rekom pensow ana jest przez zwiększenie
poziom u ekspresji drugiego, jednak dopiero inaktywacja
obu genów prow ad zi do term ow rażliw ego fenotypu. Bak­
terie B. subtilis htrA' w ykazują też obniżoną tolerancję na
H 20 2 [37],
HOMOLOGICZNE BIAŁKA HtrA
ORGANIZMÓW EUKARIOTYCZNYCH
Aż czternaście genów, kodujących białka spokrew nione z
białkiem H trA E. coli oraz jego paralogam i, zostało zidenty­
fikow anych w genomie gatunku Arabidopsis tlmliana. Białka
z tej rodziny zlokalizow ano głów nie w chloroplastach. Z a­
wierają w swej sekwencji katalityczną triadę złożoną z reszt
am inokw asow ych His-Asp-Ser, a część z nich także jedną
lub dw ie dom eny PDZ na końcu karboksylow ym [38], jed­
nak rola większości z nich nie została dotąd poznana. Pod­
w yższony poziom białka DegP2 w kom órkach A. thaliana
obserw uje się w w arunkach odw odnienia, zasolenia oraz
stresu św ietlnego. DegP2 degraduje w sposób zależny od
GTP uszk o d zo ne białko D l, będące centralnym elem entem
fotosystem u II, niezbędnym dla praw idłow ego transportu
elektronów [39].
H om ologi H trA E. coli zidentyfikow ano w komórkach
drożdży z gatunku Saccharomyces cereoisiae oraz Candida albicans. H om olog dro żdżow y N m a l l l p (ang. Nuclear
mediator of apoptosis) S. cerevisiae jest białkiem jądrow ym o
właściwościach proapoptotycznych. W w arunkach stresu
term icznego lub oksydacyjnego ( H A ) białko N m a l l l p
ulega agregacji, co prow adzi do kondensacji i fragmentacji
chrom atyny i w konsekwencji pow oduje śmierć kom órki na
drodze apoptozy [40].
Dotychczas zidentyfikow ano cztery homologi białka
H trA Escherichia coli występujące w organizm ie człowieka
hum H trA l(L 56, ORF480), hum H trA 2 (Orni), hum H trA 3,
hum H trA 4 [1], będące protezam i serynow ym i (Rys. 1). Biał­
ka H trA l i H trA 2 biorą udział w odpow iedzi na stres ter­
miczny, oksydacyjny, w regulacji w zrostu i różnicow ania
kom órek, apoptozie, a zaburzenia w ich funkcjonow aniu
m ogą przyczyniać się do rozw oju szeregu chorób, o czym
będzie m ow a w dalszej części prezentow anej pracy. Rola
hum H trA 3 i hum H trA 4 jak dotąd pozostaje najmniej pozna­
na. Ze w zględu na podobny w zór ekspresji genów H trA l i
HtrA3 w tkankach oraz podobieństw o strukturalne białek
H trA l i HtrA 3 sugeruje się, iż m ogą pełnić podobne i w za­
jemnie uzupełniające się funkcje. Podobnie jak H trA l, biał­
ko HtrA 3 w ykazuje aktyw ność proteolityczną wobec białek
z rodziny Tgf[3 (ang. Transforming growth factor), będących
czynnikam i regulującym i w zrost i różnicow anie komórek.
Podw yższony poziom ekspresji genu HtrA3 i białka HtrA3,
jaki obserw uje się w tkankach em brionalnych i łożysku w
pierw szym trym estrze ciąży, pozw ala przypuszczać, że
białko to pełni istotną rolę w rozw oju płodu i pow staw aniu
łożyska [41,42],
BIAŁKO H trA l CZŁOWIEKA (L56, ORF480, PRSS11)
Po raz pierw szy gen HtrA człowieka opisano w efek­
cie poszukiw ań genów biorących udział w odpow iedzi na
transform ację kom órek w irusam i onkogennym i. Stw ierdzo­
no w ówczas, iż jeden z genów o obniżonej ekspresji w fibroblastach człowieka transform ow anych SV40 koduje białko
w 36% identyczne z H trA Escherichia coli. Z identyfikow any
gen n azw ano genem HtrA człowieka [43].
Gen H trA l człowieka (h u m H trA l) zlokalizow any jest na
długim ram ieniu chrom osom u 10 (10q26.2) [44] i koduje
polipeptyd złożony z 480 reszt am inokw asow ych o masie
cząsteczkowej 50 kDa. W śród analizow anych gatunków
ssaków struk tu ra białka H trA l jest zachow ana w ew olu­
cji. N a poziom ie sekwencji reszt am inokw asow ych stopień
identyczności białek H trA l człowieka, krowy, św inki m or­
skiej, królika sięga niemal 98% [45].
U D Z IA Ł B IA Ł K A H t r A l W R O Z W O J U
CHO RÓ B N O W O T W O R O W Y C H
Obecnie H trA l uw aża się za białko supresorow e w roz­
woju no w o tw o ró w i potencjalny indykator progresji n o­
w otw orów . O bniżony poziom ekspresji genu hum H trAl
obserwuje się w kom órkach guzów w ęzłów chłonnych,
będących ogniskam i przerzutow ym i czerniaka, w stosunku
do pierw otnych kom órek ogniska skórnego tego now otw o­
ru. Stabilna ekspresja genu H trA l i nadprodukcja białka w
31
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
komórkach transfekow anych w ektorem niosącym p ra w id ­
łowy gen H trA l ham uje rozwój guza u m yszy [46]. O bni­
żenie poziom u ekspresji hum H trA l stw ierdzono rów nież w
kom órkach now otw oru jajnika, co jest skorelow ane z utratą
heterozygotyczności oraz hipermetylacją g enu [47],
Białko H trA l jest białkiem sekrecyjnym. O bok p eptyd u
sygnałowego na końcu am inow ym posiada dom enę ho­
mologiczną do białka Mac25, należącego do rod ziny białek
wiążących insulinow y czynnik w zrostu (IGF, ang. Insulin
Growth Factor) i zw iązanego z rozwojem szeregu n o w o tw o ­
rów, między innym i raka piersi. W obrębie sekwencji H trA l
znajduje się także m otyw inhibitora typu Kazał, który spo­
tyka się w białkach regulujących aktyw ność kom órkow ych
czynników w zrostu. Oka i wsp. wykazali, iż H trA l wiąże
i przeprow adza proteolizę białek z rodziny Tgf|3 (Bmp4,
Tgfpi, Tgf|32, akty winę, Gdf5), które biorą u d ział w reg u ­
lacji w zrostu i różnicow ania kom órek oraz produkcji białek
macierzy m iędzykom órkow ej [48]. Co więcej, odgryw ają
istotną rolę na różnych etapach kancerogenezy. Z jednej
strony pełnią rolę białek supresorow ych na w czesnych eta­
pach rozwoju procesu now otw orow ego a z drugiej strony,
stym ulują rozwój now otw oru w stadium zaaw anso w an y m
[49], H trA l dzięki aktywności proteolitycznej pełni rolę in­
hibitora wobec białek z rodziny Tgfp [48], M ożna więc p rz y ­
puszczać, iż H trA l poprzez udział w regulacji aktyw ności
czynników w zrostu może w yw ierać w pływ na funkcjono­
w anie białek zw iązanych z regulacją cyklu kom órkow ego,
czynników transkrypcyjnych, białek supresorow ych, i tym
sam ym m oże uczestniczyć w rozwoju procesów zw iąza­
nych z transformacją now otw orow ą.
dukują d u że ilości APP i wydzielają [3-am yloid, w ykazują
też w ysoki poziom syntezy H trA l. Stw ierdzono, że p ep ty dy
Ap40, Ap42 oraz peptyd C99, będący p ro d u k te m hydrolizy
APP, stanow ią substraty dla proteazy H trA l. Z ah am ow an ie
aktyw ności proteolitycznej H trA l pow oduje akum ulację
pozakom órkow ego p40. P rzypuszcza się, że p ro teaza H trA l
m oże pełnić kluczow ą rolę w kontroli poziom u P-am yloidu.
Proteoliza zapobiega akumulacji toksycznych agregatów i
tym sam ym przyczynia się do ham ow aniu rozw oju choroby
A lzheim era [52].
BIAŁKO HtrA2 CZŁOWIEKA (OMI)
D rugim znan y m hom ologiem białka bakteryjnego jest
hum H trA 2 (Orni). Gen HtrA2 człowieka (hum H trA 2) zloka­
lizow any jest na krótkim ram ieniu chrom osom u 2 (2pl3.1).
W obrębie genu znajduje się osiem eksonów , które kodują
polipeptyd, złożony z 458 reszt am inokw asow ych, o masie
cząsteczkowej około 50 kDa. N ależy jednak dodać, że w
procesie różnicow ego cięcia i składania m R N A m ogą p o ­
w stać aż cztery w arianty, których ekspresja jest specyficzna
tkankow o [2].
Podw yższony poziom HtrA 2 obserw uje się w w a ru n ­
kach stresu term icznego, a także po trak to w aniu kom órek
tunikam ycyną, która u ssaków indukuje stres w yw ołany
n iepraw idłow ą glikozylacją białek [53]. W w aru n k ach nie­
dotlenienia i reperfuzji, przy niezm ienionym poziom ie biał­
ka obserw uje się w zrost aktyw ności proteolitycznej H trA 2
w nerce, co sugeruje udział tego białka w o d p o w ied zi na
stres oksydacyjny [54],
ROLA HtrAl W ROZWOJU CHORÓB ARTRETYCZNYCH
FUNKCJA BIAŁKA HtrA2 W MECHANIZMACH
INDUKCJI APOPTOZY
Dzięki ham ow aniu sygnalizacji komórkow ej z udziałem
białek Tgfp oraz poprzez degradację elem entów macierzy
m iędzykom órkow ej, tkanki chrzęstnej, glikoprotein oraz
proteoglikanów (między innymi kolagenu ty p u II, fibromoduliny, fibronektyny), H trA l bierze udział w różnicow aniu
chondrocytów oraz praw idłow ych procesach kostnienia
[50]. Z drugiej strony, podw yższony poziom m R N A humH­
trAl oraz białka h u m H trA l [45] w tkance chrzęstnej u cho­
rych na osteoartretyzm pozw ala przypuszczać, że białko
h u m H trA l m oże uczestniczyć w degradacji chrząstki sta­
wowej i tym sam ym w p o w staw aniu zm ian patologicznych
w obrębie staw ów [50].
Białko H trA 2 pełni niezw ykle istotną rolę w in d u k o w a ­
niu apoptozy. Dojrzałe białko zlokalizow ane jest w p rz e ­
strzeni mitochondrialnej. W w arunkach indukow anej ap o ­
ptozy (pod w pływ em prom ieniow ana UV, stauro sp oryn y ,
niedotlenienia i reperfuzji) HtrA 2 ulega autoproteolizie, co
pow oduje odsłonięcie na końcu am inow ym białka m otyw u
AVPS (Ala-Val-Pro-Ser). M otyw ten jest charakterystyczny
dla białek o właściwościach p roapoptotycznych (Grim, H id,
Reaper, Smac/DIABLO) i um ożliw ia od działyw anie z biał­
kam i inhibitoram i apoptozy (IAP, ang. inhibitor of apoptosis
proteins). Białko H trA 2 z odsłoniętym m o ty w em AVPS ule­
ga translokacji do cytosolu, gdzie w iąże białka IAP i p rze­
p row ad za ich proteolizę, co z kolei pro w ad zi do aktywacji
kaspaz. W ykazano, że następujące białka z ro d zin y IAP sta­
now ią substraty dla proteazy HtrA2: CIAP1, CIAP2, XIAP,
liwiny a i [3 oraz DIAP [55,56].
ZWIĄZEK HtrAl Z ROZWOJEM CHOROBY ALZHEIMERA
Dotychczasowe w yniki bad ań pokazały zw iązek białka
H trA l z rozw ojem choroby Alzheimera, w przebiegu której
dochodzi do pow staw ania i akumulacji w m ózgu pozakom órkow ych złogów białkowych o właściw ościach neurotoksycznych. Złogi powstają w w yniku agregacji p-amyloidu, który jest generow any w efekcie hydrolizy w ielkoczą­
steczkowego białka prekursorow ego APP (ang. amyloid beta
A4 precursor protein) z udziałem sekretaz. Szlak amyloidotw órczy zależny od sekretaz P i y generuje p ep ty d y Ap40 i
Ap42, które w ykazują tendencję do tw orzenia agregatów i
są głów nym składnikiem złogów [51]. W ykorzystując linie
kom órkow e astrocytów w ykazano, iż białko H trA l uczest­
niczy w m etabolizmie P-amyloidu. A ktyw ne astrocyty p ro­
O bok białek IAP substratem proteazy H trA 2 jest cytosolowe białko o właściwościach antyapoptotycznych p e d /
peal5. Rola białka p e d /p e a l5 polega na blokow aniu syg­
nału apoptozy inicjowanego z udziałem receptorów błono­
w ych (Fas-R, TNF-R1) przez uniem ożliw ienie w ytw orzenia
kom pleksu białek inicjującego aktywację kaskad y kaspaz.
W w arun k ach indukow anej apoptozy H trA 2 w iąże białko
p e d /p e a l5 i przep ro w ad za jego proteolizę. N a d p ro d u k cja
białka p e d /p e a l5 zapobiega w iązaniu H trA 2 z XIAP i ak­
tywacji kaspazy 3. Sugeruje się, że zdolność H trA 2 do w ią­
32
w w w .postep ybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
zania białek z rodziny IAP m oże zależeć od relatyw nego
poziom u H trA 2 i białka p e d /p e a l5 [57],
Białko H trA 2 m a zdolność do indukow ania apoptozy nie
tylko na d ro d z e zależnej od kaspaz, lecz rów nież w o par­
ciu o aktyw ność proteazy serynowej. W ykazano, że mutacja
polegająca n a zam ianie reszty alaniny na glicynę w obrębie
m otyw u AVPS uniem ożliw ia oddziaływ anie białka HtrA2
z XIAP, ale nie znosi całkowicie jego proapoptotycznych
właściwości. D opiero białko HtrA 2 pozbaw ione alaniny
w obrębie w spom nianego m otyw u AVPS oraz właściw o­
ści proteolitycznych traci zdolność indukow ania apoptozy
[58,59,60],
Proteaza H trA 2 posiada rów nież zdolność w iązania i
proteolizy m itochondrialnego białka HAX-1 (ang. HSl-associated protein-1). Białko HAX-1 w ykazuje homologię do bia­
łek z rodziny Bcl-2 i posiada właściwości antyapoptotyczne. P rzypuszcza się, że bierze udział w regulacji potencjału
błonow ego m itochondrium i tym sam ym w pływ a na prze­
puszczalność błony dla białek ulegających translokacji do
cytosolu p odczas apoptozy. Do degradacji HAX-1 dochodzi
w e w czesnych etapach apoptozy, gdy HtrA 2 znajduje się
jeszcze w m ito ch o n driu m [61]. Co więcej, na przykładzie
neutrofilów człow ieka traktow anych TN Fa w ykazano, że
H trA 2 m oże indukow ać apoptozę nie ulegając przem iesz­
czeniu do cytosolu [62], Białko H trA 2 m oże zatem uczest­
niczyć w regulacji apoptozy zarów no na jej w czesnych eta­
pach, kiedy białko znajduje się jeszcze w m itochondrium ,
jak i po przem ieszczeniu do cytosolu, gdzie ham uje aktyw ­
ność białek antyapoptotycznych.
O bok w sp o m n ian y ch powyżej m echanizm ów reg ulu­
jących proces indukcji apoptozy, w których uczestniczy
HtrA2, w y k azan o istnienie zw iązku tej proteazy ze szla­
kiem indukcji śmierci komórki zależnym od białka p53.
O kazało się, że ekspresja genu humHtrA2 pozostaje pod
kontrolą p53. W w arunkach apoptozy indukow anej etopozydem (przebiegającej z udziałem p53) w kom órkach HeLa
i tym ocytach człowieka poziom ekspresji genu humHtrA2
w zrasta. W ykazano, że HtrA2 w iąże i p rzeprow ad za proteolizę białka CIAP1, głównego inhibitora apoptozy w ko­
m órkach ssaków . Zablokow anie aktyw ności proteolitycznej
h u m H trA 2 inhibitorem specyficznym dla proteaz serynow ych uniem ożliw ia proteolizę CIAP1 i tym sam ym blokuje
apoptozę zależną od p53 [63],
ZWIĄZEK BIAŁKA HtrA2 Z ROZWOJEM
CHOROBY ALZHEIMERA
W ykazano rów nież zw iązek białka HtrA 2 z rozwojem
choroby A lzheim era. HtrA 2 w chodzi w oddziaływ anie z
preseniliną-1 (PS-1) - jednym z białek biorących udział w
p o w staw aniu [3-amyloidu. PS-1 jest enzym em , który jest
elem entem kom pleksu y-sekretazy i p rzepro w ad za h y d ro ­
lizę prek u rso ro w eg o białka APP, w efekcie czego zostaje
uw olniony [3-amyloid. Mutacje w genie kodującym PS-1,
odpow iedzialne za pow staw anie p o n ad połow y dziedzicz­
nych p rz y p a d k ó w choroby Alzheimera, pow odują zw ięk­
szenie apop to zy neuronów . Przypuszcza się, że w procesie
śmierci n e u ro n ó w kluczow ą rolę odg ry w a proteaza HtrA2.
Akum ulacja [3-amyloidu m oże inicjować apoptozę, a to z
kolei pow o d u je translokację HtrA2 do cytosolu. W ykazano,
że karboksylow y fragm ent PS-1 wiąże dom eny PDZ doj­
rzałego białka HtrA2, co pow oduje zw iększenie aktyw no­
ści proteolitycznej HtrA 2 wobec białek IAP (XIAP, CIAP1,
CIAP2) i w konsekwencji aktyw uje kaspazy [64]. Białko
HtrA2 wiąże rów nież [3-amyloid lecz nie o dpow iada bez­
pośrednio za jego degradację. Należy jednak zauw ażyć,
że poziom [3-amyloidu spada o jedną trzecią w kom órkach
nadprodukujących białko HtrA 2 [65],
PRAK TYCZNE Z A ST O SO W A N IE B A D A Ń N A D
B IA Ł K A M I Z R O D Z I N Y H trA O R A Z P E R SP E K T Y W Y
IC H W Y K O R Z Y S T A N I A W P R Z Y S Z Ł O Ś C I
Intensyw ne badania p ro w adzone nad rolą prokariotycznych białek H trA budzą szczególne zainteresow anie w
kontekście w ykorzystania atenuow anych szczepów bakte­
rii htrA do konstrukcji szczepionek. Obiecujące efekty przy­
niosły badania n ad szczepionkam i na bazie atenuow anych
szczepów z gatunków Salmonella i Shigella pozbaw ionych
genu htrA. D rugą fazę testów klinicznych pom yślnie prze­
szła żyw a szczepionka CVD 908-htrA (aroC aroD htrA) na
bazie szczepu Salmonella enterica serow ariant Thypi prze­
ciwko durow i brzusznem u. Tak skonstruow ana szczepion­
ka jest bezpieczna i wysoce im m unogenna. W przeciw ień­
stwie do obecnie stosowanej szczepionki CVD 908 (aroC
aroD), indukuje odporność u ludzi już po jednorazow ym
szczepieniu [66], Ten sam szczep S. enterica htrA~ używ any
jest jako w ektor do przenoszenia plazm idów ekspresyjnych
niosących geny heterologicznych antygenów , m iędzy inny­
mi gen kodujący fragm ent pow ierzchniow ego białka SSP-2
Plasmodium falcipalum [67], gen ureAB ureazy Helicobacter
pylori [68], gen hem aglutyniny w irusa odry [69], W stępne
testy kliniczne przeszła pom yślnie szczepionka przeciw ko
tężcowi skonstruow ana w oparciu o w spom niany szczep
S. enterica h trA , w którym ekspresji ulega gen kodujący
fragm ent toksyny tężca (TetC) [70], W ykorzystana strategia
daje możliwość opracow yw ania szczepionek biwalentnych
indukujących o dpow iedź im m unologiczną przeciw ko heterologicznym antygenom .
A tenuow ane szczepy Salmonella h tr A używ a się do prze­
noszenia eukariotycznych plazm idów ekspresyjnych k o d u ­
jących cytokiny w celu m odulow ania odpow iedzi im m u ­
nologicznej. Badania p row adzone na m odelu zw ierzęcym
pokazały, iż terapia indukuje efekt przeciw now otw orow y
w czerniaku oraz m oże być stosow ana także w infekcjach
pasożytniczych [71].
Do ekspresji heterologicznych antygenów w ykorzystuje
się także silny prom otor genu htrA. Ekspresja genu htrA w y ­
raźnie w zrasta po wniknięciu bakterii z rodzaju Salmonella
do kom órek eukariotycznych. Właściwość tę w ykorzystano
w prow adzając gen kodujący C-końcowy fragm ent toksyny
jadu kiełbasianego bezpośrednio pod kontrolę prom otora
htrA. W ten sposób uzyskano silną odpow iedź im m u n o ­
logiczną przeciw ko toksynie jadu kiełbasianego u myszy
[72].
H trA w ykorzystuje się jako indykator chorób po w o d o ­
w anych przez riketsje, m ikroorganizm y będące przyczyną
szeregu chorób przenoszonych przez ow ady, pchły i klesz­
cze, takich jak gorączka plam ista (ang. spotted fever). Ampli-
33
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
fikacja genu htrA z zastosow aniem techniki PCR um ożliw ia
identyfikację patogenu i rozpoznanie gatunku [73]. Gen
htrA w ykorzystuje się w identyfikacji m etodą PCR pato­
gennej bakterii Bartonella henselae w zm ienionych węzłach
chłonnych w chorobie kociego p azura (ang. Cat Scratch
Disease) [74].
Mutacje w genie htrA pow odują stabilizację w ielu niesta­
bilnych białek otoczki komórkowej oraz fuzyjnych, stąd u ży ­
w a się m utantów h tr A w roli gospodarzy do ekspresji zrekom binow anych genów. W ten sposób uzyskano w ydajną
ekspresję szeregu zrekom binow anych białek w kom órkach
pozbaw ionych praw idłow ego białka HtrA, np. pochodnej
toksyny błonicy i zrekom binowanej podjednostki SI toksy­
ny krztuśca. Skonstruow ano także podw ójne m utanty rpoH
htrA, które jeszcze bardziej udoskonaliły możliwość ekspre­
sji heterologicznych sekrecyjnych białek [3].
O grom ny w zrost zainteresow ania eukariotycznym i biał­
kami H trA zaowocow ał ukazaniem się szeregu niezwykle
interesujących prac dotyczących roli w spom nianych bia­
łek w rozw oju chorób, w tym now otw orow ych, neurodegeneracyjnych oraz artretycznych. Sugeruje się, iż ocena
ekspresji genu H trA l m oże być w przyszłości p rzydatna w
diagnostyce onkologicznej, a aktyw ność genu H trA l może
być m arkerem progresji now otw orów . N ależy rów nież za­
uważyć, że upośledzenie procesów zw iązanych z indukcją
apoptozy m oże prow adzić do niekontrolow anego nam nażania kom órek i indukcji procesu now otw orow ego, stąd
HtrA2 jako białko proapoptotyczne m oże być zaangażow a­
ne w kancerogenezę poprzez udział w apoptozie. Istnieje
rów nież możliwość w ykorzystania w iedzy na tem at białek
H trA w leczeniu chorób artretycznych i neurodegeneracyjnych.
UWAGI KOŃCOWE
Powszechność w ystępow ania białek H trA oraz ich za­
chow ana w ewolucji aktywność proteolityczna w skazuje
na niezwykle istotną rolę omawianej rodziny białek w p ra ­
w idłow ym funkcjonow aniu kom órek i to zarów no prokariotycznych jak i eukariotycznych. Proteazy H trA są zaan­
gażow ane w degradację niepraw idłow ych i potencjalnie
toksycznych dla komórki białek oraz regulację aktywności
szeregu białek kluczowych dla właściwego przebiegu pro ­
cesów zw iązanych ze w zrostem i różnicow aniem kom ór­
ki, a w szczególnych okolicznościach kierow aniem jej na
drogę autodestrukcji. Dotychczasowe badania n ad funkcją
prokariotycznych białek H trA zaow ocow ały w ykorzysta­
niem zdobytej w iedzy przede w szystkim w konstrukcji
szczepionek na bazie atenuow anych szczepów h trA . Dal­
sze prace n ad rolą eukariotycznych białek H trA mogą dać
odpow iedź na pytania z zakresu transformacji now otw o­
rowej i procesów zw iązanych z rozw ojem chorób, w tym
neurodegeneracyjnych i artretycznych, a dokładne pozna­
nie m echanizm ów działania białek H trA dałoby możliwość
w ykorzystania zdobytej w iedzy w diagnostyce i leczeniu
tych schorzeń.
PIŚMIENNICTWO
1. Clausen T, Southan C, Ehrm ann M (2002) The H trA Fam ily of Proteases: Im plications for protein Com position an d Cell Fate. Molecular
Cell 10:443-455
2. Barrett AJ, Rawlings ND, W oessner JF (2004) Serine an d Threonine
Peptidases, W: H andbook of Proteolytic Enzym es, t II. Elsevier Aca­
demic Press, str. 1417-1784
3. Pallen BW, W ren MJ (1997) The H trA family of serine proteases. Mol
Microbiol 26: 209-221
4. Lipińska B, Sharm a S, G eorgopoulos C (1988) Sequence analysis and
regulation of the htrA gene of Escherichia coli: a sigm a 32-independent m echanism of heat-inducible transcription. Nucleic Acids Res 16:
10053-10067
5. Strauch KL, Beckwith J (1988) An Escherichia coli m utation prevent­
ing degradation of abnorm al periplasm ic proteins. Proc N atl Acad Sei
USA 85:1576-1580
6. Lipińska B, Fayet O, Baird L, G eorgopoulos C (1989) Identification,
characterization an d m apping of the Escherichia coli htrA gene, whose
product is essential for bacterial grow th only at elevated tem peratures.
J Bacterial 171:1574-1584
7. Skorko-Glonek J, W aw rzynów A, Krzewski K, K urpierz K, Lipińska B
(1995) Site-directed m utagenesis of the H trA (DegP) serine protease,
w hose proteolytic activity is indispensable for Escherichia coli survival
at elevated tem peratures. Gene 163:47-52
8. Skorko-Glonek J, Lipińska B, Krzewski K, Zolese G, Bertoli E, Tanfani
F (1997) H trA heat shock protease interacts w ith phospholipid m em ­
branes and undergoes conform ational changes. J Biol C hem 272:89748982
9. Lipińska B, Żylicz M, G eorgopoulos C (1990) The H trA (DegP) pro­
tein, essential for Escherichia coli survival at elevated tem peratures, is
an endoprotease. J Bacterial 172:1791-1797
10. C avard D (1995) Role of DegP protease on levels of various forms of
colicin A lysis protein. FEMS M icrobiol Lett 125:173-178
11. Isaac DD, Pinkner JS, H ultgren SJ, Silhavy TJ (2005) The extracytoplasmic adaptor protein CpxP is degraded w ith substrate by DegP. Proc
Natl Acad Sei USA 102:17775-17779
12. Laskowska E, Kuczynska-W isnik D, Skorko-Glonek J, Taylor A (1996)
D egradation by proteases Lon, Clp and H trA of Esclierichia coli pro­
teins intracellularly aggregated by heat shock: H trA protease action in
vivo and in vitro. Mol Microbiol 22:555-571
13. Skorko-Glonek J, Z uraw a D, K uczw ara E, W ozniak M, W ypych Z,
Lipińska B (1999) The Escherichia coli heat shock serine protease partici­
pates in defense against oxidative stress. Mol G en G enet 262: 342-350
14. Spiess C, Beil A, E hrm ann M (1999) A Tem perature-D ependent Switch
from Chaperone to Protease in W idely C onserved H eat Shock Protein.
Cell 97:339-347
15. CastilloKeller M, M isra R (2003) Protease-Deficient DegP Suppress Le­
thal Effect of a M utant O m pC Protein by Its C apture. J Bacteriol 185:
148-154
16. Rizzitello AE, H arper JR, Silhavy TJ (2001) Genetic Evidence for Paral­
lel P athw ays of C haperone Activity in the Periplasm of Escherichia coli.
J Bacteriol 183: 6794-6800
17. Krojer T, G arrido-Franco M, H uber R, E hrm ann M, Clausen T (2002)
Crystal Structure of DegP (HtrA) Reveals a N ew Protease-Chaperone
Machine. N ature 416: 455-459
18. Kolmar H, W aller PRH, Sauer RT (1996) The D egP and DegQ periplas­
mic endoproteases of Escherichia coli: specificity for cleavage sites and
substrates conform ation. J Bacteriol 178: 5925-5929
19. Skorko-Glonek J, Z uraw a D, Tanfani F, Scire A, W aw rzynów A, Narkiewicz J, Bertoli E, Lipińska B (2003) N -term inal region of H trA serine
protease is essential for stabilization of prim ary structure and m ain­
taining of its oligomeric structure. Biochim Biophys Acta 1649: 171182
20. M ileykovskaya E, D ow han W (1997) The Cpx tw o-com ponent signal
transduction pathw ay is activated in Escherichia coli m utant strains
lacking phosphatidylethanolam ine. J Bacteriol 179:1029-1034
34
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
21. Raina S, M issiakas D, G eorgopoulos C (1995) The rpoE gene encoding
the o E (ct24) heat shock sigm a factor of Escherichia coli. EMBO J 14:10431055
22. Mecsas J, Rouviere PE, Erickson JW, D onohue TJ, Gross CA (1993) The
activity of sigm a E, an Escherichia coli heat-inducible sigma-factor, is
m odulated by expression of outer m em brane proteins. Genes Dev 7:
2618-2628
23. M iyadai H, Tanaka-M asuda K, M atsuyam a S, T okuda H (2004) Effects
of Lipoprotein O verproduction on the Induction of DegP (HtrA) In­
volved in Q uality Control in the Escherichia coli Periplasm. J Biol Chem
279: 39807-39813
24. Miot M, Betton JM (2004) Protein quality control in the bacterial peri­
plasm. Microbial Cell Factories 3: 4. http://w w w .m icrobialcellfactories.com / content / 3 / 1 / 4
25. E hrm ann M, Clausen T (2004) Proteolysis as a Regulatory Mechanism.
A nnu Rev G enet 38: 709-724
26. W aller PR, Sauer RT (1996) Characterization of degQ and degS, Esch­
erichia coli genes encoding hom ologs of the DegP protease. J Bacteriol
178:1146-1153
27. Everest P, Frankel G, Li J, L und P, Chatfield S, D ougan G (1995) Ex­
pression of LacZ from the htrA, nirB and groE prom oters in a Salmonella
vaccine strain: influence of grow th in m am m alian cells. FEMS Micro­
biol Lett 126: 97-101
41. Nie G-Y, H am pton A, Li Y, Findlay JK, Salam onsen LA (2003) Identi­
fication and cloning of tw o isoform s of hum an high-tem perature re­
quirem ent factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure
and com parison of its tissue distribution w ith H trA l and HtrA2. Bioc h e m j 371: 39-48
42.Tocharus J, Tsuchiya A, Kajikawa M, Ueta Y, Oka C, Kawaichi M
(2004) Developm entally regulated expression of M orse H trA 3 and its
role as an inhibitor of TGF-p signaling. Dev G row th Differ 46: 257-274
43. Z um brunn J, Treub B (1996) Prim ary structure of a putative serine pro­
tease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett 398:187-192
44. Z um b ru n n J, Trueb B (1997) Localization of the gene for a serine
protease w ith IGF-binding dom ain (PRSS11) to hu m an chrom osom e
10q25.3-q26.2. Genom ics 45: 461-462
45. H u S-I, Carozza M, Klein M, N anterm et P, Luk D, Crowl RM (1998)
H um an HtrA, evolutionary conserved serine protease identified as
differentially expressed gene product on osteoarthritis cartilage. J Biol
C hem 273: 34406-34412
46. Baldi A, De Luca A, Morini M, Battista T, Felsani A, Baldi F, Catricala
C, A m antea A, N oonan DM, Albini A, Natali PG, Lom bardi D, Paggi
MG (2002) The H trA l serine protease is dow n-regulated d uring h u ­
m an m elanom a progression and repress grow th of m etastatic m ela­
nom a cells. Oncogene 21: 6684-6688
28. Roop RM 2nd, Fletcher TW, Sriranganathan NM, Boyle SM, Schurig
GG (1994) Identification of an im m unoreactive Brucella abortus H trA
stress response protein homolog. Infect Im m un 62:1000-1007
47. C hien J, Staub J, H u S-I, Erickson-Johnson MR, Couch FJ, Smith DI,
Crowl RM, Kaufm ann SH, Shridhar V (2004) A candidate tum or sup­
pressor H trA l is dow n-regulated in ovarian cancer. Oncogene 23:
1636-1644
29. Elzer PH, Phillips RW, Kovach ME, Peterson KM, Roop RM 2nd (1994)
Characterization and genetic com plem entation of a Brucella abortus
high-temperature-requirement A (htrA) deletion m utant. Infect Im m un
62: 4135M139
48. Oka C, Tsujimoto R, Kajikawa M, Koshiba-Takeuchi K, Ina J, Yano M,
Tsuchiya A, Ueta Y, Soam A, K anda H, M atsum oto M, Kawaichi M
(2003) H trA l serine protease inhibits signaling m ediated by Tgfp fam ­
ily proteins. Developm ent 131:1041-1053
30. Cortes G, de A storza B, Benedi VJ, Alberti S (2002) Role of the htrA
Gene in Klebsiella pneumoniae Virulence. Infect Im m un 70:4772-4776
49. Kam ińska B, W esołowska A, Danilkiewicz M (2005) TGF beta signal­
ing and its role in tum our pathogenesis. Acta Biochim Polon 52: 329337
31. Ibrahim YM, Kerr AR, McCluskey, Mitchell TJ (2004) Control of Viru­
lence by the T w o-Com ponent System C iaR /H Is M ediated via HtrA,
a Major Virulence Factor of Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol 186:
5258-5266
50. Tsuchiya A, Yano M, Tocharus J, Kojami H, Fukum oto M, Kawaichi
M, O ka C (2005) Expression of m ouse H trA l serine protease in norm al
bone and cartilage and its upregulation in joint cartilage dam aged by
experim ental arthritis. Bone 37: 323-336
32. P oquet I, Saint V, Seznec E, Simoes N, Bolotin A, G russ A (2000) HtrA
is the u nique surface housekeeping protease in Lactococcus lactis and is
required for natural protein processing. Mol Microbiol 35:1042-1051
51. Bąk D, Milewski M (2005) Choroby zw iązane z agregacją białek.
Postępy Biochem 51: 297-307
33. W ilson RL, Brown LL, Kirkwood-W atts D, W arren TK, Lund SA, King
DS, Jones KF, H ruby DE (2006) Listeria monocytogenes 10403S H trA is
necessary for resistance to cellular stress and virulence. Infect Im m un
74: 765-768
52. G rau S, Baldi A, Bussani R, Tian X, Stefanescu R, Przybylski M, Rich­
ards P, Jones SA, Shridhar V, Clausen T, Ehrm ann M (2005) Implica­
tions of the serine protease H trA l in am yloid precursor protein pro­
cessing. Proc Natl Acad Sci USA 102: 6021-6026
34. Biswas S, Biswas I (2005) Role of H trA in surface protein expression
and biofilm form ation by Streptococcus mutans. Infect Im m un 73: 69236934
53. G ray CW, W ard RV, Karran E, Turconi S, Rowles A, Viglienghi D,
Southan C, Barton A, Fantom KG, W est A, Savopoulos J, H assan NJ,
Clinkenbeard H, H anning C, A m egadzie B, Davis JB, Dingwall C, Livi
GP, Creasy CL (2000) Characterization of H um an HtrA2, novel ser­
ine protease involved in the m am m alian cellular stress response. Eur J
Biochem 267: 5699-5710
35. Rosch JW, C aparon MG (2005) The ExPortal: an organelle dedicated to
the biogenesis of secreted proteins in Streptococcus pyogenes. Mol Mi­
crobiol 58: 959-968
36. Rigoulay C, E ntenza JM, H alpem D, W idm er E, M oreillon P, Poquet I,
G russ A (2005) C om parative Analysis of the Roles of HtrA-Like Sur­
face Proteases in Two Virulent Staphylococcus aureus Strains. Infect Im ­
m un 73: 563-572
37. N oone D, H ow ell A, Collery R, Devine KM (2001) YkdA and YvtA,
HtrA-like serine proteases in Bacillus subtilis, engage in negative au­
toregulation and reciprocal cross-regulation of ykdA and yvtA gene
expression. J Bacteriol 183: 654-663
38. A d am Z, A dam ska I, N akabayashi K, Ostersetzer O, H aussuhl K,
M anuell A, Z heng B, Vallon O, Rodermel SR, Shinozaki K, Clarke AK
(2001) C hloroplast and M itochondrial Proteases in Arabidopsis. Pro­
posed nom enclature. Plant Physiol 125:1912-1918
39. H aussuhl K, A ndersson B, A dam ska I (2001) A chloroplast DegP2 pro­
tease perform s the prim ary cleavage of the photodam aged D1 protein
in p lant photosystem II. EMBO J 20: 713-722
40. Fahrenkrog B, Sauder U, Aebi U (2004) The S. cerevisiae HtrA-like pro­
tein N m a l l l p is a nuclear serine protease that m ediates yeast apopto­
sis. J Cell Sei 117:115-126
54. Faccio L, Fusco C, Chen A, M artinotti S, Bonventres JV, Zervos AS
(2000) Characterization of N ovel H u m an Serine Protease That H as Ex­
tensive Hom ology to Bacterial H eat Shock E ndoprotease H trA and Is
Regulated by Kidney Ischemia. J Biol Chem 275: 2581-2588
55. Yang QH, Church-H ajduk R, Ren J, N ew ton NL, Du C (2003) O m i/
H trA 2 catalytic cleavage of inhibitor of apoptosis (IAP) irreversibly in­
activates IAP and facilities caspase activity in apoptosis. Genes Dev 17:
1487-1496
56. Srinivasula SM, G upta S, D atta P, Z hang ZJ, H edge R, Cheong N, Fer­
nandes-A lnem ri T, Alnem ri ES (2003) Inhibitor of A poptosis Proteins
Are Substrates for the M itochondrial Serine Protease O m i/H trA 2. J
Biol Chem 278:31469-31472
57. Trencia A, Fiory F, M aitan MA, Vito P, Barbagallo APM, Perfetti A,
Miele C, Ungaro P, Oriente F, Cilenti L, Zervos AS, Form isano P, Beguinot F (2004) O m i/H trA 2 Prom otes Cell Death by Binding and De­
grading the Anti-apoptotic Protein p e d /p e a l5 . J Biol Chem 279:4656646572
58. M artins LM, laccarino I, Tenev T, Gschm eissner S, Totty NF, Lemoines
NR, Savopoulos J, G ray CW, Creasy CL, Dingwall C, D ow nw ard J
35
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
(2002) The Serine Protease O m i/H trA 2 Regulates A poptosis by Bind­
ing XIAP through a Reaper-like Motif. J Biol Chem 277: 439-444
59. Verhagen AM, Silke J, Ekert PG, Pakush M, K aufm ann H, Connolly
LM, Day CL, Tikoo A, Burke R, W robel C, Moritz RL, Sim pson RJ,
Vaux DL (2002) HtrA2 Prom otes Cell Death through Its Serine Prote­
ase Activity and Its Ability to Antagonize Inhibitor of Apoptosis Pro­
teins. J Biol Chem 277: 445-454
60. H edge R, Srinivasula SM, Z hang ZJ, Wassell R, M ukattash R, Cilenti L,
DoBois G, Lazebnik Y, Zevros AS, Fernandes-A lnem ri T, Alnemri ES
(2002) Identification of O m i/H trA 2 as M itochondrial Apoptotic Serine
Protease That Disrupts Inhibitors of A poptosis Protein-Caspase Inter­
action. J Biol Chem 277: 432-438
61. Cilenti L, Soundarapandrian MM, Kyriasis GA, Stratico V, Singh S,
G upta S, Bonventre JV, Alnemri ES, Zervos AS (2004) Regulation of
HAX-1 Anti-apoptotic Protein by O m i/H trA 2 Protease during Cell
Death. J Biol Chem 279: 50295- 50301
62. Blink E, M aianski NA, Alnemri ES, Zevros AS, Roos D, Kuijpers TW
(2004) Intram itochondrial serine protease activity of O m i/H trA 2 is re­
quired for caspase-independent cell death of hum an neutrophils. Cell
D eath Differ 11: 937-939
63. Jin S, K alkum M, Overholtzer M, Stoffel A, Chait BT, Levine AJ (2002)
CIAP1 and the serine protease HtrA2 are involved in a novel p53-dep en d en t apoptosis pathw ay in m am m als. Genes Dev 17:359-367
64. G upta S, Singh R, Datta P, Zhang ZJ, O rr C, Lu Z, D ubois G, Zevros
AS, Meisler HM , Srinivasula SM, Fernandes-A lnem ri T, Alnem ri ES
(2004) The C-term inal Taill of Presenilin Regulates O m i/H trA 2 Protease Activity. J Biol Chem 279: 45844-45854
65. Liu ML, Liu MJ, Kim MJ, Kim HJ, H ong ST (2005) H tr A2 Interacts w ith
Aß Peptide b u t Does N ot Directly Alter Its Production and D egrada­
tion. Mol Cells 20: 83-89
66. Salerno-Goncalves R, W yant TL, Pasetti MF, Fem andez-V ina M,
Tacket CO, Levine MM, Sztein MB (2003) Concom itant Induction of
CD4+ and CD8+ T cell Responses in Volunteers Im m unizes w ith Sal­
monella enterica Serovar Thypi Strain CVD 908-htrA. J Im m unol 170:
2734-2741
67. G om ez-D uarte OG, Pasetti MF, Santiago A, Sztein MB, Hoffman SL,
Levine MM (2001) Expression, extracellular secretion and im m unogenicity of the Plasmodium falciparum sporozoite protein 2 in Salmonella
vaccine strains. Infect Im m un 69:1192-1198
68. L ondom o-A rcila P, Freem an D, Kleanthous H, O 'D ow d AM, Lewis S,
T urner AK, Rees EL, Tibbits TJ, G reenw ood J, M onath TP, Darsley MJ
(2002) A ttenuated Salmonella enterica Serovar Typhi Expressing Urease
Effectively Im m unizes Mice against Helicobacter pylori Challenge as
Part of a H eterologous Mucosal Prim ing - Parental Boosting Vaccina­
tion. Infect Im m un 70: 5096-5106
69. Pasetti MF, Levine MM, Sztein MB (2003) Anim al m odels paving the
w ay for clinical trials of attenuated Salmonella Typhi live oral vaccines
an d live vectors. Vaccine 21:401-418
70. Tacket CO, Galen JE, Sztein MB, Losonsky G, W yant TL, N ataro J,
W asserm an SS, Edelm an R, Chatfield S, Dougan G, Levine MM (2000)
Safety and im m une responses to attenuated Salmonella enterica Serovar
Thypi oral live vector vaccines expressing tetanus toxin fragm ent C.
Clin Im m unol 97:146-153
71. R ozenkranz CD, Chiara D, Agorio C, Baz A, Pasetti MF, Schreiber F,
D em atteis S, M artinez M, Sztein MB, Chabalgoity JA (2003) Tow ards
N ew Im m unotherapies: Targeting Recom binant Cytokines to the Im ­
m une System using Live A ttenuated Salmonella. Vaccine 21: 798-801
72. Foynes S, Holley JL, G arm ory HS, Titball RW, Fairw eather NF (2002)
Vaccination against type F botulinum toxin using attenuated Salmonel­
la enterica var T hypim urium strains expressing the B oN T/F H c frag­
m ent. Vaccine 21:1052-1059
73. Blair PJ, Jiang J, Schoeler GB, M oron C, Anaya E, Cespedes M, Cruz C,
Felices V, G uevara C, M endoza L, Villaseca P, Sum ner JW, Richards
AL, Olson JG (2004) Characterization of Spotted Fever G roup Rickett­
siae in Flea and Tick Specimens from N orthern Peru. J Clin Microbiol
42: 4961A967
74. H ansm ann Y, DeM artino S, Piem ont Y, M eyer N, M ariet P, Heller R,
C hristm ann D, Jaulhac B (2005) Diagnosis of Cat Scratch Disease of
Bartonella henselae by PCR: a Study of Patients w ith Lym ph N ode En­
largem ent. J Clin Microbiol 43: 3800-3806
Characterization of the Htr A fam ily of proteins
Dorota Żurawa-Janicka , Joanna Narkiewicz, Barbara Lipińska
U niversity of G dansk, Institute of Biology, D epartm ent of Biochem istry, 24 K ładki St., 80-822 G dańsk, Poland
s e-mail: zuraw a@ biotech.univ.gda.pl
Key words: Escherichia coli H trA protein, heat shock proteins, h u m an H trA proteins, serine proteases
ABSTRACT
The HtrA fam ily of proteins consists of evolutionary conserved serine proteases, w hich are hom ologues of the HtrA protein from a m odel
bacterium Escherichia coli. They are w id ely distributed among organisms, prokaryotic as w ell as eukaryotic including humans. HtrA proteins
participate in defense against stresses causing aberrations in protein structure, for example heat or oxidative stress. At least four human ho­
m ologues have been identified. They are involved in cell growth and differentiation, apoptosis, and disturbances in their function may induce
carcinogenesis, arthritic and neurodegenerative disorders. This article sum m arizes recent studies regarding the HtrA fam ily of proteins, their
structure, regulation and function. It also presents practical applications of this kn ow led ge and perspective of its use in the future.
36
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
Kolagenazy typu IV (MMP-2 i MMP-9) i ich substraty - białka macierzy
zewnątrzkom órkowej, hormony, cytokiny, chem okiny i ich receptory
STRESZCZENIE
e talo p ro tein azy m acierzy (MM P) są en d o p ep ty d a za m i zależnym i od cynku, w ym aga­
jącym i obecności jo n ó w w a p n ia w śro d o w isk u , zd o ln y m i do traw ie n ia b iałk o w y ch
sk ła d n ik ó w m acierzy zew n ątrzk o m ó rk o w ej takich jak kolageny, lam in in y , pro teo g lik an y ,
fibro n ek ty n a. D egradując b iałk a m acierzy, w tym ró w n ież błony p o d staw n e, u m o żliw iają
m igrację kom órek. Je d n a k że m acierz n ie stanow i pasyw nego ru szto w an ia. Jej sk ła d n ik i są
m iędzy in n y m i re ze rw u a rem czy n n ik ó w w zrostu, k tóre m ogą być u w o ln io n e p rzez m etalo­
p ro tein a zy i m o dulow ać reakcje kom órek. Ponadto, do su b stra tó w m e ta lo p ro te in a z m acie­
rzy należy także w ie le in n y ch b iałek, takich jak horm ony, cytokiny, c h em o k in y i czy n n ik i
w zrostu, k tóre w w y n ik u pro teo lizy m ogą być a ktyw ow ane, in ak ty w o w an e bądź p rz e k sz ta ł­
cane w p ro d u k ty o now ej aktyw ności biologicznej. M etalo p ro tein azy m acierzy odgryw ają
ró w n ież isto tn ą rolę w u k ła d z ie im m unologicznym . W ynika z tego, że fu n k c ja tych enzy­
m ów jest n iez w y k le złożona i nie sp ro w ad za się do prostej d estrukcji. W w a ru n k a c h fizjo­
logicznych m eta lo p ro te in a zy są n iez b ę d n e podczas e m briogenezy i p rz eb u d o w y tk an e k , ale
z w ięk szo n a e k sp re sja tych enzym ów tow arzyszy w ie lu stanom patologicznym , tak im jak
choroby n ow otw orow e, choroby sercow o-naczyniow e, oraz a utoim m unologiczne.
M
WPROWADZENIE
M etaloproteinazy macierzy zew nątrzkom órkow ej (MMP, ang. matrix metalloproteinase), zw ane inaczej m atryksynam i, stanow ią rodzinę e n d o p ep ty d az mają­
cych dw ie w ażne w spólne cechy: zachow any ewolucyjnie m otyw sekwencyjny
obejmujący trzy reszty histydylow e wiążące jon cynku w centrum katalitycznym
oraz zachow aw czą resztę m etionylow ą zlokalizow aną poniżej miejsca w iązania
tego jonu. U większości MMP m ożna w yróżnić trzy główne dom eny: N-końcow y p rop ep ty d (prodom enę), dom enę katalityczną i dom enę hem opeksynow ą
na karboksylow ym końcu cząsteczki, ale u wielu reprezentantów tej rodziny
w ystępują także dodatkow e dom eny, decydujące o odm iennych właściwościach
poszczególnych enzym ów . Dlatego też, zarów no swoistość substratow a, jak i
b u d o w a chemiczna stanowiły podstaw ow e kryteria podziału m etaloproteinaz
macierzy na kilka głów nych gru p (kolagenazy, żelatynazy, strom elizyny, m eta­
loproteinazy błonowe) [1].
Elżbieta Hrabec
Julia Naduk
Małgorzata Stręk
Zbigniew Hrabec
Z akład E nzym ologii M edycznej, K atedra
Biochemii M edycznej, U niw ersytet M edyczny
w Łodzi, Łódź
-Z a k ła d E nzym ologii M edycznej, K atedra
Biochemii M edycznej, U niw ersytet M edyczny
w Łodzi, ul. M azow iecka 6 /8 , 92-215 Łódź; email: ehrabec@ zdn.am .lodz.pl, tel.: (042) 678 06
20, faks: (042) 678 24 65
A rtykuł otrzym ano 6 listopada 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 15 gru d n ia 2006 r.
Słowa kluczowe: m etaloproteinazy m acierzy,
kolagenazy ty p u IV (MMP-2, MMP-9), su b stra­
ty MMP, m acierz zew nątrzkom órkow a
Podziękowanie: Praca pow stała w ram ach
realizacji projektu badaw czego 502-16-196, fi­
nansow anego przez U niw ersytet M edyczny w
Łodzi
MMP uczestniczą w wielu procesach fizjologicznych; przede w szystkim w
implantacji trofoblastu, em briogenezie, rozwoju kości i szkliwa zębów, angiogenezie, gojeniu ran oraz w odnow ie tkanki łącznej [2-5], Ekspresję ich genów
obserwuje się głów nie w fibroblastach i innych rodzajach kom órek tkanki łącz­
nej, takich jak granulocyty obojętnochłonne, monocyty, makrofagi, a także w
kom órkach śródbłonka.
W w ielu stanach patologicznych dochodzi do w zrostu aktyw ności MMP.
M ożna tu w ym ienić rozrost now otw orow y, choroby zapalne, choroby sercowonaczyniow e oraz autoim m unologiczne. Zw iększona aktyw ność tych enzym ów
tow arzyszy w szystkim stanom patologicznym, z którym i zw iązany jest w z m o ­
żony proces tw orzenia now ych naczyń krw ionośnych, a więc przede w szyst­
kim w sp om n ian ym już chorobom now otw orow ym , ale także pow ikłaniom
cukrzycow ym (retinopatia proliferacyjna), degeneracji plam ki żółtej związanej
z w iekiem oraz reum atoidalnem u zapaleniu staw ów [2,6-8], A ktyw ność MMP
regulow ana jest na w ielu poziomach, obejmujących zdarzenia zachodzące w e­
w n ątrz kom órki jak i poza nią. Zależy przede w szystkim od ekspresji genów
regulow anych przez liczne cytokiny i czynniki w zrostu, ale końcow y efekt jest
rów nież w y p adk o w ą stabilizacji bądź destabilizacji ich mRNA, modyfikacji potranslacyjnych (glikozylacji), szybkości sekrecji z komórki, aktywacji latentnych
form enzym ów i h am ow ania ich aktywności przez cząsteczki tkankow ych inhi­
bitorów m etaloproteinaz macierzy (TIMP, ang. tissue inhibitors of matrix metalloproteinases), a także szybkości katabolizm u [1].
Do najlepiej poznanych przedstawicieli rodziny MMP należą kolagenazy typu
IV (żelatynazy), reprezentow ane przez MMP-2 i MMP-9 lub inaczej żelatynazę
37
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
BIAŁKA ECM
R ycin a 1. P rzyk ład y p roteo lizy z u d z ia łe m M M P-2 i M M P-9. M M P m o g ą k o n c en tro w a ć się w p o b liż u b ło n y k om órk ow ej. N a jw a ż n iejszy m b ło n o w y m „receptorem "
M M P-2 jest cząsteczk a MT1-MMP; M M P-2 m o ż e r ó w n ież w ią z a ć się z p o w ie r z c h n ią kom órk i za p o śr e d n ic tw e m in teg ryn y a .P v a M M P-9 za p o śr ed n ictw em p o w ie r z c h ­
n io w e g o recep tora CD44. M M P m o g ą d eg ra d o w a ć w ie le b iałek ECM (b r ą z o w e linie) oraz n ie b ęd ą cy ch sk ła d n ik a m i ECM. D egradacja d ek oryn y p ro w a d z i d o u w o ln ie n ia
TGF-p. D egradacja IGF-BP u w a ln ia IGF. M M P-9 r o z sz czep ia recep tor a IL-2 z lo k a liz o w a n y na p o w ierz ch n i lim fo cy tó w T, obniżając ich o d p o w ie d ź proliferacyjną na
stym ulację IL-2. M M P-2 rozcin a z w ią z a n y z błon ą k o m ó rk o w ą recep tor 1 FGF, u w alniając jego ek to d o m e n ę z d o ln ą d o w ią za n ia FGF.
A i żelatynazę B i właśnie na te dw a enzym y p ragniem y
zwrócić uw agę Czytelników.
D E G R A D A C J A BIA ŁEK M A C IE R Z Y
Z E W N Ą T R Z K O M Ó R K O W E J P RZEZ M M P
MMP m ogą degradow ać wiele białek m acierzy zew nątrzkom órkow ej (ECM, ang. extracellular matrix) i błon
podstaw nych, które są w yspecjalizowaną form ą ECM. Do
ich substratów należą m iędzy innym i kolageny, lam ininy,
fibronektyna, elastyna, entaktyna, agrekany i tenascyna [2].
D egradując białka macierzy MMP m ogą likw idow ać stru k ­
turalne bariery, umożliwiając tym sam ym inwazję k o m ó ­
rek, tak w w arunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.
Jednak białka macierzy nie stanow ią pasyw nego ru sz to w a ­
nia; są dynam iczną strukturą m odulującą reakcje kom órek,
m iędzy innym i poprzez sekwestrację m akrom olekuł syg­
nalnych, takich jak czynniki w zrostu [9]. Składniki ECM
są ponadto ligandam i dla kom órkow ych receptorów adhezyjnych - integryn, za których pośrednictw em przenoszą
sygnały do w nętrza kom órki [10]. Białka m acierzy regulują
wiele w ażnych procesów; przekazują sygnały stym ulujące
proliferację komórek, ich różnicowanie, migrację, adhezję
oraz apoptozę. Stąd prosty wniosek, że MMP, w tym także
kolagenazy typ u IV, dzięki zdolności do zm iany sk ład u i
strukturalnej organizacji ECM uczestniczą w e w szystkich
tych procesach.
Przyjmuje się powszechnie, że jedną z ważniejszych
funkcji pełnionych przez MMP-2 i MMP-9 jest degradacja
kolagenu typu IV, głów nego składnika błon podstaw nych,
w tym także naczyniowej błony podstawnej. Dzięki nisz­
czeniu tej bariery m ożliw a jest migracja kom órek podczas
m orfogenezy oraz w ędrów ka leukocytów do ognisk zap al­
nych. Zdolność do degradacji białek ECM pozw ala im ró w ­
nież regulow ać leukocytozę oraz aktyw nie uczestniczyć w
procesie miejscowego w zrostu now otw oru, angiogenezie i
p o w staw aniu przerzutów , a także niszczeniu bariery krewm ózg [11-16],
Już na w stępie zw róciliśmy uw agę, że proteoliza składni­
ków ECM przez M M P nie sprow adza się wyłącznie do nisz­
czenia fizycznych barier. Rozcinając białka macierzy MM P
biorą udział w przekazyw aniu sygnałów z ECM do kom ór­
ki. Może się to odbyw ać przynajm niej na kilka sposobów:
(1) białka m acierzy są rezerw uarem czynników w zrostu,
które m ogą być uw olnione po degradacji zw iązanych z nimi
specyficznych m akrom olekuł. Przykładem może być tran s­
formujący czynnik w zrostu-p (TGF-p, ang. transforming growthfactor-f), w ykazujący silne pow inow actw o do dekoryny.
Dekoryna, składnik ECM, jest niewielkim proteoglikanem
utrzym ującym integralność tkanek poprzez oddziaływ anie
z fibronektyną i trom bospondyną. Pełni też rolę rezerw uaru
TGF-p w środow isku ECM. Sekwestrując cząsteczki TGF-P
38
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
z ich błonow ych receptorów , reguluje szlak transmisji syg­
nału z udziałem tego czynnika w zrostu. W degradacji dekoryny, prow adzącej do uw olnienia TGF-p, m oże brać udział
kilku reprezentantów MMP: MMP-2, MMP-3 i MMP-7 [17].
Biologiczne działanie TGF-p jest bardzo szerokie, a jedną
z funkcji jest regulacja ekspresji genu kodującego MMP.
W ten sposób, uw olniony TGF-p stym uluje transkrypcję
MMP-9, ale ham uje transkrypcję genów większości induk-
T a b ela 1. Substraty k o la g en a z ty p u IV n ien a le żą ce d o białek ECM.
S u b straty k o la g e n a z
typ u IV n ie n a le ż ą c e
d o b ia łe k ECM
S k u te k d zia ła n ia m m p
p ro TGF-p
aktyw acja
p roIL l-p
aktyw acja
T N F-a
konw ersja zw iązanego z błoną
kom órkow ą proT N F-a (26 kDa) do
aktyw nej, wolnej cytokiny (17 kDa),
R eceptor 1 FGF
uw olnienie ektodom eny receptora
FGF - regulacja m itogennej i
angiogennej aktyw ności FGF
IL-2Ra
rozszczepienie receptora IL2a- obniżenie odpow iedzi
proliferacyjnej na stym ulację IL-2
IGF-BP
degradacja IF-BP - uw olnienie IGF
IL-8
odcięcie sześciu N -końcow ych reszt
am inokw asow ych p row adzi do
p ow stania IL-8 (7-77) - o 10-krotnie
wyższej aktyw ności niż IL-8
CTAP-III
PF-4
9 B
B
inaktyw acja
inaktyw acja
ENA-78
inaktyw acja
SDF-1
odcięcie czterech N -końcow ych
am inokw asów p row adzi do
u traty zdolności w iązania ze
sw oistym receptorem (CXCR-4)
SCF
uczestniczą w p ow staw aniu sSCF
MCP-3
inaktyw acja
Prolaktyna
jeden z pro d u k tó w degradacji - Nkońcow y fragm ent (16 kDa) ma
w łaściw ości antyangiogenne
Plazm inogen
angiostatyna (38 kDa fragm ent
plazm inogenu)- od g ry w a rolę
inhibitora angiogenezy
PEDF
inaktyw acja
uPA
inaktyw acja
a-PI
inaktyw acja
a l -anty chy m otrypsyna
inaktyw acja
PAI-2
inaktyw acja
Insulina
degradacja p row adzi do pow staw ania
im m unodom inujących epitopów
- skutkiem jest zaostrzenie
przebiegu cukrzycy
MBP
niszczenie osłonek m ielinow ych
IFN-p
inaktyw acja
AM
inaktyw acja oraz generow anie AM
(11-22) - czynnika zwężającego
naczynia krw ionośne
Big-ETl
aktyw acja
cyjnych MMP; taki m echanizm zapobiega niekontrolow a­
nem u u w alnianiu tego czynnika w zrostu.
(2) rozcinanie niektórych białek ECM m oże odsłaniać niedo­
stępne regiony cząsteczki (ang. criptic sites), zdolne do prze­
kazyw ania sygnałów lub prow adzić do pow stania p ro d u k ­
tów o zupełnie nowej aktyw ności biologicznej; na przykład,
jedna z m etaloproteinaz typu błonow ego (MT1-MMP, ang.
membrane type matrix metalloproteinase) i MMP-2 indukują
migrację kom órek nabłonkow ych przez rozcinanie specy­
ficznych sekwencji składnika błon p odstaw nych - lamininy-5 [18,19]. Komórki nabłonkow e mają zdolność adhezji do
lamininy-5 dzięki obecności receptora integrynow ego a 3Pr
Jednak dopiero proteolityczne rozcięcie łańcucha y2 lamininy przez MMP, eksponujące ukryte regiony cząsteczki,
nadaje kom órkom zdolność do migracji.
(3) rozległa degradacja białek ECM przez MMP p o w o d u ­
je zniszczenie adhezyjnych połączeń pom iędzy kom órką a
macierzą, uniem ożliwiając komórce odbiór sygnałów z oto­
czenia i w konsekwencji w p ro w ad za ją w apoptozę. Przy­
kładem takiego procesu m oże być sterow ana horm onalnie
inwolucja organów reprodukcyjnych czy gruczołów m lecz­
nych. Redukcja m asy tkanek sp ow odow ana jest degradacją
ECM i u tratą kom órek na skutek apoptozy [20].
W IELE S U B S T R A T Ó W M M P N IE
N A L E Ż Y D O BIA Ł E K E C M
MM P znane są przede w szystkim ze zdolności do de­
gradow ania składników ECM, ale do grona ich substratów
należy rów nież wiele innych p eptyd ó w i białek (Tabela 1,
Ryc. 1).
Ze w zględu na lokalizację (na pow ierzchni komórki),
MMP m ogą degradow ać pow ierzchniow e receptory, w
tym też adhezyjne, lub uw alniać z błony komórkowej bio­
logicznie aktyw ne cząsteczki. Mając zdolność do aktywacji
lub inaktywacji niektórych cytokin, chem okin i czynników
w zrostu regulują rów nież sygnały parakrynne. N a szcze­
gólną uw agę zasługują kolagenazy ty p u IV, dla których
rozpoznano najwięcej substratów spoza ECM.
W kom unikacji m iędzykom órkow ej, a także w k o m u ­
nikacji m iędzy kom órką a ECM, kluczow e znaczenie mają
zdarzenia zachodzące bezpośrednio na pow ierzchni kom ór­
ki lub w jej najbliższym otoczeniu. W praw dzie tylko nie­
które spośród MMP (MT-MMP) mają charakter enzym ów
błonowych, ale dzięki możliwości zakotwiczenia w olnych
M M P w błonie komórkowej, m oże dochodzić do okołokom órkowej proteolizy rów nież z ich udziałem . Najważniej­
szym błonow ym „receptorem " MMP-2 jest cząsteczka MT1MMP, uczestnicząca także (we w spółpracy z TIMP-2) w
aktywacji tego enzym u [1,21,22],
Inny sposób zakotw iczenia MMP-2 w błonie kom órko­
wej w ym aga udziału integryn. N a przykład, za pośredni­
ctw em integryny a v(33 cząsteczka MMP-2 m oże się wiązać z
pow ierzchnią kom órek śródbłonka i kom órek now otw oro­
w ych [23], W oddziaływ aniu z integryną uczestniczy d om e­
na hem opeksynow a MMP-2, a zatem takie oddziaływ anie
nie blokuje centrum katalitycznego enzym u. Z kolei aktyw ­
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
39
na MMP-9 m oże wiązać się z kom órką za pośrednictw em
pow ierzchniow ego receptora CD44 [23,24]. Inne MMP tak ­
że m ogą oddziaływ ać z receptorami błonow ym i i g rom a­
dzić się na pow ierzchni komórki. Zdolność do koncentracji
w pobliżu błony komórkowej stw arza dogodne w arunki
do traw ienia niektórych substratów . Dzięki takiej strategii
MMP m ogą wydajnie rozcinać różne białka błonow e lub
zw iązane z błoną komórkową. Uczestniczą w ten sposób
w uw alnianiu lub degradacji biologicznie aktyw nych czą­
steczek, które nie są składnikam i ECM. Poprzez degradację
białek adhezyjnych MMP mogą bezpośrednio m odulow ać
oddziaływ ania adhezyjne i migrację komórek. Przykła­
dowo, podjednostka (34 integryny m oże być degradow ana
przez MMP-7, a E-kadheryna przez MMP-3 i MMP-7. D e­
gradacja E-kadheryny prow adzi ponadto do uw olnienia
fragm entu o masie cząsteczkowej 80 kDa, który w sposób
p arakrynny stymuluje inwazję kom órek [25].
MMP MOGĄ AKTYWOWAĆ LUB UDOSTĘPNIAĆ
CYTOKINY I CZYNNIKI WZROSTU
Z lokalizow ane na pow ierzchni komórki MMP uczestni­
czą także w uw alnianiu biologicznie aktyw nych cząsteczek.
W ykazano, że zarów no MMP-2 jak i MMP-9 m ogą ak ty w o ­
wać proTGF-(3 [24,26]. TGF-(3 m a szerokie działanie biolo­
giczne; jest w ażnym czynnikiem im m unosupresyjnym , blo­
kującym oba typy odpow iedzi immunologicznej: kom órko­
w ą i hum oralną. Pobudza też syntezę białek ECM i ham uje
proliferację w ielu rodzajów komórek, w tym praw idłow ych
kom órek nabłonkow ych, ale stym uluje proliferację i zw ięk­
sza potencjał inw azyjny kom órek now otw orow ych. U dział
MMP-2 i MMP-9 w rozwoju now otw orów jest bardzo dobrze
u d ok u m entow an y [27], w arto więc w tym miejscu zwrócić
uw agę, że TGF-p, w którego aktywacji mogą uczestniczyć
obie kolagenazy typu IV ma z kolei zdolność do stym ulo­
w ania ich produkcji poprzez aktywację szlaku transmisji
sygnału z udziałem kinazy białek aktyw ow anej m itogenem
(p38 MAPK, ang. mitogen activated protein kinase) [28].
MMP m ogą także aktyw ow ać prekursor interleukiny-l(3
(IL-ip, ang. interleukin-lf) [29]. IL-1(3 w ytw arzana jest jako
prekursor o masie 33 kDa, który w w yniku proteolityczne­
go rozszczepienia łańcucha polipeptydow ego pom iędzy
A sp116 i Ala117zostaje przekształcony do aktywnej cytokiny
(18 kDa). W aktywacji uczestniczy kaspaza-1, znana też jako
konw ertaza IL-1|3 (ICE, ang. IL-lf-converting enzyme) [30],
Z ap roponow ano rów nież zupełnie inny sposób aktywacji
tej cytokiny, z udziałem MMP [29], W chorobach o p o d ło ­
żu zapalnym , takich jak miażdżyca tętnic czy reum atoidal­
ne zapalenie stawów, dochodzi do jednoczesnego w zrostu
ekspresji I L - lf i m etaloproteinaz macierzy, w tym M M P9. W ydaje się, że w takich w arunkach, proIL-l(3 m oże być
aktyw ow ana przez MMP. In vitro obie kolagenazy typ u
IV (szczególnie MMP-9) bardzo efektywnie rozcinają p re ­
kursor IL-1(3, prow adząc do pow stania pro d u k tu o pełnej
aktyw ności biologicznej. Mniej skuteczna jest MMP-3 (stromelizyna-1), ale zaktyw ow ana pod jej działaniem cytokina
jest dalej degradow ana i w konsekwencji traci właściwości
biologiczne. Schónbeck i wsp. [29] postulowali, że w og­
niskach zapalnych mógłby to być m echanizm regulujący
dostępność aktywnej cytokiny. Jest to istotne choćby z tego
p o w odu, że aktyw na IL-1(3 stym uluje ekspresję i aktywację
40
wielu m etaloproteinaz, a zatem w zajem ne oddziaływ ania
pom iędzy M M P i IL-1(3, o charakterze dodatniego sprzęże­
nia zw rotnego (cytokina stym uluje ekspresję genu kodują­
cego enzym uczestniczący w jej aktywacji), będą prow adzić
do zaostrzenia stanu zapalnego.
Czynnik m artw icy n ow otw o rów -a (TNF-a, ang. tumor
necrosis factor) jest cytokiną o kluczow ym znaczeniu w ukła­
dzie im m unologicznym i plejotropow ym działaniu. Między
innym i stym uluje proliferację limfocytów T i B, zwiększa
cytotoksyczność kom órek NK (ang. natural killer), pobudza
sekrecję niektórych cytokin oraz stym uluje ekspresję wielu
MMP. TN F-a w y tw arzan y jest głównie przez m onocyty/
m akrofagi (w o dpow iedzi na bodźce aktyw ujące receptor
TLR, ang. tool-like receptor) jako białko błonow e o masie
cząsteczkowej 26 kDa. Wiele MM P (w tym obie kolagena­
zy typu IV) m oże przeprow adzać konw ersję zw iązanego z
błoną kom órkow ą TN F-a do aktywnej, wolnej cytokiny (17
kDa), aczkolwiek głów ną rolę w tym procesie pełni blisko
spokrew niony z MM P enzym - konw ertaza TN F-a (TACE,
ang. tumor necrosis factor-a converting enzyme) [31,32].
W p rz y p a d k u insulinopodobnego czynnika w zrostu
(IGF, ang. insulin-like growth factor) w ykorzystana jest jesz­
cze inna strategia. IGF-1 i IGF-2 uczestniczą w procesie p ro­
liferacji i różnicow ania kom órek oraz regulują wiele funkcji
m etabolicznych. W przeciw ieństw ie do podobnej stru k tu ­
ralnie insuliny, praw ie cały IGF osocza skom pleksow any
jest z białkami, tak zw anym i białkami w iążącym i insulinop odobny czynnik w zrostu (IGF-BP, ang. insulin-like growth
factor-binding protein). Jak dotąd, opisano sześć rodzajów
takich białek. Sekwestrując IGF, IGF-BP zazwyczaj ham ują
działanie tego czynnika w zrostu, uniem ożliwiając jego in­
terakcję z receptorem . Chociaż opisano kilka strategii p ro­
w adzących do uw olnienia IGF z kom pleksu, wiele danych
wskazuje, że proteolityczna degradacja IGF-BP przez MMP
może odgryw ać szczególną rolę [36,37]. Przynajmniej kilka
enzym ów z tej rodziny (w tym także kolagenazy typu IV)
m a zdolność do rozcinania IGF-BP, a tym sam ym m oże re­
gulować dostępność IGF, tak w w aru n kach fizjologicznych
jak i patologicznych [38],
MMP MOGĄ DEGRADOWAĆ RECEPTORY BŁONOWE
LUB ODCINAĆ ICH DOMENY ZEWNĄTRZKOMÓRKOWE
Poza aktywacją i uw alnianiem cytokin i czynników
w zrostu, MMP m ogą degradow ać receptory błonow e lub
odcinać ich dom eny zew nątrzkom órkow e (ektodomeny).
MMP-2 rozcina zw iązany z błoną kom órkow ą receptor 1
czynnika w zrostu fibroblastów (FGF, ang. fibroblast growth
factor), uwalniając jego ektodom enę zdolną do w iązania
FGF [33], W ydaje się, że uw olnione ektodom eny receptora
FGF, łącząc się z cząsteczką czynnika w zrostu, m ogą z kolei
regulow ać jego dostępność. Z drugiej strony, odcinanie zew nątrzkom órkow ych dom en redukuje ilość miejsc w iążą­
cych FGF, co w efekcie m oże w yw oływ ać taki sam skutek.
M ogłaby to być jedna ze strategii regulow ania mitogennej
i angiogennej aktyw ności tego czynnika w zrostu. Z kolei
MMP-9, rozszczepiając receptor a IL-2 (IL-2Ra, ang. interleukin-2 receptor a), zlokalizow any na pow ierzchni limfocytów
T, w yraźnie obniża ich odp o w iedź proliferacyjną na sty m u ­
lację IL-2 [34], Może to przyspieszyć rozwój now otw oru,
bow iem zdolność do ucieczki spod n ad zo ru im m unologicz­
w w w .postępy biochem ii, pl
http://rcin.org.pl
nego sprzyja jego szybkiej progresji. N ależy w tym miejscu
wspom nieć, że kom órki now otw orow e stym ulują p ro d u k ­
cję i aktywację obu kolagenaz typ u IV i naw et jeśli same
nie syntetyzują tych enzym ów to potrafią skłonić do tego
komórki podścieliska guza [1,35]. A ktyw ow ane limfocyty T
także syntetyzują MMP-9, um ożliw iającą im migrację przez
naczyniow e błony podstaw ne. W yraźny w zrost ekspresji
genu kodującego ten enzym w ognisku now otw orow ym i
jego zdolność do degradacji IL-2Ra m oże zatem ham ow ać
proliferację limfocytów infiltrujących guz, sprzyjając w ten
sposób rozwojowi now otw oru [34],
SUBSTRATAMI MMP JEST WIELE CHEMOKIN
Do substratów MM P należy rów nież wiele chemokin.
MMP-9 odcina niewielki fragm ent z N-końca cząsteczki IL8, głów nego chem oatraktanta i aktyw atora granulocytów
obojętnochłonnych. Skrócona IL-8 (7-77) w ykazuje aż 10-20
- krotnie wyższą aktyw ność od cząsteczki o pełnej długości.
Może to oczywiście w istotny sposób przyspieszać napływ
granulocytów do miejsca infekcji [39]. W arto w tym miejscu
zwrócić uwagę, że aktywacja IL-8 przez MMP-9 jest p rzy­
kładem dodatniego sprzężenia zw rotnego, bow iem IL-8 po­
woduje degranulację neutrofili i b ard zo szybkie uw olnienie
MMP-9 zgrom adzonej w ziarnistościach żelatynazowych.
A ktyw na MMP-9 m oże pośrednio w pływ ać rów nież na
stężenie IL-8, poniew aż w w arun k ach zapalenia aktywuje
proIL -lp, silny induktor ekspresji genu kodującego IL-8.
Także inne chem okiny z rodziny CXC (chemokiny, w któ­
rych dw ie pierw sze z czterech zachow aw czych reszt cyste­
rnowych przedzielone są pojedynczym aminokw asem ), w
tym p ep ty d aktywujący tkankę łączną-III (CTAP-III, ang.
connective tissue activating peptide), czynnik płytkowy-4 (PF4, ang. platelet factor-4) i pochodzący z kom órek śródbłonka
peptyd aktyw ujący granulocyty obojętnochłonne (ENA-78,
ang. epithelial cell derived neutrophil activating peptide-78) są
rozpoznaw ane przez MMP-9, a w kontakcie z tym enzym em
m ogą być przecięte w kilku miejscach i tracą aktywność
biologiczną [3,40], Chem okiny z m otyw em sekwencyjnym
ELR (Glu-Leu-Arg), poprzedzającym sekwencję CXC, do
których należą m iędzy innym i IL-8, ENA-78 i CTAP-III, kie­
rują granulocyty obojętnochłonne do miejsc infekcji, a także
prom ują angiogenezę [40], Zw iązanie chem okiny CXC ze
sw oistym receptorem (CXCR-1, CXCR-2, ang. CXC chemokine receptor-1, -2) zapoczątkow uje proces przekazyw ania
sygnału, prow adzący do w zrostu w ew nątrzkom órkow ego
stężenia Ca2+. W ynikiem tego procesu jest m iędzy innym i
degranulacja neutrofili i ich migracja w kierunku w zrasta­
jącego stężenia bodźca chem otaktycznego. Degranulacja
pow oduje uw olnienie nieaktyw nej MMP-8 i MMP-9. Po ich
aktywacji (np. z udziałem reaktyw nych form tlenu, p ro d u ­
kow anych przez p o budzone granulocyty) następuje degra­
dacja białek ECM, um ożliwiająca migrację granulocytów.
Zw ażyw szy, że wiele chem okin m a charakter substratów
MMP-9, m ożna przyjąć, że enzym spełnia w tym układzie
podw ójną rolę: degradując białka ECM pozw ala na m igra­
cję kom órek, ale degradując chemokiny, także pełni funkcję
regulatorow ą [40],
Innym reprezentantem chem okin CXC jest czynnik p o­
chodzący z kom órek zrębu szpiku kostnego (SDF-1, ang.
stromal cell-derived factor-1), odgryw ający kluczow ą rolę w
rekrutacji hem atopoetycznych kom órek prekursorow ych
(CD34+). SDF-1 jest rów nież silnym chem oatraktantem
dla innych typów kom órek, głów nie spoczynkow ych lim ­
focytów i m onocytów. Odcięcie przez MMP czterech reszt
am inokw asow ych z N -końow ego rejonu cząsteczki SDF-1
pro w ad zi do utraty zdolności w iązania ze sw oistym recep­
torem (CXCR-4). Przynajmniej sześć enzym ów z tej rodziny,
w tym MMP-2, rozszczepia w iązanie peptydow e pom iędzy
czw artym a piątym am inokw asem cząsteczki SDF-1 [41].
O d d aw n a w iadom o, że CXCR-4 pełni rolę koreceptora
podczas fuzji w irusa HIV-1 (ang. human immunodeficiency
virus) i jest niezbędny do zakażania nim kom órek CD4+, a
fizjologiczny ligand tego receptora (SDF-1), blokując w ią­
zanie HIV do CXCR-4, ham uje infekcję. Zatem degradacja
SDF-1 przez MMP-2 będzie ułatw iać zakażenie w irusem
HIV. W tym kontekście w arto odnotow ać, że z kolei w irus
HIV m a zdolność indukow ania ekspresji genów kodujących
obie kolagenazy ty p u IV [42]. Z przew lekłym zakażeniem
tym w irusem bezpośrednio zw iązany jest zespół otępienny o cechach podostrego zapalenia m ózgu. O kazało się, że
MMP-2 m oże być bezpośrednio zaangażow ana w proces
neurodegeneracji, bow iem skrócona przez nią cząsteczka
SDF-1 (5-67) jest w ysoce neurotoksyczna [43].
Nie sposób w tym miejscu pom inąć faktu, że MMP-9
zajmuje w yjątkow ą pozycję w procesie mobilizacji hem a­
topoetycznych kom órek macierzystych ze szpiku kostnego
do krw i obwodowej. Bodźce stresowe, takie jak zapalenie,
uszkodzenia tkanek czy chem ioterapia indukują sekrecję
w spom nianego już wcześniej SDF-1, stym ulującego ekspre­
sję MMP-9. Działanie tego enzym u w procesie mobilizacji
hem atopoetycznych kom órek m acierzystych jest złożone i
obejmuje zarów no uw alnianie cytokin i czynników w zrostu
zw iązanych z ECM, niszczenie adhezyjnych połączeń po­
m iędzy kom órkam i m acierzystym i a środow iskiem szpiku,
jak i degradację białek ECM, um ożliwiającą migrację kom ó­
rek. Ale to jeszcze nie wszystko. W rekrutacji hem atopoe­
tycznych kom órek prekursorow ych i innych kom órek m a­
cierzystych uczestniczy rów nież czynnik w zrostu kom órek
m acierzystych (SCF, ang. stem cell factor), będący ligandem
dla receptora c-kit - białka o aktyw ności kinazy tyrozynowej
[44,45]. SCF w ystępuje w dw óch formach, powstających w
w yniku alternatyw nej obróbki potranskrypcyjnej. Elimina­
cja eksonu 6 pro w ad zi do pow stania białka transbłonow ego, podczas gdy cząsteczka o pełnej długości zaw iera miej­
sce cięcia rozpoznaw ane przez MMP-9. Przy udziale tego
enzym u powstaje form a w olna (rozpuszczalna) SCF (sSCF).
W praw dzie obie form y SCF (błonowa i rozpuszczalna) są
aktyw ne biologicznie i wydaje się, że sSCF nie jest konieczna
do praw idłow ego przebiegu konstytutyw nej hem atopoezy,
ale m a kluczow e znaczenie podczas szybkiej, indukow anej
stresem mobilizacji h em atopoetycznych kom órek m acierzy­
stych [44],
Substratam i MMP m ogą być też chem okiny z rodziny CC
czyli takie, w których dw ie pierw sze zachow ane w ewolucji
reszty cysteinowe następują bezpośrednio po sobie. Przy­
kładow o, MCP-3 (ang. monocyte chemoattractant protein) jest
substratem MMP-2. O dłączenie czterech am inokw asów z
N -końcow ego rejonu cząsteczki prow adzi nie tylko do jej
inaktywacji, ale przekształca ją w silnego antagonistę recep­
41
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
torów CCR-1, CCR-2 i CCR-3 (ang. CC chemokine receptor1, -2, -3). M etaloproteinazy, których synteza m a miejsce w
granulocytach obojętnochłonnych (MMP-8, MMP-9) nie są
zdolne do proteolitycznej degradacji MCP-3 [46], Inne M CP
(MCP-1, -2, -4) także są substratam i MMP i w kontakcie z
tymi enzym am i tracą swą aktyw ność agonistów stanu za ­
palnego.
MMP MOGĄ GENEROWAĆ
REGULATORY ANGIOGENEZY
Poza regulow aniem aktywności, czy też dostępności
cytokin, chem okin i czynników w zrostu, MMP rozcinają
rów nież inne białka, znosząc tym sam ym ich funkcje bio­
logiczne, ale często powstające p ro d u k ty degradacji mają
zupełnie now e właściwości. I tak, obie kolagenazy ty p u
IV oraz kilka innych MMP (zwłaszcza MMP-8 i MMP-13)
m ogą rozcinać prolaktynę, a jednym z pro d u k tó w d e g ra d a ­
cji jest N -końcowy fragm ent (16 kDa) [47]. Prolaktyna jest
horm onem laktotropow ym o masie cząsteczkowej 23 kDa,
w ydzielanym przez przysadkę, a jej N -końcow y fragm ent
(16 kDa), obecny w krw ioobiegu i w wielu narządach, jest
znany z bardzo silnych właściwości antyangiogennych; m a
zdolność do ham ow ania proliferacji kom órek śródbłonka
stymulow anej zasadow ym czynnikiem w zrostu fibroblastów (bFGF, ang. basic fibroblast growth factor) i czynnikiem
w zrostu śródbłonka naczyń (VEGF, ang. vascular endothelial
growth factor). Z kolei degradacja plazm inogenu przez kola­
genazy typu IV oraz MMP-7 prow adzi do pow stania innego
inhibitora angiogenezy - angiostatyny, stanowiącej 38 kDa
fragm ent tego białka (cztery pierw sze pętle) [21].
M ożna odnaleźć jeszcze więcej przykładów , w skazują­
cych na antyangiogenne działanie MMP, aczkolwiek chodzi
tu o produkty powstające w w yniku degradacji białek ECM.
Do takich inhibitorów należy endostatyna - 20 kDa p rote­
olityczny fragm ent kolagenu typu XVIII i restyna - frag­
m ent kolagenu typu XVI [1]. N egatyw nym i regulatoram i
angiogenezy są także fragm enty kolagenu IV: aresten (ang.
arresten), kanstatyna (ang. canstatin) i tum statyna (ang. tumstatin), pochodzące odpow iednio z łańcucha a l , a2 i a3 tego
białka. Jednak MMP są p rzede w szystkim bardzo skuteczne
w prom ow aniu angiogenezy. Inwazja proliferujących ko­
m órek śródbłonka na otaczające tkanki w ym aga degradacji
ECM i w tych procesach uczestniczą obie kolagenazy ty p u
IV [11]. MM P mogą rów nież stym ulow ać angiogenezę w
jeszcze inny sposób, degradując czynniki antyangiogenne.
W ykazano ostatnio, że czynnik pochodzący z nabłonka b ar­
w nikow ego siatkówki (PEDF, ang. pigment epithelium-deri­
ved factor), silny inhibitor angiogenezy, m oże być niszczony
przez MMP-2 i MMP-9 [6]. W ten sposób oba enzym y w łą ­
czone są w patogenezę niezwykle pow ażnego pow ikłania
cukrzycowego, jakim jest retinopatia proliferacyjna. W arto
jednak zaznaczyć, że działanie PEDF nie ogranicza się do
obszaru oka; om aw iane białko jest obecne w krw ioobiegu w
wystarczająco wysokim stężeniu by ham ow ać unaczynianie
w tórnych ognisk now otw orow ych [48],
MMP REGULUJĄ AKTYWNOŚĆ WIELU PROTEIN AZ
MMP zdolne są do inaktywacji aktyw atora plazm inoge­
n u typu urokinazow ego (uPA, ang. urokinase-type plasmino-
gen activator), jak i w ielu inhibitorów p roteianz serynow ych,
w tym inhibitora c^-proteinaz serynow ych (c^-PI, ang. a:proteinase inhibitor), c^-antychym otrypsyny i inhibitora-2
aktyw atora plazm inogenu (PAI-2, ang. plasminogen activa­
tor inhibitor) [49], Wreszcie, w charakterze substratów MMP
m ogą w ystępow ać inne latentne enzym y z tej rodziny, a o d ­
cięcie prodom eny pro w ad zi do ich aktywacji. Przykładem
m oże być w sp om n ian a już wcześniej MT-1MMP, uczestni­
cząca w aktywacji MMP-2 [1].
M M P W Ł Ą C Z O N E S Ą W P A T O G E N E Z Ę W IE L U C H O R Ó B
Poniew aż MMP-2 i MMP-9 rozpoznają tak w iele różno­
rodnych substratów (zarów no składników ECM, jak i spoza
ECM), zachw ianie rów now agi pom iędzy tym i enzym am i
a ich naturalnym i inhibitoram i (TIMP) m oże prow adzić
do rozw oju stanów patologicznych. K olagenazy typ u IV
w łączone są w patogenezę w ielu chorób. N iew ątpliw ie naj­
więcej w iadom o o ich udziale w rozw oju i progresji n o w o ­
tw orów (ten tem at był już podnoszony na łam ach Postępów
Biochemii [2]) oraz w chorobach sercow o naczyniow ych
[50], Ostatnio dużo m ów i się o roli tych e n zy m ów w rozw o­
ju chorób o podłożu autoim m unologicznym , takich jak cuk­
rzyca typu I oraz stw ardnienie rozsiane. W ynika to z faktu,
że podczas stanu zapalnego trzustki zak ty w o w an a MMP-9
może rozcinać insulinę na mniejsze fragm enty, a tym sa­
m ym brać udział w generow aniu im m unodom inujących
epitopów [51]. Prow adzi to do zaostrzenia przebiegu cho­
roby. Z kolei zdolność MMP, w tym obu kolagenaz ty p u IV,
do degradow ania zasadow ego białka m ieliny (MBP, ang.
myelin basic protein), jednego ze składników osłonek mielinow ych, pro w ad zi do jej zniszczenia, a odsłanianie im m unogennych epitopów w zm aga o dp o w ied ź im m unologiczną,
napędzając w ten sposób proces destrukcji w stw ardnieniu
rozsianym [52]. Nie bez znaczenia jest też fakt, że MMP-9
m oże rów nież degradow ać interferon p (IFN-[3), zarów no
endogenny, jak i p o daw an y w ram ach kuracji, jako środek
im m unom odulujący [52,53], Oczywiście szczegółow e om ó­
wienie roli MMP w e w szystkich w spo m n ian ych wcześniej
stanach patologicznych przekracza ram y niniejszego arty ­
kułu. Postanow iliśm y zatem zwrócić u w a g ę Czytelników
na udział tych enzym ów w rozw oju nadciśnienia.
UDZIAŁ MMP W PATOGENEZIE
CHOROBY NADCIŚNIENIOWEJ
Nadciśnienie tętnicze, niezw ykle w ażn y czynnik ry zy­
ka rozw oju chorób sercow o-naczyniowych, zw iązane jest
z procesem przeb u d ow y u k ład u sercow o-naczyniowego,
prow adzącym do postępującego w łóknienia m ięśnia serco­
wego. MMP odgryw ają istotną rolę w patogenezie chorób
sercowo-naczyniowych; uczestniczą w p rzeb u d o w ie ECM,
prow adzącej do w łóknienia m iokardium , pogrubienia bło­
ny w ew nętrznej tętnic, a także przyczyniają się do destabili­
zacji blaszek m iażdżycow ych [54,55].
O statnie badania w skazują, iż rola M M P w patogenezie
nadciśnienia nie spro w ad za się w yłącznie do przeb ud o w y
białek ECM. Ciśnienie krw i jest regulow ane dzięki w sp ó ł­
działaniu w spółczulnego u k ład u n erw ow ego i g rup y naczynioaktyw nych p ep ty dó w takich jak adren om ed u lin a (AM,
ang. adrenomedullin), pep ty d pochodny g enu kalcytoniny
(CGRP, ang. calcitonin-gene-related peptide), przedsionkow y
42
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
peptyd natriuretyczny (ANP, ang. atrial natriuretic peptide),
amylina oraz aktyw na endotelina-1 (ET-1, ang. endothelin-1)
[56,57],
A drenom edulina, peptyd zb u do w any z 52 reszt aminokwasowych, spokrew niony z kalcytoniną, CGRP i amyliną
[58-60], jest silnym czynnikiem rozszerzającym naczynia,
którego synteza zachodzi głów nie w kom órkach śródbłonka i mięśniach gładkich naczyń. M artinez i wsp. [57] w yka­
zali, że ad ren o m ed u lin a m oże być rozcinana przez MMP2 w kilku miejscach, co pro w adzi do pow stania sześciu
różnych p eptydów . Odcięcie siedm iu lub dziesięciu reszt
am inokw asow ych z rejonu N -końcow ego cząsteczki adrenom eduliny nie pow oduje u traty zdolności do w iązania z
receptorem , ani utraty aktyw ności biologicznej. AM (8-52)
i AM (11-52) m a w pełni zachow aną zdolność rozszerza­
nia naczyń krw ionośnych. Jednak dalsza degradacja tych
pep ty d ó w przez MMP-2 p ro w adzi do utraty tej funkcji, i
co ciekawe, jeden z p ro d u k tó w degradacji, AM (11-22) jest
czynnikiem obkurczającym naczynia, działającym za p o ­
średnictw em niezidentyfikow anego jak dotąd receptora.
Obecne w krw ioobiegu białko wiążące adrenom edulinę,
tzw. czynnik H, zapobiega degradacji tego horm onu przez
MMP-2 [57],
In vitro M M P m ogą degradow ać wiele białek nie będą­
cych składnikam i ECM, ale nie do końca rozpoznano czy
działają w ten sposób także in vivo. W przy p ad k u adrenom eduliny jest to bardzo p raw dopodobne, poniew aż takie
sam e p eptydy jakie pow staw ały w w yniku traw ienia tego
horm onu MMP-2 in vitro, udało się wyizolow ać z moczu
[57], MMP-2 m oże więc w znaczący sposób przyczyniać
się do rozw oju nadciśnienia, zw ażyw szy, że nie tylko ob­
niża poziom adren om ed ulin y (rozszerzającej naczynia), ale
także generuje p ep ty d o działaniu antagonistycznym . Ten
sam enzym m oże rów nież pośredniczyć w aktywacji p re­
kursorów horm o nó w regulujących ciśnienie krwi. Duża
endotelina-1 (ET-1, ang. big endothelin-1) (1-38) powstaje
m iędzy innym i w kom órkach śródbłonka, kom órkach mięś­
ni gładkich naczyń krw ionośnych i kardiomiocytach. Jest
czynnikiem inotropow ym , bardzo silnie obkurcza naczynia
krw ionośne, ale także działa jako mitogen [61]. Na terenie
śródbłonka naczyń przekształcenie dużej ET-1 do aktyw ne­
go h orm onu zachodzi głównie przy udziale enzym ów kon­
w ertujących endoteliny (ECEs, ang. endothelin-converting
enzymes). A ktyw ność tych enzym ów w kom órkach śród­
błonka jest b ard zo wysoka, a proteolityczne rozszczepienie
dużej ET-1 za ich pośrednictw em prow adzi do pow stania
aktyw nego p e p ty d u ET-1 (1-21) [62], W wielu chorobach
sercow o-naczyniow ych obserw ow ano podniesiony poziom
ET-1 w osoczu [63-65].
F ernandez-P atron i wsp. [66] wykazali, że d uża endotelina-1 m oże być także przekształcana do aktyw nego horm onu
przy udziale MMP-2. Pod w pływ em działania tego enzym u,
w w yniku rozszczepienia w iązania pom iędzy Gly32 a Leu33,
pow staje p ep ty d ET-1 (1-32), w ykazujący silniejsze działanie
skurczow e niż ET-1(1-21). W przeciw ieństw ie do kom órek
śródbłonka, w kom órkach mięśni gładkich naczyń, aktyw ­
ność ECE jest niska, ale zachodzi w nich ekspresja MMP-2.
W ydaje się zatem praw dopodobne, że w tych kom órkach
MMP-2 m ogłaby pośredniczyć w alternatywnej drodze ak­
tywacji ET-1 [66]. Za istnieniem takiego m echanizm u prze­
m aw ia też fakt, że w w ielu stanach patologicznych, takich
jak nadciśnienie, m iażdżyca i restenoza obserwuje się jed­
noczesny w zrost syntezy dużej ET-1 i MMP-2.
O dkrycie nowej drogi aktywacji ET-1, w której p ośredni­
czy MMP-2, może mieć istotne znaczenie farmakologiczne.
W w ielu laboratoriach p ro w ad zo n e są prace zmierzające do
skonstruow ania syntetycznych, selektyw nych inhibitorów
m etaloproteinaz. Selektywne ham ow anie MMP-2 mogłoby
stanow ić now ą farm akologiczną strategię leczenia chorób
naczyń, w których obserw ow ana jest nadekspresja genów
zarów no dla MMP-2, jak i dla ET-1.
UW AGI KOŃCOW E
Przytoczone powyżej fakty wskazują, że obie kolagenazy
typu IV mają niezw ykle szerokie możliwości m odulow ania
środow iska, w którym przebyw a kom órka. O ile ich zdol­
ność do degradow ania strukturalnych białek ECM (prze­
de w szystkim kolagenu typ u IV) była znana od daw na, to
ostatnio pojawia się coraz więcej informacji wskazujących,
że m ogą także degradow ać wiele biologicznie aktyw nych
molekuł, takich jak cytokiny, horm ony, chem okiny, czynni­
ki w zrostu, receptory błonow e i wiele innych białek spoza
ECM. Tym sam ym, kolagenazy ty p u IV zyskały now e ob­
licze. M ożna powiedzieć, że aw ansow ały do roli w ażnych
enzym ów regulujących podstaw ow e funkcje komórki. Bez
w ątpienia, na szczególną uw agę zasługuje MMP-9, która
jest nie tylko efektorem, ale też regulatorem w ielu funkcji
kom órek obronnych. Nie jest więc niczym zaskakującym,
że MM P w łączone są w patogenezę w ielu chorób, m iędzy
innymi now otw orow ych, u k ładu krążenia, nadciśnienia,
ostrych i przew lekłych chorób układu oddechow ego oraz
chorób przyzębia. Z tego p o w o d u zaczęto poszukiw ać spo­
sobu zaham ow ania ich aktywności. Skonstruow ano wiele
syntetycznych inhibitorów tych enzym ów . Batimastat a na­
stępnie m arim astat przeszły próby kliniczne już w drugiej
połowie lat 90. Pierwsze inhibitory MM P w p ro w adzon e do
badań klinicznych miały bardzo m ałą selektywność (ham o­
w ały aktyw ność w ielu enzym ów z tej rodziny), a ponadto ich
stosow anie zw iązane było z uciążliw ym i efektami uboczny­
mi, m iędzy innym i w postaci bólów mięśni i staw ów . Inhi­
bitory nowej generacji są znacznie bardziej selektywne, ale
pom im o tego, stosow anie takich leków nie doprow adziło
do spektakularnych sukcesów w terapii przeciw now otw orowej. Może to w ynikać z faktu, że rola tych enzym ów w
procesie n ow otw orow ym nie jest tak jednoznaczna jak p ier­
w otnie sądzono; MMP, a zwłaszcza kolagenazy typu IV nie­
w ątpliw ie sprzyjają unaczynieniu guza ale z ich udziałem
m ogą przecież także pow staw ać inhibitory angiogenezy.
P IŚ M IE N N IC T W O
1. H rabec E (2003) Udział kolagenaz typu IV w procesach patologicz­
nych. W ydaw nictw o U niw ersytetu M edycznego w Łodzi, Łódź, str.
18-48
2. Przybyłow ska K, Błasiak J (2001) M etaloproteinazy m acierzowe i ich
rola w progresji now otw orów . Postępy Biochem 47: 212-222
3. O rtega N, Behonick D, Stickens D, W erb Z (2003) H ow proteases regu­
late bone m orphogenesis. A nn N Y Acad Sci 995:109-116
4. Vu TH, W erb Z (2000) M atrix metalloproteinases: effectors of develop­
m ent and norm al physiology. Genes Dev 14: 2123-2133
Postęp y Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
43
5. Folgueras AR, Pendas AM, Sanchez LM, Lopez-Ohn C (2004) Matrix
m etalloproteinases in cancer: from new functions to im proved inhibi­
tion strategies. Int J Dev Biol 48: 411-424
6. Notari L, Miller A, M artinez A, Am aral J, Ju M, Robinson G, Smith LE,
Becerra SP (2005) Pigm ent epithelium -derived factor is a substrate for
matrix m etalloproteinase type 2 and type 9: im plications for dow nregulation in hypoxia. Invest Ophthalm ol Vis Sci 46: 2736-2747
7. W ong WT, Rex TS, Auricchio A, M aguire AM, C hung D, Tang W, Ben­
nett J (2004) Effect of over-expression of pigm ent epithelium derived
factor (PEDF) on developing retinal vasculature in the m ouse. Mol Vis
10: 837-844
8. Bainbridge J, Sivakum ar B, Paleolog E (2006) Angiogenesis as a thera­
peutic target in arthritis: lessons from oncology. C urr Pharm Des 12:
2631-2644
9. Kresse H, Schonherr E (2001) Proteoglycans of the extracellular m atrix
and grow th control. J Cell Physiol 89: 266-274
10. Ffrench-Constant C, Colognato H (2004) Integrins: versatile integra­
tors of extracellular signals. Trends Cell Biol 14: 678-686
11.R undhaug JE (2005) Matrix m etalloproteinases and angiogenesis. J
Cell Mol M ed 9: 267-285
12. Zaoui P, Cantin JF, Alimardani-Bessette M, M onier F, Halim i S, Morel
F, Cordonnier D (2000) Role of m etalloproteases and inhibitors in the
occurrence and progression of diabetic renal lesions. Diabetes M etab
26: 25-29
13. Ishida Y, Migita K, Izumi Y, N akao K, Ida H, K awakam i A, Abiru S, Ishibashi H, Eguchi K, Ishii N (2004) The role of IL-18 in the m odulation
of m atrix m etalloproteinases and m igration of hum an natural killer
(NK) cells. FEBS Lett 569:156-160
14. Shigemori Y, Katayama Y, Mori T, M aeda T, Kaw am ata T (2006) Ma­
trix metalloproteinase-9 is associated w ith blood-brain barrier opening
and brain edem a form ation after cortical contusion in rats. Acta Neurochir Suppl 96:130-133
15. G urney KJ, Estrada EY, Rosenberg GA (2006) Blood-brain barrier dis­
ruption by stromelysin-1 facilitates neutrophil infiltration in neuroin­
flammation. Neurobiol Dis 23: 87-96
16. Li WP, A nderson CJ (2003) Im aging m atrix m etalloproteinase expres­
sion in tum ors. Q J Nucl Med 47: 201-208
17. Imai K, H iram atsu A, Fukushim a D, Pierschbacher MD, O kada Y
(1997) D egradation of decorin by m atrix m etalloproteinases: identifi­
cation of a cleavage sites, kinetic analyses and transform ing grow th
factor-beta-1 release. Biochem J 322: 809-814
18. Kawano K, Yanagisawa S (2006) Predictive value of laminin-5 and
m em brane type 1-matrix m etalloproteinase expression for cervical
lym ph node m etastasis in T1 and T2 squam ous cell carcinom as of the
tongue and floor of the m outh. H ead Neck 28: 525-533
19. Guo P, Im anishi Y, Cackowski FC, Jarzynka MJ, Tao HQ, N ishikaw a
R, Hirose T, H u B, Cheng SY (2005) Up-regulation of angiopoietin-2,
matrix metalloprotease-2, m em brane type 1 metalloprotease, and lam inin 5 gam m a 2 correlates w ith the invasiveness of hum an glioma.
Am J Pathol 166:877-90
20. Sorrell DA, Szym anow ska M, Boutinaud M, Robinson C, Clarkson
RW, Stein T, Flint DJ, Kolb AF (2005) Regulation of genes encoding
proteolytic enzym es during m am m ary gland developm ent. J Dairy
Res 72: 433-441
21. Pepper MS (2001) Role of the m atrix m etalloproteinase and plasm ino­
gen activator-plasm in system s in angiogenesis. Arterioscler T hrom b
Vase Biol 21:1104-1117
22. Itoh Y, Seiki M (2006) MT1-MMP: a potent m odifier of pericellular
m icroenvironm ent. J Cell Physiol 206:1-8
23. van H insbergh VW, Engelse MA, Quax PH (2006) Pericellular protea­
ses in angiogenesis and vasculogenesis. Arterioscler Throm b Vase Biol
26: 716-728
24. Yu Q, Stamenkovic I (2000) Cell surface-localized m atrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and prom otes tum or inva­
sion and angiogenesis. Genes Dev 14:163-176
25. Noe V, Fingleton B, Jacobs K, Crawford HC, Verm eulen S, Steelant W,
Bruyneel E, M atrisian LM, Mareel M (2001) Release of an invasion pro­
44
m oter E-cadherin fragm ent by m atrilysin and strom elysin-11. J Cell Sci
114:111-118
26. W ang M, Zhao D, Spinetti G, Z hang J, Jiang LQ, Pintus G, M onticone
R, Lakatta EG (2006) Matrix m etalloproteinase 2 activation of transfor­
m ing grow th factor-betal (TGF-betal) and TG F-betal-type II receptor
signaling w ithin the aged arterial wall. Arterioscler T hrom b Vase Biol
26:1503-1509
27. Fingleton B (2006) Matrix m etalloproteinases: roles in cancer a n d me­
tastasis. Front Biosci 11: 479-491
28. Kim ES, Kim MS, Moon A (2004) TGF-beta-induced upregulation of
MMP-2 and MMP-9 depends on p38 MAPK, but not ERK signaling in
MCF10A hum an breast epithelial cells. Int J Oncol 25:1375-1382
29. Schonbeck U, Mach F, Libby P (1998) Generation of biologically active
IL-1 beta by matrix m etalloproteinases: a novel caspase-1-independent
pathw ay of IL-1 beta processing. J Im m unol 161: 3340-3346
30. D inarello CA (2005) Blocking IL-1 in systemic inflam m ation. J Exp 201:
1355-1359
31. Black RA, D oedens JR, M ahim kar R, Johnson R, G uo L, W allace A, Virca D, Eisenm an J, Slack J, Castner B, Sunnarborg SW, Lee DC, C ow ling
R, Jin G, Charrier K, Peschon JJ, Paxton R (2003) Substrate specificity
and inducibility of TACE (tum our necrosis factor alpha-converting en­
zyme) revisited: the Ala-Val preference, and induced intrinsic activity.
Biochem Soc Sym p 70: 39-52
32. M acEwan DJ (2002) TNF ligands and receptors-a m atter of life and
death. Br J Pharm acol 135: 855-875
33. Levi E, Fridm an R, Miao HQ, Ma YS, Yayon A, V lodavsky I (1996)
Matrix m etalloproteinase 2 releases active soluble ectodom ain of fibro­
blast g row th factor receptor 1. Proc Natl Acad Sci USA 93: 7069-7074
34. Sheu BC, H su SM, Ho HN, Lien HC, H uang SC, Lin RH (2001) A no­
vel role of m etalloproteinase in cancer-m ediated im m unosuppression.
Cancer Res 61: 237-242
35. Bachmeier BE, Iancu CM, Jochum M, Nerlich AG (2005) M atrix m e­
talloproteinases in cancer: com parison of know n and novel aspects of
their inhibition as a therapeutic approach. Expert Rev A nticancer Ther
5:149-163
36. Larsen PH, DaSilva AG, Conant K, Yong VW (2006) M yelin form ation
d uring developm ent of the CNS is delayed in m atrix m etalloproteinase-9 and -12 null mice. J Neurosci 26: 2207-14
37. C oppock HA, W hite A, Aplin JD, W estw ood M (2004) M atrix metalloprotease-3 and -9 proteolyze insulin-like grow th factor-binding prote­
in-1. Biol Reprod 71: 438-443
38. Sadowski T, Dietrich S, Koschinsky F, Sedlacek R (2003) M atrix Metal­
loproteinase 19 Regulates Insulin-like G row th Factor-m ediated Pro­
liferation, M igration, and A dhesion in H um an Keratinocytes through
Proteolysis of Insulin-like G row th Factor Binding Protein-3. Mol Biol
Cell 14: 4569-4580
39. Van den Steen PE, Proost P, W uyts A, Van D am m e J, O pdenakker
G (2000) N eutrophil gelatinase B potentiates interleukin-8 tenfold by
am inoterm inal processing, w hereas it degrades CTAP-III, PF-4, and
GRO-alpha and leaves RANTES and MCP-2 intact. Blood 96: 26732681
40. Van den Steen PE, W uyts A, H usson SJ, Proost P, Van D am m e J, O p­
denakker G (2003) Gelatinase B/M M P-9 and neutrophil collagenase/
MMP-8 process the chem okines hum an GCP-2/CXCL6, ENA-78/
CXCL5 and m ouse GCP-2/LIX and m odulate their physiological ac­
tivities. Eur J Biochem 270: 3739-3749
41. Me Q uibban GA, Butler GS, G ong JH, Bendall L, Pow er Ch, Clark-Le­
w is I, Overall ChM (2001) Matrix m etalloproteinase activity inactiva­
tes the CXC chem okine strom al cell-derived factor-1. J Biol Chem 276:
43503-43508
42. Johnston JB, Jiang Y, van Marie G, M ayne MB, Ni W, H olden J, McArt­
h u r JC, Pow er C (2000) Lentivirus infection in the brain induces m atrix
m etalloproteinase expression: role of envelope diversity. J Virol 74:
7211-7220
43. Z hang K, M cQuibban GA, Silva C, Butler GS, Johnston JB, H olden J,
Clark-Lewis I, Overall CM, Pow er C (2003) H IV -induced m etallopro­
teinase processing of the chem okine strom al cell derived factor-1 cau­
ses neurodegeneration. N at Neurosci 6:1064-1071
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
44. Heissig B, H attori K, Dias S, Friedrich M, Ferris B, H ackett NR, Crystal
RG, Besmer P, Lyden D, Moore MA, W erb Z, Rafii S (2002) Recruit­
m ent of stem and progenitor cells from the bone m arrow niche requi­
res MMP-9 m ediated release of kit-ligand. Cell 109: 625-637
45. Kollet O, Dar A, Shivtiel S, Kalinkovich A, Lapid K, Sztainberg Y, Tesio
M, Sam stein RM, Goichberg P, Spiegel A, Elson A, Lapidot T (2006)
Osteoclasts degrade endosteal com ponents and prom ote mobilization
of hem atopoietic progenitor cells. N at M ed 12: 657-664
46. Overall CM, M cQuibban GA, Clark-Lewis I (2002) Discovery of chem okine substrates for m atrix m etalloproteinases by exosite scanning:
a new tool for degradom ics. Biol Chem 383:1059-1066
47. Macotela Y, A guilar MB, Guzm an-M orales J, Rivera JC, Zerm eno C,
Lopez-Barrera F, N ava G, Lavalle C, M artinez de la Escalera G, Clapp
C (2006) M atrix m etalloproteases from chondrocytes generate an antiangiogenic 16 kDa prolactin. J Cell Sci 119:1790-1800
48. Petersen SV, Valnickova Z, Enghild JJ (2003) Pigm ent-epithelium -de­
rived factor (PEDF) occurs at a physiologically relevant concentration
in hu m an blood: purification and characterization. Biochem J 374:199206
49. Sternlicht MD, W erb Z (1999) ECM proteinases. W: Guidebook to the
Extracellular Matrix, anchor and adhesion Proteins. Kreis T, Vale R
(red) Oxford Univ Press, Oxford, str. 503-562
50. Blankenberg S, R upprecht HJ, Poirier O, Bickel C, Smieja M, Hafner G,
M eyer J, C am bien F, Tiret L (2003) Plasm a concentrations and genetic
variation of m atrix m etalloproteinase 9 and prognosis of patients w ith
cardiovascular disease. Circulation 107:1579-1585
51. D escam p FJ, M artens E, Ballaux F, Geboes K, O pdenakker G (2004) In
vivo activation of gelatinase B / MMP-9 by trypsin in acute pancreatitis
is a perm issive factor in streptozotocin-induced diabetes. J Pathol 204:
555-561
52. K urzepa J, Bartosik-Psujek H, Suchozebrska-Jesionek D, Rejdak K,
Stryjenka-Zim m er M, Stelmasiak Z (2005) Rola m etaloproteinaz macierzy zew nqtrzkom órkow ej w patogenezie stw ardnienia rozsianego.
N eurol N eurochir Pol 39: 63-67
56. Overall CM (2004) Dilating the degradom e: m atrix m etalloproteinase
2 (MMP-2) cuts to the heart of the m atter. Biochem J 383: e5-7
57. M artinez A, Oh HR, U nsw orth EJ, Bregonzio C, Saavedra JM, StetlerStevenson WG, C uttitta F (2004) Matrix m etalloproteinase-2 cleavage
of adrenom edullin produces a vasoconstrictor out of a vasodilator.
Biochem J 383: 413-418
58. M artinez A, Julian M, Bregonzio C, Notari L, M oody TW, C uttitta F
(2004) Identyfication of vasoactive nonpeptidic positive and negative
m odulators of adrenom edullin using a neutralizing antibody-based
screening strategy. Endocrinology 145:3858-3865
59. Postula M, M akowiecka-Cieśla M, Prejbisz A, Januszewicz A (2003)
A drenom edullina w nadciśnieniu tętniczym i innych chorobach ukła­
du sercowo-naczyniowego. N adciśnienie tętnicze 7:105-114
60. Nicholls MG (2004) H em odynam ic and horm onal actions of adreno­
m edullin. Braz J Med Biol Res 37:1247-1253
61. Giannessi D, Del Ry S, Vitale RL (2001) The role of endothelins and
their receptors in heart failure. Pharm acol Res 43:111-126
62. D'Orleans-Juste P, Plante M, H onoré JC, Carrier E, Labonte J (2003)
Synthesis and degradation of endothelin-1. Can J Physiol Pharm acol
81: 503-510
63. Yip HK, W u CJ, Chang HW, Yang CH, Yu TH, Chen YH, H ang CL
(2005) Prognostic value of circulating levels of endothelin-1 in patients
after acute m yocardial infarction undergoing prim ary coronary angio­
plasty. Chest 127:1491-1497
64. Parker JD, Thiessen JJ (2004) Increased endothelin-1 production in pa­
tients w ith chronic heart failure. A m J Physiol H eart Circ Physiol 28:
H1141-1145
65. Cardillo C, Cam pia U, Iantom o M, Panza JA (2004) E nhanced vascular
activity of endogenous endothelin-1 in obese hypertensive patients.
H ypertension 43: 36-40
66. Fem andez-Patron C, Radomski MW, D avidge ST (1999) Vascular m a­
trix metalloproteinase-2 cleaves big endothelin-1 yelding a novel vaso­
constrictor. Circ Res 85: 906-911
53. O pdenakker G, Nelissen I, Dam m e JV (2003) Functional roles and
therpeutic targeting of gelatinase B and chem okines in m ultipe sclero­
sis. Lancet N eurol 2: 747-56
54. D 'A rm iento J (2002) Matrix m etalloproteinase disruption of the extra­
cellular m atrix and cardiac dysfunction. Trends Cardiovasc Med 12:
97-101
55. N ew by AC (2005) Dual role of matrix m etalloproteinases (matrixins)
in intim al thickening and atherosclerotic plaque rupture. Physiol Rev
85:1-31
Substrates of matrix m etalloproteinases
Elżbieta Hrabec , Julia Naduk, Małgorzata Stręk, Zbigniew Hrabec
D ep artm en t of M edical Enzym ology, M edical U niversity of Lódź, 6 /8 M azow iecka St., 92-215 Łódź
;e-m ail: ehrabec@ zdn.am .lodz.pl
Key words: m atrix m etalloproteinases, MMP, type IV collagenases, extracellular m atrix
ABSTRACT
Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-dependent endopeptidases that cleave protein com ponents of extracellular matrix such as collagens, lam inin, fibronectin, proteoglycans and contribute to cell migration by elim inating the surrounding extracellular matrix and basement
membrane barriers. However, the extracellular matrix is not sim ply an extracellular scaffold because, for example, it contains sites that can
bind growth factors; therefore, degradation of the extracellular matrix com ponents by MMPs can alter cellular behavior. MMPs also cleave
a variety of non-ECM proteins, including cytokines, chem okines, and growth factors, activating or inactivating them, or generating other
products that have biological consequences. The im m une system is also influenced by MMPs. For that reason, the function of MMPs is much
more com plex and subtle than sim ple dem olition. MMPs are essential for embryonic developm ent and morphogenesis, however, exuberant
expression of these enzym es has been associated w ith a variety of destructive diseases, including tumor progression, cardiovascular diseases
and autoim m une diseases.
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
45
Rola lam in i mutacji genu LMNA w fizjologicznym i przedw czesnym starzeniu
STRESZCZENIE
Małgorzata Alicja Śliwińska
Pracow nia M olekularnych P odstaw Starzenia,
Z akład Biochemii, Instytut Biologii D ośw iad­
czalnej im. M arcelego N enckiego PA N, W ar­
szaw a
;Pracow nia M olekularnych P odstaw Sta­
rzenia, Z akład Biochemii, Instytut Biologii
D ośw iadczalnej im. M arcelego N enckiego
PAN, ul. Pasteura 3, 02-093 W arszaw a; e-mail:
m .sliw inska@ nencki.gov.pl, tel.: (022) 589 22
50
A rtykuł otrzym ano 30 października 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 14 gru d n ia 2006 r.
Słowa kluczowe: lam iny, lam inopatie, proge­
ria H utchinson-G ilford,
W ykaz skrótów: BAF (ang. barrier to autointegration factor) - represor transkrypcji; CDK
(ang. cyclin dependent kinase) - kinaza cyklinozależna; E2F - czynnik transkrypcyjny; ER
(ang. endoplasmic reticulum) - siateczka śródplazm atyczna; FACE 1 (ang. farnesylated proteins-converting enzyme 1) - m etaloproteinaza
zależna od jonów cynku; FTI (ang. farnesyl
transferaze inhibitor) - inhibitor transferazy farnezylow ej; GCL (ang. germ cell-less) - represor
transkrypcji; HGPS (ang. Hutchinson-Gilford
progeria syndrome) - progeria H utchinson-G il­
ford; HP1 (ang. heterochromatin protein 1) - niehistonow e białko uczestniczące w tw orzeniu
heterochrom atyny i w yciszaniu genów; INM
(ang. inner nuclear membrane) - w ew nętrzna
błona jądrow a; LAP (ang. lamin associated prote­
in) - białko zw iązane z lam inam i; LM NA - gen
kodujący lam iny typu A; LMNB1 - gen k o d u ­
jący lam inę BI; LMNB2 - gen kodujący lam iny
B2 i B3; MDM2 (ang. murine double minute 2)
- ligaza ubikw itylow a, negatyw ny regulator
białka p53; O N M (ang. outer nuclear membra­
ne) - zew n ętrzn a błona jądrow a; OCT-1 (ang.
octamer-binding transcryption factor 1) - czynnik
transkrypcyjny; Rb (ang. retinoblastoma protein)
- białko retinoblastom a; R eel (ang. prenyl pro­
tein protease Reel) - proteaza białek prenylow anych; SREBP-1 (ang. steroid response element bin­
ding protein-1) - czynnik transkrypcyjny, W R N
- gen kodujący helikazę DNA; ZMPST24 (ang.
zinc metalloproteinase STE24 homolog) - m etalo­
proteinaza zależna od jonów cynku
Podziękowanie: Chciałabym bardzo serdecz­
nie podziękow ać Pani Prof. d r hab. Ewie Siko­
rze, za cenne uw agi, życzliw ą krytykę i cierpli­
w ość p odczas redagow ania tego m an u sk ry p tu
am iny są białkami należącymi do rodziny filam entów pośrednich typu V. W iadom o już,
że są one nie tylko białkami strukturalnymi jądra komórki, ale też wpływ ają na struk­
turę chromatyny, regulują ekspresję genów , warunkują rozm ieszczenie i praw dopodobnie
stabilność innych białek. Tak jak lam iny pełnią w iele różnych funkcji w komórce, tak też
mutacje gen ó w kodujących te białka mogą w różny sposób w pływ ać na komórkę i w rezul­
tacie m ieć różne skutki. Mutacje genu LM NA są przyczyną licznych chorób zwanych lam inopatiami. Wśród lam inopatii znajdują się choroby dotyczące tkanki m ięśniow ej, tłuszczow ej,
aksonów, a także progerie, czyli choroby objawiające się przedwczesnym starzeniem, m.in.
progeria H utchinson-G ilford (HGPS). Wydaje się, że te same m echanizm y m olekularne, któ­
re są od p ow ied zialne za przedwczesne starzenie komórek pacjentów z HGPS, przyczyniają
się do starzenia komórek prawidłowych.
L
WPROWADZENIE
Jedną z cech odróżniających kom órkę eukariotyczną od prokariotycznej jest
obecność jąd ra kom órkow ego, organellum w ydzielonego z cytoplazm y otoczką
jądrow ą. W skład otoczki jądrowej w chodzi podw ójna błona jądrow a, kom plek­
sy białek p oró w jądrow ych oraz lam ina jądrow a (ang. nuclear lamina), zw ana
także blaszką jądrow ą. Błonę jądrow ą tw orzą dw ie błony: zew nętrzna (ONM,
ang. outer nuclear membrane) i w ew nętrzna (INM, ang. inner nuclear membrane),
łączące się w miejscach, gdzie znajdują się pory jądrow e - kom pleksy białek re­
gulujących tran sp ort pom iędzy jądrem a cytoplazmą. Z ew nętrzna błona jądro ­
w a przechodzi w siateczkę śródplazm atyczną i posiada podobne biochem iczne
i funkcjonalne właściwości, natom iast cechą charakterystyczną dla w ew nętrznej
błony jądrow ej jest obecność białek błonow ych zw anych transbłonow ym i biał­
kam i otoczki jądrowej, kotw iczonych w błonie podczas interfazy [1].
Tuż pod w ew n ętrzn ą błoną jądrow ą znajduje się blaszka jądrow ą będąca
siecią białkow ą oddziałującą z różnym i białkami i chrom atyną, zapew niająca
struk tu raln ą integralność otoczce jądrowej [2], G łów nym składnikiem blaszki
jądrowej są lam iny (ang. lamins) - białka należące do rodziny filam entów po ­
średnich (Ryc. 1).
Zainteresow anie otoczką jądrow ą znacznie w zrosło od kiedy odkryto, że m u ­
tacje w genach zarów no białek błony jądrowej, jak i lam in czy białek kom plek­
sów porów jądrow ych są przyczyną licznych chorób dziedzicznych określanych
w spólną n azw ą lam inopatii (ang. laminopathies) jeśli mutacja dotyczy genów la­
m in lub otoczkopatii
(ang. envelop athies),
jeśli m utacje zaszły
w obrębie genów
białek INM lub p o ­
rów jądrow ych [1],
Ponadto zm iany w
ekspresji lam in co­
raz częściej łączy się
z rozw ojem n o w o ­
tw orów [1,3,4].
LAMINY
- PIERWSZA
ODSŁONA
Lam iny
są
to
białka należace do ^yc’na I’ R o z m ie szc zen ie
^
rodziny filam entów
46
la m in w jądrze. Z a zn a cz o n o g łó w n e e lem en ty bud o w y jądra: p o d w ó jn ą b ło n ę jąd row ą, por ora z la m in y tw o rzą ce b la szk ę jądrow ą.
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
pośrednich typu V. Podobnie jak w szystkie filamenty po­
średnie rów nież lam iny składają się z trzech części: krótkiej
N-końcowej dom eny (ang. head domain), centralnej a-helikalnej dom eny (ang. rod domain) oraz C-końcowej dom eny
globularnej (ang. taił domain). Ze w zględu na strukturę biał­
kow ą i w zór ekspresji laminy podzielono na laminy typu A
i B [5],
U zw ierząt kręgow ych syntetyzow ane są liczne laminy,
zarów no w formie specyficznej dla kom órek linii ro zro d ­
czej, em brionów i kom órek som atycznych. W kom órkach
człowieka w ystępują trzy różne geny lam in (LM N A , LMNB1
i LMNB2), kodujące w sum ie siedem różnych białek (cztery
lam iny typu-A oraz trzy laminy typu-B). W szystkie cztery
laminy typu-A (A, AA10, C, C2) są p ro d u k tam i różnicow e­
go cięcia i składania mRNA (ang. splicing) genu LM NA. W
większości zróżnicow anych kom órek głów nym i p ro d u k ta­
mi genu LM NA są lam iny A i C. Lamina AA10 pozbaw iona
jest egzonu 10, w ykryto ją w kom órkach now otw orow ych,
ale też w licznych typach kom órek praw idłow ych, nato­
m iast lam ina C2 jest p roduktem genu LM N A specyficznym
dla kom órek linii rozrodczej [1,6]. Jak d o tąd opisano trzy la­
m iny typu-B. Lamina BI w ydaje się unikalnym produktem
genu LMNB1, zaś w w yniku różnicow ego cięcia i składania
m RN A genu LMNB2 powstaje lam ina B2 występująca w
większości kom órek oraz lamina B3, która ulega ekspresji
jedynie w sperm atocytach [1],
Lam iny stanow ią substrat kinazy cyklinozależnej 1
(CDK1) oraz kinaz mitotycznych. Podczas interfazy i m i­
tozy laminy ulegają fosforylacji, blaszka jądrow a rozpada
się, zaś tworzące ją lam iny typu-A (A i C) rozpraszają się
w postaci rozpuszczalnych dim erów , podczas gdy laminy
typu-B (BI i B2) pozostają w kontakcie z błonam i [1], Lami­
ny typu-A i B różnią się nie tylko zachow aniem podczas m i­
tozy, ale także odm iennym w zorem ekspresji w kom órkach.
Laminy typu-B zapew niają integralność jądra kom órkow e­
go, są niezbędne do przeżycia kom órki, jak też p raw id ło w e­
go rozwoju [1,7]. Laminy BI i B2 w ystępują w większości
komórek, zarów no w życiu płodow ym , jak i w kom órkach
organizm u dorosłego. W przeciw ieństw ie do lam in typu-B,
które uw aża się za podstaw ow e elem enty budujące laminę
jądrow ą, laminy typu-A w ydają się pełnić bardziej w yspe­
cjalizowane funkcje, a ich ekspresja zazwyczaj skorelow ana
jest z różnicow aniem kom órki [1], Św iadczy o tym fakt, że
zarodki ludzkie pozbaw ione lam in typu-A um ierają jesz­
cze w czasie życia płodow ego lub wkrótce po urodzeniu,
podczas gdy kom órki bez lam in A i C w hodow li dzielą się
praw idłow o [1,7].
Karioszkielet tw orzony przez lam iny pom aga w organi­
zacji kom pleksów białkow ych w obrębie jądra, ich interakcji
z chrom atyną, jak rów nież zapew nia strukturalną podporę
jądra [8], Laminy uczestniczą w regulacji ekspresji genów i
replikacji DNA, niemniej m echanizm tego procesu nie jest
do końca poznany.
O D P R E L A M IN Y D O L A M IN Y
W szystkie laminy z wyjątkiem lam iny C pow stają jako
pre-laminy, posiadające na C-końcu m otyw CaaX (cysteina,
dw a am inokw asy alifatyczne, dow olny am inokw as), zw any
rów nież Caax-box [5]. M otyw ten podlega sekwencji zd a­
rzeń prow adzących do farnezylacji i metylacji zawartej w
nim reszty cysteiny. Przyłączenie gru p y farnezylowej do
reszty cysteiny zachodzi w nukleoplazm ie i jest sygnałem
do proteolitycznego odcięcia grup y aaX, a następnie m ety­
lacji tejże cysteiny [1,9,10], (Ryc. 2). Zarów no farnezylacja,
jak i metylacja, są procesami niezbędnym i by lamina A i la­
miny typu-B mogły zostać zakotw iczone w INM. Jednakże
z chwilą przem ieszczenia do INM drogi laminy A i lamin
typu-B rozchodzą się. Podczas gdy lam iny typu-B pozosta­
ją farnezylow ane przez cały okres trw ania, lam ina A ulega
cięciu przez m etaloproteinazę zależną od cynku ZMPSTE24
(FACE-1) w obrębie sekwencji zlokalizowanej piętnaście
reszt am inokw asow ych powyżej farnezylowanej reszty cy­
steiny. W ten sposób pow staje ostateczna forma lam iny A.
Utracie grupy farnezylowej lamina A zaw dzięcza w łaściw o­
ści rozpuszczalne podczas mitozy, gdyż w tej formie białko
to nie jest w stanie pozostać zw iązane z błoną z chwilą gdy
dochodzi do ro zp ad u blaszki jądrowej.
Badania in vitro w ykazały, że m etaloproteinaza ZMPSTE24 jest niezbędna do p rzep row ad zenia tylko drugiej
endoproteolizy w procesie obróbki lam iny A, natom iast
pierwsza (odcięcie grup y aaX) m oże zostać p rzeprow ad zo­
na przez ZMPSTE24 lub Reel (ang. prenyl protein protease 1)
[8],
CUD—
D R A STY C ZN E SK U TK I D R O BN EJ
Z M IA N Y - M U T A C JE G E N U L M N A
cooh
Lamina A
R y cin a 2. O d p re-la m in y d o lam iny. N a sch em acie p r z e d s ta w io n o m odyfikacje
p otra n slacyjn e jakim u le g a pre-lam in a A n im stanie się lam in ą A.
Jak dotąd nie są znane choroby dziedziczne zw iązane z
mutacjami w genach LMNB1 i LMNB2, przypuszczalnie mu-
47
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
MODEL STRUKTURALNY
MODEL EKSPRESJI GENÓW
Zmiana struktury lamin A powoduje zaburzenia
budowy blaszki jądrowej i jej odtwarzania po mitozie
oraz zaburzenia oddziaływań z białkami
strukturalnymi
Zaburzenia oddziaływań z chromatyną
i czynnikami transkrypcyjnymi
Utrata lub nieprawidłowa
lokalizacja heterochromatyny
Obniżenie stabilności lamin
Kruchość jąder
Zmiany w kontroli transkrypcji
Zaburzenia położenia
i migracji jądra
Zaburzenia równowagi między
proliferacją a różnicowaniem
Zaburzenia metaboliczne
MODEL RETIKULARNY
MODEL CYKLU KOMÓRKOWEGO
Osłabienie oddziaływań lamin z białkami błony
jądrowej, przemieszczanie się białek INM do ER
Zaburzenia funkcji białka Rb
R y cin a 3. H ip o te ty czn e m o d ele próbujące w yja śn ić m ole k u la r n e p o d s ta w y la m in o p atii. P r zed sta w io n o p r o p o n o w a n e p rzy c zy n y (tu ż p o d n a z w ą m o d elu ) o ra z sku tk i na
p o d sta w ie [11],
tacje takie są letalne [5]. N atom iast w ykryto już p o n ad 150
mutacji w genie LM NA odpow iadających za różne choroby
dziedziczne zw ane lam inopatiam i (aktualny w y kaz do stęp ­
ny jest na stronie internetowej „Leiden m uscular d y stro p h y
pages" p o d adresem h ttp ://w w w .d m d .n l/lm n a _ h o m e .
html).
po podziale m itotycznym , czy też podczas w zrostu jądra w
interfazie. Osłabienie struktury blaszki jądrowej m oże tak­
że destabilizow ać w iązanie lam in z cytoszkieletem aktyno­
w ym , co m oże pow odow ać n iepraw idłow e kotwiczenie i
lokalizowanie jądra kom órkow ego [5,11].
Pytanie jak to się dzieje, że mutacje jednego genu p o w o ­
dują tak liczne i różnorodne choroby nadal pozostaje o tw a r­
te. Z aproponow ano cztery modele próbujące na nie o d p o ­
wiedzieć (Ryc. 3).
Laminy A zm ienione na skutek mutacji nie są w stanie
zapew nić praw idłow ego rozmieszczenia białek błony ją­
drowej, co także m oże być przyczyną choroby. N a takim za­
łożeniu opiera się m odel retikularny [11], Jeżeli pow stałe ze
zm utow anego genu laminy nie oddziałują z białkami błony
jądrowej w sposób praw idłow y, to białka te m ogą zacząć
się przem ieszczać w obrębie d w u w arstw y lipidowej, jak też
p oprzez pory jądrow e i w ten sposób znaleźć się w siatecz­
ce śródplazm atycznej. N iew ykluczone, że białka jądrow e
obecne w siateczce śródplazm atycznej oddziałują w sposób
niefizjologiczny z białkami tego p rzedziału kom órkow ego,
co m oże mieć w pływ na funkcje metaboliczne, np. m etabo­
lizm kw asów tłuszczow ych w adipocytach czy hom eostazę
w apniow ą w kom órkach m ięśniow ych [11].
Pierwszy, zw any strukturalnym , opiera się na założeniu,
że p odstaw ow ą funkcją lam in jest ochrona strukturalnej in­
tegralności jądra komórki. Zgodnie z tym założeniem m u ta ­
cje lamin A osłabiają strukturę blaszki jądrowej i zm ieniają
jej właściwości mechaniczne czyniąc ją bardziej p o d atn ą
na czynniki stresowe. Ponadto, mutacje m ogą p ow od o w ać
zm iany b u d o w y cząsteczek lamin, co m oże w p ły w ać na łą­
czenie się tych białek podczas odtw arzania blaszki jądrow ej
Inny m odel zakłada, że lam iny typu-A oraz białka z nimi
zw iązane m ogą być zaangażow ane w regulację ekspresji
genów, rów nież tych specyficznych tkankow o [5,12]. D la­
tego też mutacje genu LM NA m ogą mieć różny skutek w
różnych kom órkach. Laminy A pow stałe ze zm utow anego
genu m ogą pow odow ać zaburzenia ekspresji genów za­
rów no bezpośrednio, poprzez oddziaływ anie z czynnikam i
transkrypcyjnym i, jak i na poziom ie epigenetycznym w p ły ­
W śród chorób wynikających z mutacji genu kodującego
laminy typu-A są m.in. choroby dotyczące u k ła d u m ięśnio­
wego (dystrofia Emery-Dreifuss), tkanki tłuszczowej (syn­
drom Seip) oraz aksonów (choroba Charcot-M arie-Tooth
typu 2) [1,5,6]. N iedaw no w ykazano rów nież zw iązek m u ­
tacji w genie LM NA z chorobam i objawiającymi się p rz e d ­
w czesnym starzeniem, m.in. progerią H utchinson-G ilford
(HGPS) czy nietypow ym syndrom em W ernera [5,6].
48
w w w .postepybiochem i i.pl
http://rcin.org.pl
wając na tw orzenie heterochrom atyny. W grupie regulato­
rów transkrypcyjnych podejrzew anych o oddziaływ anie z
laminami lu b / i białkami LAP (ang. lamin associated proteins)
są m.in. białka takie jak OCT-1 (ang. octamer-binding transcryption factor 1), GCL (ang. germ cell-less), SREBP-1 (ang.
steroid response element binding protein-1), BAF (ang. barrier
to autointegration factor) oraz białko Rb (ang. retinoblastoma
protein), niemniej m echanizm m olekularny leżący u p o d ­
staw regulacji funkcji tych białek przez lam iny nie jest jasny
[5,11,13],
N iedaw no zaproponow ano rów nież czw arty m odel, m o­
del cyklu kom órkow ego, podkreślający rolę lamin typu-A
w proliferacji kom órek [11]. Z godnie z tą hipotezą mutacje
LM NA przyczyniają się do zaburzeń kontroli proliferacji ko­
mórek, zwłaszcza ponow nego wejścia w cykl kom órkow y
kom órek organizm u dorosłego. M olekularny m echanizm
tego procesu nie jest jeszcze znany. Przypuszczalnie laminy
uczestniczą w zależnym od białka Rb m echanizm ie kontroli
rów now agi m iędzy proliferacją a różnicow aniem komórek.
Badania przep ro w ad zo n e na m ioblastach ze zm utow aną,
pow odującą dystrofię formą laminy A w ykazały, że kom ór­
ki te nie są w stanie różnicować in vitro, zaś w kom órkach
m yszy LMNA-null poziom białka Rb jest znacznie obniżo­
ny. W kom órkach tych myszy białko Rb jest gw ałtow nie
deg rad o w an e przez proteasom, zatem najpraw dopodobniej
kom pleksy lam in A /C chronią je przed proteasom alną d e­
gradacją [14]. Ponadto wykazano, że in vivo hypofosforylow ane białko Rb (w tej formie białko Rb działa jako represor
transkrypcji) i laminy A /C kolokalizują na obrzeżu jądra
zaś in vitro Rb wiąże laminy A /C . O znacza to, że aktyw ność
tego białka jako represora transkrypcji koreluje z wiązaniem
przez nie lam in [12]. Białko Rb odgryw a bardzo w ażną rolę
w procesie starzenia replikacyjnego (opisano w dalszej czę­
ści tego artykułu oraz Ryc. 5), zatem fakt, iż laminy w p ły ­
wają na funkcje tego białka może tłum aczyć obserw ow ane
w p rzy p ad k u niektórych mutacji genu LM N A sym ptom y
przedw czesnego starzenia.
Z ap roponow ane modele nie w ykluczają się wzajemnie,
a wręcz przeciw nie, w ydaje się, że najpraw dopodobniej to
w łaśnie kombinacja wszystkich tych m echanizm ów - p rzy ­
czyniających się w różnym stopniu - o dp o w iad a za różno­
rodność patologicznych fenotypów obserw ow anych u p a ­
cjentów z laminopatiam i.
roku, a najczęstszą przyczyną śmierci jest zaw ał serca lub
zastoinow a niew ydolność serca [17,18],
Cechą charakterystyczną jąder fibroblastów pacjentów z
HGPS jest zm ieniony kształt (często wielopłatowość, w puklenia czy p rzepuklina jądrowa), w zrost uszkodzeń DNA
oraz sp ad ek ekspresji licznych białek jądrow ych m.in. HP1
(ang. heterochromatin protein 1) oraz białek zw iązanych z la­
m inam i A -LAP2 (ang. lamin associated protein 2) [19]. P onad­
to zaobserw ow ano, że w kom órkach osób z HGPS zmianie
ulega w zó r modyfikacji histonów, ze spadkiem specyficz­
nej dla heterochrom atyny metylacji reszty lizyny dziew ią­
tej h istonu H3 (Tri-Me-K9H3) [19,20]. Również aktywność
transkrypcyjna tych kom órek jest nieznacznie niższa mimo
m asowej dekondensacji chrom atyny [21].
U po d ło ża progerii H utchinson-Gilford leży mutacja
genu LM N A kodującego laminę A. Najczęstszą mutacją w
HGPS jest heterozygotyczna Gly608 —► Gly608 z zam ianą cytozyny na tym inę, pow odująca zaburzenia różnicowego
cięcia i składania mRNA, a w konsekwencji pow staw anie
skróconej o 50 am inokw asów , dominującej pod w zględem
funkcji wersji lam iny A, laminy AA50, zwanej też progeryną
[2,5,19], P rzew idy w an a sekwencja am inokw asow a progeryny posiada miejsce farnezylacji, natom iast jest pozbaw iona
m o ty w u RSYJLLG niezbędnego by m etaloproteinaza ZMPSTE24 m ogła dokonać endoproteolizy, co blokuje ostatni
etap dojrzew ania lam iny A oraz potencjalnego miejsca fo­
sforylacji na serynie 625 [2,21] (Ryc.4). W przeciwieństwie
do p relam iny A z niefarnezylow aną cysteiną CaaX, progeryna g rom adzi się w postaci nukleoplazm atycznych agre­
gatów nie zw iązanych z błonami [8].
Inną chorobą objawiającą się przedw czesnym starzeniem,
w której w y kry to mutacje genu LM NA, jest nietypow y syn­
d ro m W ernera. Klasyczny syndrom W ernera (WS) został
opisany jako autosom alna recesywna choroba dziedziczna,
będąca skutkiem mutacji genu W R N kodującego helikazę
DNA. S yn d ro m W ernera jest chorobą częstszą niż HGPS,
dotyka 1:100000 osób. Wiele objawów klinicznych w y stęp u ­
je zaró w n o w HGPS, jak i w syndrom ie W ernera, natom iast
objawy te u pacjentów z HGPS pojawiają się zazwyczaj w
pierw szych latach życia, podczas gdy u chorych z syndro­
m em W ernera znacznie później (w dorosłym życiu). W śród
Ser625 potencjalne miejsce fosforylacji
PRO GERIA H U T C H IN S O N -G IL F O R D
C H O R O B Ą „D O JR ZEW AN IA LAMINY"
Progeria Hutchinson-G ilford (HGPS), rzadka choroba
w aru nk o w an a genetycznie (autosom alna dominująca),
charakteryzująca się w zm ożonym i przedw czesnym sta­
rzeniem , została opisana ponad sto lat tem u [15,16]. Szacuje
się, że jedna osoba na osiem milionów z a p ad a na tą chorobę
[2], Osoby dotknięte HGPS wydają się z d ro w e w m omencie
urodzenia, jednakże zazwyczaj już w przeciągu pierw szych
dw óch lat życia pojawiają się pierw sze oznaki choroby ta­
kie jak spow olniony w zrost, utrata włosów , rzęs, brw i oraz
lipodystrofia (w szczególności znaczna u trata podskórnej
tkanki tłuszczowej), a w późniejszych latach problem y ze
staw am i, co prow adzi do upośledzenia zdolności rucho­
w ych [2,17], Średnia długość życia chorych na HGPS to 13,4
Miejsce cięcia w przypadku mutacji
R y cin a 4. K r ytyczn e m iejsce alte rn a ty w n eg o cięcia i składan ia p roduktu gen u
L M N A . N a s c h em a cie za z n a c z o n o miejsca cięcia p rod uk tu p r a w id ło w e g o gen u
L M N A oraz a llelu L M N A p o w stającego w w y n ik u p un k tow ej m utacji w y s tę p u ­
jącej w H G PS. W w y n ik u m utacji p ow sta je m R N A , k tórego p rod u k t b iałk o w y
p o z b a w io n y jest d r u g ie g o m iejsca cięcia (o zn a cz o n e g o na sch em a cie jako m iej­
sce e n d o p r o te o lity c z n e g o cięcia) n ie z b ę d n e g o w p rocesie dojrzew an ia la m iny A
(patrz Ryc. 2) ora z m iejsca fosforylacji na reszcie Ser 625 na p o d sta w ie [21].
49
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
pacjentów z sy n d ro m em W ernera, w przeciw ieństw ie do
pacjentów z HGPS, z ano to w an o w ysoki odsetek zachoro­
w ań na now otw ory, aczkolw iek śred n ia długość życia osób
z syndrom em W ernera jest d łu ższa (średnio 47 lat) niż w
przypadku osób z HGPS (13,4 lat) [2,18].
Fonga ponadto w ykazały, że niejako lam ina C jest w stanie
funkcjonalnie zastąpić lam inę A. Potencjalną strategią tera­
peutyczną mogłoby być zatem w yelim inow anie pre-lam iny
A przy pom ocy np. antysensow nych oligonukleotydow lub
RNAi.
U 15% osób, u których na p o d staw ie kryteriów klinicz­
nych rozpoznano sy n d ro m W ernera, nie znaleziono mutacji
genu WRN, natom iast w y k ry to m utację genu LM N A. Takie
przypadki n azw an o n iety p o w y m sy n d ro m e m W ernera [6].
Inny sposób usunięcia lam iny AA50 z kom órki za p ro ­
ponow ali Scaffidi i Misteli [19,22]. Jako że za pow staw anie
lam iny AA50 odpow iedzialna jest m utacja prow adząca do
pow stania kryptycznego miejsca cięcia i składania mRNA,
zatem zaprojektow ali oni oligonukleotyd (morfolino
ex o ll), który kom plem entarnie blokuje region w egzonie
11, zawierający mutację uniem ożliwiając maszynerii ró ż­
nicowego cięcia i składania m RN A dostęp do niego [22].
Badania z użyciem m orfolino e x o ll w ykazały, iż przy jego
zastosow aniu możliw e jest przyw rócenie praw idłow ego
różnicow ego cięcia i składania mRN A m inigenu lam iny A
w kom órkach HeLa [22]. Aby spraw dzić, czy przy pom ocy
e x o ll m ożliw e jest przyw rócenie praw idłow ego różnicow e­
go cięcia i składania mRN A endogennego transkryptu genu
LM NA, w p ro w adzo n o e x o ll do fibroblastów HGPS. W yka­
zano, że po czterech dniach od w pro w ad zen ia e x o ll udało
się w yelim inow ać naw et do 90% błędnie ciętego i składa­
nego mRNA laminy A. P odobny efekt uzyskano rów nież
w pięciu innych liniach kom órkow ych w y p ro w ad zon y ch
z kom órek pobranych od pacjentów HGPS (trzech liniach
fibroblastów skóry i limfocytach B). Przyw rócenie p ra w id ­
łowego cięcia i składania p ro d u k tu genu LM N A d o p ro ­
w adziło do w yelim inow ania lam iny AA50, przyw rócenia
praw idłow ej morfologii jąder oraz praw idłow ego poziom u
metylacji reszty lizyny dziewiątej histonu H3 (Tri-Me-K9), a
także regulacji licznych genów, których deregulacja charak­
teryzuje kom órki HGPS [22].
POTENCJALNE STRA TEG IE TER APEUTY CZNE
W kom órkach pacjentów z HGPS obecności zm utow anej
form y laminy A tow arzyszy sp ad ek pozio m u praw idłow ej
form y tego białka, zatem o b serw o w ane zm iany w kom ór­
kach m ogą być sp o w o d o w a n e z aró w n o sp adk iem poziom u
funkcjonalnej, praw idłow ej form y lam iny A, jak też d o m in u ­
jącym negatyw nym efektem lam iny AA50 [22]. P rzep ro w a­
dzono serię dośw iadczeń polegających na w p ro w ad zen iu
dzikiej formy lam iny A do kom órek pob ran y ch od pacjen­
tów z HGPS i zaobserw ow ano, że p o d w y ższen ie poziom u
prawidłowej form y lam iny A nie jest w stanie p rz y w ró ­
cić praw idłow ej morfologii kom órki, a p o n a d to obecność
zmutow anej form y lam iny w p ły w a na w łaściw ości dzikiej
formy. Zm iana w łaściw ości lam iny A w obecności lam iny
AA50 sugeruje, iż ta d ru g a w y w iera n eg aty w n y dom inujący
w pływ w kom órkach osób z HGPS. P o nadto w p ro w adzen ie
laminy AA50 d o z d ro w y ch fibroblastów indukuje zm iany
morfologii jąder kom ó rk o w y ch przypom inające te obser­
w ow ane w kom órkach HGPS [22], Zatem , aby przyw rócić
praw idłow ą m orfologię k o m ó rk o m chorych na H G PS nale­
ży usunąć z tych kom órek lam inę AA50.
Fong i wsp. [23] w y h od o w ali m yszy ze z m u to w a n y m allelem genu LmnaLCO/LCO, posiadające jedynie lam inę C, nie
produkujące tra n sk ry p tu pre-lam iny A. Z aró w n o zdolność
w zrostu, długość życia, s tru k tu ra kości i m ięśni tych m y­
szy nie odróżnia ich od m yszy dzikich. Podobnie analiza
histopatologiczna nie w ykazała ż a d n y c h niepraw idłow ości
w tkankach pobranych od tych zw ierząt. N atom iast zw ie­
rzęta z mutacją Lmna
po zb aw ion e zaró w n o lam iny A jak
i C przejawiają sy m p to m y dystrofii m ięśniow ej i żyją krócej
[24], Wydaje się zatem , że sam a lam ina C w zupełności w y ­
starczy by zapew nić m yszom do b rą kondycję zdrow otną,
zaś lamina A nie pełni istotnej funkcji, przynajm niej w w a­
runkach przep ro w ad zo n eg o dośw iadczenia. Św iadczy to
rów nież o tym, że nie tyle brak lam iny A jest spraw cą zm ian
morfologicznych obserw o w an y ch w kom órkach po ch o d zą­
cych od pacjentów z lam inopatiam i, co g ro m ad zen ie się lub
dominujący n eg aty w n y efekt zm utow anej form y tego biał­
ka.
Fong p rzep ro w adził dośw iadczenie, w któ ry m użył m y­
szy Zmpste24-/~. Kom órki tych m yszy p o zb aw io n e są metaloproteinazy ZMPSTE24, zatem nie zachodzi w nich endoproteoliza pre-lam iny A, co p ro w a d z i do grom adzenia się
farnezylowanej pre-lam iny A. Z w ierzęta Z m p ste 2 4 -/- prze­
jawiały liczne sym p to m y p rzed w czesn eg o starzenia p rzy­
pominające zm iany obserw ow an e u pacjentów z HGPS.
N atom iast m yszy Zmpste24~/~/ LmnahCO/LCO były zdrow e,
m im o braku lam iny A, p ra w d o p o d o b n ie dzięki obniżeniu
poziom u patogennie działającej pre-lam iny A [24], Badania
Krótko po odkryciu, że lam iny ulegają farnezylacji w y ­
kazano, iż podobnie m odyfikow ane jest rów nież białko Ras
[8], Liczne badania na drożdżach w ykazały, że modyfikacja
potranslacyjna białka Ras w ym agana jest by białko to mogło
pełnić funkcje sygnałowe, zaś farnezylacja jest niezbędna by
mogła zajść transformacja now otw orow a w onkogennych
m utantach Ras [8], Obserwacja ta zwróciła uw agę badaczy
na możliwość zastosow ania inhibitorów transferazy farnezylowej (FTI, ang. farnesyl transferaze inhibitor) w leczeniu
now otw orów . Liczne FTI zostały zsyntezow ane [25], a ba­
dania z ich zastosow aniem objęły także HGPS.
Patologiczny fenotyp obserw ow any w HGPS jest p o w o­
dow any obecnością farnezylowanej pre-lam iny A, zatem
przypuszczano, że zaham ow anie farnezylacji m ogłoby o d ­
wrócić ten fenotyp. Zachęcające w yniki uzyskano traktując
FTI fibroblasty pobrane od pacjentów z HGPS. Okazało się,
że liczne w ypuklenia błony jądrowej tych kom órek pod
w pływ em działania FTI zanikają [8,26], jednakże trzeba za­
znaczyć, że nie w ykazano w prost, że farnezylacja została
zaham ow ana. Ponadto, z roku na rok o dkryw ane są kolejne
białka, na których funkcję w pływ a proces farnezylacji, za­
tem specyficzne zaham ow anie tego procesu w przyp ad k u
tylko jednego z nich wydaje się trudne, zaś globalne może
mieć nieprzew idyw alne skutki.
LAM INY W PROCESIE ST A R ZE N IA FIZJOLOGICZNEGO
Ponad 40 lat tem u Hayflick i M oorhead [27] zauw ażyli, że
fibroblasty hodow ane in vitro dzielą się tylko określoną licz-
50
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
uszkodzenia DNA
nieprawidłowa struktura otoczki jądrowej ?
1
l
1
Replikacja DNA
R y cin a 5. Regulacja c y k lu k o m ó rk o w e g o . N a u p r o sz c z o n y m sch em a cie p rzed sta­
w io n o m ec h a n iz m regulacji cyk lu k o m ó r k o w e g o , z u w z g lę d n ie n ie m b iałek istot­
n y ch w p rocesie starzenia. W k om órk ach u leg ających p r o c e so w i starzen ia ob ser­
w u je się w z r o s t p o z io m u białka p l4 , k tóre w ią ż ą c lig a z ę u b ik w ity lo w ą M D M 2
p o w o d u je w zro st p o z io m u białka p53, a to z k olei jest a k tyw atorem transkrypcyjn ym g en u p21. Białka p21 ora z p l ó są in h ib ito ra m i k in a z cy k lin o z a leż n y c h ,
p rzez co ograniczają fosforylację białka Rb, k tóre w fo rm ie h y p o fo sfo ry lo w a n ej
p o zostaje w k o m p lek sie z cz y n n ik ie m tran sk ryp cyjn y m E2F, u n iem ożliw ia ją c
ak tyw ację p o d le g ły c h m u g e n ó w . W rezu lta cie cy k l k o m ó r k o w y zostaje za trzy­
m a n y. Szlak za leżn y o d białka p53 zostaje a k ty w o w a n y tak że p o p r z e z u sz k o d z e ­
nia D N A , a p ra w d o p o d o b n ie r ó w n ie ż p rze z n ie p r a w id ło w o ś c i struktury oto czk i
jądrow ej o b se r w o w a n e w lam inop atiach.
bę razy. Obecnie zjawisko to zw ane jest limitem Hayflicka,
zaś szereg zm ian, które zachodzą w kom órce prow adząc do
nieodw racalnego zatrzym ania jej podziałów określane są
jako starzenie replikacyjne (ang. replicative senescence). Ko­
mórki, które uległy starzeniu replikacyjnem u są nieo d w ra­
calnie zatrzym ane w fazie G l cyklu kom órkow ego, co nastę­
puje na skutek skracania z k ażd ą ru n d ą replikacji końców
chrom osom ów - tzw. telom erów [28]. O statnio wykazano,
że nie tyle samo skracanie telom erów , co uszkodzenia DNA
generow ane w nich, w yw ołują od p o w ied ź kom órki p ro w a­
dzącą do w zrostu poziom u i aktyw ności białka p53 [29], Z
kolei białko p53 aktyw uje transkrypcję genu p21, którego
p ro d u k t białkow y jest inhibitorem kinaz cyklinozależnych
CDK4/CDK6. W kom órkach starzejących się replikacyjnie
obserwuje się rów nież w zrost ekspresji innego inhibitora
CD K 4/ CDK6, białka p ló oraz białka p l4 , które w pływ a na
degradację białka p53 wiążąc ligazę ubikw itylow ą MDM2.
Z arów no p ló , jak i p21 przyczyniają się do hypofosforylacji
białka Rb, które w tej postaci pozostaje zw iązane z czynni­
kiem transkrypcyjnym E2F. Białko E2F w kom pleksie z Rb
nie aktyw uje ekspresji genów niezbędnych do przepro w a­
dzenia replikacji DNA, zatem podziały kom órki zostają za­
trzym ane (Ryc. 5).
W 2006 roku ukazała się praca w skazująca na obecność
u szkodzeń DNA telom erow ego w kom órkach starych m ałp
[30]. W iadom o rów nież, że w skórze osób w podeszłym
w ieku obserwuje się obecność innego m arkera starzenia,
tzn. SA-fi-galaktozydazy (ang. senescence associated fi-galactosidase) [31]. W ydaje się zatem , że proces starzenia kom órko­
w ego m a w pływ na starzenie całego organizm u.
N iedaw no Scaffidi i Misteli [19] opublikow ali wyniki
w skazujące na rolę lam iny A w procesie starzenia fizjolo­
gicznego. W ykazali oni obecność p rogeryny w fibroblastach
pobranych od ludzi w w ieku 81-96 lat. Komórki te miały
zm ienioną morfologię w sposób przypom inający zm iany
obserw ow ane w kom órkach pacjentów z HGPS. Zaobser­
w ow ano, że w hodow li kom órek zarów no pobranych od
m łodych (3-11 lat), jak i starszych osób (81-96 lat) p rzyby­
w a kom órek o zm ienionej morfologii jąder w raz z każdym
kolejnym pasażem . W hodow li kom órek pobranych od
osób starszych akum ulacja kom órek ze zdeform ow anym i
jądram i zachodzi gw ałtow niej niż w p rzy p a d k u kom órek
pobranych od m łodszych osób, jednakże nie zaobserw ow a­
no grom adzenia się pro g ery n y w ra z z w iekiem , zatem nie
tyle w zro st zaw artości zm utow anej form y lam iny A w ko­
mórce, co czas obecności tej form y w jądrze w ydaje się być
o d pow iedzialny za jej p a to g enn y efekt. Praw do p o d ob n ie te
sam e m echanizm y m olekularne, które są odpow iedzialne
za przedw czesne starzenie kom órek HGPS przyczyniają się
do starzenia kom órek praw idłow y ch . Różnica polegałaby
zatem na tem pie zachodzenia w sp om n ian y ch procesów.
N iew ykluczone rów nież, że n iepraw idłow ości struktury
blaszki jądrow ej, p o p rz e z m echanizm zależny od białka
p53, aktyw ują p ro g ra m starzenia [19] (Ryc. 5).
UW AGI KOŃCOW E
Chociaż minęło już p o n a d 100 lat od czasu gdy H utchin­
son i G ilford opisali chorobę n a z w a n ą później ich nazw iska­
mi - progerię H utchinson-G ilford (HGPS) [15,16], przyczy­
na tego schorzenia pozostaw ała tajemnicą aż do roku 2003,
kiedy to dw ie g ru p y b adaw cze o publikow ały niezależnie
w yniki wskazujące, że to m utacja genu LM N A kodujące­
go lam iny ty pu -A leży u p o d sta w HGPS [21,32], Mimo, iż
HGPS jest chorobą niezm iernie rzad ką (1 p rzy pad ek na 8
m ilionów uro dzeń, o d 1889 ro k u opisano n a świecie około
100 przy p ad k ó w ), w z b u d z a b a rd z o duże zainteresow anie
badaczy. Z a p ro p o n o w a n o szereg strategii terapeutycznych,
ich zastosow anie in vitro w p rz y p a d k u kom órek pobranych
od pacjentów oraz in vivo w p rz y p a d k u m yszy dało bardzo
dobre rezultaty [8,22,23,24]. Jednakże m ożliw ość zastoso­
w ania którejkolw iek z nich w p rz y p a d k u ludzi wydaje się
mało realna, przynajm niej w św ietle dotychczas posiada­
nych informacji o lam inach i ich funkcji oraz braku w iedzy,
np.: co do skali zjaw iska farnezylacji w komórce. Lamina A
pełni w iele istotnych funkcji, zatem strategia proponująca
usunięcie jej z kom órki, n aw et jeśli w krótkoterm inow ych
badaniach in vitro d aw ała obiecujące rezultaty, uderzałaby
w zbyt wiele procesów k om órkow ych, czego skutki w p rzy ­
p a d k u całego o rgan izm u tru d n o przew idzieć. Podobnie
zastosow anie inhibitorów transferazy farnezylowej w m o­
mencie, gd y jeszcze nie w iad o m o tak n a p ra w d ę ile i jakich
białek podlega procesow i farnezylacji w ydaje się ryzykow ­
ne. Ponadto, za HG PS o d p o w ia d a autosom alna mutacja
dom inującą, a objaw y choroby pojawiają się w przeciągu
pierw szych dw ó ch lat życia, zatem pow staje pytanie kiedy
rozpocząć e w en tu aln ą terapię i w jaki sposób. Niemniej, ba­
dania H G PS są b a rd z o w ażn e rów nież z p u n k tu w idzenia
poznaw czego. Są one źró d łem informacji na tem at roli la­
m in w kom órkach, jak też w p e w n y m stopniu przyczyniają
się do poznan ia procesu starzenia fizjologicznego.
P IŚ M IE N N IC T W O
1. Broers JLV, Ram aekers FCS, Bone G, Yaou RB, H uthinson CJ (2006)
N uclear Lamins: L am inopathies a n d T heir Role in Prem ature Ageing.
Physiol Rev 86: 967-1008
51
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
2. Pollex RL, Hegele RA (2004) Hutchinson-Gilford progeria syndrom e.
Clin G enet 66:375-381
3. Broers JLV, Raym ond Y, Rot MK, Kuijpers H, W agenaar SS, Ramaekers FC (1993) Nuclear A-type lam ins are differentially expressed in
h um an lung cancer subtypes. A m J Pathol 143: 211-220
4. Tilli CM, Ramaekers FC, Broers JL, H utchinson CJ, N eum ann HA
(2003) Lam in expression in norm al hum an skin, actinic keratosis, squ­
am ous cell carcinoma and basal cell carcinoma. Br J Derm atol 148:102109
5. M attout A, Dechat T, A dam SA, G oldm an RD, G ruenbaum Y (2006)
N uclear lamins, disease and aging. C urr O pin Cell Biol 18: 335-341
6. Burke B, Stew art CL (2006) The Lam inopathies: the functional archi­
tecture of the nucleus and its contribution to disease. A nnu Rev Geno­
mics H u m Genet 7: 369-405
7. H arborth J, Elbashir SM, Bechert K, Tuschl T, W eber K (2001) Iden­
tification of essential genes in cultured m am m alian cells using small
interfering RNAs. J Cell Sci 114: 4557-4565
8. Rusinol AE, Sinensky MS (2006) Fam esylated lamins, progeroid syn­
drom es and fam esyl transferase inhibitors. J Cell Sci 119: 3265-3272
9. M allam palli MP, H uyer G, Bendale P, Gelb M H, Michaelis S (2005) In­
hibiting fam esylation reverses the nuclear m orphology defect in HeLa
cell m odel for Hutchinson-Gilford progeria syndrom e. Proc Natl Acad
Sci USA 102:14416-1442
10. Young SG, Fong LG, Michaelis S (2005) Thematic review: Lipid posttranslational modifications. J Lipid Res 46:1-28
11.G otzm ann J, Foisner R (2006) A-type lam in complexes an d regenera­
tive potential: a step tow ards understanding lam inopathic diseases.
H istochem Cell Biol 125: 33-41
12. Cohen M, Lee KK, Wilson KL, G ruenbaum Y (2001) Transcryptional
repression, apoptosis, hum an disease and the functional evolution of
the nuclear lamina. Trends Biochem Sci 26:41-47
13. G ruenbaum Y, Margalit A, G oldm an RD, Shum aker DK, W ilson KL
(2005) The nuclear lam ina comes of age. N ature Rev 6: 21-31
14. Johnson BR, N itta RT, Frock RL, M ounkes L, Barbie DA, Stewart CL,
H arlow E, K ennedy BK (2004) A-type lam ins regulate retinoblastom a
protein function by prom oting subnuclear localization and preventing
proteasom al degradation. Proc Natl Acad Sci USA 101: 9677-9682
15. Gilford H (1904) Ateleiosis and progeria: continuous youth and pre­
m ature old age. Br Med J 2: 914-918
16. H utchinson J (1886) Case of absence of hair, w ith atrophic condition of
the skin and its appendages, in a boy w hose m other had been alm ost
w holly balk from alopecia areata from the age of six. Lancet I: 923
17. Bidger JM, Kill IR (2004) Aging of Hutchinson-Gilford progeria syn­
drom e fibroblasts is characterized by hyperproliferation and increased
apoptosis. Exp Gerontol 39: 717-724
18. Sm idth ED, K udlow BA, Frock RL, K ennedy BK (2005) A-type lamins,
progerias and other degenerative disorders. Mech Aging Develop 126:
447-460
19. Scaffidi P, Misteli T (2006) Lamin A -dependent nuclear defects in h u ­
m an aging. Science 312:1059-1063
20. Colum baro M, Capanni C, Mattioli E, Novelli G, Parnaik VK, Squarzoni S, M araldi NM, Lattanzi G (2005) Rescue of heterochrom atin orga­
nization in H utchinson-Gilford progeria by d ru g treatm ent. Cell Mol
Life Sci 62: 2669-2678
21. Eriksson M, Brown WT, G ordon LB, G lynn MW, Singer J, Scott L, Er­
dos MR, Robbins CM, Moses TY, Berqlund P, D urta A, Pak E, D urkin
S, Csoka AB, Boehnke M, Glover TW, Collins FS (2003) R ecurrent de
novo point m utation in lamin-A cause H utchinson-G ilford progeria
syndrom e. N ature 423: 293-298
22. Scaffidi P, Misteli T (2005) Reversal of the cellular phenotype in the
prem ature aging disease Hutchingson-Gilford Progeria Syndrom e.
N at M ed 11: 440-445
23. Fong LG, N g JK, Lam m erding J, Vickers TA, M eta M, Cote N, G avino
B, Qiao X, Chang SY, Young SR, Yang SH, Stew ard CL, Lee RT, Ben­
nett CF, Bergo MO, Young SG (2006) Prelam in A and lam in A appear
to be dispensable in the nuclear lamina. J Clin Invest 116: 743-752
24. Scaffidi P, Misteli T (2006) Good new s in the nuclear envelope, loss of
lam in A m ight be a gain. J Clin Invest 116: 632-634
25. Basso AD, Kirschmeier P, Bishop WR (2006) Them atic review series:
lipid posttranslational modifications, farnesyl transferase inhibitors. J
Lipid Res 47:15-31
26. G oldm an RD, Shum aker DK, Erdos MR, Eriksson M, G oldm an AE,
G ordon LB, G ruenbaum Y, K huon S, M endez M, Varga R, Collins FS
(2004) A ccum ulation of m utant lam in A causes progressive changes in
nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrom e. Proc
Natl Acad Sci USA 101: 8963-8968
27. Hayflick L, M oorhead PS (1961) The serial cultivation of hu m an diplo­
id cell strains. Exp Cell Res 25: 585-621
28. Itahana K, Cam pisi J, Dimri GP (2004) M echanism of cellular senescen­
ce in h um an and m ouse cell. Biogerontology 5:1-10
29. d 'A d d a di Fagagna F, Reaper PM, Clay-Farrace L, Flegier H, Carr P,
Von Zglinicki T, Saretzki G, Carter NP, Jackson SP (2003) A D N A da­
m age checkpoint response in telom ere-initiated senescence. N ature
426:194-198
30. H erbig U, Ferreira M, Condel L, Carey D, Sedivy JM (2006) Cellular
senescence in aging primates. Science 311:1257
31. Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Scott G, Roskelley C, M e­
drano EE, Linskens M, Rubelj I, Pereira-Smitch O, Peacocke M, C am pi­
si J (1995) A biom arker that identifies senescent h u m an cells in culture
and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 92: 9363-9367
32. De Sandre-Giovannoli A, Bernard R, Cau P, N avarro C, Amieli J,
Boccaccio I, Lyinnet S, Stewart CL, M unnich A, Le M errer M, Levy
N (2003) Lamin A truncation in Hutchinson-Gilford progeria. Science
300: 2055
The role of lam ins and mutations of LMNA gene
in physiological and premature aging
M ałgorzata A licja Ś liw iń s k a
The N encki Institute of E xperim ental Biology, L aboratory of M olecular Bases of Aging, 3 P asteura St., 02-093 W arszaw a, Poland
■e-mail: m .sliwinska@ nencki.gov.pl
Key words: lam ins, lam inopathies, H utchinson-G ilford progeria syndrom e
A BSTRACT:
Lamins b elong to type V intermediate filaments superfamily. They are the main structural constituencies of the nuclear lam ina but they also
influence on chromatin structure, regulation of gene expression, localization and probably protein degradation. Because lam ins play many
different roles w ithin the cell, mutations in their genes can results in variety of pathological phenotypes. M utations in LM N A gene are the
cause of many different diseases, called laminopathies. Am ong lam inopathies are muscle tissue diseases, adipose tissue diseases and also
progerias, the premature aging syndromes. O ne of the progerias, w hich results from mutation in LM NA gene, is H utchinson-G ilford progeria
syndrome (HGPS). It seem s that the same molecular m echanism s w hich are responsible for premature aging of cells of HGPS patients, are
involved in physiological aging.
52
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
Rola transbłonow ych GTPaz w m orfologii i aktyw ności m itochondriów
STRESZCZENIE
ito c h o n d ria p e łn ią w k o m ó rk ach po d staw o w ą rolę w m etab o lizm ie energetycznym ,
term ogenezie, u trzy m a n iu h om eostazy w ap n io w ej oraz apoptozie. N astęp u jące na
p rzem ian fu z ja i fragm entacja m ito c h o n d rió w zap e w n iają p raw id ło w e fu n k c jo n o w an ie m i­
to ch o n d rió w , szczególnie w kom ó rk ach tk a n e k z d u ży m z ap o trze b o w a n iem n a energię, np.
w m ię śn ia ch szkieletow ych, sercu czy u k ład z ie nerw ow ym . Fuzja m ito ch o n d rió w odgryw a
isto tn ą rolę w ro zw o ju p ło d u i u trzy m a n iu p u li m tD N A w form ie n ien a ru sz o n ej pom im o
ciągłego z ag ro ż en ia stresem oksydacyjnym . M ito ch o n d ria w form ie ro z b u d o w an e j sieci o b ­
serw uje się w kom ó rk ach szczególnie niew rażliw y ch n a działan ie czy n n ik ó w a p o ptogennych. Z k o le i z jaw isk o o d w ro tn e do fu z ji - fragm entacja m ito chondriów p o p rz ed z a pro g ra­
m ow aną śm ierć kom órki. Z godnie z obecnym stan em w ied zy m echanizm tw o rzen ia sieci
m ito c h o n d rió w lu b ich d z ielen ia się je st na stęp stw em z integrow anego w sp ó łd z ia ła n ia k ilk u
b iałe k , z k tó ry ch D rp l, M fn l, M fn2 i O p a l p e łn ią n a jisto tn ie jsz e fu n k cje. Z go d n ie z n a jn o w ­
szym i d o n iesie n iam i b iałk a o d p o w ie d zia ln e za procesy fu z ji i fragm entacji m ito ch o n d rió w
p e łn ią d o d a tk o w o z ad a n ia in n e niż te zw iązane z d y n a m ik ą przek ształceń błon. N ie je d n o ­
k ro tn ie w ła śn ie d o d atk o w a rola, ja k ą odgryw ają, jest niezw y k le isto tn a dla praw id ło w eg o
fu n k c jo n o w a n ia kom órki. W n in ie jsz ej pracy op isan o najn o w szą w ied zę n a tem at zm ian
s tru k tu raln y c h m ito c h o n d rió w ze szczególnym u w z g lęd n ie n ie m tran sb ło n o w y ch G TPaz i
ich roli w m eta b o liz m ie kom órki.
M
W PR O W A D Z E N IE - W JAKI SP O SÓ B M IT O C H O N D R IA ULEGAJĄ FUZJI?
Patrycja P a w lik o w s k a
A rk a d iu sz O r ze c h o w sk i
K atedra N au k Fizjologicznych, W ydział Me­
dycyny W eterynaryjnej, Szkoła G łów na Go­
spodarstw a W iejskiego, W arszaw a
^K ated ra N a u k Fizjologicznych, W ydział
M edycyny W eterynaryjnej, Szkoła G łów na
G o spodarstw a W iejskiego, N ow oursynow ska
159, 02-776 W arszaw a; e-mail: arkadiusz_orzechow ski@ sggw .pl, teł./fak s: (022) 847 24 52
A rtykuł otrzym ano 12 w rześnia 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 7 listopada 2006 r.
Słowa kluczowe: m itochondrium , fuzja, Mfn2
Form ow anie się sieci m itochondriów zaobserw ow ano po raz pierw szy w ko­
m órkach d rożdży (Saccharomyces cerevisiae) i m uszki owocowej (Drosophila melanogaster). Z tych organizm ów w yizolow ano rów nież po raz pierw szy białka
odpow iedzialne za fuzję i fragmentację m itochondriów . W kom órkach drożdży
zidentyfikow ano białko D n m lp zlokalizow ane po cytoplazmatycznej stronie ze­
wnętrznej błony m itochondrialnej, białko F z o lp zakotwiczone w zewnętrznej
błonie m itochondrium , a na w ew nętrznej błonie zlokalizowano białko M gm lp.
D n m lp i F z o lp to GTPazy, które p row adzą do przeciw staw nych w skutkach
procesów. Białko D n m lp pow oduje fragmentację m itochondriów , natom iast
fuzja zew nętrznych błon m itochondrialnych podlega regulacji przez F z o lp [1].
M g m lp odp o w iad a praw dopodobnie za fuzję w ew nętrznych błon m itochon­
drialnych, choć jego funkcja nie jest jeszcze dokładnie poznana. Z asugerow a­
no w stępnie m odel fuzji m itochondriów w kom órkach drożdży, zachodzący z
u działem w ym ienionych białek, który to m odel jest dotychczas powszechnie
uznaw any, choć w świetle now szych doniesień w ym aga pew nych modyfikacji.
Kluczową rolę w tym procesie odgryw a białko Fzolp, które w spółdziała z biał­
kiem p om ostow ym U g o lp zlokalizow anym podobnie jak F z o lp w zewnętrznej
błonie m itochondrialnej. Kompleks F z o lp -U g o lp wiąże się z białkiem M gm lp ,
zakotw iczonym w w ew nętrznej błonie m itochondrialnej [2], Dzięki oddziaływ a­
niom pom iędzy białkam i kom pleksu proces fuzji m oże podlegać koordynacji w
obrębie czterech błon białkow o-lipidow ych należących do sąsiadujących ze sobą
m itochondriów . Hom ologi wszystkich w ym ienionych białek, oprócz U g o lp , zi­
dentyfikow ano w kom órkach ssaków (Ryc. 1). Białku D n m lp odpow iada białko
D rp l [1], Istnieją d w a różne hom ologi białka Fzolp: M fnl (ang. mitofusin 1) i
Mfn2 (ang. mitofusin 2), oraz odpow iadające M g m lp białko O p a l zakotwiczone
w w ew nętrznej błonie mitochondrialnej (Ryc. 1). D odatkow o zidentyfikow ano
czynnik Fisi, za p ośrednictw em którego D rp l ulega translokacji do zewnętrznej
błony m itochondrialnej.
M E C H A N IZ M FRAGM ENTACJI M IT O C H O N D R IÓ W
N a zew nętrznej błonie m itochondrialnej zlokalizow ano ostatnio GTPazy
o dpow iedzialne za fuzję i fragmentację m itochondriów . Okazało się, że białka
uczestniczące w dw óch przeciw staw nych procesach zakotw iczone są w błonie
w bliskim sąsiedztwie, tw orząc tzw. loci. W ykazano m. in. w spółw ystępow anie białek D rp l i Mfn2 [3]. O dkrycia te dow odzą, że fuzja (na d rodze zależnej
53
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
R y c in a 1. S ch em a t u m iejscow ien ia w b łon ach m ito c h o n d riu m b iałek o d p o w ie ­
d z ia ln y c h za p ro ce sy fuzji lub fragm entacji m ito c h o n d rió w w k om órk ach ssa k ów
i d r o ż d ż y . O znaczen ia: O M - ze w n ętrz n a b łon a m itochon d rialna; IMS - m itoc h o n d r ia ln a p rze strz eń m ię d z y b ło n o w a ; IM - w e w n ę tr z n a b łon a m itoch on d rial­
na; M X - m acierz m itochondrialna; TM - d o m en a tran sbłonow a; H R - ang. heptad
repeat.
od Mfn2), jak i fragmentacja m itochondriów (dzięki białku
D rp l) zachodzą w obrębie zew nętrznej błony w tych sa­
m ych miejscach. M echanizm dzielenia się m itochondriów
jest w po rów naniu z fuzją słabiej poznany. Obecnie istnieją
trzy różne w ytłum aczenia przyczyn fragmentacji m itochon­
driów . Zgodnie z pierw szym z nich m itochondria ulegają
cyklicznym dynam icznym zm ianom strukturalnym , co
p ozw ala na praw idłow y rozwój i funkcjonow anie kom ór­
ki i jest zjawiskiem, które w ystępuje stale, ale z różnym
nasileniem . D ruga z m ożliwych przyczyn, to fragmentacja
m itochondriów towarzysząca stanom stresu w kom órkach
(np. zwiększonej produkcji reaktyw nych form tlenu, RFT),
która p raw do p o do b n ie stanow i istotny etap w indukcji p ro ­
gram ow anej śmierci komórki. Skoordynow ane podziały
m itochondriów w edług niektórych autorów stanow ią m e­
chanizm adaptacyjny, dzięki którem u w stanach zagrożenia
stresem oksydacyjnym kom órka „eliminuje" m itochondria
p rodukujące nadm ierne ilości reaktyw nych form tlenu.
Wreszcie, trzecia p raw d opodobna przyczyna to ostatnio
opisane zjawisko m itoptozy (program owanej śmierci m ito­
chondriów ), które polega na selektyw nym „zanikaniu" nie­
p raw id ło w o funkcjonujących organelli. Usunięcie z kom órki
m itochondriów na drodze „samobójczej" śmierci jest często
p o p rz e d z o n e ich fragmentacją i stanowić m oże m echanizm
chroniący kom órki przed czynnikam i apoptogennym i [4].
Jedn y m z głów nych i do tej pory najlepiej poznanym
białkiem zaangażow anym w proces dzielenia się m itochon­
d rió w jest D rp l (ang. dynamin-related protein 1). D rp l jest
hom ologiem D n m lp , białka zidentyfikow anego u drożdży.
Sekwencja am inokw asów D rp l w odróżnieniu od dynam in
nie zaw iera C-końcowej dom eny PH (ang. pleckstrin homology), posiada natom iast dodatkow o bogatą w prolinę d om e­
nę SH3, która praw dopodobnie pełni funkcję regulatorow ą
[5]. Białko D rp l zlokalizowane jest w cytoplazmie, a w o d ­
po w ied zi na czynniki pobudzające fragmentację m itochon­
d rió w ulega przemieszczeniu do zew nętrznej błony mitochondrialnej. Przemieszczanie się D rp l w kierunku błony
o d b y w a się za pośrednictw em białka Fisi, poniew aż sek­
wencja am inokw asow a D rp l nie zaw iera p e p ty d u sygnało­
wego, rozpoznaw anego przez klasyczne białka opiekuńcze
transportujące pro d uk ty translacji do m itoch o nd riu m [6],
W dalszych etapach fragmentacji m itochondriów Fisi peł­
ni rolę białka adaptorow ego, stabilizującego p olipeptydow y kom pleks „w ykonaw czy". O statnie b ad an ia d o w o d zą
rów nież, że jest czynnikiem limitującym w ystąpienie p ro ­
cesów fragmentacji, a nadekspresja genu kodującego biał­
ko Fisi w ydaje się wystarczająca do zainicjow ania p o d z ia ­
łów m itochondriów [7], Badania prow ad zo ne na m odelu
Saccharomyces cereoisiae dostarczyły d o w o dó w n a istnienie
kolejnego składnika kom pleksu białek zaan gażo w an y ch w
podział m itochondriów - białka M d v lp . C zynnik ten ulega
translokacji do zewnętrznej błony m itochondrialnej razem z
wcześniej w spom nianym D n m lp . Badania M ozdego i wsp.
[6] dow odzą, że kolokalizacja białek D n m lp i M d v lp jest
w aru nk iem koniecznym zainicjowania fragm entacji m ito ­
chondriów . Do tej pory w kom órkach ssaków nie ro z p o z n a ­
no białka, które odpow iadałoby charakterystycznem u dla
dro żdży czynnikow i M d v lp .
N a obecnym etapie bad ań brak w ystarczających danych
na tem at m echanizm ów m olekularnych regulujących i ini­
cjujących procesy fragmentacji m itochondriów . Postuluje
się udział Ca2+ jako w tórnego przekaźnika sygnału re g u ­
lującego podziały m itochondriów [8]. Przekonujących d o ­
w o d ó w na poparcie tej hipotezy dostarczyły badania, w
których stw ierdzono, że w odpow iedzi na uw olnienie Ca2+
z siateczki śródplazm atycznej (ER) in d u ko w an e jest p rz e ­
m ieszczanie D rp l do zewnętrznej błony m itochondrialnej.
Z kolei zablokow anie w y pływ u jonów w ap nia z siateczki
śródplazm atycznej ham uje fragmentację m itochondriów
[9].
U D Z I A Ł BIA Ł E K M F N 1 /2 W FUZJI M I T O C H O N D R I Ó W
O b yd w a zidentyfikow ane hom ologi Fzo u kręgow ców :
białka M fnl i Mfn2 biorą udział w regulacji fuzji m itochon­
driów , a ich aktyw ność jest niezbędna do praw id ło w eg o
rozw oju pło d u ssaka. Mutacje jądrow ego D N A kodującego
białka M fn są letalne. Okazało się, że dla p raw id ło w eg o ro z­
woju p ło d u niezbędna jest produkcja obu hom ologów Fzo,
a ich działanie jest niezależne i skutki braku jednego z białek
nie m ogą być w yrów nane zw iększeniem p oziom u d ru g ie­
go. Pom im o że zarów no płody m yszy z n o k au tem m fnl jak
i ze zno kautow an y m genem mfn2 um ierały około 11 d.p.c.
(łac. dies post coitum = dni po kopulacji), to różne były p rz y ­
czyny śmierci każdego z nich. Płody ze zn ok au to w any m
genem dla M fnl miały w chwili śmierci w yraźnie mniejszą
m asę ciała w porów naniu do płodów p raw id ło w y ch WT
(ang. wild type). D odatkow o, rozpoznano u nich p ow ażn e
zaburzenia rozwojowe. Z kolei u płodów z nok au tem genu
mfn2, który rów nież spow odow ał zm niejszenie m asy ciała,
nie stw ierdzono deformacji, które w skazyw ałyby na obec­
ność zab urzeń rozw ojow ych [10]. Skutki zablokow ania
ekspresji m fnl i mfn2 sum ow ały się, a obum arcie p łodów
następow ało wcześniej. Ponadto, w k ulturach p ierw otnych
fibroblastów w y p ro w adzo n y ch z p ło d ó w stw ierdzono
zm ianę kształtu i zmniejszenie rozm iarów m itochondriów .
Praw idłow y w ygląd organelli przyw róciła transfekcja ko­
m órek białkami M fnl lub Mfn2 [10], Bliższe przyjrzenie się
m echanizm om regulującym aktyw ność genów m fnl i mfn2
54
w w w .p ostepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
przep row ad zo ne przez Santela i w sp. [11] wykazało, że u
ludzi ekspresja genów kodujących M fnl i Mfn2 na poziomie
transkrypcji jest różna w poszczególnych tkankach organi­
zmu. W ysoki poziom mRNA dla M fnl i Mfn2 utrzym yw ał
się w m ięśniu sercowym. N atom iast w mięśniach szkiele­
tow ych w yższa była ekspresja mfn2. W trzustce i wątrobie,
w przeciw ieństw ie do mięśni szkieletowych, stw ierdzono
po d w y ższo n y poziom mRNA dla M fn l. W ysoką ekspresję
mfnl zaobserw ow ano rów nież w wielu liniach kom órek no ­
w otw o ro w y ch [11], W porów naniu z ekspresją na poziomie
mRNA, najw yższy poziom białka Mfn2 zaobserw ow ano w
tkankach z d u ży m zapotrzebow aniem na energię, takich jak
serce czy m ięśnie szkieletowe. W ystępow anie względnie
dużej zaw artości Mfn2 w pew nych tkankach może w ska­
zywać na szczególną rolę tego białka w regulacji fuzji i ak­
tyw ności m itochondriów charakterystycznej dla kom órek
w ym agających większej podaży energii.
Sekwencja reszt am inokw asow ych w białkach M fnl i
Mfn2 jest identyczna w 60%. Oba białka są dużym i, transbłonow ym i GTPazami, zlokalizow anym i w zewnętrznej
błonie m itochondrialnej. D om eny C-końcowa i N-końcow a
tych białek zw rócone są w stronę cytoplazmy. Za zakotw i­
czenie Mfn2 w zewnętrznej błonie mitochondrialnej od p o ­
w iada d o m ena transbłonow a i dom ena C-końcowa (Ryc. 2).
Białko pozbaw ione tych dom en pozostaje w cytoplazmie i
jest niezdolne do w spółw ystępow ania z białkami błon mito ch o nd rium [12]. O bydw a hom ologi Fzo posiadają dom e­
nę G TPazow ą zlokalizow ana przy końcu N H , oraz dw ie
zachow ane w ewolucji, hydrofobow e dom eny HR1 i HR2
(ang. heptad repeats domain). Najważniejszych do tej pory in­
formacji na tem at sposobu łączenia się za pośrednictw em
białek M fn błon zew nętrznych sąsiadujących ze sobą m i­
tochondriów dostarczyły badania przeprow adzone przez
Koshibę i w sp. [13]. Badacze ci udow odnili, że początko­
w ym etap em fuzji jest oddziaływ anie leżących naprzeciw ­
ko siebie d o m en HR2 białek Mfn należących do sąsiadują­
cych m itochondriów (Ryc. 2). Po ustaw ieniu przeciwległe
dw óch d o m e n HR2 m itochondria pozostają przez pewien
czas w bliskim kontakcie, jednak nie ulegają fuzji. D om e­
ny HR2 m o g ą tworzyć kom pleksy hom otypow e, w których
skład m o g ą w chodzić dw a białka M fnl lub d w a Mfn2, albo
heterotypow e, składające się z M fnl i Mfn2. Jednocześnie
w ykazano, że w arunkiem koniecznym dalszych etapów
fuzji m itochondriów jest aktyw ność GTPazow a białek Mfn
[13,14], Kolejnym istotnym rejonem decydującym o fuzji jest
krótka, złożona z 2-3 reszt am inokw asow ych, o zachowanej
w ewolucji sekwencji, pętla w ew nątrzbłonow a, zawierająca
resztę tryptofanu [15]. Rejon ten uw ażany jest za niezbęd­
ny do p raw idłow ego połączenia zewnętrznej i wewnętrznej
błony m itochondrialnej podczas fuzji, a punk to w a mutacja
elim inująca tryptofan zarów no w M fnl jak i Mfn2 uniem oż­
liwia tw orzenie sieci połączonych m itochondriów . Pom im o
dużego podobieństw a w budow ie w ym ienionych białek
hom ologicznych dla Fzo, w ed łu g ostatnich doniesień to
M fnl p o p rz e z oddziaływ anie z O p a l w ydaje się odgryw ać
istotniejszą rolę niż Mfn2 w bezpośrednim łączeniu błon
m itochondrialnych, jak rów nież w regulacji fuzji błony w e­
w nętrznej z zew nętrzną. W prow adzenie anty sensow nego
RNA w celu zaham ow ania transkrypcji genu kodującego
O p a l zw iększa fragmentację m itochondriów i dow odzi,
że białko to pełni w ażną funkcję w procesie fuzji błon mi-
tochondrialnych. Siatkówka oka człowieka odznacza się
bardzo w ysoką ekspresją białka O p a l, a mutacje w genie
tego białka odpow iadają za rozwój choroby zwanej atrofią
w zrokow ą typ u 1 (ang. optic atrophy type 1, OPA1) [16]. W y­
niki b ad ań dotyczących zależności pom iędzy aktyw nością
O p a l, a stopniem fuzji m itochondriów są niejednoznaczne.
W ostatnich latach Cipolat i wsp. [2] wykazali, że do p ra ­
widłowej fuzji m itochondriów niezbędne jest w spó łd ziała­
nie białek O p a l i M fnl. N adekspresja genu kodującego biał­
ko O p a l prow adzi do wykształcenia m itochondriów o w y ­
dłużon y m kształcie jedynie w przyp ad k u , gdy tow arzyszy
jej w ysoka ekspresja genu kodującego białko M fnl. Jed n o ­
czesna nadekspresja genów kodujących białka O p a l i Mfn2
nie sprzyja fuzji m itochondriów . Zależność funkcjonalna
pom iędzy O p a l i M fnl została potw ierdzona w d o św ia d ­
czeniach z nadekspresją genu kodującego M fnl p rzy ró w ­
noczesnym zaham ow aniu ekspresji genu kodującego białko
O p a l. W kom órkach nie dochodziło w ów czas do w y k ształ­
cenia zintegrowanej sieci m itochondriów [2], W pływ p o b u ­
dzający O p a l na fuzję m itochondriów uzależniony jest, jak
się wydaje, od funkcjonalnej dom eny GTPazy i praw idłow ej
dom eny C-końcowej CC (ang. coiled-coil), jak rów nież od
dostępności M fnl. Stw ierdzono, że w przeciw ieństw ie do
M fnl, Mfn2 nie oddziałuje z białkiem O p a l [2], A z a h a m o ­
w anie jego produkcji przy u trzy m an y m w ysokim poziom ie
M fnl nie w p ły w a istotnie na fuzję m itochondriów [17]. W
świetle przytoczonych doniesień w ydaje się, iż białko M fn l
pełni n ad rzęd n ą w stosunku do Mfn2 rolę regulatora fuzji
m itochondriów . D odatkow ych dow odów , przem aw iają­
cych za takim scenariuszem zdarzeń dostarczają badania, w
których w ykazano, że GTPazę M fn l charakteryzuje około
ośm iokrotnie w iększa aktyw ność katalityczna w p o ró w ­
n aniu z Mfn2 [3], Ponadto największą trwałość w iązania
i skuteczność działania w procesie fuzji m itochondriów
stw ierdza się w p rzy p ad k u hom odim eru M f n l/M f n l [17].
Z daniem niektórych badaczy głów ną rolą, jaką pełni Mfn2
w procesie fuzji, może być działanie sprzyjające agregacji
m itochondriów , natom iast dalsze etapy w aru n k o w an e są
R y cin a 2. A. S ch em at p o ło ż e n ia d o m e n białka M fn2 m y s z y , w g H o n d y i w sp .
[14]. C yfry określają p o ło ż e n ie reszt a m in o k w a s o w y c h liczo n y ch o d p o c z ą tk u d o
k ońca danej d o m en y . O znaczen ia: G TP aza - d o m e n a en zy m a ty cz n a , H R - d o m e ­
n y tzw . heptad repeat. B. P ie r w s z y etea p fuzji ze w n ę tr z n y c h b łon m ito c h o n d r ia l­
n y ch za p o śr e d n ic tw e m białek M f ń l / 2 , w g . K osh ib y i w sp . [13].
55
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
aktyw nością M fnl [18]. N iezależnie jed nak od przytoczo­
nych obserwacji, przynajmniej w kom órkach m iogennych
ze z m u to w a n y m genem mfn2 obserw uje się m ałe i p odzie­
lone m itochondria, niezdolne d o fuzji. D o datk ow o w y ka­
zano, że głów ną przyczyną choroby neurodegeneracyjnej
Charcot-M arie-Tooth typu 2, odznaczającej się stopniow ym
zanikiem aksonów nerw ów o b w od o w y ch są m utacje w
sekwencji kodującej dom enę G T Pazow ą białka Mfn2 [19].
O bserw o w an y zw iązek p o m ięd zy dy n am ik ą stru k tu ry mito chondriów a m etabolizm em kom órek oraz różne w zależ­
ności od ty p u kom órki i jej stan u fizjologicznego interakcje
białek uczestniczących w fuzji spraw iły, że transbłonow e
G TPazy stały się przedm iotem b a d a ń w aspekcie innym niż
w yłącznie zm iany m orfologiczne m itochondriów .
M fn 2 JAKO REGULATOR A K T Y W N O Ś C I
M IT O C H O N D R IÓ W I M E D IA T O R S Y G N A Ł U
W EW NĄTRZKOM ÓRKOW EGO
Badania Brocarda i w sp. [1] sugerują, że białka o d p o ­
w iedzialne za procesy fuzji i fragm entacji m itochondriów
biorą ud ział w regulacji potencjału elektrycznego błon mitochondrialnych, który z kolei w p ły w a n a natężenie procesów
energotw órczych w m itochondriach. O bniżenie potencjału
błonow ego prow adziło do nasilonej fragm entacji m itochon­
d rió w zależnej od D rp l [1], Do określenia zależności pom ię­
dzy aktyw nością białek Mfn a zm ian am i potencjału błono­
w ego m itochondriów posłużyły b ad an ia z w ykorzystaniem
k u ltu r pierw otnych fibroblastów m ysich o trzym anych z
płodów , u których zablokow ano transkrypcję genów dla
M fnl i /l u b Mfn2 [10]. Jak wcześniej w sp o m n ian o , ekspresja
genów dla oby d w u tych białek jest w a ru n k ie m koniecznym
do praw id ło w eg o rozw oju em brionalnego; dlatego też dal­
sze bad ania przepro w ad zano na k u ltu rach kom órek pier­
w otnych. W fibroblastach pochodzących z m ysich płodów
z zablokow aną ekspresją Mfn2 stw ierd zon o obniżenie mitochondrialnego potencjału błonow ego. Podobne zjawisko
zao bserw ow ano po wyciszeniu genu dla Mfn2 w k ulturach
kom órek m iogennych [15].
Obecnie wiele uw agi zw raca się na Mfn2 jako białko re­
gulatorow e, dzięki którem u m o żn a łączyć zm ian y w m or­
fologii m itochondriów ze stan em energetycznym i typem
m etabolizm u kom órki (aerobow y-anaerobow y). Mimo
p ew n y ch przesłanek, nie w y k azan o istnienia zależności
R y c in a 3. S ch em a t w e w n ą tr z k o m ó r k o w e g o d zia ła n ia b iałk a M fn 2 (op ra co w a n o
w g S a ntela [33]).
56
przyczynow o-skutkow ej pom iędzy obniżeniem całkow ite­
go poziom u ATP lub h am ow aniem oddychania m itochon­
drialnego a stopniem fuzji m itochondriów . Z aham ow anie
aktyw ności m itochondrialnego łańcucha oddechow ego, jak
rów nież zablokow anie z użyciem cykloheksym idu tran sla­
cji białek kodow anych przez DN A jądrow e, pozostaw ało
bez w pływ u na fuzję m itochondriów w kom órkach HeLa
[18]. Obserwacje w łasne potw ierdzają te doniesienia. W
kom órkach m iogennych linii C2C12 po d dany ch działaniu
insuliny, w których dodatkow o zaham ow ano aktyw ność
kom pleksu I m itochondrialnego łańcucha oddechow ego lub
syntazy ATP obserw ow ano ro zbu d o w an ą sieć m itochon­
driów (dane niepublikow ane). Przytoczone wyniki p o z w a ­
lają więc uznać, że fuzja m itochondriów nie jest w ym uszana
przez praw idłow o funkcjonujący łańcuch oddechow y, ale
jest w du ży m stopniu zależna od zm ian potencjału błono­
w ego m itochondriów .
W jednej z prac Bacha i wsp. [20] opisano obniżone utle­
nianie glukozy i zmniejszenie o ddychania m itochondrialne­
go w kom órkach m iogennych L6E9 z zaham ow aną ek spre­
sją Mfn2. W tkankach mięśni szkieletow ych pobranych od
otyłych ludzi i szczurów autorzy pracy stwierdzili obniżoną
ekspresję genu dla białka Mfn2. U zyskane w yniki św iad­
czą o istotnej roli Mfn2 w regulacji przem ian pośrednich z
udziałem m itochondriów (Ryc. 3). Obniżenie ekspresji genu
dla Mfn2 tow arzyszące otyłości m oże częściowo tłumaczyć
genezę m iopatii m itochondrialnych (np. zanik m itochon­
driów na obw odzie w łókien m ięśniow ych [21-24] w p rzy ­
p ad k u cukrzycy lub oporności na insulinę występującej w
zespole m etabolicznym [20,25]). M ięśnie szkieletowe osob­
ników otyłych charakteryzuje obniżone utlenianie glukozy
i kw asów tłuszczow ych z tow arzyszącym zaham ow aniem
aktyw ności oksydazy cytochromowej. Podobne anom alie
m itochondriów obserw ow ano w kom órkach w p rzy p ad k u
zablokow ania ekspresji genu dla białka Mfn2 w w arunkach
in vitro [20]. Sugerow ano wcześniej, że różnice w poziom ie
w spom nianych białek Mfn uczestniczących w fuzji m ito­
chondriów m ogą sprzyjać w ystąpieniu określonych chorób,
w szczególności zw iązanych z opornością na insulinę lub
zm ianam i zw yrodnieniow ym i w narządach m iąższowych.
Przypuszczenia te znajdują coraz więcej św iadectw w p ra ­
cach klinicznych opublikow anych w ostatnim czasie. O bni­
żoną ekspresję mRNA i produkcję białka Mfn2 niezależnie
od płci chorego stw ierdzono w m ięśniach szkieletowych
ludzi z otyłością oraz u chorych na cukrzycę typu 2 [25]. Po­
ziom ekspresji Mfn2 był pozytyw nie skorelow any z w ra ż ­
liwością mięśni na insulinę [25]. Istnieje coraz więcej p rze­
słanek, by sądzić, że istnieje zw iązek pom iędzy obniżoną
ekspresją genu dla białka Mfn2 a stanam i niew rażliw ości na
insulinę w cukrzycy i w otyłości z tow arzyszącą u pośledzo­
ną aktyw nością m etaboliczną m itochondriów [20,26]. Rów ­
nolegle ze zm ianam i w poziom ie białka Mfn2 obserw ow a­
no zm iany w ekspresji poszczególnych podjednostek m ito­
chondrialnego łańcucha oddechow ego [19]. Zablokow anie
ekspresji mfn2 ham uje utlenianie pirogronianu, [3-oksydację
kw asów tłuszczowych, cykl kw asów trójkarboksylow ych
(cykl Krebsa) i fosforylację oksydacyjną [25], P o d su m o w u ­
jąc zebrane doniesienia wydaje się, że deficyt Mfn2 w ko­
m órkach w stanach oporności na insulinę m oże stanowić
jeden z głów nych czynników sprzyjających w ystąpieniu
niepożądanych zm ian w działaniu m itochondriów . Poziom
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
Mfn2 w p rzy pad k u otyłości m oże zostać przyw rócony do
stanu praw idłow ego przez zred uk o w an ie m asy ciała do
zakresu fizjologicznego. Podobnie, nasilona aktyw ność m e­
taboliczna m itochondriów będąca w ynikiem zwiększonej
aktyw ności fizycznej prow adzi do w zrostu ekspresji genu
dla Mfn2 [27],
Obecnie prow adzone są rów nież intensyw ne prace nad
rolą Mfn2 w w ew n ątrzko m órko w ym system ie przekaźnictw a sygnału zależnego od insuliny na m odelu m ięśni szkie­
letow ych in vitro. Z godnie z doniesieniam i opublikow anym i
przez Bacha i wsp. [25] w proliferujących kom órkach L6E9
po 2, 4 i 48 godzinach traktow ania, insulina nie pow oduje
zm ian w produkcji Mfn2. Przeciwnie, długotrw ałe działanie
insuliny (od 2 do 10 dni) nasila ekspresję genu dla bad a­
nego białka w różnicujących się kom órkach m ięśniow ych
[28]. O trzym ane wyniki w skazują ponadto, że w zrost eks­
presji genu dla Mfn2 pod w pływ em insuliny uzależniony
jest od aktyw ności 3-kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3-K),
kluczowej dla procesów tran spo rtu glukozy i różnicow ania
się kom órek (Ryc. 3). Zebrane w yniki stanow ią podstaw ę
do dalszych bad ań nad u działem białek odpow iedzialnych
za zm iany strukturalne m itochondriów w rozw oju chorób
zw iązanych z niew rażliw ością na insulinę.
Badania n ad transbłonow ym i białkam i m itochondrialnymi p ro w ad zo n e są rów nież w kieru n k u określenia ich roli
w w ew n ątrzk o m ó rk o w y m przekaźnictw ie sygnału. Istnieją
doniesienia, że białko Mfn2 m oże pełnić funkcję pośrednie­
go elem entu sygnałowego. Badania in vitro i in vivo w yka­
zały na przykład, że nadekspresja genu dla Mfn2 ham uje
proliferację kom órek mięśni gładkich naczyń krw ionoś­
nych. M echanizm zaham ow ania podziałów kom órkow ych
był zależny od MAPK (E R K I/2) [29]. Z daniem autorów
białko Mfn2 łączy się z n a d rz ę d n y m regulatorem ścieżki
MAP kinaz - m ałą GTPazą Ras blokując sygnał m itogenny
(Ryc. 3) i indukując tym sam ym zatrzym anie cyklu kom ór­
kowego, co uniem ożliw ia zapoczątkow anie fazy G1 [29],
Podobny mechanizm m olekularny działania Mfn2 zaobser­
w o w an o w kom órkach mięśni szkieletow ych, w których za­
inicjowano proces term inalnego różnicow ania [28], W yniki
dośw iadczeń in vitro z nadekspresją genu dla białka Mfn2
sugerują ponadto, że białko Mfn2 ham uje podziały kom ó­
rek now otw orow ych p oprzez opisany pow yżej szlak ham o­
w ania białka Ras [29], Obecnie przypisuje się białku Mfn2
rolę regulatora aktyw ności oddechow ej m itochondriów w
o d po w ied zi na w ysokie zap otrzebow ania energetyczne
kom órek. D odatkow o zaburzenie funkcji Mfn2 p ra w d o p o ­
dobnie od g ry w a istotną rolę w patogenezie cukrzycy typu
2 [25] oraz m oże być przyczyną zabu rzeń regulacji cyklu
kom órkow ego [29],
Z M IA N Y ST RU K TUR ALN E
M IT O C H O N D R IÓ W A A PO P T O Z A
Ze w zg lęd u na po dstaw ow ą rolę, jaką od g ry w a m ito­
ch o n d riu m w genezie program ow anej śmierci kom órki
(ang. programmed cell death), od d a w n a poszukiw ano o d p o­
w iedzi na pytanie, czy fragm entacja/fuzja m itochondriów
w p ły w a na apoptozę, lub czy jest odw rotnie. U w aża się
obecnie, że m oże istnieć zależność przyczynow o-skutko­
w a po m ięd zy zm ianam i m orfologicznym i m itochondriów
a apoptozą. W ystępujące cyklicznie fuzja i fragm entacja
stabilizują stru k tu rę m ito ch o n d riów i są niezbędne do ich
praw idłow eg o funkcjonow ania [26], Zaburzenie tej ró w ­
now agi w k ieru nk u przew agi fragm entacji n ad fuzją p rz y ­
czynia się do p o d w yższen ia w rażliw ości kom órek na d z ia ­
łanie czynników ap optogennych. W ykazano na przykład,
że w kom órkach COS7 i H eLa ap o p to za w yw ołana przez
stau ro sp o ry n ę (sw oisty inhibitor kinaz białkow ych ty p u
C) p o p rz e d z o n a jest fragm entacją m itochondriów . Podział
m itochondriów i ap o p to zę u d ało się pow strzym ać przez
zah am ow an ie transkrypcji genu kodującego białko D rp l,
w skazując tym sam ym na znaczenie tego białka dla p ra w id ­
łow ego p rzebiegu a p o p to zy indukow anej stau ro sp oryn ą
[1]. O statnio z asu gero w an o rów nież udział Mfn2 w reg u la­
cji apoptozy, w której rolę p o śred n ik a pełni proapoptotyczne białko Bax [30], N adekspresja g enu białka Mfn2 ham uje
aktyw ność p ro ap o p to ty czn ą Bax i w y p ły w cytochrom u c z
m ito cho n d riu m [15]. Bax w o d p o w ie d z i na czynniki apoptogenne tw o rzy m egakanały w zew nętrznej błonie m itochondrialnej um ożliw iając dalsze etapy program ow anej śmierci
kom órki, w ty m u fo rm o w an ie się apo p to so m u i następczą
aktywację kasp az w ykonaw czej fazy program ow anej śm ier­
ci kom órki. W ostatnich latach zw rócono rów nież u w agę na
fakt, że agregacji Bax z z e w n ętrzn ą błoną m itochondrialną
tow arzyszy proces fragm entacji m itochondriów . Co więcej,
podczas indukcji ap o p to zy w y tw o rz o n y za pośrednictw em
Bax kanał lipidow y w zew nętrznej błonie m itochondrialnej b u d o w ą p rz y p o m in a kanały pow stające w pierw szych
etapach fragm entacji m itochondriów . Karbowski i w sp.
[30] w ykazali, że Bax w sp ółw y stęp u je z białkami D r p l i
Mfn2 w zew nętrznej błonie m itochondrium , co do d atk o w o
w skazuje na udział tego białka w procesach fragmentacji
m itochondriów . Z w iększona oporność kom órek na działa­
nie czynników apo p to g enn y ch , będąca w ynikiem fuzji m i­
tochondriów , nie jest jed y n y m m echanizm em chroniącym
kom órki p rzed szkodliw ym i w p ły w am i środow iska. W
kom órkach m ięśni szkieletow ych, intensyw ne przem iany
oksydacyjne, w tym p o d w y ższo n e w y tw arzan ie anionorodnika pon ad tlen k o w eg o , sprzyjają p o w staw an iu m utacji w
m tD N A . W ykazano, że Mfn2 chroni m itochondria p rzed
zw iększeniem przepuszczalności błon m itochondrialnych
(ang. permeability transition pore, PTP) w yw ołanym przez re ­
aktyw ne form y tlenu [15], O statnio zw rócono rów nież u w a ­
gę na u d ział innego białka transbłonow ego - O p a l w u trz y ­
m aniu p raw idłow ej stru k tu ry grzebieni m itochondrialnych,
aktyw ności syntazy ATP i z ah am o w an iu w y p ły w u cyto­
chrom u c z m ito ch o n d riu m [3], co m oże stanowić p o d staw ę
m echanizm u oporności n a działanie niektórych czynników
apoptogennych. Fuzja m itoch o nd rió w w ydaje się zatem sta­
now ić jeden z p o d sta w o w y c h m echanizm ów chroniących
m itochondria p rzed szk o d liw ym działaniem reaktyw nych
form tlenu, a w konsekw encji p rz e d pow staw aniem i k u m u ­
low aniem się m utacji w m tD N A [31], U trzym anie ró w n o ­
w agi p o m ięd zy rozm iaram i fuzji i fragmentacji m itochon­
driów o d g ry w a rów nież istotną rolę w procesie starzenia
się o rganizm u, kiedy w iad o m o , że obrona antyoksydacyjna
ulega up o śled zen iu [32], W b ad an iach na m odelu Drosophila
stw ierdzono, że m utacja g en u fz o l, w w yniku którego h a ­
m ow ana jest aktyw ność F zo l, p rzyspiesza k u m ulow an ie
się u sz k o d z e ń w m ateriale genetycznym m itochondrium i
zm niejsza n atężenie o dd y ch an ia kom órkow ego [31],
57
Po stępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
PERSPEKTYWY
Różnice pom iędzy m itochondriam i dotyczące rozm ia­
rów i kształtu obserw ow ane są nie tylko w zależności od
typu kom órki i stadium jej rozwoju, ale rów nież w obrę­
bie tej samej komórki pod w pływ em działających na nią
czynników środow iska zew nętrznego. Obecnie u w a ż a się,
że fuzja i fragmentacja, decydując o kształcie i aktyw ności
m itochondriów , w arunkują biologiczne funkcje, jakie or­
ganelle te mają do w ypełnienia w komórce, chociaż brak
jeszcze pełnego rozeznania co do znaczenia każdego z w y ­
m ienionych procesów. Zebrane dotychczas obserwacje, w
szczególności dotyczące działania transbłonow ych GTPaz
m itochondrialnych, wskazują na pilną potrzebę podjęcia
bad ań ukierunkow anych na poznanie m echanizm ów p a ­
togenezy i przeciw działanie rozwojowi niektórych chorób
degeneracyjnych, u podłoża których leżą zaburzenia czyn­
ności mitochondriów . O bniżona ekspresja białka Mfn2 ob­
serw ow ana u chorych na cukrzycę i osób otyłych w skazuje,
że zaburzenia aktywności tego białka m ogą stanow ić jedną
z przyczyn insulinooporności. Zależności pom iędzy eks­
presją genów dla poszczególnych białek uczestniczących w
integracji błon m itochondrialnych a stanam i chorobow ym i
oraz dane dotyczące m echanizm ów fuzji i dzielenia się m i­
tochondriów są niezwykle cenne, jednakże nadal bez o d p o ­
wiedzi pozostają pytania, w jaki sposób i za pośrednictw em
jakich sygnałów w ew nątrzkom órkow ych in d u k ow an e są
zm iany strukturalne m itochondriów . Do tej pory naukow cy
nie potrafią rów nież w ykazać zw iązku przyczynow o sk ut­
kowego pom iędzy dynam iką przekształceń strukturalnych
m itochondriów a aktyw nością metaboliczną komórki.
PIŚM IE N N IC TW O
1. Brocard JB, Rintoul GL, Reynolds IJ (2003) New perspectives on m ito­
chondrial m orphology in cell function. Biol Cell 95: 239-242
2. Cipolat S, M artins de Brito O, Dal Zilio B, Scorrano L (2004) OPA1 re­
quires m itofusin 1 to prom ote m itochondrial fusion. Proc N atl Acad
Sci USA 101:15927-15932
3. M eeusen SL, N unnari J (2005) H ow m itochondria fuse. C urr O pin Cell
Biol 17: 389-394
12. Rojo M, Legros F, Chateau D, Lombes A (2002) M em brane topology
and m itochondrial targeting of mitofusins, ubiquitous m am m alian ho­
mologs of the transm em brane GTPase Fzo. J Cell Sci 115:1663-1674
13. Koshiba T, Detm er SA, Kaiser JT, Chen H, McCaffery JM, Chan DC
(2004) Structural basis of m itochondrial tethering by m itofusin com ­
plexes. Science 305: 858-862
14. H onda S, Aihara T, H ontani M, O kubo K, Hirose S (2005) M utational
analysis of action of mitochondrial fusion factor mitofusin-2. J Cell Sci
118: 3153-3161
15. N euspiel M, Z unino R, Gangaraju S, Rippstein P, McBride H (2005)
Activated m itofusin 2 signals m itochondrial fusion, interferes w ith
Bax activation, and reduces susceptibility to radical induced depolari­
zation. J Biol C hem 280: 25060-25070
16. Satoh M, H am am oto T, Seo N, Kagawa Y, Endo H (2003) Differen­
tial sublocalization of the dynam in-related protein OPA1 isoforms in
m itochondria. Biochem Biophys Res C om m un 300: 482-493
17. Ishihara N, Eura Y, M ihara K (2004) M itofusin 1 and 2 play distinct
roles in m itochondrial fusion reactions via GTPase activity. J Cell Sci
117: 6535-6546
18. Legros F, Lombes A, Frachon P, Rojo M (2002) M itochondrial fusion in
hu m an cells is efficient, requires the inner m em brane potential, an d is
m ediated by m itofusins. Mol Biol Cell 13: 4343-4354
19. Pich S, Bach D, Briones P, Liesa M, Cam ps M, Testar X, Palacin M, Zorzano A (2005) The Charcot-M arie-Tooth type 2A gene product, Mfn2,
up-regulates fuel oxidation through expression of OXPHOS system.
H um Mol Gen 14:1405-1415
20. Bach D, Pich S, Soriano FX, Vega N, Baum gartner B, Oriola J, D augaard
JR, Lloberas J, C am ps M, Zierath JR, Rabasa-Lhoret R, W allberg-Henriksson H, Laville M, Palacin M, Vidal H, Rivera F, Brand M, Z orzano
A (2003) Mitofusin-2 determ ines m itochondrial netw ork architecture
and m itochondrial metabolism. J Biol Chem 278:17190-17197
21. Geller ich FN, Trum beckaite S, M üller T, D eschauer M, Chen Y, G iza­
tullina Z, Zierz S (2004) Energetic depression caused by m itochondrial
dysfunction. Mol Cell Biochem 256/257: 391-405
22. C haturvedi S, Bala K, Thakur R, Suri V (2005) M itochondrial encephalomiopathies: advances in understanding. M ed Sci M onit 11: RA238246
23. O ldfors A, Tulinius M (2003) M itochondrial encephalom yopathies. J
N europathol Exp N eurol 62: 217-227
24. Sm eitink JAM (2003) M itochondrial disorders: clinical presentation
and diagnostic dilem m as. J Inherit M etab 26:199-207
5. Bossy-Wetzel E, Barsoum MJ, G odzik A, Schw arzenbacher R, Lipton
SA (2003) M itochondrial fission in apoptosis, neurodegeneration and
aging. C urr O pin Cell Biol 15: 706-716
25. Bach D, N aon D, Pich S, Soriano FX, Vega N, Reiusset J, Laville M,
Guillet C, Boirie Y, W allberg-Henricsson H, Manco M, Calvani M,
Castagneto M, Palacin M, M ingrone G, Zierath JR, Vidal H, Zorzano A
(2005) Expression of Mfn2, the Charcot-M arie-Tooth neuropathy type
2A gene, in hum an skeletal muscle: effects of type 2 diabetes, obesity,
w eight loss, and the regulatory role of tum or necrosis factor alpha and
interleukin-6. Diabetes 54: 2685-2689
6. M ozdy AD, McCaffery JM, Shaw JM (2000) D n m lp G TPase-m ediated
m itochondrial fission is a m ulti-step process requiring the novel inte­
gral m em brane com ponent Fislp. J Cell Biol 151: 367-380
26. Chen H, C hom yn A, Chan DC (2005) D isruption of fusion results in
m itochondrial heterogeneity and dysfunction. J Biol Chem 280: 2618526192
7. Yoon Y, Krueger EW, O sw ald BJ, M cNiven MA (2003) The m itochon­
drial protein hFisl regulates m itochondrial fission in m am m alian cells
through an interaction w ith the dynam in-like protein DLP1. Mol Cell
Biol 23: 5409-5420
27. Cartoni R, Leger B, Hock MB, Praz M, Crettenand A, Pich S, Ziltener
JL, Luthi F, Deriaz O, Z orzano A, Gobelet C, Kralli A, Russel AP (2005)
M itofusins 1 /2 and ERRa expression are increased in hum an skeletal
m uscle after physical activity. J Physiol 567: 349-358
8. Scorrano L (2003) Divide et impera: Ca2+ signals, m itochondrial fission
and sensitization to apoptosis. Cell Death Differ 10:1287-1289
28. Paw likow ska P, Orzechowski A (2006) M itofusin 2 (Mfn2) - a key
player in insulin-dependent m yogenesis in vitro. Cell Tissue Res (w
druku)
4. Skulachev VP (2006) Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis. A poptosis 11: 473-485
9. Breckenridge DG, Stojanovic M, Marcellus RC, Shore GC (2003) Caspase cleavage product of BAP31 induces m itochondrial fission through
endoplasm ic reticulum calcium signals, enhancing cytochorom e c re­
lease to the cytosol. J Cell Biol 160:1115-1127
10. Chen H, Detm er SA, Ewald AJ, Griffin EE, Fraser SE, Chan DC (2003)
Mitofusins M fnl and Mfn2 coordinately regulate m itochondrial fusion
and are essential for embryonic developm ent. J Cell Biol 160:189-200
11. Santel A, Frank S, G aum e B, H errler M, Youle RJ, Fuller MT (2003) Mitofusin-1 protein is a generally expressed m ediator of m itochondrial
fusion in m am m alian cells. J Cell Sci 116: 2763-2774
29. Chen KH, G uo X, Ma D, Guo Y, Li Q, Yang D, Li P, Q iu X, W en S, Xiao
RP, Tang J (2004) D ysregulation of HSG triggers vascular proliferative
disorders. N at Cell Biol 6: 872-883
30. Karbowski M, Lee YJ, G aum e B, Jeong SY, Frank S, N echushtan A,
Santel A, Fuller M, Sm ith CL, Youle RJ (2002) Spatial and tem poral
association of Bax w ith m itochondrial fission sites, D rp l, and Mfn2
during apoptosis. J Cell Biol 159: 931-938
31. W esterm ann B (2002) M erging m itochondria m atters. C ellular role and
m olecular m achinery of m itochondrial fusion. EMBO Rep 3: 527-531
58
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
32. Vasiliaki A, M ansouri A, Rem m en H, van der M eulen JH, Larkin L,
Richardson AG, M cArdle A, Faulkner JA, Jackson ML (2006) Free radi­
cal generation by skeletal m uscle of adult and old mice: effect of con­
tractile activity. Aging Cell 5:109-117
33. Santel A (2006) Get the balance right: M itofusins roles in health and
disease. Biochim Biophys Acta 1763: 490-499
Role of transmembrane GTPases in m itochondrial m orphology and activity
Patrycja P a w lik o w sk a , A rk a d iu sz O r z e c h o w sk i 0
D epartm ent of Physiological Sciences, Faculty of V eterinary M edicine, W arsaw A gricultural U niversity, 159 N ow oursynow ska St., 02-776
W arsaw , Poland
e-mail: arkadiusz_orzechow ski@ sggw .pl
Key words: m itochondrion, fusion, Mfn2
A B ST A C T
M itochondria play crucial role in the energetic metabolism , therm ogenesis, maintenance of calcium hom eostasis and apoptosis. Cyclic chan­
ges in fusion and fission o f mitochondria are required for properly functioning organelles, especially in tissues w ith high dependence on
energy supply such as skeletal m uscles, heart, or neurons. The key role of mitochondrial fusion is observed in embryonic developm ent and
m aintaining unchanged m tD N A pool under conditions of oxidative stress. There is a large number of data indicating that mitochondrial
networks often accompany the resistance to apoptotic stim uli. In contrast to fusion - the mitochondrial fission precedes apoptosis. According
to the new est kn ow led ge precise interactions betw een a fe w proteins are required for mitochondrial fusion and division. Am ong them D rpl,
M fn l, Mfn2 and O p al are considered the m ost important. Recent reports shed som e light on the physiological importance of proteins parti­
cipating in mitochondrial m embrane dynam ics in energy production, apoptosis and cellular signaling. In this review the authors report on
the recent kn ow led ge concerning structural changes of mitochondria w ith a particular interest to transmembrane GTPases and their role in
cellular physiology.
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
59
Tuftsyna - now e analogi i w ła ściw o ści
STRESZCZENIE
A nn a W a rd o w sk a 1'
K rystyna D zie r z b ic k a 2
A ndrzej M y ś liw s k i 1
'K atedra H istologii i Im m unologii, A k adem ia
M edyczna, G dańsk
2K atedra Chem ii O rganicznej, W ydział C he­
m iczny, Politechnika G dańska, G d a ń sk
A nna W ardow ska, K atedra H istologii i Im ­
m unologii, A kadem ia M edyczna, ul. D ębinki 1,80-210 G dańsk e-mail: anna.w ardow ska@
am g.gda.pl, tel. (058) 349 14 44
A rtykuł otrzym ano 6 czerw ca 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 11 w rz eśn ia 2006 r.
Słowa kluczowe: tuftsyna, im m u n o m o d u lato r,
analogi tuftsyny, aktyw ność biologiczna
Wykaz skrótów: AIDS - zespół n abytego u p o ­
śledzenia odporności; AZT - a zy d o ty m id y n a ;
CD (ang. cluster of differentiation) - kom pleks
różnicow ania (tym sym bolem i o d p o w ie d n ią
cyfrą oznaczone są stru k tu ry pow ierzch n io w e
kom órek, głów nie leukocytów ); G M D P - Nacetylo-glukozam ino-m uram ylodipeptyd; IgM
- przeciw ciało klasy IgM; IL-1 - interleu k in a 1;
IL-2 - interleukina 2; IFN-y - interferon y; M D P
- N -acetylo-m uram ylo-L -alanylo-D -izoglu ta­
rnina; nor-M D P - N -acetylo-nor-m uram ylo-L alanylo-D -izoglutam ina; Pap - p-am inofenyloalanina; THFy2 (ang. thymic humoral factor )
- p o lipeptydow y czynnik h u m o raln y grasicy;
TLR (ang. Toll-like receptors) - recep to ry Tollpodobne; WBC (ang. white blood cells) - krw in k i
białe
Podziękowanie: Praca p ow stała pod czas reali­
zacji projektu badaw czego KBN 2P05A 00428
60
uftsyna, zbudowana z czterech reszt am inokw asow ych (TKPR), jest najm niejszym en­
d ogennym im m unom odulatorem występującym w naturze w e krwi człowieka i innych
ssaków . Została w yizolow ana w 1970 roku na Uniw ersytecie Tufts w Bostonie (USA) przez
Najjara i N ishioka [1]. Tuftsyna jest zw iązkiem o bardzo szerokim spektrum aktywności
biologicznej, aktywuje w iele elem entów układu im m unologicznego, powodując wzrost cytotoksyczności makrofagów oraz granulocytów. W ykazuje ona działanie nie tylko im m unostym ulujące, ale również przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, przeciwnow otw orow e oraz
przeciwgrzybicze. W artykule opisano now e w łaściw ości i analogi tuftsyny.
T
W P R O W A D Z E N IE
T uftsyna jest tetrapep ty d em (Ryc. 1) zlokalizow anym w łańcuchu ciężkim Fc
im m unoglobuliny G (IgG) i uw alniana jest w w yniku działania dw óch specy­
ficznych enzym ów : endokarboksypeptydazy tuftsynowej śledziony, rozszcze­
piającej w iązanie peptyd o w e pom iędzy R292 i E293 oraz leukokininazy, znajdu­
jącej się w błonach kom órek fagocytujących, hydrolizującej w iązanie m iędzy
K288 i T289 [1,2]. N ajważniejszą aktyw nością biologiczną tuftsyny jest aktywacja
fagocytozy granulocytów i m akrofagów . Indukuje ona rów nież pinocytozę czy
w y b u ch tlenow y fagocytów, co w efekcie pro w ad zi do zwiększonej aktywności
bakteriobójczej tych kom órek, a także niszczenia kom órek transform ow anych
n o w o tw o ro w o [3], W ykazano, że poprzez aktywację procesów im m unologicz­
nych, a w szczególności fagocytozy, tuftsyna m oże w sposób pośredni w p ły ­
w ać na układ nerw ow y. Zatem z pow odzeniem m ożna nazw ać ten tetrapeptyd
łącznikiem pom iędzy obydw om a układam i: odpornościow ym i nerw ow ym
[4,5]. O pisano rów nież, że istnieje bezpośrednia zależność m iędzy praw idło­
w y m funkcjonow aniem śledziony a aktyw nością tuftsyny. Badania prow adzone
na organizm ach żyw ych pokazały, że u osobników , którym usunięto śledzionę
w ystępuje niekorzystny dla organizm u nabyty deficyt tuftsyny pow odując jego
osłabienie i podatność na wiele infekcji [6]. Ze w zględu na swoje właściwości
tuftsyna jest wciąż bardzo interesującym tem atem badań w w ielu ośrodkach na
świecie. W tej publikacji om ów im y interesujące naszym zdaniem prace o publi­
k o w an e po 1999 roku.
W Ł A ŚC IW O ŚC I TUFTSYNY
Pom im o wielu,
bo p o n a d 30-tu lat
b ad ań nad aktyw ­
nością
tuftsyny,
okazało się, że nie
w szystkie jej w łaś­
ciwości zostały p o ­
znane. Pavlov i Sam on in a [7] w sw o­
jej pracy zwrócili
u w ag ę na całkowi­
cie now ą, dotych­
czas nie eksplo­
ro w an ą zdolność
tego tetrap ep ty d u
do
zm niejszania
ow rzodzeń. W yka­
zano, że profilak­
tyczne i terapeu­
tyczne podaw anie
tuftsyny pow oduje
R y cin a L T u ftsyn a (TKPR).
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
ograniczenie miejsca ow rzodzenia oraz szybsze wygojenie
chorej tkanki.
W roński i wsp. [8] odkryli, że tuftsyna wiąże się selek­
tyw nie z neuropiliną-1 blokując w iązanie VEGF (naczynio­
wego, endotelialnego czynnika w zrostu). Sugerują oni, że
obecność receptorów dla tuftsyny na kom órkach śródbłonka
odzw ierciedla zdolność tych kom órek do udziału w reakcji
zapalnej. Zatem stosow anie odpow iednich sond m ogłoby
okazać się użyteczne w uw idacznianiu zapaleń naczyń in
vivo. Trevisani i w sp. [9] stw ierdzili, że aktyw ność i stężenie
tuftsyny jest niższe w przy p ad k u marskości w ątroby czy
uszkodzenia funkcji śledziony i przyczynia się do osłabie­
nia aktywności fagocytarnej granulocytów . Potw ierdzili oni
niedobór tego tetrap ep ty du w p rz y p a d k u wycięcia w ątroby
(splenektomia), przewlekłej białaczki szpikowej, zw łóknie­
nia szpiku, plamicy m ałopłytkowej, niedokrw istości sierpowatej oraz AIDS. W ostatnich latach ukazało się kilka prac
podejm ujących kwestię w p ły w u transplantacji śledziony i
w ątroby na aktyw ność u kładu im m unologicznego i zdol­
ność do obrony przed infekcjami. Foschi i wsp. [10] w y k a­
zali, że ortotropow e przeszczepienie w ątroby prow adzi do
o d b u d ow y naturalnych sił obronnych organizm u poprzez
podw yższenie aktyw ności tuftsyny skutkujące zwiększoną
aktyw nością fagocytarną neutrofili. Efekt przyw rócenia pra­
w idłow ego poziom u tuftsyny i IgM w surow icy pacjentów
po częściowej autotransplantacji śledziony, zaobserw ow ali
rów nież Zhang i wsp. [11], Z kolei Brandt i wsp. [12] prze­
badali grupę dzieci z uszkodzoną śledzioną. Wykazali, że
w prow adzenie autologicznej tkanki śledziony prow adzi do
znacznego zwiększenia odpow iedzi im munologicznej na
szczepionkę przeciw pneum okokom , jak rów nież do p o d ­
niesienia poziom u tuftsyny w surowicy.
Siemion i wsp. [3] opisali w p ły w nie tylko tuftsyny, ale
rów nież innych im m u n o pep ty d ó w , np. tym uliny, tymopoetyny, tym ozyny i czynnika hum oralnego grasicy (jeden
z czynników grasicy w pływ ający na proces dojrzew ania
limfocytów T) na centralny system nerw ow y (CNS). P o d ­
kreślili oni w swojej pracy, badaną od lat 80-tych XX w.,
zdolność tuftsyny do znoszenia czucia bólu. Za tę aktyw ­
ność, jak też osłabienie efektu odstaw ienia m orfiny obser­
w ow anego u uzależnionych od tego leku szczurów , o d p o ­
w iada d ipeptyd o sekwencji prolilo-arginina. Kozlovskaya i
w sp. [13] testowali tuftsynę i niektóre jej analogi podaw ane
d ootrzew now o (i.p) szczurom i m yszom na działanie antystresowe. N atom iast radiofarm aceutyczny zw iązek Tc99m-RP128 [14], z b u d ow an y z Tc i tripep ty d u N,N-dimetylo-GSC(Acm) połączony poprzez resztę glicyny z pentap ep ty d em TKPPR, który wiąże się in vivo ze specyficznym
błonow ym receptorem dla tuftsyny [15,16], zastosow ano do
w ykryw ania i oznaczania miejsc zapalnych w centralnym
system ie n erw ow ym [17]. Z w iązek ten przeszedł do I fazy
b ad ań klinicznych [18]. O kazało się, że jest on bezpiecznym
i skutecznym środkiem znajdującym zastosow anie w u w i­
dacznianiu zm ienionych chorobow o miejsc u pacjentów z
długotrw ałym reum atoidalnym zapaleniem staw ów [18].
W ang i w sp. [19] stwierdzili, że fragm ent 1-3 tuftsyny (TKP)
działa jako inhibitor m akrofagów /m ikrogleju odgryw ający
w ażną rolę ochronną zapobiegającą krw otokow i śródm ózgow em u w badaniach na m odelu zwierzęcym. Tripeptyd
(TKP) obniża rów nież produkcję w olnych rodników oraz
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
ilość n e u ro n ó w ulegających degradacji, czego efektem jest
zmniejszenie obszaru uszkodzenia, a także popraw ia dzia­
łanie u k ład u nerw ow eg o [19]. Raibon i wsp. [20] u d o w o d ­
nili, że inhibitor 1-3 tuftsyny p o dan y do ciałka szklistego
oka po w o d u je zw iększoną regenerację aksonów w arstw y
zwojowej siatków ki oraz zm niejszenie ilości fagocytów w
siatkówce.
T U F T S Y N A W L IP O S O M A C H
A graw al i G u p ta [21] oraz G u p ta i Flaq [22] wykazali, że
um ieszczenie tuftsyny w liposom ach lub na powierzchni
liposom ów niosących antybiotyki, np. am foterycynę B czy
nystatynę, zw iększa specyficzne w iązanie tych nośników
z kom órkam i u k ła d u fagocytów jednojądrzastych oraz ak­
tyw ność cytotoksyczną tych kom órek, a także efekt tera­
p eutyczny leku. Tem at nośników podjęli rów nież Ahsan
i wsp. [23] skupiając się bardziej na rodzajach nośników i
ich o d d ziały w an iu z m akrofagam i. Owais i wsp. [24] b ad a­
li w p ły w liposom ów z b u d o w an y ch z dietylokarbam azyny
(DEC) zaw ierających tuftsynę przeciw infekcji Brugia malayi
(nitkowiec) u myszy. T uftsyna kapsułkow ana w liposo­
m ach zw iększała skuteczność zw alczania naw et dorosłych
pasożytów . Z espół K hana [25-27] badał w pływ tuftsyny
w liposom ach zaw ierających nystatynę (Tuft-Lip-Nystat)
w zw alczaniu eksperym entalnej kandydozy w yw oływ a­
nej przez Candida albicans, wykazującej oporność in vivo na
am foterycynę B (AmpB). W ykazali oni również, że podanie
polienow ego antybiotyku, jakim jest nystatyna lub amfoterycyna B razem z tuftsyną m yszom B alb/c z neutropenią
zakażonych k a n d y do zą, aktyw uje układ im m unologicz­
ny i p ro w a d z i do całkow itego wyleczenia. W ażną rolę w
ak ty w o w an iu m akrofagów odegrała tutaj profilaktyka z
użyciem tuftsyny kapsułkow anej w liposomach. Wydaje
się, że liposom y niosące tuftsynę m ogą być dobrym i noś­
nikam i dla leków w leczeniu infekcji, podczas których o d ­
pow iedź układu im m unologicznego bazuje na aktywacji
m akrofagów . Do p ow yższych prac naw iązało w ostatnich
latach w iele zespołów n au k o w y ch [24-32], W ykorzystali oni
w sw oich badaniach liposom y jako nośniki leków. D odat­
kowo zw iększyli specyficzność oddziaływ ania liposom ów
z m akrofagam i p o p rzez inkorporację tuftsyny do w nętrza
nośników lub na ich pow ierzchnię. Wykazali również, że
profilaktyczne p o d a w a n ie zw ierzętom liposom ów z samą
tuftsyną zw iększa odp orn ość na malarię [22], leiszmaniozę
[32] i infekcje grzybicze [24-30]. N atom iast obecność o d p o ­
w iedniego anty biotyk u w takich liposom ach podnosi efekt
terapeutyczny leku [22,24,32].
A N A L O G I T U F T SY N Y I ICH
A K T Y W N O Ś Ć B IO L O G IC Z N A
Tuftsyna jest zw iązkiem b ardzo podatnym na biodegra­
dację i to było jed n y m z głów nych pow odów do poszuki­
w ania jej analogów o d łu ż sz y m czasie działania, wyższej
aktyw ności biologicznej, bardziej trw ałych i potencjalnie
p rzy datn y ch w terapii. Z syntetyzow ano wiele analogów
tuftsyny, m iędzy innym i: różniących się składem i sekw en­
cją a m ino k w asó w w łańcuchu [2,6,33,34], o przedłużonym
łańcuchu p e p ty d o w y m [2,6,35,36], analogi zawierające
pochodne k w asu 1-am inocyklobutano-l-karboksylow ego
[2,6,37], tioanalogi [38], analogi posiadające w iązanie izo-
http://rcin.org.pl
61
peptydow e [2,6,39], cykliczne analogi,
np. cykliczny peptyd c-[T-K-P-R-G] o
aktywności porów nyw alnej do tuftsyny w stężeniu 50-ciokrotnie niższym
[40], analogi retro-inverso zawierające
nie tylko białkowe, ale i niebiałkowe
am inokw asy [2,6,41,42] oraz analogi
m odyfikow ane cukrami, m iędzy inny­
mi dicukrow ą pochodną m uram ylodip eptydu (GMDP) [43], O statnio opisa­
no syntezę cyklicznych azo pep ty d ó w
w tym także analogów tuftsyny (Ryc.
2a i 2b) [44],
Podjęto rów nież próby modyfikacji
tuftsyny przez przyłączenie do niej n a­
turalnych peptydów , np. THFy2 [45].
Opierając się na danych dotyczących
tych analogów w ostatnim czasie zsyntetyzow ano koniugaty tuftsyny z bio­ R y c in a 2. C y k licz n e a z o a n a lo g i tu ftsy n y [44].
logicznie czynnym i zw iązkami, takimi
im m unologicznego, p rzede w szystkim na pobudzenie syn­
jak: m uram ylodipeptyd (MDP, zw iązek 3a na Ryc. 3), nortezy w olnych rodników przez granulocyty i w mniejszym
m uram ylodipeptyd (nor-MDP, zw iązek 3b na Ryc. 3) [46,47]
stopniu przez m akrofagi oraz syntezy m onokin przez moczy azydotym idyna (AZT, zw iązek 4 na Ryc. 3) [48],
nocyty. Koniugaty tuftsyny z m u ram y lo d ip ep ty d em i norm u ram y lo dipep ty d em p o d d an o badaniom , których celem
Dzierzbicka i wsp. [46,47] przy projektow aniu koniubyła: ocena w p ły w u tych zw iązków na żyw otność m ononugatów tuftsyny z m uram y lo d ip ep ty dem i n or-m uram yloklearnych kom órek krw i obwodow ej (PBMC), limfocytów
dipeptydem (związek 3a i 3b na Ryc. 3) w ychodzili z za­
krw i obw odow ej (PBL) i m onocytów, ocena sekrecji czyn­
łożenia, że połączone cząsteczki o zbliżonej aktyw ności
nika m artw icy no w otw o ru (TNFa) i interleukiny 6 (IL-6) w
biologicznej m ogą okazać się w swoim działan iu bardziej
hodow lach kom órek stym ulow anych badanym i zw iązka­
przydatne farmakologicznie niż obie składow e, tzn. m urami. Zbadanie w p ły w u na cytotoksyczność n aturalnych ko­
m ylopeptyd i tuftsyna osobno, a ich łączny efekt działania
m órek zabójczych (NK) oraz ocena w ybuchu tlenow ego w
może mieć charakter nie tylko addytyw ny, ale w ręcz synersubpopulacjach krw i obw odow ej pod w pływ em badanych
giczny. Działanie m uram ylodipeptydu obejm uje aktyw acje
zw iązków . Zaletą badanych koniugatów było ich szybsze
m onocytów i makrofagów. M uram ylodipeptyd jako analog
działanie i w iększa skuteczność w porów naniu do tuftsy­
fragm entów ściany bakterii działa na receptory dla lipopony. Planow ane testy in vivo na m odelu zw ierzęcym będą
lisacharydu (LPS) typu CD14 oraz rodzinę receptorów TLR.
m ogły potw ierdzić potencjalną użyteczność tych połączeń.
Jak w iadom o, pobudzenie tych receptorów w yw ołuje sze­
Do syntezy koniugatów tuftsyny z m uram ylod ip ep ty d em
reg aktywności komórek. Działanie tuftsyny skierow ane
i n o r-m u ram ylod ip ep ty d em zastosow ano m etodę m iesza­
jest głównie na aktywację nieswoistych elem entów uk ład u
nych bezw odników z w ykorzystaniem chlorom rów czanu
izobutylu i N-m etylom orfoliny [46,47].
W 2002 roku Zhang i wsp. [49] zsyntetyzow ali analogi
tuftsyny (związki 5a-j na Ryc. 4), m iędzy innym i z m u ram y ­
lodipeptydem , w ykorzystując syntezę na nośniku stałym o
nazw ie „M eshed-Bag G athered-Bunch" (MBGB).
R ycin a 3. K on iu gaty tu ftsyn y (3a) i retro-tuftsyny (3b) z m u r a m y lo d ip e p ty d e m
(M DP) lu b n o r -m u ra m y lo d ip ep ty d em (nor-M D P) [46,47] o ra z z A Z T (4) [48].
62
Zsyntetyzow any przez Fridkina i wsp. [48] k oniugat AZT,
leku stosow anego w terapii AIDS, z tuftsyną (AZT-tuftsyna)
(związek 4 na Ryc. 3) rów nież w ykazyw ał właściwości obu
kom ponentów . Podobnie jak AZT ham ow ał on aktyw ność
odw rotnej transkryptazy i ekspresję antygenu HIV i p odob­
nie do tuftsyny pobudzał uw alnianie IL-1 przez mysie m a­
krofagi. Badania w ykazały, że koniugat A ZT-tuftsyna nie
jest cytotoksyczny w stosunku do kom órek T (limfocytów
T) i m oże mieć potencjalne zastosow anie w terapii AIDS.
Często w końcowej fazie choroby AIDS obejmującej infek­
cje sp ow odow ane przez drobnoustroje oportunistyczne
(Toxoplasma gondii, Candida albicans, cytomegalow irus) czy
now otw ory (mięsak Kaposiego, chłoniak w yw odzący się z
limfocytów B czy rak szyjki macicy) pojawia się u pacjentów
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
5a. Mur/VAc-Ala-D-izoGln-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5b. Mur/VAc-Ala-D-izoGln-Lys-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5c. Ala-D-izoGln-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5d. Ala-D-izoGln-Lys-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5e. MurA/Ac-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5f. MurA/Ac-Lys-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5g. Mur/VAc-Thr-D-izoGln-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5h. MurA/Ac-Thr-D-izoGln-Lys-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5i. MurA/Ac-Ala-D-Glu(OBzl)-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
5j. Mur/VAc-Ala-D-Glu(OBzl)-Lys-Thr-Arg-Pro-Lys-OH
R y cin a 4. A n a lo g i tu ftsy n y z s y n te ty z o w a n e n a n o śn ik u sta ły m (MBGB) [49],
leukopenia (zmniejszenie liczby krw inek białych w e krwi),
pow oduje to, że terapia AZT (pierw szy lek ham ujący sw o­
iście replikację wirusa) nie m oże być stosow ana. Tuftsyna
w pływ ająca na leukocytozę p ro w ad zi do podw yższenia
liczby WBC, dlatego też p odaw anie jej np. z AZT lub inny­
mi lekami m oże w pływ ać korzystnie na rezultaty leczenia.
G okulan i wsp. [50] zsyntetyzow ali polituftsynę (TKPR)4(|
jako nośnik dla syntetycznych p ep ty d ó w w yw odzących
się z białek gp41 i gp l2 0 w irusa HIV. Stw ierdzono, że za­
stosow anie polituftsynow ego nośnika m oże zwiększyć o d­
pow iedź im m unologiczną przeciw słabo im m unogennym
syntetycznym peptydom , które są determ inantam i anty­
genow ym i naturalnych fragm entów m ikroorganizm ów
chorobotw órczych. Zainteresow anie polituftsyną jest duże,
p oniew aż w ykazuje ona taką sam ą aktyw ność biologiczną
jak tuftsyna, zw iększa produkcję IL-2 i IFN-y, a przy tym
posiada dłuższy czas półtrw ania w organizmie.
Mezo i w sp. [51] opisali syntezę i im m unoaktyw ność n o ­
w ych nośnikow ych cząsteczek opartych na sekwencji tuftsyno-podobnej. O ligopeptydy bazujące na pentapeptydzie
(TKPKG)n (n=2,4,6,8), pochodnej tuftsyny o różnej długości
łańcucha, zostały zsyntetyzow ane na nośniku stałym. Te
dobrze rozpuszczalne oligomery były nietoksyczne w sto­
sun k u do m ysich kom órek śledziony, nie były im m unogenne, a ich im m unostym ulatorow e efekty pow odow ały
w zrost o dpow iedzi przeciwciał na antygen (SRBC) u m y­
szy. O trzym an e dane sugerują, że now e oligotuftsynow e
pocho d n e m ogą być obiecującymi nośnikam i dla syntetycz­
nych szczepionek.
Jed n ym ze sposobów leczenia i zapobiegania choro­
bie A lzheim era jest im m unoterapia. U w aża się, że głów ną
p rzyczyną choroby A lzheim era są płytki starcze, utw orzone
z białka zw anego ß-am yloidem powstającego z białka prekursorow ego, APP, w ystępującego w e w szystkich kom ór­
kach organizm u. W ażnym celem b ad ań n ad lekami przeciw
tw orzeniu złogów ß-am yloidu jest enzym sekretaza. Poszu­
kuje się zw iązków zarów no aktyw ujących a-sekretazę p ro ­
m ującą tw orzenie nieszkodliw ego APP, jak i inhibitory ß- i
y-sekretazy. Szuka się rów nież leków utrudniających tw o­
rzenie lub rozbijanie złogów ß-am yloidu, a także próbuje
się otrzym ać szczepionki przeciw ß-am yloidowi. M anea i
wsp. [52,53] zsyntetyzow ali na nośniku stałym koniugaty
zaw ierające p eptyd o w e d eterm inanty antygenow e B-komórek ß-am yloidu Aß(4-10) (FRHDSGY) połączone wiązaniem
a m id o w y m po p rzez resztę pentaglicyny czy a-, ß-alaniny
z po cho d n ą tetratuftsyny (Ac-[TKPKG]4-N H 2) lub z peptyd o w y m nośnikiem w ydłużonym przez przyłączenie anty­
genu kom órek T-pomocniczych (Ac-FFLLTRILTIPQSLD[TKPKG]4-N H 2) zapalenia w ątroby ty p u B (Ryc. 5). O kaza­
ło się, że m odyfikacja peptydow ego epitopu (3-amyloidu
przez przyłączenie do nośnika lub poprzez w prow adzenie
d im eru z b u d o w an eg o z alaniny, prow adzi do otrzym yw a­
nia syntetycznych antygenów rozpoznaw anych przez prze­
ciwciała. Badania te odgryw ają w ażną rolę w projektow aniu
syntetycznych szczepionek o potencjalnym zastosow aniu w
leczeniu choroby Alzheimera.
P O D S U M O W A N IE
Tuftsyna jest n atu ralny m tetrapeptydem aktyw ującym
m onocyty, m akrofagi i polim orfonuklearne leukocyty
w zm acniając ich naturalną zabójczą aktyw ność przeciw
licznym p ato g en o m i now otw orom . Antymikrobiologiczn a aktyw ność tego p ep ty d u w zrasta przez przyłączenie do
jego C-końca fragm entu etylenodiam iny z resztą acylową
k w asu tłuszczow ego, np. palm itynow ego i włączenie tak
zm odyfikow anej tuftsyny (palmitoilo-tuftsyny, TKPR-NH(CH2)2-N H -C O -C 15H 31) w liposomy [22], Tuftsyna w liposom ach nie tylko podnosi odporność gospodarza przeciw
chorobom z akaźnym , takim jak np. gruźlica czy leiszmanioza, ale także p o zw ala na efektywne dotarcie leku do miejsca
infekcji. T uftsyna jako lek nie znalazła do tej pory w iększe­
go zastosow ania, głów nie z uw agi na jej szybką biodegrada­
cję w o rganizm ie (okres półtrw ania wynosi około 16 minut).
Pow stające w w y n ik u biodegradacji enzymatycznej tripepty d y TKP i KPR w ykazują działanie hamujące aktywność
tuftsyny. D latego też w dalszym ciągu poszukuje się aktyw ­
niejszych i trw alszych jej analogów, np. poprzez otrzym y­
w an ie k o n iu g ató w z biologicznie czynnym i zw iązkam i czy
szukanie o d p o w ied nich nośników.
A
Ac-[T K P K G]4-NH2
h -x 2f r h d s g y x 2 - I
X = Q(T20-Ap(4-10)4)
X = Ala(T20(Ap4-10-Ala)4)
X = p-Ala(T20(A34-10-Ala)4)
B
Ac-FFLLTRILTIPQSLD-[T K P K G]4-NH2
H-X2FRHDSGYX2 J
X = Q(T20-T-komórki-AP(4-10)4)
X = Ala(T20-T-komórki(Ap4-10-Ala)4)
X = p-Ala(T20-T-komórki(Ap4-10-Ala)4)
Rycina 5. Struktura koniugatów zawierających AP(4-10)-tetratuftsyno-pochodne (A)
oraz modyfikowane antygenem komórek T-pomocniczych (B) [53].
P IŚ M IE N N IC T W O
1. Najjar VA, N ishioka K (1970) Tuftsin: a natural phagocytosis stim ula­
ting peptide. N ature 228: 672-673
63
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
2. Siemion Z, Kluczyk A (1999) Tuftsin: O n the 30-year anniversary of
Victor Najjar's discovery. Peptides 20: 647-674
3. Siemion Z, Kluczyk A, Cebrat M (2005) The peptide m olecular links
betw een the central nervous and the im m une systems. A m ino Acids
29:161-176
23. Ahsan F, Rivas IP, Khan MA, Torres Suarez AI (2002) Targeting to
m acrophages: role of physiochem ical properties of particulate carriers-liposom es and m icrospheres-on the phagocytosis of m acrophages.
J Control Release 79: 29-40
4. H erm an ZS, Stachura Z, Siemion IZ, Naw rocka E (1980) Anelgestic
activity of som e tuftsin analogs. N aturw issenschaften 67: 613-614
24. Ow ais M, M isra-Bhattacharya S, H aq W, G u p ta CM (2003) Im m uno­
m odulator tuftsin augm ents antifilarial activity of diethylcarbam azine
against experim ental burgian filariasis. J D rug Target 11: 247-251
5. H erm an ZS, Stachura Z, Opielka L, Siemion IZ, N aw rocka E (1981)
Tuftsin and D-Arg3- tuftsin possess analgestic action. Experientia 37:
76-77
25. Khan MA, Firoz A, Jabeen R, O w ais M (2004) Prophylactic role if imm unom odulators in treatm ent of system ic candidiasis in leucopenic
mice. J D rug Target 12: 425-433
6. Dzierzbicka K, Rakowski T, Kolodziejczyk AM (2000) Tuftsyna - endogenny im m unom odulator. Post Biochem 46: 327-335
26. Khan MA, Faisal SM, H aque W, O w ais M (2002) Im m unom odulator
tuftsin augm ents anti-fungal activity of am photericin B against experi­
m ental m urine candidiasis. J D rug Target 10:185-192
7. Pavlov TS, Sam onina GE (2004) A new property of endogenous im m unostim ulator taftsin. B Exp Biol M ed 138:163-164
8. von W ronski M, Raju N, Pillai R, Bogdan NJ, Marinelli ER, N anjappan
P, Ram alingam K, A runachalam T, Eaton S, Linder KE, Yan F, Pochon
S, Tweedle MF, N unn AD (2006) Tuftsin binds neuropilin-1 through
a sequence similar to that encoded by exon 8 of vascular endothelial
grow th factor. J Biol Chem. 281: 5702-5710
9. Trevisani F, Castelli E, Foschi FG, Parazza M, Loggi E, Betelli M, Melotti C, Domenicali M, Zoli G, Bem ardi M (2002) Im paired tuftsin activity
in cirrhosis: relationship w ith splenic function and clinical outcome.
G ut 50:707-712
27. Khan MA, A hm ad N, Moin S, M annan A, H aq W, Pasha ST, Khan A,
Ow ais M (2005) Tuftisn-m ediated im m unoprphylaxis against an iso­
late of Aspergillus fumigatus show s less in vivo susceptibility to a m pho­
tericin B. FEMS Im m unol Med Microbiol 44: 269-276
28. Khan MA, Ow ais M (2005) Im m unom odulator tuftsin increases the
susceptibility of Cryptococcus neoform ans to liposom al am photericin
B in im m unocom petent BALB/c mice. J D rug Target 13: 423-429
29. Khan MA, Khan A, Ow ais M (2006) Prophylactic use of liposom ized
tuftsin enhances the susceptibility of Candida albicans to fluconazole in
leucopenic mice. FEMS Im m unol M ed Microbiol. 46: 63-69
10. Foschi FG, Trevisani F, Loggi E, Parazza M, Melotti C, Badeschi E,
M ingazzini L, C appa FM, Cescon M, A ndreone P, Grazi G, Stefani GF,
Bemardi M (2005) Effect of liver transplantation on tuftsin activity and
phagocytic activity of neutrophil granulocytes in patients w ith liver
cirrhosis. Int Arch Allergy Im m unol 137: 258-262
30. Khan MA, N ash TH, Kh.anam S, Mallick AI, A hm ad I, H aq W, A hm ad
N, Ow ais M (2004) Coadm inistartion of im m unom odulatory tuftsin
and liposom ized nystatin can com bat less susceptible Candida albicans
infections in tem porarily neutropenic mice. FEMS Im m unol M ed Mi­
crobiol 41: 249-258
11. Zhang H, Chen J, Kaiser GM, M apudengo O, Z hang J, Exton MS, Song
E (2002) The value of partial splenic autotransplantation in patients
w ith portal hypertension. Arch Surg 137: 89-93
31. Khan MA, Syed FM, Nasti HT, Saima K, H aq W, S hehbaz A, O w ais M
(2003) Use of tuftsin bearing nystatin liposom es against an isolate of
Candida albicans show ing les in vivo susceptibility to am photericin B. J
D rug Target 11: 93-99
12. Brandt CT, Maciel DT, Caneca OAF, Barbadosa de Castro CMM, Bragante de Araujo L (2001) A utotransplant of spleen tissue in children
w ith schistosomiasis: evaluation of splenic function after splenosis.
M em Inst O sw aldo Cruz 96 Suppl: 117-122
13. Kozlovskaya MM, Kozlovskii H, Valdm an EA, Seredenin SB (2003)
Selank and short peptides of the tuftsin Family in the regulation of
adaptive behavior in stress. Neurosci Behav Physiol 33: 853-860
14. W ong E, Bennett S, Lawrence B, Fauconnier T, Lu LFL, Bell RA, Thom back JR, Eshima D (2001) Tuftsin receptor-binding peptide labeled
w ith technetium : chem istry and prelim inary in vitro receptor-binding
study. Inorg Chem 40: 5695-5700
15. Bump NJ, James L, Wleklik M, Reichler J, Najjar VA (1986) Isolation
and subunit com position of tuftsin receptor. Proc N atl Acad Sci USA
83: 7187-7191
16. Bum p NJ, Najjar VA, Reichler J (1990) The characteristics of purified
HL60 tuftsin receptors. Mol Cell Biochem 92: 77-84
17. Paul C, Peers SH, W oodhouse LE, Thornback JR, G oodbody AE,
Bolton C (2000) The detection and quantitation of inflam m ation in the
central nervous system during experim ental allergic encephalom yeli­
tis using the radiopharm aceutical Tc-99m-RP128. J Neurosci M ethods
98:83-90
18. Caveliers V, G oodbody AE, Tran LL, Peers SH, Thornback JR, Bossuyt
A (2001) Evaluation of 99mTc-RP128 as a potential inflam m ation im ­
aging agent: hum an dosim etry and first clinical results. J Nucl M ed 42:
154-61
19. W ang J, Rogove AD, Tsirka AE, Tsirka SE (2003) Protective role of tuft­
sin fragm ent 1-3 in an anim al m odel of intracerebral hem orrhage. A nn
N eurol 54: 655-664
20. Raibon E, Sauve Y, Carter DA, Gaillard F (2002) Microglial changes
accom panying the prom otion of retinal ganglion cell axonal regenera­
tion into peripheral nerve grafts. J Neurocytol 31: 57-71
21. A graw al AK, G upta CM (2000) Tuftsin-bearing liposom es in treatm ent
of macrophage-based infections. A dv D rug Delivery Rev 41:135-146
22. G upta CM, H aq W (2005) Tuftsin-bearing liposom es as antibiotic car­
riers in treatm ent of m acrophage infections. M ethods Enzym ol 391:
291-304
32. A grawal AK, Agrawal A, Pal A, G uru PY, G upta CM (2002) Superior
chem otherapeutic efficacy of am photericin B in tuftsin-bearing liposm oes against Leishmania donovani infections in ham sters. J D rug Target
10: 41-45
33. Fridkin M, Stabinsky Y, Zakuth V, Spirer Z (1977) Tuftsin and som e
analogs. Synthesis and interaction w ith h u m an polym orphonuclear
leukocytes. Biochim Biophys Acta 496: 203-211
34. K onopińska D, Naw rocka E, Siemion IZ, Ślopek S, Szym aniec S,
Klonowska E (1977) Partial sequence of histones w ith tuftsin avtivity.
Int J Protein Peptide Res 9: 71-77
35. Konopińska D, Najjar VA, Callery M (1982) Synthesis of tuftsinyltuftsin w ith potential tum oricidal activity. Polish J C hem 56:1063-1066
36. Konopińska D, Siemion IZ, Szym aniec S, Ślopek S (1979) Tuftsin and
its analogs. Part VII. Experim ental proof of the hypotesis on functional
conservatism in coding of tuftsin sequence. Polish J C hem 53: 343-351
37. G ershonov E, G ranoth R, Tzehoval E, G aoni Y, Fridkin M (1996) 1Am inocyclobutane- carboxylic acid derivatives as novel structural
elem ents in bioactive peptides: application to tuftsin analogs. J M ed
Chem 39: 4833-4843
38. Zacharic B, Sauve G, Penny C (1993) Thioacylating agents. Use of thiobenzim idazolone derivatives for the preparation of thiotuftsin ana­
logs. T etrahedron 49:10489-10500
39. Mezo G, Szekerke M, Sarm ay G, Gergely J (1990) Synthesis and func­
tional studies of tuftsin analogs containing isopeptide bond. Peptides
11: 405-415
40. Nishioka K, Obeyesekere NU, M cM urray JS (1995) E nhanced phago­
cytosis activity of cyclic analogs of tuftsin. Biochem Pharm acol 49:735738
41. Arcoleo F, M ilano S, D'A gostino P, M isiano G, C appelletti S, G rom o G,
Marcucci F, Leoni F, Cillari E (1997) Effect of partially m odified retroinverso-analogues derived from C-reactive protein on the induction of
nitric oxide synthesis in peritoneal m acrophages. Br J Pharm acol 120:
1383-1389
64
w w w .p ostep yb iochem ii.p l
http://rcin.org.pl
42. Kraus-Berthier L, Ferry G, Com be-Perez V, Visalli M, Rem ond G, Vin­
cent M, Bounti JA (1991) A pproaches to som e biochemical m echanism
of action of tuftsin and analogues. Biochem Pharm acol 41:1411-1418
48. Fridkin M, Tsubery FI, Tzehoval E, Vonsover A, Biondi L, Filira F, Rocchi R (2005) Tuftsin-AZT conjugates: potential m acrophage targeting
for AIDS therapy. J Peptide Sci 11: 37-44
43. Titov VM, M eshcheryakova FA, Balashova TA, A ndronova TM, Iva­
nov VT (1995) Synthesis and im m unological evaluation of the con­
jugates com posed from a m uram yl peptide GM DP and tuftsin. Int J
Peptide Protein Res 45: 348-355
49. Z hang SD, Liu G, Xia SQ, W u P, Zhang L (2002) „M eshed-Bag Gathered-Bunch" m ethod for solid-phase synthesis of small molecular di­
verse com pounds. J Com b Chem 4:131-137
44. Fridkin G, G ilon C (2002) Azo cyclization: peptide cyclization via azo
bridge form ation. J Pept Res 60:104-111; Correction: (2003) J Pept Res
61:158-158
50. G okulan K, Khare S, Rao DN (1999) Increase in the im m unogenicity
of HIV peptide antigens by chemical linkage to poly tuftsin (TKPR40).
D N A Cell Biol 18: 623-630
45. G ranoth R, Vadai E, Burstein Y, Fridkin M, Tzehoval E (1997) TuftsinTH F-gam m a 2 chimeric peptides: potential novel im m unom odulators.
Im m unopharm acology 37: 43-52
51. M ezo G, Kalaszi A, Remenyi J, Majer Z, Hilbert A, Lang O, Kohidai L,
B am a K, Gaal D, H udecz F (2004) Synthesis, conformation, and im m unoreactivity of new carrier molecules based on repeated tuftsin-like
sequence. Biopolymers 73: 645-656
46. Dzierzbicka K (2004) Synthesis of conjugates of m uram yl dipeptide
and nor-m uram yl dipeptide w ith retro-tuftsin (Arg-Pro-Lys-ThrOMe)
as potential im m unostim ulants. Pol J C hem 78: 409-416
52. M anea M, Mezo G, H udecz F, Przybylski M (2004) Conjugates con­
taining a p-amyloid plaque specific epitope as lead structure for vac­
cines against Alzheim er's disease. Biopolymers 76: 503-511
47. Dzierzbicka K, Trzonkowski P, Sew erynek P, Kołodziejczyk AM,
M yśliwski A (2005) Synthesis and biological activity of tuftsin, its ana­
logue an d conjugates containing m uram yl dipeptides or nor-m uram yl
dipeptides. J Peptide Sci 11:123-135
53. M anea M, H udecz F, Przybylski M, Mezo G (2005) Synthesis, solution
conform ation, and antibody recognition of oligotuftsin-based conju­
gates containing a (3-amyloid(4-10) plaque-specific epitope. Bioconju­
gate C hem 16: 921-928
T uftsin - n ew analogues and properties
A n n a W a rd o w sk a 1 , K rystyn a D zie r z b ic k a 2, A n d rzej M y ś liw s k i 1
‘D e p a rtm en t of H istology an d Im m unology, M edical U niversity of G dansk, D ębinki 1 St., 80-210 G dansk, Poland
d e p a r t m e n t of O rganic Chem istry, G dansk U niversity of Technology, 11 /1 2 G. N arutow icza St., 80-952 G dansk, Poland
Ee-m ail: anna.w ardow ska@ am g.gda.pl
Key words: tuftsin, im m unom odulator, tuftsin analogues, biological activity
ABSTRACT
Tuftsin, a natural tetrapeptide of sequence TKPR, occuring in the blood of hum ans and other mammals, capable of stim ulating certain
w h ite b lood cells (monocytes, macrophages, and neutrophils), was isolated at Tufts University in 1970 by Najjar and N ishioka [1]. Tuftsin is
a com poun d w ith a w ide spectrum o f biological activities, notable enhances phagocytosis, im m une response, bactericidal, tumoricidal and
antifungal activities. This article concerns n ew analogues and properties of tuftsin.
65
P ostępy Biochem ii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
Regulacja biosyntezy etylenu u roślin
K am il F ran k ow sk i
Jacek K ęsy
Jan K o p ce w icz
Z akład Fizjologii i Biologii M olekularnej Ro­
ślin, Insty tu t Biologii Ogólnej i M olekularnej,
U niw ersytet M ikołaja K opernika, T oruń
Z akład Fizjologii i Biologii M olekularnej Ro­
ślin, Instytut Biologii Ogólnej i M olekularnej,
U niw ersytet M ikołaja K opernika, ul. G agarina
9, 87-100 Toruń; e-mail: Kam il.Frankowski@
uni.torun.pl, tel.: (056) 611 44 46, faks: (056) 611
47 72
A rtykuł otrzym ano 19 m aja 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 11 w rześnia 2006 r.
Słowa kluczowe: etylen, biosynteza etylenu,
syntaza A CC, oksydaza ACC
Wykaz skrótów: ACC - kw as 1-am inocyklopropano-l-karboksylow y; ACO - oksydaza
ACC; ACS - syntaza ACC; CDPK (ang. calcium-dependent protein kinase) - kinaza białkow a
zależna od w apnia; MACC - m alonylo-A CC;
MAPK (ang. mitogen-activated protein kinase)
- kinaza MAP; MTA - m etylotioadenozyna;
PLP - 5 '-fosforan pirydoksalu, SAM - S-adenozylom etionina
Podziękowania: Praca pow stała w trakcie re­
alizacji g ra n tu badaw czego UM K n r 305-B.
A utorzy dziękują prof. d r hab. S tanisław ow i
Kow alczykow i za cenne uw agi dotyczące ni­
niejszej pracy na etapie jej pow staw ania
STRESZCZENIE
ty le n jest h o rm o n em ro ślin n y m uczestniczącym w k o n tro li w ie lu procesów w z ro stu i
ro zw o ju roślin. R eg u lu je on także reakcje ro ślin y na w ie le c zy n n ik ó w środ o w isk o w y ch .
Z ro zu m ien ie m echanizm ów tej reg u lacji p rz y n ió sł d o k o n a n y w o sta tn im czasie p o stę p b a ­
d a ń n a d biosyntezą i szlakam i sygnalizacy jn y m i tego h o rm o n u . Isto tn e znaczenie w tej re g u ­
lacji m a w ielo rak o k o n tro lo w an a , zró żn ico w an a czasow o i p rz e strz e n n ie e k sp re sja ro d z in y
genów kodujących enzym y uczestniczące w jego b io sy n tezie. B ardzo w ażn a jest ró w n ie ż
specyficzna p o tran slacy jn a regulacja sam ych b iałe k enzym atycznych. Istn ie n ie w ie lu m e­
chanizm ów regulujących po zio m e ty le n u u m o żliw ia tem u h o rm o n o w i tak szeroki u d z ia ł w
k o n tro lo w an iu fu n k c jo n o w an ia rośliny.
E
W PR O W A D Z EN IE
Pom im o swojej prostej dw uw ęglow ej struktury, etylen jest efektyw nym m o­
dulatorem w zrostu i rozwoju roślin [1], N iem al k ażda tkanka roślinna jest w
stanie produkow ać etylen, jednak w większości p rzy p ad k ó w jego produkcja
utrzym uje się na stosunkow o niskim poziomie, a w zrasta jedynie w pew nych
okresach rozwoju (kiełkowanie nasion, starzenie i odcinanie kw iatów i liści,
dojrzew anie owoców). W pływ na produkcję etylenu mają zarów no biotyczne
(patogeny), jak i abiotyczne (zranienia, susza, niedotlenienie, 0 3 i S 0 2) czynniki
zew nętrzne oraz horm ony roślinne. Produkcja etylenu jest kontrolow ana przez
światło i ulega rytm icznym zm ianom w cyklu d o bow ym [2].
Poznanie szlaku biosyntezy etylenu stało się m ożliw e dzięki odkryciu p re­
kursorów tego horm onu: S-adenozylom etioniny (SAM) i kw asu 1-aminocyklopropano-1-karboksylow ego (ACC) [3] oraz w yizolow aniu i opisaniu enzym ów
biorących udział w jego biosyntezie - syntazy i oksydazy ACC (ACS, ACO).
Po zsekw encjonow aniu genów kodujących syntazę i oksydazę ACC u różnych
roślin [4-6] okazało się, że tw orzą one w ielogenow e rodziny, których ekspre­
sja podlega zróżnicowanej regulacji. Szybki rozwój b ad ań dotyczących regula­
cji biosyntezy etylenu spow odow ał brak aktualnych danych w tej dziedzinie w
polskiej literaturze. Wcześniejsze prace przeglądow e na ten tem at zostały o p u b ­
likow ane przez Jakubow icz [7,8].
SZLAK BIOSYNTEZY ETYLENU
Prekursorem etylenu u roślin jest metionina, w ystępująca w 80% w postaci
S -a d e n o z y lo m e tioniny [9], która
w w ielu reakcjach
w kom órkach peł­
ni funkcję donora
g ru p m etylow ych
(Ryc. 1). Pierw ­
szym etapem bio­
syntezy
etylenu
z
S-adenozylom etioniny jest jej
przekształcenie do
kw asu
1-aminoc y k lo p r o p a n o - 1 k a r b o k s y lo w e g o .
Ten etap biosynte­
zy, katalizow any
przez syntazę ACC
etylen
( S - a d e n o z y lo - L R y cin a 1. S zlak b io sy n te zy etylen u . S z c z e g ó ło w y o p is w tek ście (w g [16] z m o ­
m etionino mety- d y fik ow an e).
w w w .postepybiochem ii.pl
66
http://rcin.org.pl
lotioadenozyno-liazę), jest jednocześnie istotnym punktem
regulacji tem pa biosyntezy etylenu [3,10], Aktyw ność tego
enzym u m oże być regulow ana zarów no przez kinazy, jak i
fosfatazy białkowe (PPazy). Powstająca jako pro d u kt ubocz­
ny reakcji 5'-m etyltioadenozyna (MTA) ulega w tórnem u
przekształceniu do m etioniny [11], co pozw ala zachować
grupę m etylow ą oraz siarkową do następnego cyklu p ro ­
dukcji etylenu bez konieczności zwiększania puli m etioni­
ny. Końcowy etap biosyntezy etylenu, stanow iący zarazem
drugie miejsce regulacji, katalizuje oksydaza ACC. Pow sta­
jący w reakcji H C N jest przekształcany przez syntazę P-cyjanoalaninow ą do p-cyjanoalaniny. Kwas 1-aminocyklopropano-1-karboksylow y może być także przekształcony do
malonylo-ACC (MACC). Reakcja ta pozw ala na regulację
puli w olnego kw asu 1-am inocyklopropano-l-karboksylo­
wego.
W zależności od gatunku i w aru nk ó w środow iska, kon­
trola produkcji etylenu może odbyw ać się zarów no na po ­
ziomie ekspresji genów, jak i aktywności enzym ów syntazy
i oksydazy ACC [12-15], Kluczowym etapem tej regulacji
w ydaje się być jednak katalizow ana przez syntazę ACC
konw ersja S-adenozylom etioniny do kw asu 1-aminocyklopropano-l-karboksylow ego [10].
GENY EN Z Y M Ó W FUNKCJONUJĄCYCH
W BIOSYNTEZIE ETYLENU
T a b ela 1. W p ły w róż n y c h cz y n n ik ó w na ekspresję g e n ó w z ro d zin y sy n ta z A C C
u Arabidopsis thaliana.
C z y n n i k i w p ły w a j ą c e
na e k s p r e s ję g e n ó w
W p ły w na ek s p r e s ję
P i ś m ie n n ic t w o
AC S
A uksyny
indukcja ekspresji
ACS2, ACS4-ACS12
[20, 22, 23,
29-34]
C ykloheksim id
(CHX)
w zm ożona akum ulacja
m RN A w szystkich genów
ACS za w yjątkiem ACS1
[23]
Etylen
stym ulacja ekspresji: ACS6
ACS2 (traktow anie
etylenem pow yżej
2h zw rotnie ham uje
ekspresję ACS2)
negatyw na
regulacja: ACS8
[31]
[21, 35]
[2]
Z ranienia
indukcja ekspresji
ACS2, ACS4, ACS6
[20,21, 30,
31, 35]
C zynniki
środow iskow e
(cyjanek, 0 3, bodźce
m echaniczne)
indukcja ekspresji ACS6
[22, 31-33]
Św iatło
indukcja ekspresji ACS2,
ACS5, ACS8, ACS9
[2]
Z egar okołodobow y
indukcja ekspresji ACS8
[2]
SYNTAZY ACC
Pierw szą sklonow aną syntazą ACC była syntaza cukini
[4]. Zidentyfikow ano i zsekw encjonowano rów nież geny
ACS z pom idora, goździka, jabłka, Arabidopsis thaliana i w ie­
lu innych gatunków , co zostało szeroko opisane w pracach
przeglądow ych [17,18], Spośród badanych gatunków roślin
najlepiej poznano rodzinę 12 genów oznaczonych jako ACS
u A. thaliana [19-22]. W ykazano, że geny ACS u tej rośliny
rozm ieszczone są na pięciu chrom osom ach (Ryc. 2A) [19]
oraz, że tw orzą 3 gałęzie drzew a filogenetycznego (Ryc. 2B)
[23], Szczegółowe badania wykazały jednak, że nie w szyst­
kie z tych genów kodują funkcjonalne białka. P rodukt genu
ACS2 jest nieaktyw ny [23], a ACS3 to pseudogen stanow ią­
cy częściowo zdeletow aną [24] lub, w edług innych, zduplikow aną [23,25] formę ACS1. Geny oznaczone jako ACS10 i
ACS12 w ykazują natom iast silne podobieństw o do aminotransferaz [23]. W pełni aktyw ne białka kodow ane są przez
8 genów (.ACS2, ACS4-ACS9, ACS11) [20-24],
B-
/A C S 6
ACS1
ACS2
ACS7
ACS 11
ACS4
ACS8
ACS5
ACS9
AC S 10
ACS 12
AT alaninowa
AT asparaginowa
R y c in a 2. S ch em at ro z m ieszcz en ia g e n ó w A C S na ch ro m o so m a ch A . thaliana (A)
ora z d r z e w o filo g en ety czn e, obrazujące p o ch o d z en ie s y n ta z A C C i am in otran sferaz (AT) (B) (w g [23] z m o d y fik o w a n e ).
W ykazano, że ekspresja genów kodujących poszczegól­
ne izoformy syntaz ACC regulow ana jest w sposób zróżni­
cow any [26-28], zarów no przez czynniki w ew nętrzne, jak i
zew nętrzne (Tab. 1). Ekspresja poszczególnych genów ACS
jest także zróżnicow ana tkankow o. W korzeniach siewek A.
thaliana rosnących na świetle w ykazano ekspresję genów
ACS2, ACS4-ACS12, podczas gdy w liściach ekspresji ulega­
ją ACS2, ACS2, ACS4-ACS8, A C S U iAC S12 [23,29]. Ekspre­
sja ACS2 i ACS5 zachodzi w hypokotylach. W kw iatach n a­
tom iast ekspresji ulegały ACS1, ACS2, ACS4-ACS9 i ACS11,
w łuszczynach ACS1, ACS2, ACS5, ACS8-ACS12.
OKSYDAZY ACC
O ksydazy ACC należą do rodziny dioksygenaz. U A. tha­
liana obejmuje ona 17 genów, z których tylko dw a zostały
scharakteryzow ane funkcjonalnie [36,37], Ekspresja genów
ACO jest rów nież zróżnicow ana tkankow o. Pokazano, że
od gryw a ona istotną rolę w tw orzeniu haczykow atego za­
gięcia pędu. Akumulacja tran skryp tu A tA C 0 2 u rzodkiew nika ma miejsce w kom órkach znajdujących się po jego ze­
wnętrznej stronie, co koreluje z wcześniejszymi doniesienia­
mi Schw ark'a i Bopp'a dotyczącym i ilościowego rozkładu
kw asu 1-am inocyklopropano-l-karboksylow ego w pędach
siewek fasoli [37,38], Mimo że u grochu akum ulacja mRNA
PsACOl w ystępuje po w ew nętrznej stronie haczykow atego
zagięcia p ę d u [27], to jednak różnice te m ogą być w ynikiem
odm iennego m echanizm u tw orzenia się tej struktury u obu
gatunków [37]. U grochu zagięcie tw orzy się powyżej liścieni (roślina epigeiczna), a u A. thaliana poniżej liścieni (rośli­
na hypogeiczna).
67
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
W genom ie pom idora zidentyfikow ano cztery geny ko­
dujące oksydazy ACC: LeAC01-LeAC04 [39-42]. W dojrze­
wających ow ocach i starzejących się liściach tej rośliny zaob­
serw ow ano w zm ożoną akum ulację transkryptów LeACOl
i LeAC03, a zranienia stym ulują ekspresję LeACOl [39].
W pylnikach po zapyleniu obserw ow ano w zrost poziom u
mRNA LeAC02, natom iast w znam ieniu słupka, słupku i
w płatkach korony LeAC03. Postępujący proces starzenia
organów kw iatow ych pom idora koreluje ze w zrostem ak u ­
mulacji m RN A LeACOl [43]. Spośród trzech zidentyfikow a­
nych genów ACO u melona, ekspresja CMeACOl zachodzi
w dojrzałych owocach oraz w liściach, natom iast w etiolow anych hypokotylach obserw ow ano podw yższoną a k u m u ­
lację m RN A CM eAC02, a w kw iatach CM eAC03 [44],
B U D O W A I W ŁAŚC IW O ŚC I ENZYM Ó W
BIOSYNTEZY ETYLENU
SYNTAZY ACC
Syntazy ACC należą do rodziny białek, których struk tu ra
przypom ina p od g ru p ę am inotransferaz zależnych od 5'-fosforanu pirydoksalu (PLP) [45]. PLP jest kofaktorem w ią ­
żącym się do miejsca aktyw nego syntaz przed zw iązaniem
liganda. Syntazy ACC są enzym am i cytosolowymi, o krót­
kim czasie półtrw ania [3,11,46], regulow anym i zarów no na
poziom ie transkrypcyjnym [11,16,47], jak i potranslacyjnym ,
m. in. w szlaku degradacji zależnym od ubikwitylacji [47,48],
Masy cząsteczkowe polipeptydów kodow anych p rzez geny
A CS u A. thaliana, podobnie jak syntazy innych gatunków
roślin, mieszczą się w granicach 50 - 61 kDa [10,23,49]. Sto­
pień identyczności ich sekwencji am inokw asow ych w y n o ­
si 32 - 91%, co w skazuje na d użą różnorodność tych bia­
łek [23]. W badaniach ekspresji poszczególnych form A CS
w kom órkach E. coli stw ierdzono, że za wyjątkiem ACS1,
ACS10 i ACS12, wszystkie inne syntazy w ykazują ak ty w ­
ność enzym atyczną [23]. Brak aktyw ności ACS1 tłum aczy
się brakiem specyficznej trójki am inokw asów Thr-Asn-Pro
(TNP), b ądź Pro-Ser-Asn (PSN) w ewolucyjnie zachow yw a­
nym regionie IV polipeptydów (Ryc. 3), który jest częścią
w ypętlenia znajdującego się bardzo blisko reszty A sn209,
w chodzącej w skład centrum aktyw nego [50,51], Usunięcie
tego trip eptyd u z ACS2 pow oduje utratę aktyw ności enzy­
matycznej [24]. W ydaje się, że TNP odgryw a istotną rolę w
pozycjonow aniu Lys278 (region V) w ew nątrz centrum ak­
tywnego, gdyż w prow adzenie TNP do ACS1 przyw raca jej
aktyw ność [24,50,51].
ACS10 i ACS12, podobnie jak ACS1, były początkow o
uw ażane za pseudogeny. Analiza filogenetyczna oraz a n a ­
liza kom plementacji z użyciem m utanta ATazy DL39 E.
coli w ykazały jednak, że funkcjonalnie ACS10 i ACS12 są
am inotransferazam i o wysokiej specyficzności w zględem
asparaginianu i am inokw asów arom atycznych (funkcjonal­
ne izoformy syntazy ACC nie w ykazują aktyw ności am ino­
transferaz) [23]. W zw iązku z tym, rodzina genów ACS u A.
thaliana obejmuje 8 genów funkcjonalnych i 1 gen niefunk­
cjonalny.
Na podstaw ie struktury krystalograficznej oraz w o p ar­
ciu o SDS-PAGE, filtrację żelową i analizę komplem entacji
mutacji ustalono, że aktyw ne syntazy ACC tw orzą hom o- i
heterodim ery, a ich centrum aktyw ne tw orzone jest w sk u ­
tek o d działyw ań poszczególnych m onom erów [23,25,50,5254], Reszta Tyr92 (region II) oddziałuje ze znajdującą się w
centrum ak ty w n y m Lys278, która z kolei tw orzy kowalencyj­
ną zasadę S h iffa z PLP pochodzącym z drugiej podjednost­
ki [50], U A. thaliana heterodim ery m ogą pow staw ać jedy­
nie m iędzy polipeptydam i należącym i do tej samej gałęzi
filogenetycznej (Ryc. 2B) [25], W skazuje to na fakt istnienia
strukturalnego podobieństw a centrów aktyw nych zarów no
homo-, jak i heterodim erów . W yjątkiem jest ACS7, która
m oże tw orzyć funkcjonalne heterodim ery z syntazam i obu
gałęzi filogenetycznych, np. z ACS6, ACS4, ACS8, ACS9
[25]. N aw et nieaktyw na enzym atycznie ACS1 tw orzy ak­
tyw ne enzym atycznie heterodim ery z ACS2 i ACS6, jednak
w tym w y p a d k u donorem reszty Lys278 nie m oże być ACS1
[25], Ostatecznie w ykazano, że polipeptydy syntazy ACC
m ogą utw orzyć 45 hom o- i heterodim erów , z czego jedynie
8 hom o- i 17 heterodim erów jest aktyw nych enzym atycznie,
pozostałe zaś są nieaktyw ne [25].
W szystkie izozym y syntazy ACC zaw ierają 7 zachow a­
nych w ewolucji regionów oraz 11 zachow anych w ewolucji
reszt am inokw asow ych charakterystycznych dla syntaz i
am inotransferaz (Ryc. 3) [49,55-58]. W ACS10 Tyr92 została
zastąpiona przez resztę Ser, a w ACS12 przez Phe. W ięk­
szość zachow anych w ewolucji reszt am inokw asow ych
zgru p o w an a jest na pow ierzchni dim erów , blisko centrum
aktyw nego [50], O dpow iedzialna za specyficzność substra­
tow ą reszta Glx (region I) jest obecna w e w szystkich syntazach ACC z wyjątkiem ACS10, gdzie została zastąpiona
przez Głn [59]. W ydaje się, że reszta Glx nie jest jedynym
czynnikiem nadającym specyficzność substratow ą, gdyż
posiadająca ją ACS12 nie w ykazuje aktyw ności syntazy.
Ze w zględu na silnie skrócony C-końcowy fragm ent ACS7,
ACS10 i ACS12 nie posiadają, mającej istotne znaczenie dla
regulacji aktywności, konserw atyw nej reszty Ser [60].
OKSYDAZY ACC
Z p o w o d u trudności z izolacją aktyw nego enzym u ok­
sydazę ACC nazyw ano początkow o enzym em tw orzącym
etylen (ang. ethylene-forming enzyme) i przyjm ow ano, że jest
on zw iązany z frakcją błonow ą [3,61]. Pierw szą aktyw ną
oksydazę ACC w yizolow ano z m elona i stw ierdzono, że
należy ona do rodziny oksygenaz [62], O ksydazy ACC do
swojej aktyw ności w ym agają Fe2+jako kofaktora, O, i askorbinianu jako kosubstratów oraz CO, jako aktyw atora, który
p raw do p o d ob n ie chroni centrum aktyw ne en zy m u przez
tw orzenie kom pleksu z Fe(II) [63,64]. Obecnie w ydaje się, że
oksydazy ACC są białkami cytosolowym i, chociaż enzym
ten lokalizow ano także w apoplaście ow oców pom idora i
jabłka [65,66], W tkankach produkujących etylen oksydazy
w ystępują w w yższych stężeniach niż syntazy ACC, jednak
ich okres półtrw ania wydaje się być stosunkow o krótki [67],
E ndogennem u w zrostow i poziom u etylenu w owocach
brzoskw ini po aplikacji tego horm onu, tow arzyszył w zrost
zarów no aktyw ności sam ego enzym u, jak rów nież poziom u
m RN A PPACOl [68], U brokułu natom iast, w zro st p ro d u k ­
cji etylenu w starzejących się pąkach kw iatow ych zw iązany
był tylko ze w zrostem aktyw ności sam ego en zy m u [69], W y­
daje się, że podobnie jak w p rz y p a d k u syntaz ACC, poziom
ekspresji, jak i aktyw ności oksydaz ACC jest zależny od or­
ganu oraz w aru n k ó w rozw ojow ych i środow iskow ych.
w w w .postepybiochem ii.pl
68
http://rcin.org.pl
V
ACS1
ACS2
ACS4
ACS5
A CS6
ACS7
ACS8
ACS9
ACS10
ACS11
ACS12
I
I
I
I
I
I
I
I
I
v
I
V
QMGLAENQL
QMGLAENQL
QMGLAENQL
QMGLAENQL
QM GLAENQL
QM GLAENQv
QMGLAENQL
QM GLAENQL
Q 1 G LAqNn K
QM GLAENQL
Q 1 GLAESTL
FQDYHGL
FQDYHGL
FQDYHGL
FQDYHGm
FQDYHGL
FQDYHGL
FQDYHGL
FQDYHGL
ye P S D G L
FQDYHGL
y K P f EGL
Region I
V
ACS1
ACS2
ACS4
ACS5
A CS6
ACS7
A CS8
A CS9
ACS10
ACS11
ACS12
V
Region II
FCLADP GDAFLv
FCLADPGDVFLi
FCLADP GDAF LI
FCLAe PGDAFL1
FCLAn PG D g FLv
F ILADPNDALLv
FCLADP GDAFL1
FCLAe P GDAF LI
FCLADS Gn AFLv
FCLAn PGDAFLi
FCLADHGn AFLi
Region III
........PTPYY...
........Ps PYY...
........PTPYY...
........PTPYY...
........PTPYY...
........PTPYY...
........PTPYY...
........PTPYY...
........PTPCS ...
........PAPYY...
........PTPYY...
W
V
... s N - - - P L G T
... T N P S N P L G T
... T N P S N P L G T
... T N P S N P L G T
... T N P S N P L G T
... T N P S N P L G A
... T N P S N P L G T
... T N P S N P L G T
... s N P S N P m G s
...T N P S N P L G T
... s N P S N P v G N
Region IV
V V
V
...DEIY.
...DEIY.
...DEIY.
...DEIY.
...DEIY.
...DEIY.
...DEIY.
...DEIY.
...n E l f.
...DEIY.
...DEI f.
Region V
Region VI
Region VII
R y cin a 3. Z e s ta w ie n ie fra gm en tów sek w en cji a m in o k w a s o w y c h sy n ta z A C C z A. thaliana z za z n a c zen iem 7 ew o lu cy jn ie za c h o w y w a n y c h re g io n ó w (R egion I - VII),
11 ew o lu cy jn ie z a c h o w y w a n y c h reszt a m in o k w a s o w y c h (n ie w y p e łn io n e trójkąty), reszty G lx (w y p e łn io n y trójkąt) nadającej s p e cy fic zn o ść sub stratow ą oraz reszty Ser
(gw ia zd k a ), b ędącej m iejscem fosforylacji. S z c z e g ó ło w y o p is w tek ście (w g [23] zm o d y fik o w a n e ).
REGULACJA BIOSYNTEZY ETYLENU
O bserw ow ane zm iany produkcji etylenu w yw ołane
czynnikam i w ew nętrznym i i środow iskow ym i sp ow odo­
w an e są skom plikow aną regulacją na poziomie ekspresji
genów , jak i regulacją potranslacyjną. Istotne znaczenie w
regulacji biosyntezy etylenu mają auksyny, cytokininy oraz
zegar okołodobow y. Kontrola biosyntezy etylenu odbyw a
się także na zasadzie sprzężenia zw rotnego poprzez autokatalityczny lub autoinhibicyjny w pływ na ekspresję genów
zaangażow anych w jego biosyntezę, jednakże m olekularne
m echanizm y tych interakcji są słabo poznane.
REGULACJA PRZEZ AUKSYNĘ
A uksyny stym ulują produkcję etylenu poprzez aktyw a­
cję genów syntaz ACC. U rzodkiew nika ekspresja ACS4 w
o dpow iedzi na egzogenne podanie IAA następuje już po 25
m inutach i jest niew rażliw a n a inhibitory biosyntezy białek,
co sugeruje, że jest to pierw otna odpow iedź na auksyny [30],
Prom otor ACS4 zaw iera cztery m otyw y charakterystyczne
dla grupy czynników pierwotnej odpow iedzi na auksyny
[30]. P ostulow any m odel działania auksyny zakłada, że
w iąże się ona bezpośrednio do jednego z białek kom plek­
su ligazy E3 ty p u SCF, przez co aktyw uje proteolizę białek
A U X /IAA, blokujących działanie czynników transkrypcyjnych ARF (ang. auxin response factor) [70-72], Jedno z takich
białek, ARF19, po uw olnieniu z kom pleksu ARF-AUX/IAA,
w iąże się z sekwencją prom otorow ą ACS4, aktywując jego
ekspresję [73]. Interakcja auksyn z etylenem ma jednak b ar­
dziej złożony charakter. Z auw ażono, że aktywacja białka
ARF19 następuje rów nież pod w pływ em etylenu oraz, że
etylen pow oduje stymulację biosyntezy IAA [73], M echa­
nizm tej interakcji polega na aktywacji przez etylen genów
syntazy antranilowej, odpow iedzialnej za syntezę IAA.
W zrost poziom u IAA pro w ad zi z kolei do w zrostu pozio­
m u etylenu. Efekt ten m oże być p odstaw ą w spom nianego
wyżej m echanizm u pozytyw nego sprzężenia zw rotnego w
biosyntezie etylenu.
REGULACJA EKSPRESJI A C S IA C O PRZEZ
ŚWIATŁO I ZEGAR OKOŁODOBOWY
Zegar okołodobow y odpow iedzialny jest za regulację 24
godzinnych rytm ów takich zjawisk, jak np. ruchy liści czy
elongacja hypokotyla [48,49]. Cyklicznym zm ianom ulega
rów nież produkcja etylenu [14,50]. W ykazano, że fluktua­
cjom tym tow arzyszą zm iany aktyw ności zarów no syntazy,
jak i oksydazy ACC [13,52], Rolę zegara w regulacji p ro d u k ­
cji etylenu u roślin potw ierdziły badania prow adzone na
m utantach A. thaliana tocl-1 i ccal-ox [2]. Cykliczne uw alnia­
nie etylenu u rzodkiew nika jest skorelow ane z fluktuacja­
mi poziom u transkryptów ACS2, ACS5, ACS8, ACS9, przy
czym ACS8 zachow uje rytm iczność ekspresji zarów no po
przeniesieniu roślin na ciągłe światło, jak i na ciągłą ciem­
ność, podczas gdy ACS5 i ACS9 jedynie po przeniesieniu na
ciągłe światło [2], Ekspresja genu ACS2 charakteryzuje się
natom iast 12 g odzinnym przesunięciem w fazie w stosunku
69
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
do ACS8. Analiza prom otora genu ACS8 ujawniła obecność
w nim charakterystycznego regionu CA A N N N N A TC o d ­
pow iedzialnego za dobow ą regulację ekspresji genów LHC/
CAB - kodujących białka zw iązane z fotosyntezą [2,56,57].
U w aża się zatem , że dobow e zm iany produkcji etylenu u A.
thaliana są zw iązane z cykliczną ekspresją genu ACS8.
Choć w większości przy p ad k ów to syntazy ACC są o d ­
pow iedzialne za generow anie rytm ów produkcji etylenu w
cyklu dobow ym , to jednak m ożna przypuszczać, że u p e w ­
nych gatunków , czy też na pew nych etapach rozwoju, bio­
synteza etylenu może być rów nież regulow ana na poziom ie
oksydaz ACC. Towarzyszący przeniesieniu siewek A. tha­
liana do ciemności spadek uw alniania etylenu skorelow any
jest ze spadkiem poziom u transkryptów ACO [2], Po p rze­
niesieniu siewek na światło ciągłe następuje w zrost a k u m u ­
lacji m RN A ACO. Fizjologiczne znaczenie rytmicznej p ro ­
dukcji etylenu u roślin pozostaje niejasne, choć przypuszcza
się, że etylen odgryw a istotną rolę w regulacji w ydłużania
się p ę d u [50,58,59].
REGULACJA POTRANSLACYJNA
N a istnienie potranslacyjnego m echanizm u regulujące­
go aktyw ność syntazy ACC wskazują badania, w których
obserw ow ano w zrost aktywności tych enzym ów po jedno­
czesnym p o dan iu elicitora i inhibitorów transkrypcji [74,75].
Szczegóły tego zjawiska zostały poznane dzięki badaniom
m u tan tó w szlaku biosyntezy etylenu cin (ang. cytokinin-insensitivé) [76,77] oraz eto (ang. ethylene-overproducer), u któ­
rych obserw ow ano anomalie w biosyntezie tego h orm onu
[77,78]. M utanty cin charakteryzują się brakiem produkcji
etylenu w odpow iedzi na aplikację cytokinin, podczas gdy
m utanty eto mają podw yższony poziom
biosyntezy etylenu i w ykazują w zm ożoną
o dpow iedź na etylen.
ACS5 (być m oże też inne izoform y syntazy ACC) do de­
gradacji z udziałem proteasom u 26S. Za interakcje z ETOl
o d po w iad a praw d o p o do b n ie C-końcowy fragm ent ACS5,
gdyż mutacja eto2 zaburza oddziaływ anie tych dw óch bia­
łek. Dośw iadczenia in vitro, w ykazujące ham ujący w pływ
ETOl na aktyw ność ACS5 [80] sugerują, że ETOl nie tylko
uczestniczy w degradacji ACS5, ale rów nież obniża jego ak­
tyw ność enzym atyczną. Tak więc, w iększa stabilność ACS5
i ACS9 u m utan tó w eto2 i eto3 w ydaje się być w ynikiem bra­
ku możliwości interakcji m iędzy tymi białkami a składni­
kiem kom pleksu ligazy E3, ETOl.
Po pozn an iu sekwencji genu CIN5 okazało się, że jest on,
podobnie jak E T02, z m u to w any m allelem ACS5 [76]. P oda­
nie cytokininy etiolow anym siew kom A. thaliana prow adzi
do w zrostu czasu p ółtrw ania ACS5 [47], co sugeruje, że hor­
m on ten w p ły w a na biosyntezę etylenu przez zwiększenie
stabilności białka ACS5. N a podstaw ie analiz m utan tó w eto
m ożna przypuszczać, że indukcja biosyntezy etylenu przez
cytokininy polega na blokow aniu interakcji ACS5 z ETOl
poprzez modyfikację C-końcowej dom eny tego enzym u.
Okazuje się jednak, że cytokininy dodatkow o zw iększa­
ją stabilność ACS5 rów nież u m u tan tó w eto2 i eto3 [47,80].
W skazuje to na istnienie dodatkow ego m echanizm u, za po ­
mocą którego cytokininy zwiększają produkcję etylenu u A.
thaliana (Ryc. 4).
Istotnym elem entem m echanizm u proteolitycznej degra­
dacji białek z udziałem proteasom u 26S w kom órkach jest
rubinylacja, polegająca na koniugacji białek RUB (ang. re­
lated to ubiquitin) do kom pleksu ligazy ubikw ityny E3 [83],
Z auw ażono, że m utanty A. thaliana z niefunkcjonalnym i
białkami RUB1 i RUB2 charakteryzują się zw iększoną p ro ­
dukcją etylenu [84], Aczkolwiek u m u tan ta reel (ang. rub
Z identyfikow ano trzy m utanty eto: etol
- recesyw ny [78], eto2 i eto3 - dominujące
[79]. Ustalono, że mutacja eto2, polegająca
na insercji pojedynczej pary zasad na koń­
cu 3' ACS5, prow adzi do zm iany d w u n a ­
stu C-końcowych am inokw asów białka
[76]. Z m iana ta w konsekwencji pow oduje
stabilizację enzym u, nie w pływając przy
tym na poziom jego mRNA [47]. Mutacja
eto3, natom iast, polega na zamianie Val457
na A sp w C-końcowej części ACS9 [47],
Z am iana ta rów nież prow adzi do w zrostu
stabilności enzym u, nie wpływając na p o­
ziom transkryptu.
Po zsekw encjonow aniu ETOl [80] oka­
zało się, że koduje on białko zawierające
dom enę BTB (ang. broad-complex, tramtrack,
bric-a-brac) i należy do rodziny białek tw o­
rzących kom pleksy ligaz E3 ubikw ityny
ty p u BTB (Ryc. 4) [81,82]. W ykazano, że
ETOl bezpośrednio oddziałuje zarów no
z ACS5 jak i CUL3 [80]. W ydaje się więc,
że pełni ono rolę substratow o specyficzne­
go białka adaptorow ego wyznaczającego
\
Destabilizacja
R y cin a 4. M o d el regulacji b io s y n te z y etylen u . Z e w z g lę d u na różnice C -k o ń co w y ch d o m e n d w u k las syntaz
A C C , regulacja ich a k ty w n o ści p rzeb iega w o d m ie n n y s p o só b (kolor c z e r w o n y i jasnon iebieski). R eszty Ser
zlo k a liz o w a n e na k o ń c a ch C tych e n z y m ó w , s ta n o w ią m iejsca d o c e lo w e d la k in az b ia łk o w y ch z a leżn y ch od
w a p n ia (CDPK) lu b k in a z M A P (M APK ). Fosforylacja m o ż e h a m o w a ć za c h o d zą c ą z u d z ia łe m p ro tea so m u 26S
p roteolityczn ą d egrad ację s y n ta z A C C , blokując o d d z ia ły w a n ia k o m p lek su lig a zy u b ik w ity n y E3 ty p u BTB
(E T 01-C U L 3) z ACS. N ie w ia d o m o c z y A C S2 i A C S6 są r ó w n ie ż d e g r a d o w a n e p r z e z p ro tea so m 26S (strzałki
ze zn a k iem zap ytan ia). K o m p le k s E T 01-C U L 3 katalizuje k o w alen cyjn e p rzy łą czen ie u b ik w ity n y (Ub) d o ACS.
A k ty w n o ść E T 0 1 -C U L 3 jest m o d y fik o w a n a p rze z p rzy łą czen ie białek R UB d o k o m p lek su , co katalizuje e n z y m
k on iu g u ją cy RCE1. Z m ie n io n e w w y n ik u m utacji C -k o ń co w e frag m en ty A C S5 i A C S9 u n iem o żliw ia ją proteolizę ty ch białek (kolor zielo n y ). S z c z e g ó ło w y o p is w tek ście (w g [93] zm o d y fik o w a n e ).
70
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
conjugating enzymé), wykazującego defekt w przyłączeniu
RUB do kom pleksu ligazy E3, w zrost produkcji etylenu
korelował ze zw iększoną aktywnością oksydazy ACC [85].
Może to w ynikać z faktu, że sam etylen stym uluje aktyw ­
ność oksydaz ACC [36,86], W ydaje się zatem, że podniesio­
ny poziom biosyntezy etylenu u rcel jest rezultatem w zro­
stu stabilności syntaz ACC, spow odow anej defektem ligazy
ubikw ityny E3.
W etylenow ą regulację wpisuje się dodatkow o sam szlak
sygnalizacyjny tego horm onu, jak i jego oddziaływ ania z
innymi szlakami sygnalizacyjnymi. Z pewnością na tym nie
kończy się złożoność tej regulacji. Należy się spodziew ać, że
w niedalekiej przyszłości poznam y więcej szczegółów tych
skom plikow anych współzależności.
Innym m echanizm em regulującym tem po degradacji
białek z u działem ubikw ityny jest proteoliza składników
samego kom pleksu ubikwitylującego poprzez m echanizm
autoubikwitylacji [87,88], Potraktow anie cytokininam i
transgenicznych roślin A. thaliana z nadekspresją ETOl nie
prow adzi do stabilizacji syntaz ACC, co sugeruje, że d o­
stępność E TO l odgryw a także istotną rolę w regulacji d e­
gradacji syntazy ACC [80].
1. Ecker JR (1995) The ethylene signal transduction pathw ay in plants.
Science 268: 667-675
2. Thain SC, V andenbussche F, L aarhoven LJJ, Dowson-Day MJ, W ang
ZY, Tobin EM, H arren FJM, Millar AJ, Van Der Straeten D (2004) Cir­
cadian rhythm s of ethylene em ission in Arabidopsis. Plant Physiol 136:
3751-3761
3. Yang SF, Hoffm an NE (1984) Ethylene biosynthesis and its regulation
in higher plants. A nnu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 35:155-189
4. Sato T, Theologis A (1989) Cloning the m RNA encoding 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase, the key enzym e for ethylene bio­
synthesis in plants. Proc Natl Acad Sci USA 86: 6621-6625
5. H am ilton AJ, Bouzayen M, G rierson D (1991) Identification of a to­
m ato gene for the ethylene-form ing enzym e by expression in yeast.
Proc Natl Acad Sci USA 88: 7434-7437
6. Spanu P, Reinhardt D, Boiler T (1991) Analysis and cloning of the
ethylene-form ing enzym e from tom ato by functional expression of its
m RNA in Xenopus laevis oocytes. EMBO J 10: 2007-2013
7. Jakubowicz M (1996) Etylen - jego udział w regulacji dojrzewania
owoców i starzenia się kwiatów . Aspekty biotechnologiczne. Postępy
Biochem 42: 65-72
8. Jakubowicz M (2002) Structure, catalytic activity and evolutionary re­
lationships of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase, the key
enzym e of ethylene synthesis in higher plants. Acta Biochim Polon 49:
757-774
9. Ravanel S, Gakiere B, Job D, Douce R (1998) The specific features of
m ethionine biosynthesis and m etabolism in plants. Proc N atl Acad Sci
USA 95: 7805-7812
10. Kende H (1993) Ethylene biosynthesis. A nnu Rev Plant Physiol Plant
Mol Biol 44: 283-307
11. Bleecker AB, Kende H (2000) Ethylene: A gaseous signal molecule in
plants. A nnu Rev Cell Dev Biol 16:1-18
12. Kathiresan A, Reid DM, C hinnappa CC (1996) Light-entrained and
tem perature-entrained circadian regulation of activity and m essenger
RNA accum ulation of 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase
in Stellaria longipes. Planta 199: 329-335
13. K athiresan A, N agarathna KC, M oloney MM, Reid DM, C hinnappa
CC (1998) Differential regulation of 1-am inocyclopropane-l-carboxylate synthase gene family and its role in phenotypic plasticity in Stella­
ria longipes. Plant Mol Biol 36: 265-274
14. M achackova I, C hauvaux N, Dewitte W, van O nkelen H (1997) D iur­
nal fluctuations in ethylene form ation in Chenopodium rubrum. Plant
Physiol 113: 981-985
15. Finlayson SA, Lee IJ, M ullet JE, M organ PW (1999) The m echanism of
rhythm ic ethylene production in Sorghum. The role of phytochrom e B
and sim ulated shading. Plant Physiol 119:1083-1089
16. W ang KLC, Li H, Ecker JR (2002) Ethylene biosynthesis and signaling
netw orks. Plant Cell 14: Suppl. S131-S151
17. Johnson PR, Ecker JR (1998) The ethylene gas signal transduction
pathw ay: A m olecular perspective. A nnu Rev G enet 32: 227-254
18. Ge L, Liu JZ, W ong WS, Hsiao WLW, C hong K, Xu ZK, Yang SF, K ung
SD, Li N (2000) Identification of a novel m ultiple environm ental fac­
tor-responsive 1-am inocyclopropane-l-carboxylate synthase gene,
NT-ACS2, from tobacco. Plant Cell Environ 23:1169-1182
19. The A rabidopsis G enom e Initiative (2000) N ature 408: 796-815
20. Liang X, Abel S, Keller JA, Shen NF, Theologis A (1992) The 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase gene family of Arabidopsis thalia­
na. Proc Natl Acad Sci USA 89:11046-11050
21. Van der Straeten D, R odrigues-Pousada RA, Villarroel R, H anley S,
G oodm an HM, Van M ontagu M (1992) Cloning, genetic m apping, and
expression analysis of an Arabidopsis thaliana gene that encodes 1-ami-
Istotne znaczenie dla stabilności enzym ów biorących
udział w biosyntezie etylenu mają rów nież procesy fosfo­
rylacji i defosforylacji białek. Inhibitory kinaz S e r/T h r obni­
żają produkcję etylenu, podczas gdy aplikacja inhibitora fo­
sfataz białkow ych pow oduje w zrost jego produkcji [89,90],
W ykazano rów nież, że katalizow ana przez CDPK fosfory­
lacja reszty Ser460 w LeACS2 z pom idora stanow i istotny
etap regulacji jej aktyw ności [60]. N a podstaw ie po ró w n a­
nia sekwencji am inokw asow ych syntaz ACC z różnych ga­
tun kó w roślin ustalono, że w regionie końca C większości
enzym ów zachow yw any jest charakterystyczny tripeptyd
A rg /L y s-L e u / Val-Ser [60], U fosforylow ana reszta Ser460 w
LeACS2 jest odpow iednikiem reszty Ser461 ACS5 z A. tha­
liana, zm utow anej u eto2 [60], M ożna zatem przypuszczać,
że regulacja aktyw ności syntaz ACC, mających ewolucyjnie
zachow yw aną sekwencję końca C (u A. thaliana są to ACS4,
ACS5, ACS8, ACS9), odbyw a się w podobny sposób. Substratam i dla CDPK m ogą być także izozymy syntazy ACC
nie posiadające konserw atyw nego C-końcowego fragm en­
tu, a mające resztę Ser [91].
W genetycznych i biochemicznych badaniach odpow ie­
dzi na czynniki stresowe w ykazano, że rów nież kinazy
MAP regulują stabilność syntaz ACC [92], Aktywacja szla­
ku kinaz M AP prow adzi do stabilizacji ACS6, a fosforylacja
trzech reszt seryny w ACS2 i ACS6 przez MPK6 z tytoniu
(ortolog indukow anej stresem kinazy SIPK z A. thaliana)
blokuje ich degradację (Ryc. 4). Docelowe miejsca fosforyla­
cji dla kinaz MAP występują na C-końcowych fragm entach
ACS1, ACS2 i ACS6, co w skazuje na specyficzną regulację
aktyw ności tych enzym ów .
P O D S U M O W A N IE
Przedstaw iona w niniejszej pracy w ielopoziom ow a re­
gulacja biosyntezy etylenu w ynika z udziału tego horm onu
w kontroli szerokiego spektrum procesów fizjologicznych:
od kiełkow ania nasion, przez całą ontogenezę, po reakcje
roślin na bodźce środow iskow e. W ielogenowa rodzina syn­
taz ACC, w której poszczególne geny podlegają zróżnico­
w anej ekspresji, a ich p ro d uk ty cechują się zróżnicow anym i
właściwościami biochem icznym i, mogąc tw orzyć hom o- i
heterodim ery, pozw ala roślinom reagow ać na zmieniające
się w arunki w sposób czasowo i przestrzennie specyficzny.
PIŚM IE N N IC TW O
71
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
nocyclopropane-l-carboxylate synthase. Proc N atl Acad Sci USA 89:
9969-9973
22. Arteca JM, Arteca RN (1999) A m ulti-responsive gene encoding 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase (ACS6) in m ature Arabidopsis
leaves. Plant Mol Biol 39: 209-219
23. Liang X, Oono Y, Shen NF, Kohler C, Li K, Scolnik PA, Theologis A
(1995) Characterization of two m em bers (ACS1 and ACS3) of the 1am inocyclopropane-l-carboxylate synthase gene family of Ambidopsis
tlmliana. Gene 167:17-24
24.Yam agam i T, Tsuchisaka A, Yam ada K, H addon WF, H arden LA,
Theologis A (2003) Biochemical diversity am ong the 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase isozym es encoded by the Arabidopsis
gene family. J Biol Chem 278:49102-49112
25. Tsuchisaka A, Theologis A (2004) Heterodim eric interactions am ong
the 1-am ino-cyclopropane-l-carboxylate synthase polypeptides en­
coded by the Arabidopsis gene family. Proc Natl Acad Sci USA 101:
2275-2280
26. Oetiker JH, Olson DC, Shiu OY, Yang SF (1997) Differential induction
of seven 1-am inocyclopropane-l-carboxylate synthase genes by elicitor in suspension cultures of tom ato (Lycopersicon esculentum). Plant
Mol Biol 34: 275-286
27. Peck SC, Kende H (1998) Differential regulation of genes encoding
1-am inocyclopropane-l-carboxylate (ACC) synthase in etiolated pea
seedlings: Effects of indole-3-acetic acid, w ounding, and ethylene.
Plant Mol Biol 38: 977-982
28. Barry CS, Llop-Tous MI, G rierson D (2000) The regulation of 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid synthase gene expression during
the transition from system-1 to system-2 ethylene synthesis in tomato.
Plant Physiol 123: 979-986
29. Tsuchisaka A, Theologis A (2004) U nique and overlapping expression
patterns am ong the Arabidopsis 1-am inocyclopropane-l-carboxylate
synthase gene family members. Plant Physiol 136: 2982-3000
30. Abel S, N guyen MD, Chow W, Theologis A (1995) ACS4, a prim ary
indoleacetic acid-responsive gene encoding 1-am inocyclopropane-lcarboxylate synthase in Arabidopsis thaliana. J Biol C hem 270: 1909319099
31. Vahala J, Schlagnhaufer CD, Pell EJ (1998) Induction of an ACC syntha­
se cDNA by ozone in light-grow n Arabidopsis thaliana leaves. Physiol
Plant 103: 45-50
32. O verm yer K, T uom inen H, K ettunen R, Betz C, Langebartels C, Sanderm ann H Jr, Kangasjarvi J (2000) Ozone-sensitive Arabidopsis rcdl
m utant reveals opposite roles for ethylene and jasm onate signaling
pathw ays in regulating superoxidedependent cell death. Plant Cell 12:
1849-1862
33. Smith JM, Arteca RN (2000) M olecular control of ethylene production
by cyanide in Arabidopsis thaliana. Physiol Plant 109:180-187
34. Tian Q, Uhlir NJ, Reed JW (2002) Arabidopsis SH Y2/IAA3 inhibits a u ­
xin regulated gene expression. Plant Cell 14: 301-319
35. Liang X, Shen NF, Theologis A (1996) Li(+)-regulated 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase gene expression in Arabidopsis thalia­
na. Plant J 10:1027-1036
36. Gomez-Lim MA, Valdes-Lopez V, C ruz-H em andez A, Saucedo-Arias
LJ (1993) Isolation and characterization of a gene involved in ethylene
biosynthesis from Arabidopsis thaliana. Gene 134: 217-221
37. Raz V, Ecker JR (1999) Regulation of differential grow th in the apical
hook of Arabidopsis. D evelopm ent 126: 3661-3668
38. Schwark A, Bopp M (1993) Interaction of ethylene and auxin in the
regulation of hook grow th II. The role of ethylene in different grow ing
regions of the hypocotyls hook of Phaseolus vulgaris. J Plant Physiol
142: 585-592
39. A lexander L, Grierson D (2002) Ethylene biosynthesis and action in
tomato: a m odel for climacteric fruit ripening. J Exp Bot 53: 2039-2055
40. Bidonde S, Ferrer MA, Zagzouti H, Ram assam y S, Latche A, Pech JC,
H am ilton AJ, Grierson D, Bouzayen M (1998) Expression and charac­
terization of three tom ato 1-aminocyclopropane-l-carboxylate oxidase
cDNAs in yeast. Eur J Biochem 253: 20-26
41. N akatsuka A, M urachi S, O kum ishi H, Shiomi S, N akano R, Inaba KY
(1998) Differential expression and internal feedback regulation of 1am inocyclopropane-l-carboxylate synthase, 1-am inocyclopropane-l-
carboxylic acid oxidase, and ethylene receptor genes in tom ato fruit
during developm ent and ripening. Plant Physiol 118:1295-1305
42. Pech JC, Latche A, Bouzayen M (2004) Ethylene biosynthesis, W:
Davies PJ (red) Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction,
Action! Kluw er Academic Publisher, Dordrecht, Boston, London, str.
115-136
43. Fluhr R, M attoo AK (1996) Ethylene biosynthesis and perception. Crit
Rev Plant Sci 15: 479-523
44. Lelievre JM, Latche A, Jones B, Bouzayen M, Pech JC (1997) Ethylene
and fruit ripening. Physiol Plant 101: 727-739
45. M ehta PK, Hale TI, Christen P (1993) Am inotransferases: D em onstra­
tion of hom ology and division into evolutionary subgroups. Eur J Bio­
chem 214: 549-561
46. Yip WK, Dong JG, Kenny JW, Thom pson GA, Yang SF (1990) Charac­
terization and sequencing of the active site of 1-am inocyclopropane-lcarboxylate synthase. Proc Natl Acad Sci USA 87: 7930-7934
47. Chae HS, Faure F, Kieber JJ (2003) The etol, eto2, and eto3 m utations
and cytokinin treatm ent increase ethylene biosynthesis in Arabidopsis
by increasing the stability of ACS protein. Plant Cell 15: 545-559
48. W oeste KE, Ye C, Kieber JJ (1999) Two Arabidopsis m utants that over­
produce ethylene are affected in the posttranscriptional regulation of
1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid synthase. Plant Physiol 119:
521-530
49. Rottm ann WE, Peter GF, Oeller PW, Keller JA, Shen NF, N agy BP,
Taylor LP, Campbell AD, Theologis A (1991) 1-am inocyclopropane-lcarboxylate synthase in tom ato is encoded by m ultigene family whose
transcription is induced during fruit and floral senescence. J Mol Biol
222: 937-961
50. Capitani G, H ohenester E, Feng L, Storici P, Kirsch JF, Jansonius JN
(1999) Structure of 1-am inocyclopropane-l-carboxylate synthase, a
key enzym e in the biosynthesis of the plant horm one ethylene. J Mol
Biol 294: 745-756
51. T arun AS, Lee JS, Theologis A (1998) R andom m utagenesis of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase: A key enzym e in ethylene
biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA 94: 9796-9801
52. H uai Q, Xia YH, Chen YQ, Callahan B, Li N, Ke HM (2001) Crystal
structures of 1-am inocyclopropane-l-carboxylate (ACC) synthase in
complex w ith am inoethoxyvinylglycine and pyridoxal-5'-phospha­
te provide new insight into catalytic mechanisms. J Biol Chem 276:
38210-38216
53. Li Y, Feng L, Kirsch JF (1997) Kinetic and spectroscopic investigations
of w ild-type and m utant form s of apple 1-am inocyclopropane-l-carboxylate synthase. Biochemistry 36:15477-15488
54. T arun AS, Theologis A (1998) Com plem entation analysis of m utants of
1-am inocyclopropane-l-carboxylate synthase reveals the enzym e is a
dim er w ith shared active sites. J Biol C hem 273:12509-12514
55. Yang SF, Dong JG (1993) Recent progress in research of ethylene bio­
synthesis. Bot Bull Acad Sini 34: 89-101
56. H uang PL, Parks JE, Rottm ann WE, Theologis A (1991) Two genes en­
coding 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase in zucchini (Cucurbita pepo) are clustered and sim ilar but differentially regulated. Proc
Natl Acad Sci USA 88: 7021-7025
57. M ehta PK, H ale TI, Christen P (1989) Evolutionary relationships
am ong aminotransferases. Eur J Biochem 186: 249-253
58. M ehta PK, C hristen P (1994) H om ology of 1-am inocyclopropane-lcarboxylate synthase. 8-am ino-7-oxononanoate synthase, 2-amino-6caprolactam racemase, 2,2-dialkylglycine decarboxylase, glutam ate1-sem ialdehyde 2,1-am inom utase and isopenicillin-N-epimerase w ith
aminotransferases. Biochem Biophys Res C om m un 198:138-143
59. M cCarthy DL, Capitani G, Feng L, G ruetter MG, Kirsch JF (2001) G lu­
tam ate 47 in 1-am inocyclopropane-l-carboxylate synthase is a major
specificity determ inant. Biochemistry 40:12276-12284
60. Tatsuki M, Mori H (2001) Phosphorylation of tom ato 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid synthase, LE-ACS2, at the C-terminal re­
gion. J Biol Chem 276: 28051-28057
61. Lieberm ann M (1979) Biosynthesis and action of ethylene. Ann Rev
Plant Physiol 30: 533-591
62. H am ilton AJ, Lycett GW, G rierson D (1990) Antisense gene that in­
hibits synthesis of the horm one ethylene in transgenic plants. N ature
346: 284-287
72
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
63. Prescott AG, John P (1996) Dioxygenases: m olecularstructure and role
in plant metabolism. A nnu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47: 245271
64. Zhou J, Rocklin AM, Lipscomb JD, Q ue L Jr, Solomon El (2002) Spec­
troscopic studies of 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase:
m olecular m echanism and CO, activation in the biosynthesis of ethy­
lene. J Am er Chem Soc 124: 4602-4609
65. C hung MC, Chou SJ, Kuang LY, C ham g Y, Yang SF (2002) Subcellular
localisation of 1-am inocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase in ap­
ple fruit. Plant Cell Physiol 43: 549-554
66. Ramassam y S, Olm os E, Bouzayen M, Pech JC, Latche A (1998) 1-aminocyclopropane-l-carboxylate oxidase of apple fruit is periplasmic. J
Exp Bot 49:1909-1915
67. Barlow JN, Z hang Z, John P, Baldwin JE, Schofield CJ (1997) Inactiva­
tion of 1-am inocyclopropane-l-carboxylate oxidase involves oxidative
modifications. Biochemistry 36: 3563-3569
68. M athooko FM, Tsunashim a Y, Kubo Y, Inaba A (2004) Expression
of 1-am inocyclopropane-l-carboxylate (ACC) oxidase gene in peach
(Prunus persica) fruit in response to treatm ent w ith carbon dioxide and
1-methylcyclopropene: possible role of ethylene. African J Biotech 3:
497-502
69. Kasai Y, H yodo H, Ikom a Y, Yano M (1998) Characterization of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate (ACC) oxidase in broccoli florets and
from Escherichia coli cells. Bot Bull Acad Sin 39: 225-230
70. D harm asiri N, D harm asiri S, Estelle M (2005) The F-box protein TIR1
is an auxin receptor. N ature 435: 441-445
71. Kępiński S, Leyser O (2005) The Arabidopsis F-box protein TIRlis an
auxin receptor. N ature 435:446-451
72. Kowalczyk S, H adow ska E, Piekarska A (2005) Roślinne układy ubikwitylacji i degradacji białek w proteasom ach - kluczowe elem enty
horm onalnych szlaków sygnałowych. Postępy Biochem 51:171-187
73. Li J, Dai X, Zhao Y (2006) A role for Auxin Response Factor 19 in auxin
and ethylene signaling in Arabidopsis. Plant Physiol 140: 899-908
74. Chappell J, Hahlbrock K, Boiler T (1984) Rapid induction of ethylene
biosynthesis in cultured parsley cells by fungal elicitor and its rela­
tionship to the induction of phenylalanine am m onia lyase. Planta 161:
475-480
75. Felix G, G rosskopf DG, Regenass M, Basse CW, Boiler T (1991) Elicitor-induced ethylene biosynthesis in tom ato cells. Characterization
an d use as a bioassay for elicitor action. Plant Physiol 97:19-25
76. Vogel JP, W oeste KE, Theologis A, Kieber JJ (1998) Recessive and dom ­
inant m utations in the ethylene biosynthetic gene ACS5 of Arabidopsis
confer cytokinin insensitivity and ethylene overproduction, respec­
tively. Proc N atl Acad Sci USA 95:4766-4771
77. Vogel JP, Schuerm an P, W oeste K, Brandstatter I, Kieber JJ (1998) Isola­
tion and characterization of Arabidopsis m utants defective in the induc­
tion of ethylene biosynthesis by cytokinin. Genetics 149: 417-427
78. G uzm an P, Ecker JR (1990) Exploiting the triple response of Arabidopsis
to identify ethylene-related m utants. Plant Cell 2: 513-523
79. Kieber JJ, Rothenberg M, Roman G, Feldm ann KA, Ecker JR (1993)
CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathw ay in Arabi­
dopsis, encodes a m em ber of the raf family of protein kinases. Cell 72:
427-441
80. W ang KLC, Yoshida H, Lurin C, Ecker JR (2004) Regulation of ethylene
gas biosynthesis by the Arabidopsis ETOl protein. N ature 428: 945-950
81. Pintard L, W illems A, Peter M (2004) Cullin-based ubiquitin ligases:
Cul3-BTB complexes join the family. EMBO J 23:1681-1687
82. Hejka T, Kowalczyk S (2006) Zależna od ubikw ityny proteoliza białek
w regulacji procesów w zrostu i rozw oju roślin. Post Biol Kom 33:159174
83. Dharm asiri N, Estelle M (2004) Auxin signaling and regulated protein
degradation. Trends Plant Sci 9: 302-308
84. Bostick M, Lochhead SR, H onda A, Palm er S, Callisa J (2004) Related to
U biquitin 1 and 2 are redundant and essential and regulate vegetative
growth, auxin signaling, and ethylene production in Arabidopsis. Plant
Cell 16: 2418-2432
85. Larsen PB, Cancel JD (2004) A recessive m utation in the RUBl-conjugating enzym e, RCE1, reveals a requirem ent for RUB modification
for control of ethylene biosynthesis and proper induction of BASIC
CHITINASE and PDF1.2 in Arabidopsis. Plant J 38: 626-638
86. De Paepe A, Vuylsteke M, Van H um m elen P, Zabeau M, Van Der Straeten D (2004) Transcriptional profiling by cDNA-AFLP and m icroar­
ray analysis reveals novel insights into the early response to ethylene
in Arabidopsis. Plant J 39: 537-559
87. M athias N, Johnson S, Byers B, Goeb M (1999) The abundance of cell
cycle regulatory protein Cdc4p is controlled by interactions betw een
its F box and S kplp. Mol Cell Biol 19:1759-1767
88. Galan JM, Peter M (1999) U biquitin-dependent degradation of m ulti­
ple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc Natl Acad Sci
USA 96: 9124-9129
89. Spanu P, G rosskopf DG, Felix G, Bolle T (1994) The apparent turno­
ver of 1-am inocyclopropane-l-carboxylate synthase in tom ato cells is
regulated by protein phosphorylation and dephosphorylation. Plant
Physiol 106: 529-535
90. T uom ainen J, Betz C, Kangasjarvi J, Ernst D, Yin ZH, Langebartels
C, Sanderm ann H Jr (1997) O zone induction of ethylene em ission in
tom ato plants: regulation by differential accum ulation of transcripts
for the biosynthetic enzym es. Plant J 12:1151-1162
91. Sebastia CH, H ardin SC, Clouse SD, Kieber JJ, H uber SC (2004) Iden­
tification of a new m otif for CDPK phosphorylation in vitro that sug­
gests ACC synthase m ay be a CDPK substrate. Arch Biochem Biophys
428: 81-91
92. Liu Y, Zhang S (2004) Phosphorylation of ACC synthase by MPK6, a
stress-responsive MAPK, induces ethylene biosynthesis in Arabidopsis.
Plant Cell 16:3386-3399
93. Chae HS, Kieber JJ (2005) Eto Brute? Role of ACS turnover in regulat­
ing ethylene biosynthesis. Trends Plant Sci 10: 291-296
R egulation of ethylene b iosynthesis in plants.
K a m il F ran k ow sk i v Jacek K çsy, Jan K o p ce w icz
D ep artm en t of Physiology an d M olecular Biology of Plants, Institute of G eneral a n d M olecular Biology, N icolaus C opernicus U niversity, 9
G agarina St, 87-100 T orun, Poland
e-mail: K am il.Frankow ski@ uni.torun.pl
K ey words: ethylene, ethylene biosynthesis, ACC synthase, ACC oxidase
A BST R A C T
Ethylene is one of the plant horm ones that controls growth and development. There are m any responses regulated via ethylene in response to
exogenous stim uli. Research o n ethylene biosynthesis and the signalling pathway enabled us to understand the m echanism of the regulation
of these responses. Different temporal and spatial expression of genes encoding enzym es involved in ethylene biosynthesis is of great impor­
tance for the regulation of ethylene responses. Also, post-translational regulation of the enzym es seem s to be a key regulatory mechanism for
the control of their activity. Because of versatile regulation of its production, ethylene can control plant developm ent at many levels.
73
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
N ow e spojrzenie na proces degradacji ziaren skrobi
w chloroplastach Arabidopsis thaliana L.
STRESZCZENIE
D orota S a m o jed n y
S ła w o m ir O r zech o w sk i
Katedra Biochemii Wydział Rolnictwa i Biolo­
gii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego,
Warszawa
Katedra Biochemii Wydział Rolnictwa i Biolo­
gii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego,
ul. Nowoursynowska 159, Budynek 37, 02-776
Warszawa; e-mail: slawomir_orzechowski@
sggw.pl, tel.: (022) 593 25 78, faks: (022) 593 25
63
Artykuł otrzymano 18 lipca 2006 r.
Artykuł zaakceptowano 14 września 2006 r.
Słow a kluczow e: amylaza, Arabidopsis, chloro­
plast, maltoza, rozkład skrobi
Stosow ane skróty: AMY - a-amylaza, EC
3.2.1.1; BAM/BMY - (3-amylaza, EC 3.2.1.2;
DPE - D-enzym, enzym dysproporcjonowania
EC 2.4.1.25; GWD - dikinaza: glukan, woda,
EC 2.7.9.4; ISA - izoamylaza, EC 3.2.1.68; LDA
- pullulanaza, EC 3.2.1.142; MEX1 - transpor­
ter maltozy; PHS - fosforylaza skrobiowa, EC
2.4.1.1; PWD - dikinaza: fosfoglukan, woda,
EC 2.7.9.5
krobia asymilacyjna jest gromadzona w ciągu dnia i stanowi głów ne źródło energii dla
m etabolizm u komórki podczas nocy. O bserw ow any cykliczny rozkład skrobi stał się
m odelem doświadczalnym chętnie w ykorzystyw anym przez uczonych, a w n iosk i w ysunięte
na podstaw ie w yn ik ów badań znajdują w ykorzystanie w analizie m echanizm ów degrada­
cji zarówno skrobi tranzytorycznej, jak i zapasowej. Rozkład skrobi m ożna podzielić na 2
etapy: zapoczątkowanie degradacji oraz hydroliza i fosforoliza ziaren skrobi do oligosacharydów i ich pochodnych. Kluczowe znaczenie w tym procesie przypisuje się p-amylazie,
produkt jej aktywności p-m altoza transportowana jest do cytosolu i tam podlega dalszym
przemianom. Degradacja skrobi podlega złożonej i nie do końca jeszcze wyjaśnionej re­
gulacji. N ajw ażniejszym i elem entam i wpływ ającym i na szybkość rozkładu skrobi są: cykl
dobow y, fosforylacja skrobi oraz regulacja aktyw ności enzym ów. O dbywa się ona poprzez
zm ianę potencjału redoks, zmianę pH i stężenia substratów jak również fosforylację białek
zaangażowanych w rozkład skrobi przez specyficzne fosfatazy. Prezentowana praca ma na
celu usystem atyzowanie aktualnej w ied zy na temat degradacji skrobi w liściach Arabidopsis
thaliana L.. W yniki badań ostatnich lat rzucają n ow e światło na proces rozkładu skrobi, a
także na jego kontrolę.
S
W PR O W A D Z E N IE
Skrobia jest najczęściej w ystępującym m ateriałem zapasow ym u roślin. Jest
to polim er zb u dow any z reszt sześciowęglowego, redukującego cukru a-D-glukozy. Cząsteczki glukozy połączone są ze sobą w iązaniam i a - l,4 i a - l,6 glikozydow ym i. W iązania a-glikozydow e um ożliw iają polim erom glukozy tw orze­
nie stru k tu ry heliakalnej. W skutek polimeryzacji glukozy w cząsteczce skrobi
dochodzi do w ytw orzenia dw óch frakcji: am ylozy i am ylopektyny. Amyloza
zb u d o w an a jest głównie z nierozgałęzionych łańcuchów (struktura linearna)
połączonych w iązaniam i a - l,4 glikozydow ym i, podczas gdy cząsteczki amylo­
pektyny są rozgałęzione, a rozgałęzienia u tw orzo ne są przez w iązania a-l,6 glikozydow e. Skrobia występuje w komórce roślinnej w postaci nierozpuszczalnych
ziaren w ytw arzanych w plastydach. W zależności od rodzaju p lastydu można
w yróżnić skrobię tranzytoryczną lub zapasow ą, która pow staje odpow iednio w
chloroplastach i amyloplastach. Podziału tego m ożna dokonać także w oparciu
o pew ne cechy charakteryzujące ziarna skrobi, takie jak: wielkość, kształt czy
b u d o w a w ew nętrzna. Ziarna skrobi asymilacyjnej A. thaliana składają się w oko­
ło 90 % z łańcuchów am ylopektyny [1], które tw orzą półkrystaliczną strukturę
granul [2,3]. Podstaw ą struktury granul jest u p akow anie polim erów am ylopek­
tyny w zorganizow ane szeregi. Ziarna skrobi z bu d o w an e są z promieniście uło­
żonych łańcuchów, których końce nieredukujące skierow ane są do powierzchni.
Polim ery tw orzą na przem ian występujące blaszki półkrystaliczne i amorficzne
o szerokości 9 nm, które zw ane są strefam i półkrystalicznym i. Strefy te są uło ­
żone na przem ian ze strefami amorficznymi. Tak pow stałe obie strefy nazyw a
się pierścieniem przyrostu. Budow a ziaren skrobi jest dość dobrze u do k u m en ­
tow ana [3-8],
Większość roślin syntetyzuje i degraduje skrobię w zależności od wielu czynni­
ków w ew nętrznych i zewnętrznych, a także m.in. od stadium rozwoju. Ma to zna­
czenie w przypadku organów spichrzowych takich jak bulw y czy korzenie. Bio­
synteza skrobi była przedm iotem wielu badań, których wyniki prezentowano w
licznych pracach zarówno oryginalnych, jak i przeglądowych [9-14]. Substratem w
syntezie skrobi jest aktyw na form a glukozy, w tym p rzy p a d k u ADP-glukoza p o­
w stała w reakcji katalizowanej przez pirofosforylazę ADP-glukozy (ADPGPazę)
z glukozo-1-fosforanu i ATP [9]. ADP- glukoza zostaje następnie przyłączona
do nieredukującego końca powstającego łańcucha am ylozy lub am ylopektyny
[11,15], Tw orzenie cząsteczek am ylopektyny i strukturalne jej upakow anie jest
ze sobą ściśle pow iązane i podlega precyzyjnej regulacji. Proces ten w ym aga
uczestnictw a w ielu enzym ów , m.in. syntazy skrobi (SS) i enzym ów rozgałęzia­
jących (SBE). A m yloza powstaje w ew nątrz ziarna jako przenikająca go pojedyn-
74
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
cza helisa i w ym aga zaangażow ania głównie syntazy skrobi
związanej z ziarnem (GBSS) [4,14].
D EG R A D A C JA SKROBI
Proces degradacji skrobi jest słabiej poznany niż jej bio­
synteza i wiele danych w skazuje na to, że nie jest taki sam
we w szystkich organach danej rośliny, a także różni się p o­
m iędzy tym i sam ym i organam i u różnych gatunków roślin
[16]. Degradacja skrobi w chloroplastach ma na celu uw ol­
nienie zm agazynow anej w czasie dnia energii. Podczas nocy
rozkład skrobi dostarcza substratów do syntezy cukrów za­
pewniając tym sam ym ciągły ich eksport do organów niefotosyntetyzujących, dostarcza także szkieletów w ęglow ych
i energii niezbędnej do procesów zachodzących w ew nątrz
komórki. Z aangażow ane są w tym procesie enzym y z klasy
hydrolaz i transferaz (Ryc. 1).
Dzięki poznaniu pełnej sekwencji genów Arabidopsis [17],
naukow cy są w stanie łatwiej uzyskiw ać rośliny zm odyfi­
kow ane genetycznie. Uzyskuje się m utanty z w yciszonym i
genam i kodującym i poszczególne enzym y zw iązane z prze­
m ianam i skrobi. Badanie zm ian m etabolicznych poszcze­
gólnych m utan tó w oraz postęp w technikach analitycznych
um ożliw iły zw eryfikow anie teoretycznych m odeli degra­
dacji skrobi w chloroplastach A. thaliana. Dziś w iadom o, że
rozkład skrobi asymilacyjnej w A. thaliana odbiega od d o ­
brze poznanego m odelu rozkładu skrobi zapasowej w ziar­
niakach zbóż [18-20].
Proces rozkładu skrobi asymilacyjnej (Ryc. 2) m ożna
najogólniej podzielić na 2 etapy: zapoczątkow anie degra­
dacji oraz rozkład ziaren skrobi do oligosacharydów i ich
pochodnych. U zyskane w w yn ik u rozkładu skrobi cukry są
następnie w łączane do szlaków m etabolicznych zarów no w
chloroplastach, jak i w cytoplazmie.
ZA P O C Z Ą T K O W A N IE R O Z K Ł A D U
Z IAR EN SKROBI ASYMILACYJNEJ
ROLA a-AMYLAZ
Ziarna skrobi w yizolow ane z chloroplastów w w arunkach
natyw nych nie są dobrym substratem dla enzym ów amylolitycznych [8]. Enzym katalizujący pierw szy etap procesu
R y c in a 1. S ch em a t p rzed staw iający d ziała n ie e n z y m ó w b iorących u d z ia ł w d egradacji skrobi w chloroplastach. ISA3- iz o a m y la z a 3; PH S1- c h lo r o p la sto w a izoform a fosfo ryla zy skrobiow ej; D PE1- ch lo rop lastow a izo fo rm a e n z y m u d ysp rop orcjon ow an ia.
75
P o stęp y Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
R y cin a 2. P r zy p u szc za ln y p rzeb ieg procesu degradacji skrobi w ch loroplastach A. thaliana. O p is w tekście. G W D - d ik in aza glu k an , w o d a ; P W D - d ik in aza fo sfoglu kan ,
w o d a ; ISA 3 - iz o a m y la za 3; PH S1 - ch lo r o p la sto w a izoform a fo sfo ry la z y skrobiow ej; DPE1 - ch lo r o p la sto w a izoform a e n z y m u d y sp rop orcjo n o w an ia .
degradacji skrobi m usi posiadać zdolność do uw alniania
łańcuchów glukozy znajdujących się na pow ierzchni ziarna.
W ykazano, że w w arunkach in vitro kilka różnych enzym ów
jest zdolnych do katalizow ania takiej reakcji [21,22], ale je­
dynym i praw dopodobnym i enzym am i zdolnym i do tego
typu reakcji in vivo w roślinach są endoam ylazy- a-am ylazy
(Ryc. 1). W bielmie kiełkujących ziarniaków zbóż a-am y lazy
hydrolizują w iązania a -l,4 glikozydow e w ew nątrz polim e­
rów znajdujących się na pow ierzchni ziaren lub w kanałach
w ew n ątrz granul, uwalniając łańcuchy poliglukanów , które
służą jako substraty w dalszych etapach degradacji. W ge­
nom ie A. thaliana są kodow ane trzy białka o sekwencji aminokw asow ej homologicznej do innych a-am ylaz, a jedna z
nich AMY3 posiada lokalizację chloroplastow ą. Sądzono,
że to w łaśnie AMY3 rozpoczyna degradację pow ierzchni
ziaren podczas nocy. Jednak na podstaw ie w yników badań
nad m u tantam i okazało się, że żadna z w ytypow anych na
podstaw ie sekwencji izoform a-am y lazy nie jest w y m a­
gana do rozkładu skrobi. W ykorzystując insercję T-DNA
blokow ano aktywność poszczególnych genów kodujących
a -am y lazy , a uzyskane m utanty w ykazyw ały praw idłow e
tem po degradacji skrobi w liściach w ciągu nocy. Podobne
wyniki uzyskano podczas w ygaszenia aktyw ności jedno­
cześnie w szystkich trzech genów [23]. Przedstaw ione w y ni­
ki bad ań wskazują, że rozpoczęcie degradacji pow ierzchni
ziaren skrobi A. thaliana nie odbyw a się przy udziale a - a m y ­
laz, lub też genom Arabidopsis zaw iera now ą endoam ylazę z
niezidentyfikow aną do tej pory sekwencją am inokw asow ą
(Ryc. 2). Rola AMY3 pozostaje jednak niewyjaśniona. Zdaje
się, że enzym ten mógłby być zaangażow any w mobiliza­
76
cję skrobi, ale rezultaty dotychczasow ych eksperym entów
pokazują, że jego brak m oże być rekom pensow any przez
aktyw ność innych enzym ów .
ZNACZENIE ENZYMÓW FOSFORYLUJĄCYCH SKROBIĘ
Podczas, gdy m echanizm uw alniania rozpuszczalnych
łańcuchów glukanów z ziaren skrobi nie jest wyjaśniony,
w iadom o, że w ten proces zaangażow any jest stosunkow o
n iedaw no odkryty enzym , zw any dikinazą: glukan, w oda
(GWD). W genomie rzodkiew nika zidentyfikow ano 3 geny
odpow iedzialne za kodow anie hom ologów GWD, 2 posia­
dają sekwencję kierującą je do chloroplastów: GWD1 i PWD
(GWD3) [24-26]. Identyfikacja białka GWD pochodzącego
z ziem niaka w ykazała, że katalizuje on odw racalną reakcję
przenoszenia reszty p-fosforanowej z ATP na 6 węgiel w
reszcie glukozy w ew nątrz am ylopektyny [27], Reszta y-fosforanow a przenoszona jest na cząsteczkę w ody, co m a na
celu w ytw orzenie stechiometrycznej ilości w olnego fosfora­
n u i AMP [28]. Fosforylacja łańcuchów am ylopektyny przy
udziale GWD m a miejsce zarów no podczas syntezy, jak i
degradacji skrobi in vivo [28], A naliza substratów dla GWD
w ykazała, że enzym ten preferuje cząsteczki am ylopektyny
bardziej niż cząsteczki am ylozy w stosunku 30% dla am yło­
zy i 70% dla amylopektyny. A ktyw ny enzym w ym aga więc
obecności w iązań a-l ,6 glikozydow ych, a jego aktywność
zwiększa się w raz ze w zrostem polimeryzacji cząsteczek
glukozy [26]. Pom im o dość niskiej częstotliwości, z jaką
reszty glukozow e są fosforylowane, w liściach Arabidopsis
jest to około 0,1%, co oznacza, że 1 na 1000 reszt posiada
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
grupę fosforanow ą [29], to obecność aktywnej GWD w ydaje
się być niezbędna do praw idłow ego przebiegu procesu.
skrobi, a p o nadto w ykazują z redukow ane tem po degradacji
skrobi [33].
Białko GWD składa się z dw óch domen: jednej o aktyw ­
ności dikinazy i drugiej, N-terminalnej dom eny o nie w
pełni poznanej funkcji. Sugerow ana funkcja N-terminalnej
dom eny GWD, to udział w prom ow aniu aktywności innych
enzym ów degradujących skrobię poprzez interakcję z łań­
cuchami poliglukanu na pow ierzchni ziaren lub z sam ym i
enzym am i [28], jak rów nież decydow anie o specyficzności
substratowej GWD [30].
ENZYMY USUWAJĄCE ROZGAŁĘZIENIA
H om olog GWD - PWD, dikinaza: fosfoglukan, w oda
też zaangażow ana jest w m etabolizm skrobi [24,25], M u­
tacje wyciszające gen PWD pow odują, że rośliny nie są w
stanie praw idłow o degradow ać skrobi. U nich jednak w
przeciw ieństw ie do m utantów sexl (starch excess 1, czyli o
zwiększonej zawartości skrobi), u których gen GWD jest
nieaktyw ny, nie ulega redukcji ilość fosforu zw iązanego ze
skrobią. W cząsteczce PWD C-końcowa dom ena w yk azu­
je zbliżoną budow ę do C-końcowej dom eny GWD i innych
dikinaz, natom iast N -końcowa dom ena PWD znacznie się
różni od N-końcowej dom eny GWD. Analiza aktywności
PWD uzyskanej w w yniku nadekspresji w kom órkach £.
coli dow iodła, że PWD może tylko fosforylować łańcuchy
am ylopektyny, które zawierają już grupy fosforanowe i w
odróżnieniu od GWD nie stw ierdzono aktywności transferazowej bez uprzedniego ufosforylow ania łańcuchów
a-g lu k a n ó w . Transfer ortofosforanu katalizow any przez
ten enzym odbyw a się na węgiel w pozycji C3 w cząsteczce
glukozy w łańcuchu am ylopektyny [27], W skazuje to na o d ­
mienną specyficzność substratow ą obu enzym ów (GWD1
i PWD), co mogłoby być skutkiem różnej budow y dom en
N-końcow ych odpow iedzialnych za w iązanie łańcucha p o ­
liglukanu i decydujących praw dopodobnie o specyficzności
substratow ej enzym ów [30].
H Y D RO LIZA I FOSFOROLIZA SKROBI D O
O L IG O S A C H A R Y D Ó W I ICH P O C H O D N Y C H
Pierwszy etap degradacji skrobi prow adzi do uw olnienia
linearnego glukanu rozpuszczonego w stromie chloroplastu
(Ryc. 2). Enzym y obecne w chloroplastach mogą potencjalnie
katalizować dw ie alternatyw ne ścieżki jego dalszej degra­
dacji. Pierwsza angażuje enzym chloroplastow ą fosforylazę
skrobiow ą - PHS1 [31,32], która uw alnia glukozo-l-fosforany (Ryc. 1). Druga ścieżka w ym aga obecności p~amylazy,
która katalizuje reakcję odłączania od nieredukującego koń­
ca linearnego glukanu cząsteczek maltozy (Ryc. 1). Cztery z
dziewięciu p-am ylaz kodow anych w genom ie Arabidopsis
posiadają peptyd sygnałow y kierujący je do chloroplastów.
W yniki ostatnich badań w skazują na to, że degradacja line­
arnego glukanu zachodzi zw ykle przy udziale (3-amylazy,
a nie na drodze fosforolizy glukanu. Tezę tą oparto na na­
stępujących spostrzeżeniach: po pierwsze, m utanty z w y ­
ciszonym genem fosforylazy glukanu w ykazują norm alny
poziom degradacji skrobi [2], Po drugie, m utanty z nieak­
tyw nym genem (3-amylazy mają zred u ko w aną zdolność
degradacji skrobi [21]. Po trzecie, rośliny nie posiadające en­
zym ów biorących udział w metabolizm ie m altozy grom a­
dzą duże jej ilości proporcjonalne do produkcji maltozy ze
G enom Arabidopsis koduje cztery białka mogące brać
udział w hydrolizie w iązań a - l ,6 glikozydow ych w łańcu­
chu glukanu (Ryc. 1). Jedno z nich należy do klasy dekstrynaz granicznych (LDA - pullulanaza), a pozostałe trzy są
izoam ylazami (ISA). LDA jest w ysoce aktyw na w bielmie
kiełkujących ziarniaków zbóż i wiele w skazuje na to, że
jest ona zaangażow ana w hydrolizę w iązań a - l ,6 glikozy­
dow ych w tych organach. N atom iast rośliny Arabidopsis z
nieaktyw nym genem dla tego enzym u w ykazują norm alny
poziom degradacji skrobi w liściach podczas nocy [34], Po­
zwala to sądzić, że jedna lub więcej izoamylaz, a nie pullu ­
lanaza m ogą być zaangażow ane w ten proces.
Udział ISA zarów no w procesie biosyntezy, jak i de­
gradacji p rzysparza trudności w zidentyfikow aniu, która
izoforma odpow iada za hydrolizę w iązań a -l,6 glikozy­
dow ych podczas rozkładu skrobi. W liściach A. thaliana,
bielmie zbóż, bulw ach ziemniaka, redukcja lub eliminacja
aktywności wszystkich trzech izoform izoam ylaz prow adzi
do zaburzeń w syntezie skrobi. W zrasta liczba ziaren, a co
najmniej część łańcuchów skrobi jest zastępow ana przez
rozpuszczalny glukan, zw any fitoglikogenem [35]. Sposób
działania izoam ylazy na ziarna skrobi i m echanizm pow sta­
wania łańcuchów fitoglikogenu w norm alnych w arunkach
nie są jeszcze dobrze poznane. U ziem niaka p ro du k ty ge­
nów StISAl i StISA2 tw orzą w spólnie heterotetram ery, któ­
re są odpow iedzialne za w ym ierną działalność izoam ylazy
w bulw ach [36,37], Podobne w spółdziałanie różnych form
izoamylaz mogłoby mieć miejsce także w liściach Arabido­
psis.
Chociaż zarów no ISA1, jak i ISA2 są niezbędne podczas
normalnej syntezy skrobi w liściach Arabidopsis, to p rzep ro ­
w adzone badania w skazują na to, że nie są one zaangażo­
w ane w hydrolizę w iązań a - l,6 glikozydow ych w czasie
nocnej degradacji skrobi. U m u tantów isal i isa2 zarów no
skrobia, jak i fitoglikogen są całkowicie degradow ane w
ciągu nocy [34,35]. Biorąc pod uw agę, że fitoglikogen ma
wyższy stosunek w iązań glikozydow ych a -l,6 do a -l,4 w
porów naniu do am ylopektyny, proces hydrolizy w iązań a1,6 w fitoglikogenie m usi przebiegać szybciej niż w liściach
typu dzikiego [38].
Wyniki bad ań podw ażające zaangażow anie LDA, ISA1
czy ISA2 w degradację skrobi asymilacyjnej m ogłyby suge­
rować, że znaczącą rolę w procesie ro zp ad u skrobi odg ry­
wa ISA3. W stępna analiza m utan tó w z w yciszonym genem
ISA3 pokazuje, że zaw artość skrobi jest u nich w yższa niż
w liściach typu dzikiego, co potw ierdza udział ISA3 w h y ­
drolizie nocą w iązań a - l,6 glikozydowych. M ożliwe jest, że
istnieje inny, niezidentyfikow any do tej pory enzym , który
bierze udział w tym etapie rozkładu skrobi, jednak do tej
pory nie m a żadnych d o w o d ów potwierdzających to przy­
puszczenie.
O statnio przep ro w ad zo n e badania, a głównie po p raw ie­
nie czułości detekcji p-m altozy, pozw alają przypuszczać, że
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
77
(3-amylaza m oże działać na pow ierzchni granul uwalniając
cząsteczki m altozy [34], Po tym odkryciu zaczęto się zasta­
nawiać, czy m oże ona współdziałać z enzym em usuw ającym
rozgałęzienia. W tedy degradacja pow ierzchni ziaren skrobi
przez p-am ylazę mogłaby postępow ać bez ograniczeń w y ­
nikających z w ystępow ania w iązań a - l ,6 glikozydowych.
A nalizow ano do tego celu m utanty isa3, Ida i podw ójne m u ­
tanty isa3/lda z w yciszonymi genam i zarów no isoam ylazy
3, jak i pullulanazy. Potw ierdzono zaangażow anie ISA3
w degradację powierzchni ziaren skrobi. M utanty miały
zredukow ane tem po degradacji skrobi. Z aproponow ano
nowy, b ardzo uproszczony m odel jej degradacji polegający
na tym, że na pow ierzchnię ziaren miałyby działać w sp ó l­
nie (3-amylaza i ISA3 [34]. Produktem ich działania byłyby
m altoza i liniowe glukany (Ryc. 2). Zaobserw ow ano także
w zrost ilości a -a m y la z y w m utantach isa3 i podw ójnych
m utantach isa3/lda, co może sugerow ać próbę rekom pensacji braku ISA3 przez działanie a-am y lazy , jednak w yjaśnie­
nie tego zjawiska w ym aga w nikliw szych b adań [34].
D E G R A D A C JA SKROBI JAKO O D PO W IE D Ź
N A STRESY ŚR O D O W ISK O W E
W yniki b ad ań prow adzonych nad rolą fosforylazy skro­
biowej w skazują, że wyciszenie aktyw ności genu kodujące­
go ten enzym nie pow oduje znaczących zm ian w akumulacji
skrobi w ciągu dnia i jej degradacji w nocy. Zaobserw ow ano
jednak, że m utanty z nieaktyw nym genem plastydowej fo­
sforylazy skrobiowej (phsl) są w rażliw sze na stres w o dn y i
zasolenia. W skazuje to na to, że fosforylaza skrobiowa, p o ­
w odując fosforolityczny rozkład skrobi i dostarczając su b ­
stratów do m etabolizm u chloroplastu, m ogłaby odgryw ać
w ażną rolę w tolerancji stresów abiotycznych [2]. Wyniki
ostatnio prow adzonych bad ań wskazują rów nież na znacz­
ną rolę fosforolitycznego rozkładu skrobi w w arunkach
sprzyjających fotooddychaniu, jako uzupełnienie norm alnie
przebiegającej hydrolizy skrobi z udziałem p-am ylazy [39].
M utanty phsl w ystaw ione na działanie stresu prezentow ały
zm iany fenotypow e liści oraz akum ulację skrobi. Sugerow a­
no, że niezdolność m utantów do degradacji skrobi przez fosforylazę skrobiow ą w określonych w arunkach środow iska
skutkuje tw orzeniem się uszkodzeń na blaszkach liściowych
i w konsekwencji śmiercią komórek. Z aobserw ow ano także,
że zm iany te pojawiają się tylko na dojrzałych liściach, a li­
ście dojrzewające już podczas działania czynników streso­
w ych nie w ykazują już tak daleko posuniętych modyfikacji,
co w skazuje na to, że chloroplastow a fosforylaza skrobi bie­
rze udział w szybkiej odpow iedzi na nagłe środow iskow e
zm iany, a także w procesie aklimatyzacji do zm ieniających
się w aru n k ó w środow iskow ych [2].
P-am ylaza poza kluczow ą rolą w degradacji skrobi p o d ­
czas nocy bierze także praw dopodobnie udział w odpow ie­
dzi na szok tem peraturow y. W ykazano, że w p rzy p ad k u
stresu spow odow anego niską tem peraturą in dukow ana jest
ekspresja jednego z izoenzym ów p-am ylazy - BMY8, a w
p rzy p ad k u stresu spow odow anego w ysoką tem peratura
w zrasta poziom białka kodow anego przez BMY7. Indukcja
ekspresji p-am ylazy zw iązana jest praw dopodobnie z rolą,
jaką pełnią jej produkty hydrolizy, czyli cząsteczki m alto­
zy. Przypuszczalnym zadaniem zakum ulow anej w stromie
chloroplastu podczas stresu tem peraturow ego m altozy jest
78
ochrona białek strom y i błon tylakoidów biorących udział w
fotosyntetycznym łańcuchu tran sp o rtu elektronów [40].
M A LT O Z A JAKO GŁÓ W NY P R O D U K T D E G R A D A C JI
SKROBI OPUSZCZAJĄCY C H LOROPLASTY
M altoza uw alniana przez p -am y lazę i tran sp o rto w an a z
chloroplastów podczas nocy w ystępuje w formie anom eru
p. Ponadto, obserw ow any jest gradient stężenia p-m altozy
pom iędzy chloroplastem i cytosolem [41], O statnio pojawiły
się dow o d y na to, że m altoza p ro d u k o w a n a podczas deg ra­
dacji skrobi nie jest m etabolizow ana w ew nątrz chloropla­
stów, ale jest transportow ana do cytosolu przez specyficzny
przenośnik m altozy (MEX1) [33]. W yciszenie genu kodują­
cego ten przenośnik pow oduje, że w zrost roślin jest silnie
ograniczony, a liście w ykazują zm niejszoną zaw artość chlo­
rofilu. Mutacje w genie MEX1 p ro w ad zą do akum ulacji m al­
tozy w liściach Arabidopsis, a jej poziom w zrasta 40-krotnie
w poró w nan iu z liśćmi ty p u dzikiego. Ilość m altozy spada
podczas dnia, a w zrasta w ciągu nocy, co jest sp ow odow ane
niem ożnością eksportu maltozy, produkow anej podczas p~
am ylolitycznego rozp ad u skrobi w nocy. U m u tan tó w mexl
obserwuje się podw yższony poziom skrobi asymilacyjnej, a
tem po jej degradacji, jak i syntezy jest ograniczone [33],
P-amylolityczna degradacja glukanów pow oduje p o ­
w staw anie niewielkiej ilości m altotrioz ze w zg lęd u na m oż­
liwość działania p-am ylazy tylko na łańcuchy składające
się z więcej niż trzech reszt glukozy [42], Jedynym znanym
enzym em k o dow anym w genom ie Arabidopsis zdolnym
do m etabolizm u m altotrioz jest enzym dysproporcjonow ania, a -l,4 glukanotransferaza (D-enzym, DPE1). Enzym
ten m oże w ykorzystać dw ie cząsteczki m altotriozy w celu
w ytw orzenia m altopentozy i uw olnienia jednej cząsteczki
glukozy (Ryc. 1).
Dow ód potw ierdzający zaangażow anie tego enzym u w
m etabolizm m altotrioz podczas degradacji skrobi otrzym a­
no na podstaw ie w yników bad ań nad m utantam i z w yci­
szonym genem DPE1. W ykazują one zredu k o w an y poziom
degradacji skrobi i zw iększoną akum ulację m altotrioz w
nocy w ilościach dużo w yższych niż w liścich typu dzikiego
[43], Sugeruje się, że w liściach typu dzikiego m altopentoza,
która pow staje w w yniku działania DPE1 podlega h y d ro ­
lizie przez p-am ylazę. Z kolei glukoza, drugi p ro d u k t tej
reakcji, eksportow ana jest do cytosolu przez specyficzny
przenośnik glukozy zlokalizow any w w ew nętrznej błonie
chloroplastu [44].
W przy p ad k u braku białka MEX1, czyli transportera
głów nego p ro d u k tu degradacji - m altozy, jej eksport z chlo­
roplastu jest niem ożliwy, ale eksport glukozy powstałej w
w yniku działalności DPE1 nadal się odbyw a. U podw ójnych
m u tantów dpel/mexl ani m altoza, ani glukoza nie m oże
opuścić chloroplastu ze w zględu na zablokow anie eksportu
i braku m etabolizm u maltotrioz. Oba p ro d u k ty działalności
P-am ylazy są więc a kum ulow ane w chloroplastach. M u tan ­
ty w ykazują silnie zredukow ane tem po w zrostu i obniżoną
zaw artość chlorofilu w liściach, co m oże być spow odow ane
m iędzy innym i brakiem syntezy sacharozy podczas nocy
czy też akum ulacją maltozy, która m oże w pływ ać p o śred ­
nio na funkcjonow anie a p aratu fotosyntetycznego poprzez
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
w yw oływ anie stresu chemicznego lub osmotycznego w e­
w nątrz chloroplastu. Alternatywnie, m altoza m oże działać
jako m olekuła sygnalna, która może tłumić ekspresję p o d ­
staw ow ych genów biorących udział w fotosyntetycznej asy­
milacji węgla. Jeśli to jest praw d ziw a rola maltozy, to dzien­
ne zm iany jej stężenia mogą być w ażne w procesie sygna­
lizacyjnym, pow odującym asymilację dw u tlenk u węgla w
ciągu dnia, a degradację skrobi podczas nocy [45].
M ETABOLIZM MALTOZY W C YTOSOLU
Zdaw ało by się, że m altoza w cytosolu podlega h yd ro ­
lizie przez a-glukozydazę, a następnie jest przem ieniana
w glukozo-6-fosforan przez heksokinazę. W szystko jednak
w skazuje na to, że nie jest to przem iana odbywająca się w
liściach Arabidopsis (Ryc. 3). M altoza jest m etabolizow ana w
reakcji transglukozylacji, a dow ody na to pochodzą z badań
n ad m utantam i z w yciszonym genem transglukozydazy
(DPE2). D-enzym jest strukturalnie podobny do amylomaltazy [46], która jest zaangażow ana w m etabolizm m altozy
u bakterii. Liście m utantów ze zniesioną aktyw nością DPE2
nie mają możliwości, jak liście typu dzikiego przenoszenia
jednej reszty glukozy z m altozy na rozgałęziony, cytosolow y heteroglukan i uw alnianie drugiej [47], M utanty te mają
fenotyp zbliżony do m utantów mexl. Poziom maltozy jest u
nich kilkakrotnie w yższy w porów naniu do roślin typu dzi­
kiego, obserw ow ane jest rów nież zaham ow anie degradacji
skrobi [47,48], Pozw ala to przypuszczać, że udział DPE2 w
m etabolizm ie m altozy jest głów ną ścieżką działającą na eks­
portow ane do cytosolu cząsteczki maltozy. P raw d op o d o b­
ne jest, że cząsteczka glukozy uw olniona z m altozy przez
DPE2 do cytoplazm y jest przem ieniana do heksozofosforanu przez heksokinazę. Losy drugiej cząsteczki glukozy
zostały niedaw no w yjaśnione [49]. Jest ona przenoszona na
cytosolowy, złożony z różnych m onosacharydów w ęglow o­
dan (w jego skłąd w chodzą głównie: arabinoza, galaktoza i
glukoza, połączone w iązaniam i glikozydowym i). Cytosolo­
wy heteroglukan jest substratem dla wielu enzym ów , które
uwalniają z niego cząsteczki m onosacharydów , disacharydów , b ądź ich pochodne. D obrze udo k um en to w ana jest
rola cytosolowej izoformy fosforylazy skrobiowej (PHS2)
w rozkładzie tego polisacharydu, która posiada podobnie
jak DPE2 zdolność w ykorzystyw ania heteroglukanu jako
substratu do dw ukierunkow ej reakcji przenoszenia reszt
glukozow ych [49], Powstałe w w yniku degradacji skrobi
cząsteczki glukozo-l-fosforanu w chodzą w cykl przem ian
kom órkowych. P rzem iany m ogą prow adzić do w ytw orze­
nia cząsteczek UDP-glukozy, a następnie zsyntetyzow ania z
nich sacharozy, która jest dostarczana do tkanek i organów
R y cin a 3. S ch em at p rzedsta w iający p rze m ia n y m a lto z y w cy to p la z m ie. O p is w tekście. Gic - glu k oza; G lc-6-P - g lu k o zo -6 fosforan; G lc-1-P - glu k o zo -l-fo sfo ra n ; U D P u ry d y n o d ifo sfo ra n ; Frc-6-P- fru k tozo-6 fosforan; Sue- sacharoza; HXK - h ek sok in aza; PGI2 - c y to z o lo w a izoform a iz o m era zy fo sfo g lu k o z y ; PG M 2 - cy to so lo w a izoform a
fo sfo g lu k o m u ta zy ; U D P G ase - p irofosforylaza U D P -g lu k o zy; SPS - syn ta za sach arozo-6-fosforanu; SPP - fosfataza sach arozo-6-fosforan u; DPE2 - cy to so lo w a izoform a
e n z y m u d ysp rop orcjo n o w a n ia ; P H S2 - c y to so lo w a izoform a fo sfo ry la z y skrobiow ej, Scu-6-P - sa ch arozo-6- fosforan.
79
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
niefotosyntetyzujących. Z sacharozy, która jak niedaw no
stw ierdzono, rów nież na drodze endocytozy może dostać
się do kom órek heterotroficznych [50] w szeregu reakcji en­
zym atycznych mogą pow staw ać ziarna skrobi zapasowej
[51]. P rodukty rozkładu skrobi m ogą także, w chodząc w
szlak innych przem ian, dostarczyć pirogronianu będącego
głów nym substratem oddychania w ew nątrzkom órkow ego,
zachodzącego w m itochondrium [52].
REGULACJA D EG RA DA CJI SKROBI
ASYMILACYJNEJ W LIŚCIACH A. THALIANA
CYKL DOBOWY
W standardow ych w arunkach, kiedy skrobia jest synte­
tyzow ana w ciągu dnia nie zachodzi jej degradacja, bądź
zachodzi w niewielkim stopniu. Po rozpoczęciu nocy po ­
ziom degradacji skrobi w zrasta w ciągu dw óch pierw szych
godzin i następnie pozostaje na relatyw nie stałym poziomie
do jej zakończenia [52]. W efekcie nocnego rozkładu skrobi
asymilacyjnej praw ie cały jej zapas zostaje zużyty. A zatem
tem po degradacji skrobi jest uzależnione od ilości zak u ­
mulow anej w ciągu dnia skrobi i m a na celu nieprzerw ane
dostarczanie, na relatyw nie stałym poziomie, fosforanów
heksoz potrzebnych komórce. Wyjątek stanow i fotoperiod
dłuższy niż 16 godzin, kiedy to zm iany długości oświetlenia
skutkują zm ianam i w tempie biosyntezy i degradacji skrobi
[53].
FOSFORYLACJA SKROBI
Mutacje, które eliminują białko GWD lub jej dom enę
odpow iedzialną za aktywność, prow adzą do wysokiej re­
dukcji zarów no ilości fosforu zw iązanego z am ylopektyną,
jak i sam ego tem pa degradacji skrobi. Liście m utantów sexl
akum ulują skrobię w ilościach siedm iokrotnie przew yższa­
jących zaw artość skrobi w liściach roślin typu dzikiego [29].
Tłumacząc znaczenie GWD i jej zaangażow anie w proces
degradacji skrobi, w skazuje się na rolę grup fosforanowych
lub sam ych cząsteczek białka GWD, które to m ogą w pły­
wać na aktyw ność innych, nie poznanych jeszcze enzym ów ,
atakujących powierzchnię ziaren skrobi. G rupy fosforano­
we m ogą w pływ ać na upakow anie polim erów glukozy w e­
w nątrz am ylopektyny, zwiększając pow ierzchnię pom iędzy
łańcucham i i zmniejszając ich hydrofobowość. Przypuszcza
się, że zarów no GWD, jak i PWD poprzez współdziałanie,
tworząc ufosforylow aną am ylopektynę w pozycjach od p o ­
w iednio C6 i C3 reszt glukozy, udostępniają pow ierzchnię
granul dla innych enzym ów i przez to regulują tem po d e­
gradacji skrobi [24,27], Poznanie dokładnego m echanizm u
działania GWD i PWD w ym aga jednak w ielu wnikliw ych
badań n ad budow ą i funkcją tych enzym ów , a także nad
prod u k tam i ich działania.
REGULACJA EKSPRESJI I AKTYWNOŚCI ENZYMÓW
UCZESTNICZĄCYCH W ROZKŁADZIE SKROBI
Sposoby, a raczej kom pleksow e m echanizm y, dzięki któ­
rym roślina włącza i kontroluje ścieżkę degradacji skrobi nie
są do końca poznane, ale dzięki postępującym badaniom
regulacja tego procesu jest stopniow o wyjaśniana. O dkry­
cie, że transkrypty kilku enzym ów potencjalnie biorących
udział w degradacji skrobi pojawiają się w ścisłych dzien­
nych cyklach i po d okołodobow ą kontrolą, pozw ala sądzić,
że kontrola procesu odbyw a się na poziom ie transkrypcyjnym. T ranskrypty niektórych genów , kodujących enzym y
biorące udział w degradacji skrobi, zaczynają zwiększać
swój poziom już przed końcem dnia. Poziom tych transkryptów spada pow oli podczas nocy, utrzym uje niski p o ­
ziom w pierw szych godzinach światła, a osiąga szczyt m ię­
dzy 4 a 8 godziną dnia [38,54], O bserw ow any jest jednak
brak korelacji pom iędzy poziom em tych transkryptów , a
ilością kodow anych przez nie enzym ów zaangażow anych
w rozkład skrobi. Dotychczas nie m a żadnego d o w o d u na
to, że ilość jakiegokolw iek enzym u obecnego w liściach Ara­
bidopsis i niezbędnego podczas degradacji skrobi zmienia
się w cyklu dziennym , i że jest to skorelow ane z jego rolą w
kontroli tego procesu. Dla kilku kluczow ych enzym ów ze
ścisłymi dziennym i zm ianam i transkryptów , bardzo mało
jest zm ian w ilości białka enzym u, co sugeruje, że kontrola
degradacji skrobi odbyw a się w głównej m ierze na pozio­
mie potranslacyjnej modyfikacji aktyw ności enzym ów lub
przy udziale białek regulatorow ych [54].
Fosforylacja białek. Stosunkow o now o po zn an y m m echa­
nizm em , biorącym udział w kontroli aktyw ności enzym ów
uczestniczących w rozkładzie skrobi, jest odw racalna fosfo­
rylacja białek. W ostatnim czasie, badania dostarczają coraz
więcej dow od ó w wskazujących na faktyczne zaang ażo w a­
nie tego m echanizm u w regulację procesu. W w yizolow a­
nych z endosperm u pszenicy am yloplastach zidentyfikow a­
no pew ną liczbę fosfoprotein, a w śród nich także te uczest­
niczące w m etabolizm ie skrobi, głów nie biosyntezie am y­
lopektyny, co m oże w skazyw ać, że pew ne jej etapy mogą
być kontrolow ane poprzez fosforylację białek [55], O statnie
w yniki b ad ań n ad m utantam i sex4 w skazują na to, że k o n­
trola procesu degradacji jest rów nież sp raw o w ana przez fo­
sforylację białek. O dkryto, że mutacje w sex4 spow odow ane
są przez gen kodujący białkow ą fosfatazę [56], M utanty sex4
w standardow ych w arunkach w zrostu akum ulują trzykrot­
nie więcej skrobi w porów naniu do roślin typu dzikiego, ze
w zględu na niskie tem po degradacji skrobi w ciągu nocy
[32,52]. Ilość chloroplastowej a -a m y la z y - AMY3 jest u tych
m utantów zred uk o w an a [52]. Jednak AMY3 nie jest k odo­
w ana w locus sex4, a m utanty z brakiem AMY3 posiadają
norm alne tem po degradacji skrobi. W zw iązku z tym, jest
mało praw dopodobne, że spadek degradacji skrobi u m u ­
tantów sex4 jest skutkiem zredukow anej ilości AMY3 [23].
C hloroplastow a lokalizacja białka SEX4, pow inow actw o
do glukanu oraz fenotyp o zwiększonej ilość skrobi w p o ­
rów naniu do roślin ty pu dzikiego, u m utan tó w z w yciszo­
nym genem sex4 w skazują na to, że białko SEX4 w iąże się
ze skrobią w w arunkach in vivo i jest potrzebne d o jej p ra ­
w idłow ego m etabolizm u. SEX4 w ykazuje d użą hom ologię
z ssaczym białkiem laforyną, które jest konieczne do p ra ­
w idłow ego m etabolizm u glikogenu. Laforyna defosforyluje
i aktyw uje kinazę 3 syntazy glikogenu, która z kolei fosforyluje i inaktyw uje syntazę glikogenu [56], W p rz y p a d k u w y ­
stąpienia mutacji genu laforyny obserw uje się zaburzenia
chorobowe, polegające między innym i na grom adzeniu się
w cytoplazm ie nierozpuszczalnego polisacharydu [57], O d ­
kryto, że genom Arabidopsis koduje 10 hom ologów kinazy
3 syntazy glikogenu, z czego przynajmniej jedna jest zloka­
lizow ana w chloroplastach i to ona m ogłaby być celem dla
białka SEX4, ale potw ierdzenie tej hipotezy w y m ag a jeszcze
80
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
wielu badań [56], Laforyna posiada na N-końcu unikalną
dla enzym ów w yizolow anych ze zw ierząt dom enę w ią­
żącą w ęglow odany (CBM ang. carbohydrate-binding modu­
le). Ostatnio stw ierdzono, że enzym ten oprócz glikogenu
może w ykorzystyw ać jako substart w reakcji defosforylacji
inne polisacharydy, np.: am ylopektynę [57], W zw iązku z
pow yższym SEX4 mogłoby kontrolow ać degradację skrobi
na dw a sposoby. Pierwsza m ożliwość polegać m oże na u su ­
w aniu reszt ortofosforanow ych z am ylopektyny (pow sta­
łych na skutek działalności GW D i PWD). Efektem defosfo­
rylacji am ylopektyny jest zm iana jej stopnia upakow ania i
hydrofilności, co m a znaczenie dla możliwości przyłączenia
się i aktyw ności enzym ów amylolitycznych. Z kolei innym
sposobem kontroli degradacji skrobi przez białko SEX4, m o­
głoby być w pływ anie poprzez defosforylację na aktywność
enzym u lub enzym ów bezpośrednio lub pośrednio zw iąza­
nych z tym procesem. Taki m odel regulacji jest dobrze po­
znany w p rzy pad k u m etabolizm u glikogenu, natom iast dla
przem ian skrobi w roślinach teoria ta w ym aga weryfikacji i
dalszych badań w przyszłości.
Podobną rolę jak białku SEX4 przypisuje się roślinnej po­
dw ójnie specyficznej fosfatazie DSP, która wiąże się z ziar­
nam i skrobi, a zlokalizow ana została w chloroplastach. Po­
ziom transkryptu DSP silnie skorelow any jest z poziom em
transkryptów enzym ów zw iązanych z degradacją skrobi.
Sugeruje się, że białko to m oże regulow ać tem po degradacji
skrobi poprzez odw racalną fosforylację. Także to białko, ze
w zględu na dom enę wiążącą w ęglow odany, w ykazuje p o ­
dobieństw o do ludzkiego białka laforyny [58],
Potencjał redoks. Potencjał redoks zdaje się pełnić znaczą­
cą rolę w regulacji rozkładu skrobi. M ożna by podejrzewać,
że kontrola procesu degradacji odbyw a się także poprzez
utlenianie lub redukcję kluczow ych dla procesu enzym ów .
Redukcja grup sulfhydrylow ych odbyw a się z udziałem
tioredoksyny, która up rzed nio zostaje zredukow ana przez
elektrony w ybite z fotosystem u I, a przeniesione przez ferrodoksynę. Tioredoksyna jest w ażnym regulatorem zaw ie­
rającym sąsiadujące ze sobą reszty cysteiny, których grupy
hydrosulfidow e m ogą ulegać odw racalnie utlenieniu. Zre­
d u kow ana forma tioredoksyny dom inuje w świetle i może
stym ulow ać aktyw ność w ielu enzym ów w w yniku redukcji
ich m ostków dw usiarczkow ych. Sugeruje się, że niektóre
enzym y degradujące skrobię m ogą być aktyw ow ane przez
utlenianie. W dzień redukcja g ru p sulfhydrylow ych m ogła­
by zapobiegać degradacji syntetyzow anej skrobi [16].
Wiele enzym ów w spółdziałających z tioredoksyną zosta­
ło niedaw no odkrytych, włączając p-am ylazę i pullulanazę
z liści szpinaku [13]. P row adzone badania nad GWD suge­
rują, że aktywność tego en zy m u jest także kontrolow ana
p o przez zm ianę potencjału redoks [16,59]. Utlenienie GWD
wyw ołuje inaktywację enzym u i form ow anie się m ostków
dw usiarczkow ych, które m ogą być następnie redukow ane
p rzez tioredoksynę, co p rzyw raca aktyw ność białka [59],
N ajnow sze w yniki badań prezentują p -am ylazę (BMY7/
TR-BAMY) obecną w piasty dach Arabidopsis, której ak­
tyw ność jest ściśle regulow ana przez potencjał redoks [60],
Indukcję ekspresji i pojawienie się aktyw nego enzym u ob­
serw uje się w w arunkach stresu abiotycznego, co sugeruje,
że TR-BAMY mogłoby brać u d ział w regulow anej potencja­
łem redoks ścieżce degradacji skrobi zachodzącej podczas
oświetlenia [60].
Wpływ pH i stężenia maltooligosacharydów. Stężenie jonów
w odorow ych m oże odgryw ać rolę w regulacji procesu p o ­
przez oddziaływ anie na aktyw ność enzym ów degradują­
cych skrobię, np. poprzez ich przekształcenia konformacyjne. O dczyn pH podlega zm ianom w chloroplastach podczas
przejścia ze światła do ciemności. Stroma chloroplastów
zm ienia pH ze słabo alkalicznego do obojętnego, co może
prom ow ać aktyw ność niektórych enzym ów degradujących,
ale m ało p raw d op o d ob n e jest, aby zm iany pH mogły bez­
pośrednio inicjować degradację, czy też kontrolować prze­
bieg tego procesu [16].
Poziom m altooligosacharydów ham uje tem po degrad a­
cji skrobi poprzez w spółzaw odniczącą inhibicję enzym ów
w ykorzystujących skrobię jako substrat [42,61] lub poprzez
w ystępow anie w bliskości ziaren uniem ożliw iać przez to
ich degradację. Pozw ala to na dostosow anie tem pa degra­
dacji skrobi do aktualnego zapotrzebow ania rośliny na jej
produkty.
P O D S U M O W A N IE
W pełnym zrozum ieniu procesu degradacji ziaren skrobi
prow adzącego od skrobi do fosforanów heksoz pozosta­
je jeszcze wiele znaków zapytania. W pierwszej kolejności
należy w ziąć pod uw agę fakt, że najlepiej poznany do tej
pory m odel rozkładu skrobi w chloroplastach A. thaliana
m oże różnić się od procesów zachodzących w liściach, czy
też w organach grom adzących skrobię zapasow ą innych ga­
tunków roślin. Różnice te m ogą wynikać głównie z różne­
go składu izoenzym atycznego zaangażow anych w rozkład
skrobi enzym ów oraz z charakteru organu, w którym ten
proces się odbyw a. G łów nym enzym em odpow iedzialnym
za proces rozkładu skrobi w chloroplastach A. thaliana jest
P-amylaza, a p ro d u k t jej działania, p-maltoza, transporto­
w ana jest do cytoplazm y gdzie ulega dalszym przem ianom .
Słabo poznany jest, jak do tej pory, sposób regulacji procesu
mobilizacji skrobi asymilacyjnej. W ostatnim czasie zespoły
badaczy z całego św iata donoszą o odkryciach, które w ska­
zują na ogrom ną złożoność i precyzję kontrolujących ten
proces m echanizm ów . Wiele w skazuje na to, że kluczową
rolę w procesie inicjacji degradacji skrobi odgryw ają enzy­
m y fosforylujące skrobię, czy to przez zm ianę właściwości
stru k tu ry ziaren skrobi, czy też przez stw orzenie m ożliw o­
ści do pow stania wielobiałkow ego kom pleksu, który roz­
poczyna hydrolizę ziarna skrobi. Szybkość samego procesu
degradacji w ydaje się być z kolei regulow ana poprzez m o­
dyfikacje potranslacyjne poszczególnych enzym ów am ylo­
litycznych. O dbyw a się to głównie poprzez fosforylację bia­
łek oraz dzięki zm ianie potencjału redoks, zachodzących w
cyklu dobow ym lub pod w pływ em abiotycznych stresów.
PIŚM IE N N IC T W O
1. Lloyd JR, K ossm ann J, Ritte G (2005) Leaf starch degradation comes
out of the shadows. T rends Plant Sci 10:130-137
2. Zeem an SC, Smith SM, Sm ith AM (2004) The breakdow n of starch in
leaves. N ew Phytol 163: 247-261
81
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
3. Zeem an SC, Tiessen A, Pikling E, Kato KL, Donald AM, Smith AM
(2002) Starch synthesis in Arabidopsis. G ranule synthesis, composition,
and structure. Plant Physiol 129: 516-529
27. Ritte G, H eydenreich M, M ahlow S, Haebel S, Kotting O, Steup M
(2006) Phosphorylation of C6- and C3-positions of glucosyl residues in
starch is catalysed by distinct dikinases. FEBS Lett 580:4872-4876
4. Smith AM, Denyer K, M artin C (1997) The synthesis of the starch gran­
ule. A nnu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 67-87
28. Ritte G, Lorberth R, Steup M (2000) Reversible binding of the starchrelated R1 protein to the surface of transitory starch granule. Plant J 21:
387-391
5. Ball SG, van de Wal MHBJ, Visser RGF (1998) Progress in u nderstand­
ing the biosynthesis of amylose. Trends Plant Sci 12: 462-467
6. M yers AM, Morel MK, James MG, Ball SG (2000) Recent progress
tow ard understanding biosynthesis of the am ylopectin crystal. Plant
Physiol 122: 989-997
7. Verm eylen R, Goderis B, Reynaers H, Delcour JA (2004) Am ylopec­
tin m olecular structure reflected in m acrom olecular organization of
granular starch. Biomacromolecules 5:1775-1786
8. Tester RF, Karkalas J, Ql X (2004) Starch structure and digestibility Enzym e-Structure relationship. W orld's Poultry Science Journal 60:186195
9. M artin C, Smith AM (1995) Starch biosynthesis. Plant Cell 7: 971-985
10. James MG, Denyer K, M yers AM (2003) Starch synthesis in the cereal
endosperm . C urr O pin Plant Biol 6: 215-222
11. Smith AM (2001) The biosynthesis of starch granule. Biomacromol­
ecules 2: 335-341
12. Zeem an SC, Smith SM, Sm ith AM (2002) The prim ing of am ylose syn­
thesis in A rabidopsis leaves. Plant Physiol 128:1069-1076
13. Tetlow IJ, Moreli MK, Ernes MJ (2004) Recent developm ents in undersanding the regulation of starch m etabolism in higher plants. J Exp Bot
55: 2131-2145
14. D obrzyńska UE, Orzechowski S (2004) Enzym y biorące udział w bio­
syntezie i rozkładzie skrobi w roślinach. Post N auk Roi 5: 57-70
15. Smith AM (1999) M aking starch. C urr O pin Plant Biol 2: 223-229
16. Smith AM, Zeem an SC, Smith SM (2005) Starch degradation. A nnu
Rev Plant Biol 56: 73-98
17. The Arabidopsis Genom e Initiative (2000) Analysis of the genom e se­
quence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. N ature 408: 796-814
18. Fincher GB (1989) Molecular and cellular biology associated w ith en­
dosperm m obilization in germ inating cereal grains. A nnu Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol 40: 305-346
19. Ritchie S, Sw anson SJ, Gilroy S (2000) Physiology of the aleurone layer
and starchy endosperm during grain developm ent and early seedling
growth: new insights from cell and m olecular biology. Seed Science
Research 10:193-212
20. Lovegrove A, Hooley R (2000) Gibberellin and abscisic acid signalling
in aleurone. Trends Plant Sci 5:102-110
21. Scheidig A, Frölich A, Schulze S, Lloyd JR, Kossm ann J (2002) Downregulation of a chloroplast-targeted beta-am ylase leads to a starch-ex­
cess phenotype in leaves. Plant J 30: 581-591
22. Sun Z, Duke SH, H enson CA (1995) The role of pea chloroplast [alpha]-glucosidase in transitory starch degradation. Plant Physiol 108:
211-217
23. Yu TS, Z eem an SC, Thom eycroft D, Fulton DC, D unstan H, Lue WL,
H egem ann B, Tung SY, Um emoto T, C happie A, Tsai DL, W ang SM,
Smith AM, Chen J, Smith SM (2005) alpha-am ylase is not required for
b reakdow n of transitory starch in Arabidopsis leaves. J Biol C hem 280:
9773-9779
24. Kötting O, Pusch K, Tiessen A, Geigenberger P, Steup M, Ritte G (2005)
Identyfication of a novel enzym e required for starch m etabolism in
Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, w ater dikinase. Plant Physiol
137: 242-252
25. B aunsgaard L, Lütken H, Mikkelsen R, Glaring MA, Pham TT, Blennow A (2005) A novel isoform of glucan, w ater dikinase phosphorylates pre-phosphorylated a-glucans and is involved in starch degrada­
tion in Arabidopsis. Plant J 41: 595-605
26. Mikkelsen R, Baunsgaard L, Blennow A (2004) Functional character­
ization of a-glucan, w ater dikinase, the starch phosphorylating en­
zyme. Biochem J 377: 525-532
29. Yu TS, Kofler H, H äusler RE, Hille D, Flügge UJ, Zeem an SC, Smith
AM, K ossm ann J, Lloyd J, Ritte G, Steup M, Lue WL, Chen J, W eber
A (2001) The Arabidopsis sexl m utant is defective in the R1 protein, a
general regulator of starch degradation in plants, and not in the chlo­
roplast hexose transporter. Plant Cell 13:1907-1918
30. M ikkelsen R, Suszkiewicz K, Blennow A (2006) A now el type carbohydrate-binding m odule identified in a-glucan, w ater dikinases is
specific for regulated plastidial starch metabolism . Biochem 45: 46744682
31. Lin TP, Caspar T, Somerville C, Preiss J (1988) A starch deficient m u ­
tant of Arabidopsis thaliana w ith low ADP glucose pyrophosphorylase
activity lacks one of the tw o subunits of the enzym e. Plant Physiol 88:
1175-1181
32. Zeem an SC, N orthrop F, Smith AM, Rees T (1998) A starch- accum u­
lating m utant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch
hydrolyzing enzym e. Plant J 15:357-365
33. Niittylä T, Messerli G, Trevisan M, Chen J, Sm ith AM, Z eem an SC
(2004) A previously unknow n m altose transporter essential for starch
degradation in leaves. Science 303: 87-89
34. Delatte T, U m hang M, Trevisan M, Eicke S, T hom eycroft D, Sm ith SM,
Zeem an SC (2006) Evidence for distinct m echanism s of starch granule
breakdow n in plants. J Biol Chem 281:12050-12059
35. Zeem an SC, Um em oto T, Lue WL, Au-Yeung P, M artin C, Sm ith AM,
Chen J (1998) A m utant of Arabidopsis lacking a chloroplastic isoam y­
lase accum ulates both starch and phytoglycogen. Plant Cell 10:16991712
36. Bustos R, Fahy B, H ylton CM, Seale R, N ebane NM, E dw ards A, M ar­
tin C, Smith AM (2004) Starch granule initiation is controlled by a heterom ultim eric isoamylase in potato tubers. P N A S 101: 2215-2220
37. H ussain H, M ant A, Seale R, Zeem an SC, Hinchliffe E, E dw ards A,
Hylton C, Bom em ann S, Smith AM, M artin C, Bustos R (2003) Three
isoforms of isoamylase contribute different catalytic properties for the
debranching of potato glucans. Plant Cell 15:133-149
38. Lu Y, G ehan JP, Sharkey TD (2005) Daylength and circadian effects on
starch degradation and m altose m etabolism . Plant Physiol 138: 22802291
39. Weise SE, Schrader SM, Kleinbeck KR, Sharkey TD (2006) C arbon bal­
ance and circadian regulation of hydrolytic and phosphorolytic break­
dow n of transitory starch. Plant Physiol 141: 879-886
40. Kaplan F, G uy Ch (2004) ß-am ylase induction and the protective role
of maltose during tem perature shock. Plant Physiol 135:1674-1684
41. Weise SE, Kim KS, Stewart SP, Sharkey TD (2005) ß-m altose is the
m etabolically active anom er of m altose d uring transitory starch deg­
radation. Plant Physiol 137: 756-761
42. Lizotte PA, H enson CA, Duke SH (1990) Purification and characteriza­
tion of pea epicotyl ß-am ylase. Plant Physiol 92: 615-621
43. Critchley JH, Zeem an SC, Takaha T, Smith AM, Sm ith SM (2001) A
critical role for disproportionating enzym e in starch breakdow n is re­
vealed by a knock-out m utant in Arabidopsis. Plant J 26: 89-100
44. W eber A, Servaites JC, Geiger DR, Kofler H, Hille D, G röner F, Hebbeker U, Flügge U (2000) Identification, purification and m olecular
cloning of a putative plastidic glucose translocator. Plant Cell 12: 787801
45. Pomocniczy m aterial Science Online: Niittylä T, Messerli G, Trevisan
M, Chen J, Smith AM, Zeem an SC (2004) A previously unknow n m alt­
ose transporter essential for starch degradation in leaves. Science 303:
87-89
46. Boos W, Shum an H (1998) M alto se/m altodextrin system of Escherichia
coli: transport, m etabolism, and regulation. Microbiol Mol Biol Rev 62:
204-229
82
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
47. Chía T, Tchom eycroft D, Chappie A, Messerli G, Chen J, Zeem an SC,
Smith SM, Smith AM (2004) A cytosolic glucosyltransferase is required
for conversion of starch to sucrose in Arabidopsis leaves at night. Plant
J 37: 853-863
48. Lu J, Sharkey TD (2004) The role of am ylom altase in m altose m etabo­
lism in the cytosol of photosynthetic cells. Planta 218: 466-473
49. Fettke J, Chia T, Eckerm ann N, Sm ith A, Steup M (2006) A transglucosidase necessary for starch degradation and m altose m etabolism in
leaves at night acts on cytosolic heteroglycans (SHG). Plant J 46: 668684
50. Baroja-Femandez E, Etxeberria E, M uñoz FJ, M orán-Zorzano MT,
Alonso-Casajús N, Gonzalez P, Pozueta-Rom ero J (2006) A n im portant
pool of sucrose linked to starch biosynthesis is taken u p by endocytosis in heterotrophic cells. Plant Cell Physiol 47: 447-456
51. M uñoz FJ, M oran Zorzano MT, Alonso-Casajús N, Baroja-Femández
E, Etxeberria E, Pozueta-Rom ero J (2006) N ew enzym es, new pathw ays
and an alternative view on starch biosynthesis in both photosynthetic
and heterotrophic tissues of plants. Biocatalysis and B iotransform ation
24: 63-76
52. Zeem an SC, Rees T (1999) Changes in carbohydrate m etabolism and
assimilate export in starch-excess m utants of Arabidopsis. Plant Cell
Env 22:1445-1453
53. Gibon Y, Balsing OE, Palacios-Rojas N, Pankovic D, H endriks JHM,
Fisahn J, H ohne M, G ünther M, Stitt M (2004) A djustm ent of dium al
starch turnover to short days: depletion of sugar during the night leads
to a tem porary inhibition of carbohydrate utilization, accum ulation of
sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the following light period. Plant J 39: 847-862
54. Smith SM, Fulton DC, Chia T, Thom eycroft D, C happie A, D unstan H,
H ylton C, Zeem an SC, Smith AM (2004) Diurnal changes in the tran-
scriptom e encoding enzym es of starch m etabolism provide evidence
for both transcriptional and posttranscriptional regulation of starch
m etabolism in Arabidopsis leaves. Plant Physiol 136:2687-2699
55. Tetlow IJ, W ait R, Lu Z, A kkasaeng R, Bowsher CG, Esposito S, Kosar-Hashem i B, Morell MK, Ernes MJ (2004b) Protein phosphorylation
in am yloplasts regulates starch branching enzym e activity and protein-protein interactions. Plant Cell 16: 694-708
56. Niittyla T, Com parot-M oss S, Lue WL, Messerli G, Trevisan M, Sey­
m our MDJ, Gatehouse JA, Villadsen D, Smith SM, Chen J, Zeem an SC,
Smith AM (2006) Similar protein phosphatases control starch m etabo­
lism in plant and glycogen m etabolism in m am m als. J Biol Chem 281:
11815-11818
57. W orby CA, Gentry MS, Dixon JE (2006) Laforin: a dual specific­
ity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. J Biol
Chem 281: 30412-30418
58. Kerk D, Conley TR, Rodriguez FA, Tran HT, Nim ick M, M uench D,
M oorhead GB (2006) A chloroplast-localized dual-specificity protein
phosphatase in Arabidopsis contains a phylogenetically dispersed and
ancient carbohydrate-binding dom ain, w hich binds the polysaccha­
ride starch. Plant J 46: 400-413
59. Mikkelsen R, M utenda KE, M ant A, Schurm ann P, Blennow A (2005)
a-glucan, w ater dikinase (GWD): A plastidic enzym e w ith redox-reg­
ulated and coordinated catalytic activity and binding affinity. PNAS
102:1785-1790
60. Sparla F, Costa A, Lo Schiavo F, Pupillo P, Trost P (2006) Redox regula­
tion of a novel plastid-targeted p-am ylase of Arabidopsis tlwliana. Plant
Physiol 141: 840-850
61. W itt W, Sauter JJ (1996) Purification and properties of the starch gran­
ule-degrading alpha-am ylase from potato tubers. J Exp Bot 47: 17891795
N ew look at starch degradation in Arabidopsis thaliana L. chloroplasts
D orota S am ojed n y , S ła w o m ir O r ze c h o w sk i
D epartm ent of Biochem istry, Faculty of A griculture and Biology, W arsaw A griculture U niversity, 159 N ow oursynow ska St., B uilding 37, 02-776
W arsaw , Poland
e-mail: slaw om ir_orzechow ski@ sggw .pl
Key words: am ylase, Arabidopsis, chloroplast, m altose, starch degradation
A BSTRACT
Transitory starch is accumulated during the day and is the main source of energy for the cell m etabolism during the night. The observed pe­
riodical starch degradation has becom e a m odel often used by scientist in their experiments. Starch granule degradation could be divided into
2 periods: initiation of degradation and digestion of amylopectin and amylose into maltooligosaccharide and their derivative. Key meaning
is attributed in this process to p-am ylaze, product of its activity p-m altose is transported to the cytosole and there it subjects farthest conver­
sions. It has been demonstrated that a number of enzym es take part in the starch degradation process. H owever, the w ay of regulating their
activity is still not fully explained. There is most important elem ents effecting rate of starch decomposition: day cycle, starch phosphorylation
and regulation of enzym e activity. It proceeds through redox potential, pH changes and phosphorylation of protein involved in starch degra­
dation due specific phosphatases. The purpose of the current work is to systematize the kn ow led ge of the Arabidopsis thaliana L. leaf starch
degradation. The results of the recent research cast a new light on the starch degradation process as w ell as on its control.
83
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
Różnorodność i regulacja kanałów w o d n y ch w św iecie roślin
STRESZCZENIE
P a w eł M a teu sz M ordaka
G rażyna D ą b r o w sk a
Z akład G enetyki, Instytut Biologii Ogólnej i
M olekularnej, W ydział Biologii i N auk o Ziem i,
U niw ersytet Mikołaja K opernika w Toruniu,
T oruń
Z akład Genetyki, Instytut Biologii Ogólnej
i M olekularnej, W ydział Biologii i N a u k o
Ziemi, U niw ersytet Mikołaja K opernika w
T oruniu, ul. G agarina 9, 87-100 T oruń; e-mail:
brow sk@ uni.torun.pl, tel.: (056) 611 45 76, faks:
(056) 611 47 72
A rtykuł otrzym ano 18 w rześnia 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 27 listopada 2006 r.
Słow a k luczow e: transport w ody, kanał błono­
w y, akw aporyny, stres abiotyczny
W ykaz skrótów : AB A - kw as abscysynow y;
A D H (ang. antidiuretic hormone) - w azopresyna, ho rm o n antydiuretyczny; AQ P (ang.
aquaporin) - akw aporyna; cAMP - cykliczny
adenozyno-5'-trifosforan; CDPK (ang. calciumdependent protein kinase) - kinaza zależna od
jonów w apnia; M1P (ang. membrane integral
protein) - integralne białko błonow e; N IP (ang.
nodulin26-like intrinsic proteins) - akw aporyna
hom ologiczna do białka N odulin26; PIP (ang.
plasma membrane intrinsic protein) - a k w apory­
na błony kom órkow ej; PK (ang. protein kinases)
- kinazy białek; PM (ang. plasma membrane)
- błona płazm atyczna; PPase (ang. protein pho­
sphatases) - fosfatazy białek; N PA (ang. asparagine-proline-alanine) - zachow any w ewolucji
m otyw reszt am inokw asow ych: asparaginaprolina-alanina; ROS (ang. reactive oxygen spe­
cies) - reaktyw ne form y tlenu; RT-PCR (ang.
reverse transcription - polymerase chain reaction)
- reakcja ampłifikacji na m atrycy cDNA; SIP
(ang. small basic intrinsic protein) - akw aporyna
o niskiej hom ologii do AQP1; TIP (ang. tonoplast intrinsic protein) - akw aporyna tonoplastu;
TM (ang. tonoplast membrane) - błona w akuoli
kom órek roślinnych, tonoplast
ntegralne białka błon ow e (MIP) są zróżnicowaną klasą białek b łonow ych, które pośredni­
czą w przep ływ ie w o d y (akwaporyny), małocząsteczkowych roztworów, takich jak glice­
rol oraz gazów poprzez b łon y kom órkowe. W ostatnich latach badania dostarczyły istotnych
informacji pozwalających na pełniejsze scharakteryzowanie u roślin tej dużej klasy białek,
kanałów wodnych. Białka MIP zidentyfikowano w w ielu organizmach zarówno jedno- jak
i w ielokom órkow ych. Akwaporyny pełnią istotna rolę w rozwoju roślin i ich adaptacji do
zm ieniającego się środow iska zewnętrznego. W pływ na ekspresję genów kodujących akw a­
poryny, w yw ierają takie czynniki jak: hormony, susza, w ysokie stężenia soli i światło. Ak­
tywność kanałów w od nych jest regulowana poprzez fosforylację i protony wewnątrzkom ór­
kow e. Przypuszcza się, że istnieją też inne m echanizmy regulacji tych białek poprzez działa­
nie gradientu ciśnienia osm otycznego i hydrostatycznego, kontrolę reaktywnych form tlenu
czy tworzenie heterotetramerów.
I
W P R O W A D Z E N IE
Życie pow stało w środow isku w o dn y m - w oda jest absolutnie niezbędna
do u trzy m an ia procesów m etabolicznych w organizm ach żywych. Zaw artość
w o d y w tkankach m oże sięgać 95% - protoplazm a zaw iera od 50% (w organel­
lach bogatych w lipidy) do 90% w ody. Soczyste owoce, miękkie liście i korzenie
zawierają aż 70 - 95% w ody. N atom iast w pozornie suchych nasionach i z a ro d ­
nikach w o d a stanow i od 10 do 15%.
W yróżnia się trzy m ożliw e drogi przepływ u w o d y w tkankach roślinnych:
apoplastyczną, sym plastyczną oraz transkom órkow ą [1]. Przenikanie w ody
p rzez półprzepuszczalne błony biologiczne - możliw e jest dzięki obecności bło­
now ych białek, ak w ap o ryn [2], Obecność akw aporyn w błonie plazmatycznej
zw iększa od 10 do 100 razy przepuszczalność cząsteczek w ody. Pojedynczy
kanał transportuje ok. 2 - 3 m iliardy cząsteczek w ody w ciągu sekundy. B ada­
nia z w ykorzystaniem zw iązków rtęci (inhibitorów akw aporyn) pozw alają na
przypuszczenia, że ak w aporyny zaangażow ane są w pobieranie do 80% w od y
w chłanianej przez korzeń [3,4],
A k w aporyny należą do bardzo starej filogenetycznie rodziny kanałów biał­
kow ych M IP (ang. Membrane Integral Proteins) [5]. Kanały w odne zidentyfiko­
w ano dotychczas p raw ie w e w szystkich typach żyw ych organizm ów : u ssaków,
kręgow ców , bezkręgow ców , roślin oraz bakterii i archebakterii [3], Specyficz­
ne ak w apo ryn y m ogą transportow ać także obok w ody inne m ałocząsteczkowe
związki: glicerol (np. glicerol facilitator GlpF E. coli, AQP3, AQP7 człowieka czy
AtNIP6;l rzodkiew nika) [6-8], m ocznik (AQP1 człowieka) [9], am oniak i jony
am onow e (AtTIP2;l i AtTIP2;3 Arabidopsis thaliana) [10], kw as borow y (AfNIP5;l
A. thaliana) [11], nadtlenek w od o ru (akw aporyna Chara corallina) [12] czy m ało­
cząsteczkow e alkohole [13], Zdolność do przepuszczania określonych zw iązków
zależna jest o d bu d o w y kanału w miejscu filtru wielkości. Zastąpienie argininy
195 i histy d yn y 180 am inokw asam i hydrofobow ym i (alaniną i w aliną) w AQP1
um ożliw iło przep ły w m ocznika przez kanał i jednocześnie nie w pływ ało na
przepuszczalność cząsteczek w ody. Z am iana fenyloalaniny 56 i histydyny 180
przez reszty alaniny zw iększa średnicę kanału i um ożliw ia przepływ glicerolu
[9], A kw ap o ry ny uczestniczą także w transporcie C 0 2 [14]
Rośliny posiadają wiele sekwencji kodujących kanały w odne, co w skazuje na
ich d u żą różnorodność. Projekt sekwencjonow ania genom u Arabidopsis thaliana
zaow ocow ał identyfikacją 38 genów kodujących akw aporyny. Trzy z nich skla­
syfikow ano jako pseudogeny (A1TIP2, A1NIP2.1 i AfNIP3.1) [15], w p rzy p ad k u
23 zaobserw ow ano ekspresję specyficzną dla tkanki i w arun k ó w środow isko­
w ych [16], U ry żu zidentyfikow ano 33 białka z rodziny akw aporyn [17], a k u ­
k u ry d za p o siad a co najmniej 31 genów kodujących kanały w odne, z czego kilka
84
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
ulega ekspresji na wysokim poziom ie [18]. Dla porów nania
w genom ie człowieka zidentyfikow ano dotychczas jedynie
13 białek rodziny MIP. Zlokalizow ano je w różnego typu
nabłonkach, śródbłonkach i w ielu innych tkankach. Pełnią
one znaczącą rolę w wielu procesach fizjologicznych i p a ­
tologicznych: m.in. w form ow aniu moczu, sekrecji płynów,
tw orzeniu i usuw aniu obrzęku m ózgu, regulacji ciśnienia,
naw ilżaniu skóry, m etabolizmie tłuszczy, angiogenezie g u ­
zów now otw orow ych i migracji kom órek [19].
Podział kanałów w odnych zależnie od rodzaju transpor­
tow anych zw iązków w ym aga szczegółowych analiz, a sam
m echanizm transportu wielofunkcyjnego nie jest do końca
poznany. Dlatego akw aporyny roślinne podzielone zostały
na p od staw ie subkom órkow ej lokalizacji kanałów i homologii na cztery rodziny (Ryc. 1) [20]:
- ak w ap o ry n y błony komórkowej PIPs (ang. Plasma memb­
rane Intrinsic Proteins) tw orzą dw ie podrodziny: PIP1 (z
w y d łu ż o n y m N -końcem białka) oraz PIP2 (z w ydłużonym
C-końcem);
- ak w apo ry n y tonoplastu TIPs (ang. Tonoplast Intrinsic Pro­
teins) podzielono na trzy podrodziny: aTIPs, [3TIPs, yTIPs, z
w yjątkiem NfTIPa, która tw orzy oddzielną grupę;
- NLMs (ang. NOD26-like MIPs) lub NIPs (ang. Nodulin26like Intrinsic Proteins) - hom ologii białka NOD26 (akwa­
poryny błony peribakteroidu Glicynę max biorącej udział
w w ym ianie m etabolitów pom iędzy gospodarzem a symbiontem), o nieustalonej sublokalizacji w innych roślinach,
przew odzące cząsteczki w o d y oraz niepolarne związki małocząsteczkow e [4];
PIP2a
RD28
MipC
PM28a
PIP3
PM28b
Pr/AQP1
MipA
MipB
PIP1 b
PIP1a
PIP1C
AQP0
AQP2
AQP1
At-yTIP
Zm TIPI
At-a TIP
Pv-a TIP
So-öTIP
AÍ-5TIP
A /M l Pa
GlpF
AQP3
FPS1
NOD26
NLM1
ZmSIP1;2
AfSIP1;1
A. thaliana
A. thaliana
M. crystallinum
S. olerácea
A. thaliana
S. olerácea
P. nil
M. crystallinum
M. crystallinum
A. thaliana
A. thaliana
A. thaliana
H. sapiens
H. sapiens
H. sapiens
A. thaliana
Z. mays
A. thaliana
P. vulgaris
S. olerácea
A. thaliana
N. tabacum
E. coli
H. sapiens
S. cerevisiae
G. max
A. thaliana
Z. mays
A. thaliana
y
PIP2
/ PIP
► PIP1
)
>- ssacze AQP
-y T IP '
- aTIP
M IP
-5 T IP
j
kanały
glicerolowe
- NIP
~SIP
R y cin a 1. A n a liz a filo g en ety czn a b iałek ro d zin y MIP m eto d ą prostej p arsy m o n ii
p rzy u ż y c iu p rogram u p ak ietu PHILIP. Białka G lpF £. coli oraz FPS1 d ro żd ży
transportują glicerol, białk o A Q P3 ssa k ó w transportuje z a r ó w n o glicerol jak i
w o d ę . Białka p o d r o d z in y N L M (N O D 2 6 G. max i jeg o h o m o lo g i) oraz Nf-TIPa
transportują ta k że m ałe n iep o larn e cząsteczk i. P o zostałe a k w a p o ry n y transportu­
ją w y łą c z n ie cz ąsteczk i w o d y , a ich klasyfikacja z a le ż y o d miejsca ro z m ieszczen ia
w k om ó rce i h o m o lo g ii sekw encji.
- SIPs (ang. Small basic Intrinsic Proteins) - białka o niskiej
homologii z AQP1 człowieka (około 15%), zlokalizow ane
w całej roślinie (podrodzina SIP1) lub tylko w korzeniach
(podrodzina SIP2), alanina m otyw u NPA pętli B p odstaw io­
na jest treoniną (AfSIPl;l), cysteiną (AfSIPl;2) bądź leucyną
(A/SIP2) [21], w ystępują w błonach siateczki śródplazm atycznej [22], różnice w budow ie am inokw asów tw orzących
w nętrze kanału w porów naniu z innym i akw aporynam i
mogą świadczyć o innej specyficzności substratow ej kanału
[23].
NOW E U ST A LE N IA DOTYCZĄCE
STRUKTURY K A N A Ł Ó W W O D N Y C H
S truktura pierw szorzędow a białka AQP1 składa się z
sześciu dom en (HI - H6). Z arów no koniec N jak i C białka
zlokalizowane są w ew nątrz-kom órkow o. Trzy pętle ozna­
czone jako LA, LC i LE położone pom iędzy helisami znaj­
dują się na zew nątrz komórki, dw ie inne LB i LD zlokali­
zow ane są w ew nątrz-kom órkow o. Porów nanie sekwencji
AQP1 z innym i białkami rodziny MIP w ykazało istnienie 22
zachow anych w ewolucji reszt am inokw asow ych, m iędzy
innym i m otyw u asparagina-prolina-alanina (NPA) znajdu­
jącego się w pętli pom iędzy dru g ą a trzecią helisą transbłonow ą w każdym p ow tórzeniu tandem ow ym . Pow tórzenia
tandem ow e mają przeciw ną orientację w błonie biologicz­
nej. M otyw NPA w pierwszej części białka znajduje się w
pętli cytoplazm atycznej, w drugiej - w pętli zew nątrzkomórkowej, co daje sym etrię kanału w zględem pow ierzchni
błony [5],
Miejsce odpow iedzialne za h am ow anie transportu w ody
w obecności jonów rtęci zlokalizow ano w pozycji resz­
ty am inokw asow ej Cys-189, poprzedzającej m otyw NPA
w obrębie pętli E. M utanty białka AQP1 z am inokw asam i
flankującymi m otyw N PA zam ienionym i na am inokw asy
o większej masie traciły zdolność przew odzenia w ody [24],
G dy resztę alaniny 73 - am inokw as w pętli B korespondują­
cy z resztą cysteiny 189 w pętli E - zastąpiono resztą cystei­
ny, a resztę cysteiny 189 resztą seryny, zm ienione białko tra­
ciło sw ą aktyw ność w obecności jonów H g2+. Podobne zja­
wisko obserw ow ano przy zam ianie reszt am inokw asow ych
otaczających m otyw N PA pętli B na reszty am inokw asow e
o większej masie cząsteczkowej (Ryc. 2). Badania te d o p ro ­
w adziły do pow stania m odelu klepsydry struktury kanału
w odnego opisanego w pracy przeglądow ej z 2004 roku [3].
Z przepływ em w ody w roztw orze w iąże się jednoczesny
przepływ protonów połączonych z cząsteczkami w ody w ią­
zaniami w odorow ym i. Z b ad ań wynikało, że kanał w odny
transportuje cząsteczki w ody nie przepuszczając jednak jo­
nów hydroniow ych H 30 +. Struktura klepsydry akw aporyny
składa się z dw óch stożkow atych przedsionków , cytoplazmatycznego i zew nątrzkom órkow ego, połączonych w ą ­
skim kanałem o długości 20 A. Miejsce odpychania elektro­
statycznego cząsteczek obdarzonych ładunkiem oraz filtr
wielkości znajdują się około 8 A powyżej środka kanału. W
tym miejscu średnica kanału w ynosi około 2,8 A, tyle samo,
co średnica van der Waalsa cząsteczki w ody. Większość reszt
am inokw asow ych wyściełających ściany kanału pochodzi
z dom en transbłonow ych i m a charakter hydrofobow y - w
miejscu filtru wielkości znajduje się fenyloalanina 56 dom e-
85
P ostępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
sami fizjologicznymi: m. in. z otw ieraniem i zam ykaniem
aparatów szparkow ych [28], w zrostem w ydłużeniow ym
kom órek [29] czy rucham i organów [30,31].
R y cin a 2. M o d el p rzestrzen nej b u d o w y białka A Q P1. H e lisy tra n sb ło n o w e za ­
z n a cz o n o jako H I - H 6, p ętle jako LA - LE. P ętle LB i LE zaw ierają za c h o w a n e
w ew o lu cji m o t y w y N P A . M iejsce h a m o w a n ia jo n am i H g 2+ (C ys-189) ozn a cz o n o
jako SH.
ny H3. O bok znajdują się dw ie zachow ane w ewolucji resz­
ty am inokw asow e: arginina 195 i histydyna 180, obdarzone
w pH n eu traln y m dodatnim ładunkiem elektrostatycznym .
Reszty am inokw asow e Arg-195 i His-180 tw orzą filtr wiel­
kości i dodatko w o odpychają protony i inne kationy, unie­
możliwiając im przep ły w przez kanał w odny (Ryc. 3) [25].
D odatkow o pow yżej miejsca filtru wielkości, obecny jest
szereg reszt am inokw asow ych zawierających atom y tlenu
w g rup ach karbonylow ych (Gly-188, Cys-189, Gly-190 i Ile191), które są korzystnie energetycznym i substytutam i do
w iązania protonów . Reszta cysteiny 198 ma zorientow aną
do w n ętrza po ru gru p ę sulfhydrylow ą - zw iązanie jonu rtęci
fizycznie blokuje kanał i uniem ożliw ia transport cząsteczek
w o d y przez błonę. W miejscu nałożonych na siebie m oty­
w ów N PA następuje reorientacja cząsteczki w ody. Poniżej
znajduje się dru g i szereg tlenów karbonylow ych pochodzą­
cych z reszt Leu-75, His-74, Ala-73 i Gly-72 [26]. Orientacja
cząsteczki w ody zm ienia się w trakcie jej przep ły w u przez
kanał. G dy cząsteczka w ody w pływ a do przew od u z prze­
strzeni zew nątrzkom órkow ej tlen skierow any jest w dół. W
miejscu m otyw ów NPA następuje jej obrót i dalszy prze­
pływ tlenem skierow anym ku górze (Ryc. 3) [26].
Z 38 akw aporyn A. thaliana większość ulega ekspresji
albo w korzeniach albo w kw iatach. Brak jest kanałów w o d ­
nych specyficznych wyłącznie dla liści. G eny należące do
p o d ro dzin PIP i TIP są aktyw ne transkrypcyjnie, w p rze­
ciw ieństwie do białek NIP, których ekspresja jest znacznie
niższa. W odpow iedzi rośliny na stres abiotyczny, np. su ­
szę, ekspresja wielu genów ak w apo ry n jest obniżana, choć
są też takie geny, których ekspresja w zm aga się (AfPIPl;4 i
AfPIP2;5) lub nie ulega zm ianie (AfPIP2;6 i A fSIPl;l) [32],
Poziom ekspresji AfPIP2;5 w zrastał po um ieszczeniu rośliny
w niskiej tem peraturze, podczas gdy ekspresja pozostałych
genów po d rodziny PIP ulegała zaham ow aniu. W w a ru n ­
kach stresu solnego nie zaobserw ow ano istotnych zm ian w
ekspresji genów PIP [33],
Stymulację ekspresji genów ak w ap o ry n suszą zaobser­
w ow ano u tytoniu (geny NcMip2 i NcMip3) [34] oraz Craterostigma plantagineum (CpPIPa2 i CpPIPa6) [35]. Z kolei eks­
presja genów M ipA i MipC M. crystallinum w w arunkach
suszy gw ałtow nie spada by powrócić następnie do stanu
pierw otnego [36].
Stw ierdzono różnice w e w pływ ie fitohorm onu - ABA
- na ekspresję poszczególnych ak w ap o ry n A. thaliana, co
sugeruje, że część z nich jest regulow ana zależnie od kw asu
abscysynowego, a pozostałe na d rodze niezależnej od tego
zw iązku. W iadom o, że ABA w p ły w a na ekspresję niektó­
rych genów PIP w korzeniach i liściach rzodkiew nika [33] i
ku k u ry d zy [37], U Phaseolus vulgaris zaobserw ow ano także
zwiększenie ilości białka PIP1 w liściach po dolistnym p o d a ­
niu kw asu abscysynow ego [38]. Zidentyfikow ano także gen
środowisko
zewnętrzne
WPŁYW C Z Y N N IK Ó W ABIOTYCZNYCH N A
EKSPRESJĘ G E N Ó W A K W A PO RY N
Kontrola w a ru n k ó w w odnych ma decydujące znacze­
nie dla u trzy m an ia hom eostazy organizm u. Kanały w odne
w ykazują złożony system regulacji ekspresji na poziom ie
transkrypcji. Badania z w ykorzystaniem technik biologii
m olekularnej (hybrydyzacje in situ, typu northern, RT-PCR,
dośw iadczenia im m unocytochem iczne) w ykazały różni­
ce w ekspresji genów akw aporyn. Niektóre białka ro d zi­
ny MIP ulegają ekspresji konstytutyw nej i stanow ią około
20% w szystkich białek błonow ych komórki. Inne podlegają
regulacji czynnikam i zew nętrznym i (odpow iedź na stres,
zm ianę w a ru n k ó w świetlnych) lub ulegają ekspresji zależ­
nej od poziom u fitohorm onów [1].
Najw yższą ekspresję genów akw aporyn obserw uje się w
tkankach o d u ż y m przepływ ie strum ienia w ody lub m eta­
bolitów oraz w tkankach przew odzących. P onadto akwaporyny tonoplastow e w ystępują licznie w tkankach merystem atycznych (w miejscach biogenezy w akuolarnej) [27].
Obecność ak w ap o ryn została pow iązana z licznymi proce-
/
^^196
®
i
odpychanie
elektostatyczne
cytoplazma
R y cin a 3. S ch em at p rzedstaw iający p r z e p ły w cz ą stec zek w o d y p r z e z kanał w o d ­
ny. P r zep ły w H 3O ł jest h a m o w a n y p r z e z filtr w ie lk o ś c i i o d p y c h a n ie elektrosta­
ty cz n e reszty arg ininy 195 (R195) i reszty h is ty d y n y 180 (H180) (zm o d y fik o w a n o
w g [26]).
86
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
kodujący białko Af-TIP, którego ekspresja znacząco w zrasta
po stymulacji kw asem giberelinow ym [39],
w odnego u szpinaku w arunkuje defosforylacja SoPIP2;l w
kom órkach liści [41].
A naliza ekspresji akw aporyn Oryza sativa oraz Zea mays
w ykazała, że istnieje zależność pom iędzy poziom em transkryptu genów kodujących białka PIP i TIP a w arunkam i
świetlnymi. Najw yższy poziom ekspresji genów ak w a­
poryn OsPIPl;2, OsPIPl;3, OsPIP2;3, OsPIP2;4, OsPIP2;5,
OsTIPl;2 i OsTIP2;l zaobserw ow ano w korzeniach roślin
w czasie dnia, najniższy w czasie nocy [17]. Badania nad
w p ły w em światła i ciemności na ekspresję genów PIP Zea
mays (Zm PIPl;l, ZmPIPl;5, ZmPIP2;l i ZmPIP2;5) w rytmie
16 godzin św iatła i 8 godzin ciemności w ykazały, że m ak­
sym alny poziom transkryptów w ystępuje w okresie od
2 do 4 godziny okresu światła, następnie ekspresja spada
gw ałtow nie, utrzym uje się na niskim poziom ie przez drugą
połow ą okresu światła i przez początek okresu ciemności,
by w zrosnąć i osiągnąć m aksim um m iędzy d ru g ą a czw artą
godziną dnia. Przedłużenie okresu ciemności z 8 do 52 go­
dzin doprow adziło do uzyskania w pierwszej dobie ciem­
ności profilu ekspresji charakterystycznego dla p o p rzed ­
nich w aru n k ó w świetlnych, a następnie trw ałego spadku
ekspresji genów Z m PIPl;l ZwPIP2;l i ZmPIP2;5 w drugiej
dobie ciemności [40],
D owiedziono, że akw aporyna PM28A szpinaku fosfo­
rylow ana jest w pozycji reszty Ser-274 (m otyw S-X-R ki­
nazy C kręgowców) w obecności w olnych jonów Ca2+ [42].
W procesie regulacji aktyw ności a k w ap o ry n sugeruje się
udział związanej z błoną kom órkow ą kinazy zależnej od
jonów wapnia. G dy potencjał w o dn y w apoplaście jest w y ­
soki, jony Ca2+ napływ ają do w nętrza kom órki, a w ysokie
stężenie cytopłazm atycznego w apnia aktyw uje CDPK, któ­
ra fosforyluje reszty serynow e akw aporyn. Kanały w odne
błony plazmatycznej pozostają otwarte. Aby zm inim alizo­
w ać straty w ody przy niskim potencjale w od y apoplastu,
(sygnalizow anym niskim stężeniem w ap n ia w cytosolu)
akw aporyny ulegają defosforylacji i przepuszczalność bło­
ny kom órkowej spada. Jednocześnie pozostają otw arte biał­
ka podrodziny TIP, co pozw ala na nap ły w w o d y z w akuoli
i zrekom pensow anie jej strat w cytoplazm ie [3]. A zad i wsp.
[31] wykazał, że akw aporyna obecna w płatkach kw iatu tu ­
lipana jest fosforylowana poprzez kinazę zależną od jonów
Ca2+, a proces defosforylacji przepro w adza fosfataza typu
2A. Fosforylacja ak w ap o ry n była ściśle skorelow ana z zależ­
nym od tem peratury otw ieraniem i zam ykaniem płatków,
co sugeruje zaangażow anie akw aporyn w tran sp o rt w ody
tow arzyszący tym procesom [31]. W yniki te pokazują, że
podczas rozw oju i w odpow iedzi roślin na bodźce środo­
wiskowe, proces fosforylacji m oże stanow ić istotny m echa­
nizm regulacji aktyw ności ak w ap o ry n u roślin (Ryc. 4).
REGULACJA A K TYW N O ŚC I A K W A PO R Y N
PROCES FOSFORYLACJI
O prócz specyficznej regulacji ekspresji genów ak w ap o ­
ryn, aktyw ność kanałów w odnych regulow ana jest także na
poziom ie potranslacyjnym. Stw ierdzono, że przepuszczal­
ność w o d y przez m em brany jest regulow ana przez fosforylację reszt seryny w dom enach cytoplazm atycznych N- i
C-końca akw aporyn. Dośw iadczenia z w ykorzystaniem
heterologicznej transkrypcji genów akw aporyn w oocytach
Xenopus laevis w obecności cAM P (aktyw ator szlaku kinazy
A) oraz kw asu okadaikow ego (inhibitora fosfataz) dow iodły
istnienia fosforylowanych reszt seryny w białkach: PuTIP3;l
Phaseolus vulgaris (Ser-7), SoPIP2;l Spinacia olerácea (Ser-274 i
Ser-277) oraz GmNodulin26 Glicynę max (Ser-262) [41].
Poza u dokum entow anym i miejscami fosforylacji zlo­
kalizow anym i w obszarach term inalnych polipeptydów ,
w szystkie akw aporyny błony kom órkowej oraz niektóre
akw aporyny tonoplastow e posiadają zachow aną w ew olu­
cji resztę seryny położoną w cytoplazm atycznej pętli obok
pierw szego m otyw u NPA. Reszta seryny ta otoczona jest
przez am inokw asy tw orzące m otyw R/X-K-X-S-X-X-R roz­
poznaw any przez wiele kinaz, m.in. kinazę zależną od jo­
nów w apnia (ang. Calcium-Dependent Protein Kinase, CDPK)
[41]. Podobny m otyw w ystępuje u ak w ap oryn tonoplastowych, gdzie reszta seryny po dstaw iona jest przez resztę
treoniny [1], W ysoki stopień zachow ania w ewolucji m oty­
w u sugeruje w ażne znaczenie strukturalne i funkcjonalne.
Fosforylacja ak w ap oryn m oże być zw iązana ze stadium
rozw ojow ym rośliny bądź z czynnikam i zew nętrznym i.
Gm Nodulin26 jest fosforylowana w sym biosom ach podczas
dojrzew ania brodaw ek oraz bierze udział w osmoregulacji
kom órki podczas stresu solnego lub w odnego. PvTIP3;1 jest
aktyw ow ana w rozwijających się nasionach. M echanizm re­
gulacyjny pow oduje defosforylację PvTIP3;1 w trakcie imbibicji nasion. O graniczenie utraty w ody w w arunkach stresu
TWORZENIE HETEROTETRAMERÓW
W błonie kom órkowej lub w tonoplaście akw aporyny
w ystępują przew ażnie w postaci oligom erów złożonych z
czterech identycznych polipeptydów . W ykazały to badania
z użyciem kriokrystalografii elektronowej u fasoli i szpinaku
[1]. Jednak w tonoplaście soczewicy zaobserw ow ano obec­
ność kanałów w odnych złożonych z dw óch polip ep ty d ó w o
m asach 25 i 26 kDa [43], Badania p rzep ro w ad zo n e u k u k u ­
ry d zy dow iodły, że jednym z m echanizm ów regulacyjnych
aktyw ność akw aporyn m oże być tw orzenie kom pleksów
przez te białka (Rys. 4). Koekspresja Zm PIPl;2 i ZwPIP2 w
oocytach X. laevis zwiększała przepuszczalność w o d y przez
błonę w porów naniu do ekspresji pojedynczych genów PIP.
K om pleksy białek m ogą uspraw nić transp o rt akw aporyn
p o drodziny PIP1 do błony plazm atycznej, które w postaci
hom otetram erów często nie zwiększają lub jedynie w nie­
w ielkim stopniu zwiększają przepuszczalność błon oraz
w płynąć na fałdow anie się i zm ianę konformacji fragm en­
tu białka na granicy pętli E i szóstej dom eny transbłonowej
[41].
ZMIANY pH I STĘŻENIA Ca2+
Badania nad ekspresją genów AfPIP2;l, AfPIP2;2 oraz
A fPIP2;3 w oocytach X. laevis dow iodły istnienia m echanizm u
regulacyjnego przep ły w u w ody przez błonę kom órkow ą,
zw iązanego z odczynem p H w ew nątrz kom órki. Spadkow i
p H cytoplazm y z 7 do 6 jednostek tow arzyszył spadek
przepuszczalności błony. W ykazano, że w p H kw aśnym ,
reszta His-197 położona w pętli w ew nątrzkom órkow ej
AtIPlP2;2 ulega protonacji, co prow ad zi do zm iany w
87
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
strukturze i niedrożności kanału przez część pętli D białka
[44], P odobny w pływ na strukturę kanału m ogą mieć
w ew nątrzkom órkow e jony w apnia, które łącząc się z Ckońcem akw aporyny poprzez kalm odulinę uniem ożliw iają
przepływ w ody przez kanał [41]. Z aobserw ow ano, że
jony Ca2+ zmniejszają aktyw ność kanałów w o d n y ch w
oczyszczonych pęcherzykach błonowych. M echanizm tego
ham ow ania, bezpośredniego czy pośredniego, aktyw ności
akw aporyn wciąż jest nieznany, obserw ow any jest gdy
stężenie jonów w apnia w cytoplazm ie w aha się w zakresie
od 10 -1 0 0 pM. Obserwacje fizjologiczne p rzep ro w ad zo n e u
ku k u ry dzy i m elona wykazały, że jony w apnia neutralizują
negatyw ne działanie chlorku sodu na przepuszczalność
w ody w korzeniu. Wyniki te są w yraźnie różne od
tych obserw ow anych w w yizolow anych pęcherzykach
błonowych, co może świadczyć o istnieniu innego, nie
odkrytego m echanizm u, obejmującego rolę w apnia w
przekazyw aniu sygnału podczas stresu solnego [1],
inhibicji przepływ u w ody przez kanał był uzależniony
od ruchów w ody spow odow anych zm ianam i ciśnienia.
Sugeruje to, że w ysoki zakres p rzepływ u w ody w kanale
w o d n ym m oże w ym uszać w ysokie ciśnienie powstające
w m om encie zmniejszania się średnicy kanału. Stw ierdzo­
no, że kw as abscysynow y m oże neutralizow ać ham ow anie
SUSZA, STRES SOLNY
degradacja
DZIAŁANIE REAKTYWNYCH FORM TLENU
W ykazano, że niska tem peratura zmniejsza p rz e w o d ­
nictwo hydrauliczne w korzeniach pom idora [45] i k u k u ­
rydzy [46]. U w aża się, że efekt ten w yw ołany jest pop rzez
nadtlenek w o do ru uw alniany w m omencie w y staw ienia
korzeni na działanie chłodu [47], Reaktyw ne form y tlenu
zmniejszają także aktyw ność kanałów w odnych w k o m ó r­
kach Chara corallina [48], Okazało się, że reaktyw ne form y
tlenu zmniejszają przew odnictw o hydrauliczne aż do 90%,
są więc bardziej w ydajne niż sole rtęci, które pow szechnie
znane są jako inhibitory kanałów w odnych. H entzler i w sp.
[48] zaproponow ał, że reaktyw ne formy tlenu w pływ ają na
przepuszczalność akw aporyn bezpośrednio po p rzez oksy­
dację tych białek lub pośrednio poprzez oksydację lipidów
błonow ych i tworzenie wolnych rodników . Ze w zględ u na
to, że reaktyw ne formy tlenu uznaw ane są za cząsteczki
sygnałow e w komórkach, rów nież w p rzy p ad k u a k w a p o ­
ryn m ogą rozpoczynać kaskadę reakcji w pływ ających na
regulację ich aktywności (Ryc. 4) [1],
MXr
B ________________
(
STRESOSMOTYCZNY
S
i!
CIŚNIENIE OSMOTYCZNE I HYDROSTATYCZNE
Ye i w sp. [49] wykazali, że w ysokie stężenie eterów gli­
kolowych (powyżej 800 mM) zmniejsza przepuszczalność
w ody w akw aporynach. Praw dopodobnie w ysokie ciśnie­
nie podczas przepływ u cząsteczek d op ro w ad za do napięć
w ew n ątrz kanału oraz deformacji białka, uniemożliwiającej
transport w od y [2,49],
S
NIEDOTLENIENIE!
CIÓNIENIE
HYDROSTATYCZNE
NISKA
TEMPERATURA
Innym param etrem , który może regulow ać otw ieranie
kanałów w odnych jest kom órkow e ciśnienie hyd ro staty cz­
ne czyli turgor. Zm iany ciśnienia w yw oływ ały p rz e w o d z e ­
nie hydrauliczne w kom órkach korow ych korzenia. Z akres
H*
/ __
ROS
^
®
STRES
OSMOTYCZNYjy
R ycin a 4. P r o p o n o w a n e m ec h a n iz m y regulacji a k ty w n o ści k a n a łó w w o d n y c h u roślin. (A). K ontrola p o zio m u transkrypcji i ilo ści białka. S u sza, stres s o ln y oraz inne
b o d ź ce ś r o d o w is k o w e zn a n e są jako cz y n n ik i w p ły w a ją c e na transkrypcję g e n ó w a k w a p o r y n i p r a w d o p o d o b n ie na ich translację oraz d egradację, określając w ten sp o só b
ilość k a n a łó w w o d n y c h w b łon ach kom órki. T w o rze n ie p rzez białka PIP h e te r o m e r ó w u ro ślin jest h ip o tety cz n e , g d y ż d o tej p ory zjaw isk o to z a o b se r w o w a n o w oocytach
Xenopus. W yd aje się, ż e m ech a n izm ten preferuje transport h o m o lo g ó w PIP1 d o b ło n y p lazm atyczn ej (PM). (B). W ew n ą trzk o m ó rk o w a z m ia n a lokalizacji. P r zem ieszcza n ie
a k w a p o ry n TIP z ton o p la stu (TP) d o m a ły c h p ę ch er zy k ó w w e w n ą tr z k o m ó r k o w y c h s tw ie r d z o n o w k om órk ach z a w ie sin y z M. crystallinum h o d o w a n y c h w w aru n k a ch
stresu o s m o ty c z n e g o . W y k azan o p o d o b n y m ec h a n iz m dla a k w a p o ry n PIP, ch o ć p o zo sta je o n h ip otezą. (C). K ontrola p rze p u sto w o ści kanału . Fosforylacja oraz d efosfo ry lacja a k w a p o ry n p rze p r o w a d za n a o d p o w ie d n io p rzez k in azy (PK) i fo sfa ta zy (PPase) reguluje o tw ier a n ie i z a m y k a n ie k a n a łó w w o d n y c h w TM i PM. R eak tyw n e form y
tlenu, w y s o k ie stężen ia r o z tw o ró w i k o m ó rk o w e ciśn ie n ie h y d r o sta ty c zn e w p ły w a ją na a k ty w n o ść ak w ap oryn , ch oć efekty b e z p o śr e d n ie g o c z y p o śr ed n ieg o ich działania
pozostają c ią g le n iew yjaśn ion e. S ch em at p okazuje tak że d ziałan ie k in azy b ia łe k o ra z w p ły w niskiej tem p eratu ry, n ied o tle n ien ia oraz stresu o s m o ty c z n e g o na g ro m a d ze n ie
się, o d p o w ie d n io , rea k tyw n y ch form tlenu i p ro to n ó w (z m o d y fik o w a n e w g [1]).
88
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
kanałów w odnych spow odow ane w ysokim ciśnieniem [1],
Oba ty p y regulacji m ogą brać udział w kształtow aniu się
turgoru kom órki zależnie od w aru n kó w w odnych i osmotycznych (Rys. 4) [2].
D Y N A M IK A SUBK OM Ó RK OW EJ
LOKALIZACJI A K W A PO RY N
Obecnie w iadom o, że fosforylacja akw aporyn w pływ a na
przepuszczalność błon, jednak sam m echanizm regulacji nie
jest poznany. Podejrzew a się, że otw arcie kanału w odnego
następuje, gdy dochodzi do bezpośredniego oddziaływ ania
ujemnie naładow anej reszty fosforanowej z przestrzenną
stru k tu rą białka. N iew ykluczone jest jednak, że fosforylacja
reszt serynow ych ma znaczenie w w ew nątrzkom órkow ym
transporcie akw aporyn z przybłonow ych pęcherzyków do
błony plazm atycznej, jak m a to miejsce w p rzy p adk u akwaporyny 2 (AQP2) człowieka w kom órkach kanalików zbior­
czych nerki [41]. W głów nych kom órkach kanalika zbior­
czego nerki białko AQP2 zlokalizow ane jest w obrębie w e­
w nątrzkom órkow ych pęcherzyków położonych przy błonie
komórkowej. Związanie w azopresyny (ADH, ang. antidiuretic hormone) przez receptor V2 następuje w obecności cAMP,
który aktyw uje podjednostkę katalityczną kinazy A. Kinaza
A fosforyluje białko AQP2 w pozycji Ser-256, co pow oduje
przem ieszczenie się i fuzję pęcherzyków ze szczytow ą częś­
cią błony kom órkowej oraz w zrost przepuszczalności w ody
przez błonę. Przy braku w azopresyny w e krw i akw aporyna
2 przem ieszczana jest do w n ętrza kom órki i przepuszczal­
ność błony komórkowej sp ad a do poziom u podstaw ow ego
[50].
Badania nad białkami MipA, MipB, M ipC i MipF u Mesembryanthemum crystallinum (ang. common ice plant) w ska­
zują na skom plikow any proces dystrybucji akw aporyn
do organelli kom órkowych. Nie każde białko należące do
po d ro d zin y PIP trafia do błony komórkowej, a każdy TIP
do tonoplastu. Doświadczenia z w ykorzystaniem im m unolokalizacji akw aporyn in situ w skazują na krążenie białek
pom iędzy błonam i w komórce, m.in. za pośrednictw em
plazm alem m osom ów [51].
Roślinne akw aporyny są transportow ane do docelowych
błon plazm atycznych szlakiem sekrecyjnym z siateczki
śródplazm atycznej poprzez aparat Golgiego oraz liczne
ty p y pęcherzyków . Rozmieszczenie ak w apo ryn jest jednak
bardziej skom plikow ane niż prosty m odel transportu białka
do błony plazmatycznej czy tonoplastu. AfPIPl rzodkiew nika, ZmPIPl;2 i ZmPIP2;5 k u k u ry d z y zostały zlokalizow a­
ne głów nie w błonie komórkowej, ale także w plasm alem m osom ach i innych w ew nętrznych błonach kom órki [41].
Obecność białka McPIPl;4 ujaw niono w tonoplaście, a w
błonie plazm atycznej zlokalizow ano tylko niewielką część
McPIP2;l obecnego w komórce. Stw ierdzono także zm ianę
lokalizacji akw aporyn w o dpow iedzi na czynnik stresowy.
Stres osmotyczny w yw ołany m annitolem spow odow ał
w zrost ilości białka M cTIPl;2 (McMipF) w błonie w akuoli i zm ianę jego dystrybucji do innych m em bran w ew nątrz
kom órki. Takie zm iany M cTIPl;2 nie były obserw ow ane w
obecności inhibitorów transportu pęcherzykowego: brefeld y ny A, w ortm anniny i cytochalazyny D. McTIPl;2 w ystę­
pow ało w postaci glikozylowanej, co w skazuje na duże zna­
czenie modyfikacji potranslacyjnych w dystrybucji ak w ap o ­
ryn w obrębie błony plazmatycznej w komórce [52],
PO D SU M O W A N IE
Kanały w o dn e w kom órkach roślinnych w ykazują różni­
ce w sposobach transportu selektywnego, w lokalizacji w e­
w nątrzkom órkow ej i m echanizm ach regulacji. W zw iązku z
tym, że kom órki roślinne w ykazują d uży stopień przedziałowości m uszą więc nieustannie koordynow ać transport
w ody i innych roztw orów , a także gazów zarów no poprzez
błonę plazm atyczną, jak i inne błony w ew nątrzkom órkow e.
Rośliny zm uszone są dokonyw ać ciągłej kontroli przepły­
w u w ody podczas swojego rozw oju w ew nątrz wszystkich
tkanek, w odpow iedzi na zmieniające się w arunki środo­
w iska ich życia. Istnieje wiele m echanizm ów , które mogą
w pływ ać na regulację kanałów w odnych u roślin zarów no
na poziom ie tkankow ym , kom órkow ym , w ew nątrzkom ór­
kow ym czy m olekularnym .
P IŚ M IE N N IC T W O
1. Luu D-T, Maurel C (2005) Aquaporins in a challenging environment:
molecular gears for adjusting plant w ater status. Plant Cell Environ 28:
85-96
2. Hachez C, Zelazny E, Chaum on F (2006) M odulating the expression
of aquaporin genes in planta: A key to understand their physiological
functions? Biochim Biophys Acta 1758:1142-1156
3. Dąbrowska G, Głowacka B (2004) A kw aporyny - nowe spojrzenie na
transport w ody w roślinach. Postępy Biochem 50:383-387
4. Kaldenhoff R, Fischer M (2006) A quaporins in plants. Acta Physiol 187:
169-176
5. Ishibashi K (2006) Aquaporin subfamily w ith unusual NPA boxes. Bio­
chim Biophys Acta 1758: 989-993
6. Friihbeck G, Catalan V, Gomez-Ambrozi J, Rodriquez A (2006) Aquaporin-7 and glycerol permeability as novel obesity drug-target pathways.
Trends Pharmacol Sci 27: 345-347
7. W ang Y, Schulten K, Tajkhorshid E (2005) W hat makes an aquaporin a
glycerol channel: A comparative study of AqpZ and GlpF. Structure 13:
1107-1118
8. Wallace IS, Roberts DM (2005) Distinct transport selectivity of two
structural subclasses of the nodulin-like intrinsic protein family of plant
aquaglyceroporin channels. Biochemistry 44:16826-16834
9. Beitz E, Wu B, Holm LM, Schultz JE, Zeuthen T (2006) Point m utation
in the arom atic/arginine region in aquaporin 1 allow passage of urea,
glycerol, amm onia, and protons. Proc Natl Acad Sci USA 103:269-274
10. Loque D, Ludew ig U, Yuan L, von W iren N (2006) Tonoplast intrinsic
proteins AtTIP2;l and AtTIP2;3 facilitate NH , transport into the vacuole.
Plant Physiol 137: 671-680
11. Takano J, W ada M, Ludew ig U, Schaaf G, von W iren N, Fujiwara T
(2006) The Arabidopsis major intrinsic protein NLP5;1 is essential for ef­
ficient boron uptake and plant developm ent under boron limitation.
Plant Cell 18:1498-1509
12. Bienert GP, Schjoering JK, Jahn TP (2006) M em brane transport of hydro­
gen peroxide. Biochem Biophys Acta 1758: 994-1003
13. Hill AE, Shachar-Hill B, Shachar-Hill Y (2004) W hat are aquaporins for?
J Membr Biol 197:1-32
14. Flexas J, Ribas-Carbo M, H anson DT, Bota J, Otto B, McDowell N, Me­
drano H, Kaldenhoff R (2006) Tobacco aquaporin N tA Q Pl is involved
in mesophyll conductance to C 0 2 in vivo. Plant J 48:427-439
15. Quigley F, Rosenberg JM, Shachar-Hill Y, Bohnert HJ (2002) From ge­
nom e to function: the Arabidopsis aquaporins. Genome Biol 3:1-17
16. Weig A, Deswarte C, Chrispeels MJ (1997) The major intrinsic protein
family of Arabidopsis has 23 mem bers that from three distinct groups
with functional aquaporins in each group. Plant Physiol 114:1347-1357
17. Sakurai J, Ishikawa F, Yamaguchi T, U em ura M, Maeshima M (2005)
Identification of 33 rice aquaporin genes and analysis of their expression
and function. Plant Cell Physiol 46:1568-1577
89
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
18. C haum ont F, Barrieu F, Wójcik E, Chrispeels MJ, Jung R (2001) Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize.
Plant Physiol 125:1206-1215
19. W ang F, Feng XC, Li YM, Yang H, Ma TH (2006) Aquaporins as poten­
tial drug targets. Acta Pharmacol Sin 27: 395-401
20. Zardoya R (2005) Phylogeny and evolution of the major intrinsic protein
family. Biol Cell 97: 397-414
21. Wallace IS, Roberts DM (2004) Elomology m odeling of representative
subfamilies of Arabidopsis major intrinsic proteins. Classification based
on the arom atic/arginine selectivity filter. Plant Physiol 135:1059-1068
22. Ishikawa F, Suga S, Uem ura T, Sato MH, Maeshima M (2005) Novel
type aquaporin SIPs are mainly localized to the ER mem brane and show
cell-specific expression in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett 579: 58145-5820
23. Kruse E, Uehlein N, Kaldenhoff R (2006) The aquaporins. Genome Biol
7:206
24. Tómroth-Horsefield S, W ang Y, Hedfalk K, Johanson U, Karlsson M,
Tajkhorshid E, Neutze R, Kjellbom P (2006) Structural mechanism of
plant aquaporin gating. Nature 439: 688-694
25. Gonen T, W altz T (2006) Structure of aquaporins. Q Rev Biophys 39:361396
26. Agre P, Kozono D (2003) Aquaporin w ater channels - molecular mecha­
nism for hum an diseases. FEBS Lett 27: 72-78
27. Chrispeels MJ, Crawford NM, Schroeder JI (1999) Protein for transport
of w ater and mineral nutrients across the m em branes of plant cells.
Plant Cell 11: 661-675
28. MacRobbie EAC (2006) Control of volum e and turgor in stomatal guard
cells. J M em brane Biol 210:131-142
29. Hachez C, Moshelion M, Zelazny E, Cavez D, C haum ont F (2006) Local­
ization and quantification of plasma m em brane aquaporin expression in
maize prim ary root: a cue to understanding their role as cellular plum b­
ers. Plant Mol Biol 62:305-323
30. Moshelion M, Becker D, Biela A, Uehlein N, Hedrich R, Otto B, Levi H,
Moran N, Kaldenhoff R (2002) Plasma mem brane aquaporins in the mo­
tor cells of Samanea saman: diurnal and circadian regulation. Plant Cell
14: 727-739
31. Azad AK, Sawa Y, Ishikawa T, Shibata H (2004) Phosphorylation of
plasma m em brane aquaporin regulates tem perature-dependent open­
ing of tulip petals. Plant Cell Physiol 45: 608-617
32. Alexandersson E, Fraysse L, Sjovall-Larsen S, Gustavsson S, Fellert M,
Karlsson M, Johanson U, Kjellbom P (2005) Whole gene family expres­
sion and drought stress regulation of aquaporins. Plant Mol Biol 59:469484
33. Jang JY, Kim DG, Kim YO, Kim JS, Kang H (2004) An expression analy­
sis of a gene family encoding plasma mem brane aquaporins in response
to abiotic stresses in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol 54: 713-725
34. Yu Q, H u Y, Li J, W u Q, Lin Z (2005) Sense and antisense expression of
plasm a m em brane aquaporin from Brassica napus in tobacco and its ef­
fects on plant drought resistance. Plant Sci 169: 647-656.
35. Mariaux JB, Bockel C, Salamini F, Bartels D (1998) Desiccation- and abscisic acid-responsive genes encoding major intrinsic proteins (MIPs)
from the resurrection plant Craterostigma plantagineum. Plant Mol Biol
38:1089-1099
36. Yamada S, Katsuhara M, Kelly WB, Michałowski CB, Bohnert HJ (1995)
A family of transcripts encoding w ater channel proteins: tissue-specific
expression in the com m on ice plant. Plant Cell 7:1129-1142
37. Zhu C, Schraut D, H artung W, Schaffner AR (2005) Differential respons­
es of maize MIP genes to salt stress and ABA. J Exp Bot 56: 2971-2981
38. Aroca R, Ferrant A, Vemieri P, Chrispeels MJ (2006) Drough, abscisic
acid and transpiration rate effects on the regulation of PIP aquaporin
gene expression and abundance in Phaseolus vulgaris plants. A nn Bot 98:
1301-1310
39. Phillips AL, Huttly AK (1994) Cloning of tw o gibberellin-regulated
cDNAs from Arabidopsis thaliana by subtractive hybridization:
expression of the tonoplast w ater channel, gamma-TIP, is increased by
GA3. Plant Mol Biol 24: 603-615
40. Lopez F, Bousser A, Sissoeff I, Gaspar M, Lachaise B, H oarau J, M ahe A
(2003) Diurnal regulation of w ater transport and aquaporin gene expres­
sion in maize roots: contribution of PIP2 proteins. Plant Cell Physiol 44:
1384-1395
41. C haum ont F, Moshelio M, Daniels MJ (2005) Regulation of plant aqua­
porin activity. Biol Cell 97: 749-764
42. Johansson I, Larsson C, Ek B, Kjellbom P (1996) The major integral pro­
tein of spinach leaf plasm a m em branes are putative aquaporins and
are phosphorylated in response to Ca2+ and apoplastic w ater potential.
Plant Cell 8:1181-1191
43. H arvengt P, Vlerick A, Fuks B, W attiez R, Ruysschaert JM, H om ble F
(2000) Lentil seed aquaporins form a hetero-oligomer which is phos­
phorylated by a Mg2+-dependent and Ca2+-regulated kinase. Biochem J
352:183-190 '
44. Toumaire-Roux C, Sutka M, Javot H, G out E, Gerbeau P, Luu DT, Bligny
R, Maurel C (2003) Cytosolic pH regulates root w ater transport during
anoxic stress through gating of aquaporins. N ature 425: 393-397
45. Bloom AJ, Zwieniecki MA, Raundal LB, Holbrook NM, St Clair DA
(2004) W ater relations under root chilling in a sensitive and tolerant to­
m ato species. Plant Cell Environ 27:971-979
46. Melkonian J, Yu L-X, Setter TL (2004) Chilling responses of m aize (Zea
maysL.) seedlings: root hydraulic conductance, abscisic acid, and stomal
conductance. J Exp Bot 55:1751-1760
47. Lee SH, Singh AP, C hung GC (2004) Rapid accum ulation of hydrogen
peroxide in cucum ber roots d ue to exposure to low tem perature appear
to m ediate decrease in w ater transport. J Exp Bot 55:1733-1741
48. Hentzler TE, Ye Q, Steudle E (2004) Oxidative gating of water channels
(aquaporins) in Chara by hydroxyl radicals. Plant Cell Environ 27:11841195
49. Ye Q, Wiera B, Steudle E (2004) A cohesion/ tension m echanism explains
the gating od water channels (aquaporins) in Chara intem nodes by high
concentreation. J Exp Bot 55:449-461
50. Christensen BM, Zelenina M, Aperia A, Nielsen S (2000) Localisation
and regulation of PKA-phosphorylated AQP2 in response to V.,-recep­
tor agonist/antagonist treatment. A m J Physiol 278: 92-95
51.Barkla BJ, Vera-Estrella R, Pantoja O, Kirch HH, Bohnert HJ (1999)
Aquaporin localization - how valid are the TIP and PIP labels? Trends
Plant Sci 4: 86-88
52. Vera-Estrella R, Barkla JB, Bohnert HJ, Pantoja O (2004) Novel regula­
tion of aquaporins during osmotic stress. Plant Physiol 135: 2318-2329
The high diversity and regulation of plant water channels
Paweł Mateusz Mordaka, Grażyna Dąbrowska
D epartm ent of Genetics, Institute of General and M olecular Biology, Faculty of Biology an d E arth Sciences, N icolaus C opernicus U niversity,
G agarina St. 9, 87-100 Toruń, Poland
: e-mail: brow sk@ uni.torun.pl
Key w ords: w a ter transport, m em brane channel, aquaporins, abiotic stress
A BST RA CT
Membrane intrinsic proteins (MIPs) are a diverse class of integral membrane proteins that mediate the bi-directional flux of water (aquapo­
rins), uncharged small solutes such as glycerol and/or gases across cellular membranes. The past year has brought significant advances in
the characterization in plants of a large class this of water channel. MIPs have been identified in many single- and multi- cellular organisms.
Aquaporins play important role in plant developm ent and their adaptation to even changing environment. At the transcriptional level aqua­
porins have been up- or down-regulated in response to hormones, drought, salnity and light. Recent data indicate that plant aquaporin activity
might be regulated by phosphorylation and intracellular protons. N ovel m echanism s of regulation by hetero-tetramer formation or through
control by reactive oxygen species and osmotic or hydrostatic pressure gradients is also discussed.
90
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
Fulereny w biologii
STRESZCZENIE
u le re n y to cząsteczki, w k tórych atom y w ęgla tw orzą reg u larn e, k u liste stru k tu ry , przy­
p o m in a jąc e p iłk ę fu tbolow ą. N ajtrw alszą z n ich jest cząsteczka z b u d o w a n a z 60 atom ów
w ęgla. Ze w z g lęd u na obecność 60 z d elo k a liz o w an y c h elek tro n ó w , cząsteczka ta m oże przy­
łączać i oddaw ać elektrony, w y kazując tym sam ym w łaściw ości a n ty o k sy d ac y jn e lu b prooksydacyjne. T e w łaściw ości fu lere n ó w zw róciły uw agę na m ożliw ość zasto so w an ia fu lere n ó w
i ich p o ch o d n y ch w terapii. W yn ik i dotychczasow ych b a d ań w sk azu ją, że d z ia łan ie fu lere ­
nów znacząco zależy od rodzaju, ilości i geom etrii p o d sta w n ik ó w przyłączonych do „w ęglo­
wej p iłeczk i". Istotne jest odkrycie an ty w iru so w eg o d z ia łan ia fu leren ó w , w tym przeciw ko
w iru so w i HIV . F ulereny m ogą być cytotoksyczne p o p rzez g e n ero w a n ie re ak ty w n y c h form
tle n u p o d w ływ em św iatła w id z ia ln eg o i h am o w an ie a ktyw ności enzym atycznej. Z dolność
tw o rz en ia re ak ty w n y c h form tle n u m oże zostać w y k o rzy stan a w tera p ii fo to d y n am iczn ej.
F
W PR O W A D Z E N IE - ODKRYCIE FULERENÓW
W rok u 2006 mija 21 rocznica odkrycia i 10 rocznica przyznania N agrody
Nobla dla trójki naukow ców H. Kroto, R. Smalley'a i R. C url'a za odkrycie i
badania n ad now ą form ą alotropow ą węgla, którą nazw ano buckm insterfulerenam i lub krócej fulerenami. N azw ą tą objęto cząsteczki, w których atom y węgla
tw orzą regularne struktury przypom inające sw oim w yglądem piłkę futbolową.
N ajtrw alszą z nich jest Cw) składająca się z 20 pierścieni 6-członowych i 12 5-członow ych, jednak stw ierdzono istnienie struktur C70, C_ czy n aw et C% (Ryc. 1).
Trwałość struktury C60 wiąże się z geom etrią cząsteczki będącej praw ie idealną
kulą i istnieniem 60 zdelokalizow anych elektronów. Ten fakt zwrócił rów nież
uw agę na możliwość przyłączania elektronów pochodzących od innych cząstek,
co w iązało się z potencjalnymi właściwościami antyoksydacyjnym i i zm iatający­
mi w olne rodniki. Jednocześnie rów nie łatw o fulereny m ogą oddaw ać elektro­
ny, co w skazuje na ich ew entualne działanie prooksydacyjne i możliwość gene­
row ania reaktyw nych form tlenu [1,2]. W ten sposób cząsteczka, której odkrycie
w iązało się z badaniam i z zakresu astrofizyki i chemii trafiła do n auk biologicz­
nych. Po opracow aniu m etody syntezy większych ilości węglowej „piłeczki"
C60 rozpoczęły się badania n a d możliwościami praktycznego jej zastosow ania
A n ita K rok osz
Z akład
Radiobiologii, K atedra Biofizyki
M olekularnej, U niw ersytet Łódzki, Łódź
Z akład Radiobiologii, K atedra Biofizyki
M olekularnej, U niw ersytet Łódzki, ul. Banacha
12/16, 90-237 Łódź; e-mail: krokosz@ biol.uni.
lodz.pl, tel.: (042) 635 44 80
A rtykuł otrzym ano 8 listopada 2006 r.
A rtykuł zaakceptow ano 17 listopada 2006 r.
Słowa kluczowe: fulereny, toksyczność, antyoksydanty, fotouczulacze, w łaściw ości antyw i­
rusow e
W ykaz skrótów: C, - pochodna
p odstaw io­
na trzem a cząsteczkam i kw asu m alonow ego;
FHP1 - heksapochodna CM|z P I i pięciom a g ru ­
pam i m alonianu dietylu; FP1 - m onopochodna
z P I; nano-C 60 - agregaty Cw o w ym iarach
25-500 nm ; P I (ang. pyropheophorbide a) - pirofeoforbid a; PVP - poliw inylopirolidon; RFT
- reaktyw ne form y tlenu
„ B u ck m in sterfu lleren - h alf o f it in w ater" b y P roftessor T am as E. G u n d a from D ep artm en t o f P h arm aceutical
C h em istry, U n iv ersity o f D eb recen, H u n g a ry (h t t p : //d r a g o n .k lt e .h u /~ g u n d a t/p o v r a y a .h t m ), w ith p erm is­
sio n . C reated w ith the p ro gram s M o l2M o l 5.5 and P O V -R ay 3.6.
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
91
N ano-C(() w ykazuje także silną toksyczność w stosunku
do fibroblastów skóry, kom órek raka w ątroby (HepG2) i
astrocytów [6], A nalizow ano przeżyw alność kom órek, ak­
tyw ność m itochondrialną kom órek (z MTT), uw alnianie
dehydrogenazy mleczanowej, syntezę glutationu (GSH) i
peroksydację lipidów. Zaobserw ow ano znaczny spadek
przeżyw alności kom órek ze w zrostem stężenia nano-C60 p o ­
łączony ze znaczną peroksydacją lipidów . Nano-C60 nie w y ­
kazyw ało w p ły w u na aktyw ność m itochondrialną kom órek
(w czasie trw ania dośw iadczenia czyli do 48 godz.) ani na
uw alnianie dehydrogenazy mleczanowej z kom órek. W zra­
stało natom iast stężenie GSH, co świadczyło o wzm ożonej
syntezie tego antyoksydanta. D odanie do hodow li kom ór­
kowej kw asu L-askorbinowego (0,06ml Im M do 4ml) cał­
kowicie znosiło toksyczne działanie nano-C 60. Toksyczności
wobec badanych kom órek nie w ykazyw ała rozpuszczalna
w w odzie pochodna z 24 grupam i -O H C60(OH)24 (Ryc. 2).
R ycin a 1. Struktura fu leren u Cw.
w układach biologicznych. Niektóre z właściwości C60 np.
brak rozpuszczalności w rozpuszczalnikach polarnych spo­
w odow ały, że zsyntezow ano pochodne zawierające grupy
hydrofiłow e rozszerzając możliwości w ykorzystania fulerenów. N iektóre z pochodnych fulerenów mają już swoje n a­
zw y g ru p o w e zw iązane z obecnością określonych p o d staw ­
ników , np. C60(OH)n to fulerole, C6t)H n - fulerany. Poniżej
om ów iono głów ne nurty badań i możliwości w ykorzysta­
nia fulerenów i ich pochodnych w biologii.
T O K S Y C Z N O Ś Ć FULERENÓW
Cząsteczki C60 w kontakcie z w odą, tw orzą trw ałe agre­
gaty nanom etrow ych w ym iarów (25-500 nm) nazyw ane
nano-C 60. Ich wielkość, barwa, własności pow ierzchniow e
oraz reaktyw ność różnią się w zależności od w aru n k ó w w
jakich pow stały. Zawiesiny C60 pozostają trw ałe w przecią­
gu miesięcy w roztw orach o niskiej sile jonowej (I < 0,05).
Istnieją doniesienia, że zaw iesiny te są toksyczne dla kom ó­
rek i w yw ołują uszkodzenia poprzez oddziaływ anie elek­
trostatyczne ze strukturam i kom órkow ym i [3,4] i poprzez
reaktyw ne form y tlenu [5,6].
Badania spektrofotom etryczne z użyciem jodofenolu w y ­
kazały, że w układzie nie zawierającym kom órek, nano-C 60
jest odpow iedzialny za pow staw anie anionorodnika ponadtlenkow ego [5]. A nionorodnik p onadtlenkow y (Oy ) należy
do RFT i jest p ro d u k tem jednoelektronowej redukcji tlenu.
N atom iast fulerol C60(OH)24 nie indukow ał pow staw ania
anionorodnika ponadtlenkow ego. M ożna na podstaw ie p o ­
w yższych informacji w nioskować, że toksyczność nano-C 60
w ynika z generow ania w układzie zawierającym kom órki
anionorodnika ponadtlenkow ego, który jest bezpośrednią
przyczyną zaobserw ow anych uszkodzeń.
W Ł AŚC IW O ŚC I ANTYBAKTERYJNE I
A N T YW IRU SO W E, TERAPIA F O T O D Y N A M IC Z N A
DZIAŁANIE ANTYBAKTERYJNE
Badania nad toksycznością fulerenów p row adzone
na
kom órkach bakteryjnych
zwróciły
uw agę
na
możliwość w ykorzystania tych zw iązków jako czynników
bakteriobójczych. Fulereny i ich pochodne w ykazyw ały
działanie bakteriobójcze zarów no przeciw ko bakteriom
G ram -dodatnim jak i G ram -ujem nym . Tsao i w sp. [7]
Fortner i w sp. [3] zaobserw ow ali, że nano-C60 w stęże­
niach pow yżej 0,4 p pm pow oduje zaham ow anie w zro­
stu bakterii E. Coli D H 5a i B. Subtilis CB315 w hodow lach
pro w adzonych w różnych pożyw kach oraz w w arunkach
tlenow ych i beztlenowych. O ddychanie bakterii było ham o ­
w ane przez zaw iesiny nano-Ch0, natom iast inkubacja kom ó­
rek z fulerolem (C60(OH)2224) nie w yw oływ ała zm ian w in­
tensyw ności oddychania. A utorzy sugerują, że toksyczność
nano-C W
) jest zw iązana z oddziaływ aniem cząsteczek C6Q/
posiadających ujemny ładunek na pow ierzchni, z błonam i
kom órkow ym i bakterii.
Podobne w yniki uzyskali Lyon i wsp. [4] analizując ana­
logiczne układy badawcze.
92
R y cin a 2. Struktura h y d r o k sy fu ler en u (fulerolu) CM(O H )2(.
w w w .postępy biochem ii.pl
http://rcin.org.pl
badali 20 szczepów bakteryjnych, w tym Staphylococcus
spp., Enterococcus faecalis, E. Coli, Salmonella typhi i Klebsiella
pneumoniae w kierunku wrażliwości na karboksyfuleren,
a d d u k t C60 i trzech cząsteczek kw asu m alonow ego (C3)
(Ryc. 3). Pochodna ta działała bakteriobójczo na wszystkie
szczepy bakterii G ram -dodatnich w stężeniach poniżej 50
m g /l. N atom iast bakterie Gram -ujem ne nie były w rażliw e
naw et na stężenie 500 m g /l. A utorzy stwierdzili, że
następow ało włączenie pochodnej fulerenu do ściany
komórkowej Staphylococci i Streptococci oraz destrukcja błony
plazmatycznej w bakteriach G ram -dodatnich. W badaniach
in vivo na m yszach zakażonych Streptococcus pyogenes,
karboksyfuleren
podany
dootrzew now o
zmniejszał
śmiertelność m yszy o 33% [8].
Prow adzone są też prace n ad antybakteryjnym działa­
niem kationow ych fulerenów poprzez blokow anie o d d y ­
chania bakterii [9,10]. M ashino i w sp. [10] zaobserw ow ali
dw ufazow e działanie dw óch izom erów położenia jodku
C60-bis(N,N-dim etylopirolidyniowego) na w ew nętrzne bło­
ny bakterii E. coli. O bydw a izom ery w stężeniach poniżej 5
pM pow odow ały obniżenie szybkości absorpcji tlenu, nato­
m iast dla stężeń powyżej 10 pM absorpcja tlenu wzrastała.
A ktyw ność analizow anych izom erów zależała od ich stęże­
nia oraz od w arun k ó w doświadczenia, tj. obecności lub bra­
ku światła. Pom iary w oltam perom etryczne potw ierdziły,
że dla w yższych stężeń jodku C60-bis(N,N-dimetylopirolidyniowego) w układzie powstaje H 20 2 w reakcji zred u k o­
wanej form y pochodnej fulerenu z tlenem cząsteczkowym.
Dalsze prace [11] wykazały, że pochodne C podstaw ione
długim i łańcuchami w ęglow odorow ym i nie w ykazują ak­
tywności przeciw ko badanym bakteriom.
TERAPIA FOTODYNAMICZNA
Fulereny z grupam i hydrofilowymi, w tym kationowym i,
są też obiecującymi kandydatam i do stosow ania w terapii
fotodynamicznej. W ykazują większą w ydajność i selektyw ­
ność w zabijaniu bakterii gram -dodatnich, gram -ujem nych
i grzybów niż stosow ane obecnie antybiotyki [12]. Jedną z
ostatnio zsyntezow anych pochodnych o w spom nianych
wyżej właściwościach jest pochodna podstaw iona (3-cyklodekstryną [13]. Posiada zdolność do rozszczepiania DNA
po naprom ieniow aniu światłem w idzialnym w tem peratu­
rze pokojowej.
R y cin a 3. A d d u k t fu leren u i trzech cz ą stec zek k w a s u m a lo n o w e g o (C3).
Fulereny m ogą znaleźć także zastosow anie w terapii
fotodynamicznej now otw orów . Ze w zględu na wielkość
cząsteczki są transportow ane do kom órki poprzez receptoroniezależną endocytozę lub pinocytozę. Tworząc po chod­
ne C60, które w ydajnie będą generow ać reaktyw ne formy
tlenu, można, operując podstaw nikam i, tworzyć zw iązki o
określonej selektywności. Wielkość cząsteczki i sposób jej
transp o rtu do kom órki ogranicza także m aksym alne stęże­
nie pochodnej fulerenu w komórce. Badano dw ie pochodne
C60 z pirofeoforbidem a i ich toksyczność dla kom órek ostrej
białaczki limfatycznej (Jurkat) [17]. Pirofeoforbid a (PI) jest
fotouczułaczem, który dobrze w nika do komórek. Zsyntetyzow ano mono- (FP1) i heksapochodną (FHP1) C60 z PI o
w zorach jak na Ryc. 4. Zaobserw ow ano, że w pochodnej
FP1 następuje fotoindukow any transfer elektronu z reszty
pirofeoforbidowej do Ch() i obniżenie fototoksyczności tego
zw iązku w porów naniu z pochodną FHP1 i PI. W pochod­
nej FHP1 obecność pięciu grup m alonianu dietylu p ow od u -
O dpow iedzialne za fototoksyczność fulerenów są reak­
tyw ne formy tlenu generow ane w w yniku transferu energii
lub elektronu z cząsteczki fulerenu na tlen [14]. Yamakoshi
i w sp. [15] wykazali, że tlen singletowy ’O, powstaje p o d ­
czas naśw ietlania światłem w idzialnym roztw orów C60 w
niepolarnych rozpuszczalnikach. W rozpuszczalnikach p o­
larnych, w tym w w odzie, p roduktam i naśw ietlania C60 były
anionorodnik ponadtlenkow y (Oy ) i rodnik hydroksylow y
( OH). Wydajność tw orzenia tych reaktyw nych form tlenu
była większa, gdy w roztw orze znajdow ały się fizjologicz­
ne stężenia zw iązków redukujących np. NADH. H am ano
i w sp. [16], badając rozpuszczalne w w odzie pochodne C60
obserw ow ali generow anie tlenu singletowego także w roz­
tw orach wodnych.
R y cin a 4. M o n o p o ch o d n a C60 z p iro fe o fo rb id em a (FP1) i h e k sa p o ch o d n a C60 z
p iro fe o fo rb id em a i m a lo n ia n em d iety lu (FHP1).
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
93
je zablokow anie transferu elektronu w ew nątrz cząsteczki i
generow anie w układzie tlenu singletowego.
Obiecujące w terapii fotodynamicznej wydają się być po ­
chodne C60 z przyłączonym i dw iem a do czterech cząstecz­
kami kw asu m alonow ego [18,19], Po naprom ieniow aniu
św iatłem w idzialnym ham ow ały w zrost kom órek HeLa.
Toksyczność pochodnej fulerenu była zależna od ilości p o d ­
staw ników , stężenia zw iązku i czasu naprom ieniow ania.
Dla dipodstaw ionej pochodnej uzyskano 63% obniżenie
w zrostu kom órek przy stężeniu karboksyfulerenu 40 pM
[19]. Pochodne te pow odow ały także blokadę cyklu ko­
m órkow ego HeLa, obniżając liczbę kom órek w fazie G1 i
podwyższając liczbę kom órek w fazie G2+M cyklu kom ór­
kowego.
W ynika stąd, że nie tylko RFT są o dpow iedzialne za fototoksyczność pochodnych fulerenów, ale możliw y jest udział
innych m echanizm ów ham ow ania w zrostu czy zabijania
komórek. Bardzo istotna jest także wielkość i geom etria p o ­
chodnej fulerenu oraz możliwość kontaktu fragm entu C60 z
obszarem m ającym ulec uszkodzeniu [14,18]. Porów nując
fototoksyczność dendro[C 60]fulerenu z pochodną p o d sta­
w ioną kw asem m alonow ym należałoby oczekiwać większej
toksyczności po dendro[C w)]fulerenie, ze w zględu na w ięk­
szą wydajność kw antow ą tw orzenia tlenu singletow ego w
układzie. Jednak efekty w układzie kom órkow ym (Jurkat)
są odw rotne. M ożna sugerować, że fragm ent C60, który jest
bezpośrednio odpow iedzialny za transfer energii i genero­
w anie RFT oraz obecność zbyt dużych podstaw ników (jak
w d endro[C 60]fulerenie) może obniżać efekt cytotoksyczny z
pow o du zbyt dużej odległości od celu w komórce [18]. Jed­
nak nie należy zapominać, że fulereny mają także zdolność
zm iatania RFT i wg. Bensasson i wsp. [20] dendro[C 60]fuleren
reaguje z ’0 2 3,5-krotnie szybciej niż pochodna z kw asem
m alonow ym , z szybkościami reakcji rzędu 107 s'1.
WŁAŚCIWOŚCI ANTY-HIV
W udl i wsp. [21,22] wykazali, że proteaza HIV (HIV-P)
może być skom pleksow ana i zaham ow ana przez C60, który
idealnie pasuje do miejsca wiążącego tego enzym u. Jednak
brak rozpuszczalności C60 w rozpuszczalnikach polarnych,
a co za tym idzie w płynach biologicznych ograniczało far­
makologiczne zastosow ania fulerenu. W zw iązku z tym b a­
dano pochodne C60 z podstaw nikam i polarnym i i w y k aza­
no, że dendrofulereny [23] w ykazują działanie anty-H IV w
limfocytach człowieka z EC_0 = 0,22 pM [24], Dalsze badania
w ykazały, że inne dw upodstaw ione pochodne C60 rów nież
cechują się aktyw nością antyw irusow ą. Rajagopalan i wsp.
[25] wykazali, że pochodna bis-sukcynoim ido p,p'-bis-(2amino-etylo)-difenylo-Ch0 w ykazuje działanie przeciw ko
w irusom HIV-1 i HIV-2 w badaniach in vitro. Ponadto, zw ią­
zek ten jest dobrze tolerow any przez m yszy po p o d an iu
dootrzew now ym . Jednak istotne są: w zajem ne położenie
podstaw ników , obecność dodatniego ładu n k u w pobliżu
„węglowej piłki" oraz wielkość podstaw ników . Długie, p o ­
larne łańcuchy podstaw ione do fulerenu pow odują znaczną
cytotoksyczność zw iązku i obniżenie zdolności niszczenia
w irusa HIV. M archesan i wsp. [26] zaproponow ali kilka
dw upodstaw ionych pirolidynofulerenów różniących się
geometrią cząsteczki i na podstaw ie aktyw ności a n ty w iru ­
94
sowej w zainfekow anych w irusam i HIV-l(IIIB) lub HIV2(ROD) limfocytach człowieka ocenili, że sole am oniow e
izom erów trans w ykazują silne działanie antyw irusow e w
nanom olarnych stężeniach. N atom iast izom er cis i forma
z w iązaniam i ekw atorialnym i były odpow iednio mało ak­
tyw ne lub całkowicie nieaktyw ne w kierunku HIV.
W Ł A ŚC IW O ŚC I A NT YO K SY DA CY JNE
R eaktyw ne form y tlenu, m iędzy innymi: nadtlenki, anionorodnik p onadtlenkow y (Oy ) i rodnik hydroksylow y
( OH) są o dpow iedzialne za uszkodzenia stru k tu r kom ór­
kow ych prow adzące w efekcie do śmierci komórki. Istnieje
wiele czynników generujących w kom órkach stres oksyda­
cyjny, którego w ynikiem jest p o dw yższony poziom reak­
tyw nych form y tlenu w kom órkach i tkankach. N ależą do
nich: prom ieniow anie UV, prom ieniow anie jonizujące, ksenobiotyki, zw iększony wysiłek fizyczny. W etiologii wielu
chorób, np. neurodegeneracyjnych, jak choroba A lzheim e­
ra, choroba Parkinsona, w skazuje się na udział RFT. Rod­
niki tlenow e odpow iedzialne są rów nież za procesy starze­
nia. Znalezienie skutecznych zm iataczy RFT w w arunkach
in vivo m oże pom óc zmniejszyć lub w yelim inow ać skutki
podw yższonego stężenia reaktyw nych form tlenu [27].
Pochodne fulerenów rozpuszczalne w w odzie, np. fulerole (polihydroksyfulereny) [Ch0(O H )J, karboksyfulereny,
PEG-fulereny (fuleren m odyfikow any glikolem polietyle­
now ym ) lub PVP-fulereny (cząsteczki CH) opłaszczone poliw inylopirolidonem ) są skutecznym i zm iataczam i w olnych
rodników generow anych w w aru n kach stresu oksydacyjne­
go w kom órkach. N a tyle skutecznym i, że n azw an o je „gąb­
kami rodnikow ym i" (radical sponge) [28,29]. N azw ę „Ra­
dical Sponge®" zastrzeżono n aw et dla pochodnej powstałej
przez opłaszczenie CM) przez poliw inylopirolidon o masie
cząsteczkowej 60-80 kDa w stosunku m olow ym 0,42-0,67:1.
Powstaje w ten sposób rozpuszczalny w w odzie zw iązek ze
średnim przekrojem cząsteczki około 688 n m [29],
PVP-, gam m a-cyklodekstryno- i hydroksy- fulereny w y ­
kazyw ały silne działanie antyoksydacyjne w keratynocytach skóry człowieka (HaCaT) p od d any ch działaniu UVB
[30]. Oceny dokonano m etodą fluorescencyjną na p od sta­
wie testu z dioctanem karboksydichlorofluoresceiny, który
ocenia ogólny poziom stresu oksydacyjnego w układzie.
Z aobserw ow ano także ochronne właściwości pochodnych
fulerenów , gdy stres oksydacyjny inicjowano za pom ocą tBuOOH. Z aobserw ow anie tych właściwości sugeruje m oż­
liwość dyfuzji rozpuszczalnych w w odzie pochodnych fu­
lerenów w poprzek błon kom órkow ych. Ponadto, zaobser­
w ow ano ochronne działanie pochodnych C60 w inicjowanej
przez t-BuOOH podobnej do apoptozy śmierci keratynocytów skóry człowieka.
W układzie chemicznym , gdy rodniki hydroksylow e
generow ano w reakcji Fentona, a anionorodniki ponadtlenkow e enzym atycznie przez układ ksantyna-oksydaza
ksantynow a, badania p ro w ad zo n e m etodą EPR w ykazały
skuteczność PEG-, hydroksy-, izostearyniano-fulerenów
większą lub porów nyw alną z kw asem askorbinow ym lub
jego 2-O-fosforylowaną pochodną [29,30].
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
Fulerole (C60(OH)n n=18-22) okazały się także skuteczny­
mi zm iataczam i rodników generow anych radiacyjnie [31].
D odanie fulerolu do kom órek Stylonychia mytilus chroniło
je przed prom ieniow aniem gam m a z 60Co aż do daw ki 1500
Gy. Poziom ochrony był zależny od stężenia fulerolu w za­
w iesinie kom órek i m aksym alny osiągnięto dla 0,10 m g /m l.
Jednak podniesienie stężenia do 0,25 m g /m l pow odow ało
zm niejszenie przeżyw alności komórek w stosunku do kon­
troli naprom ieniow anej daw ką 500 Gy.
Fulereny m ogą chronić nie tylko przed reaktyw nym i
form am i tlenu. W ykazano, że fulerole bezpośrednio reagują
z tlenkiem azotu N O [32], Fulerol C60(OH)24 chronił bezjądrzaste kom órki śródm iąższow e jądra dorosłych szczurów
p rzed reaktyw nym i form ami azotu. H am ow ał w yw oływ a­
ne przez NO obniżenie aktywności katalazy, transferazy
glutationow ej i peroksydazy glutationowej.
Czy „pochłanianie" rodników jak gąbka to jedyny m e­
chanizm działania fulerenów jako zm iataczy w olnych ro d ­
ników ? Istnieją wyniki, które potwierdzają, że niektóre p o ­
chodne fulerenów m ogą naśladow ać enzymy. Pochodna C60
z trzem a cząsteczkami kw asu m alonow ego (C3) w ykazuje
aktyw ność manganow ej dysm utazy ponadtlenkow ej (MnSOD) w w arunkach in vitro i in vivo [33]. Reakcja pom iędzy
Oy a C3 nie zachodzi bezpośrednio [20], ale poprzez kata­
lityczną dysm utację anionorodnika ponadtlenkow ego. Po­
danie C3 m yszom SO D 2'/_, z niedoborem mitochondrialnej
MnSOD, pow odow ało 3-krotne w ydłużenie długości ich
życia. Badania im m unocytochem iczne potw ierdziły, że C3
lokuje się w m itochondriach. Można więc przypuszczać, że
efektyw ne naśladow anie działania SOD jest kolejną cechą
tego wielofunkcyjnego związku.
G harbi i wsp. [34] donoszą, że nie tylko rozpuszczalne w
w odzie pochodne, ale w o d na zawiesina Ch(| (cząstki o śred­
nicach od 60 do 1650 nm) po d aw an a dootrzew now o szczu­
rom chroniła ich w ątroby przed w olnorodnikow ym uszko­
dzeniem indukow anym czterochlorkiem węgla (tetrachlorom etanem ). A utorzy ci sugerują, że wcześniejsze doniesie­
nia o toksyczności w odnych zawiesin C60 na kom órki [5,6]
w iążą się ze sposobem przygotow ania zaw iesin i m ożli­
wością adsorpcji rozpuszczalników organicznych użytych
do w stępnego przygotow ania nano-C60 na pow ierzchni
„węglowej piłki". Brak toksyczności C6Qzaw artego w sadzy
fulerenowej zawierającej do 15% C60 zaobserw ow ali także
polscy naukow cy H uczko i wsp. [35], którzy badali w pływ
w odnej zaw iesiny sadzy fulerenowej na skórę człowieka w
kierunku w yw oływ ania reakcji alergicznych.
PO D SU M O W A N IE
Fulereny wydają się być bardzo obiecującą klasą zw iąz­
ków mogących spełniać wiele funkcji biologicznych w za­
leżności od jakości i ilości podstaw ników , wielkości czą­
steczki, sposobu przygotow ania zaw iesin lub roztw orów ,
zastosow anego stężenia zw iązku. Jednak m nogość tych
funkcji zm usza także do brania pod uw agę, czasami prze­
ciw staw nego ich działania, szczególnie w w arunkach in
vivo. W ym aga to dalszych b ad ań i prac uwzględniających
różne w arunki p row adzenia reakcji.
PIŚM IE N N IC T W O
1. Aldersey-W illiam s H (1997) Najpiękniejsza m olekuła, W ydaw nictw o
A m ber, W arszaw a
2. H uczko A (2000) Fulereny, W ydaw nictw o N aukow e PW N, W arsza­
wa
3. Fortner JD, Lyon DY, Sayes CM, Boyd AM, Falkner JC, H otze EM, Alem any LB, Tao YJ, G uo W, A usm an KD, Colvin VL, H ughes JB (2005)
C60 in water: nanocrystal form ation and microbial response. Environ
Sci Technol 39:4307-4316
4. Lyon DY, Fortner JD, Sayes CM, Colvin VL, H ughe JB (2005) Bacterial
cell association and antim icrobial activity of a C60 w ater suspension.
Environ Toxicol Chem 24: 2757-2762
5. Sayes CM, Fortner JD, Guo W, Lyon D, Boyd AM, A usm an KD, Tao
YJ, Sitharam an B, W ilson LJ, H ughes JB, W est JL, Colvin VL (2004) The
differential cytotoxicity of water-soluble fullerenes. N ano Lett 4:18811887
6. Sayes CM, Gobin AM, A usm an KD, M endez J, West JL, Colvin VL
(2005) Nano-Cwl cytotoxicity is due to lipid peroxidation. Biomaterials.
26: 7587-7595
7. Tsao N, Luh TY, C hou CK, Chang TY, W u JJ, Liu CC, Lei HY (2002) In
vitro action of carboxyfullerene. J A ntim icrob Chem other 49: 641-649
8. Tsao N, Luh TY, Chou CK, W u JJ, Lin YS, Lei HY (2001) Inhibition
of group A. streptococcus infection by carboxyfullerene. Antimicrob
Agents Chem other 45:1788-1793
9. M ashino T, O kuda K, H irota T, H irobe M, N agano T, M ochizuki M
(1999) Inhibition of E. Coli grow th by fullerene derivatives and inhibi­
tion mechanism. Bioorg Med Chem Lett 9: 2959-2962
10. M ashino T, Usui N, O kuda K, H irota T, Mochizuki M (2003) Respi­
ratory chain inhibition by fullerene derivatives: hydrogen peroxide
production caused by fullerene derivatives and a respiratory chain
system. Bioorg Med Chem 11:1433-1438
11. M ashino T, N ishikaw a D, Takahasi K, Usui N, Yamori T, Seki M, Endo
T, M ochizuki M (2003) Antibacterial and antiproliferative activity of
cationic fullerene derivatives. Bioorg Med Chem Lett 13:4395-4397
12. Tegos GP, D em idova TN, Arcila-Lopez D, Lee H, W harton T, Gali H,
H am blin MR (2005) Cationic fullerenes are effective and selective anti­
microbial photosensitizers. Chem Biol 12:1127-1135
13. Liu Y, Zhao YL, Chen Y, Liang P, Li L (2005) A water-soluble ß-cyclodextrin derivative possessing a fullerene tether as an efficient photo­
driven DNA-cleavage reagent. T etrahedron Lett 46: 2507-2511
14. G uldi DM, Prato M (2000) Excited-state properties of C ^ fullerene de­
rivatives. Acc Chem Res 33: 695-703
15. Yamakoshi Y, U m ezaw a N, Ryu A, A rakane K, M iyata N, G oda Y,
M asum izu T, N agano T (2003) Active oxygen species generated from
photoexcited fullerene Ch(| as potential medicines: Oy versus '0 2. J
Am Chem Soc 125:12803-12809
16. H am ano T, O kuda K, M ashino T, H irobe M, A rakane K, Ryu A, Mashiko S, N agano T (1997) Singlet oxygen production from fullerene
derivatives: effect of sequential functionalization of the fullerene core.
Chem C om m un 1: 21-22
17. Rancan F, H elm reich M, Moelich A, Jux N, Hirsch A, Roeder B, W itt C,
Boehm F (2005) Fullerene-pyropheophorbide a complexes as sensitizer
for photodynam ic therapy: U ptake and photo-induced cytotoxicity on
Jurkat cells. J Photochem Photobiol B 80:1-7
18. Rancan F, Rosan S, Boehm F, Cantrell A, Brellreich M, Schoenberger
H, Hirsch A, M oussa F (2002) Cytotoxicity and photocytotoxicity of a
dendritic CMm ono-adduct and a m alonic acid C ^ tris-adduct on Jur­
kat cells. J Photochem Photobiol B 67:157-162
19. Yang XL, Fan CH, Z hu HS (2002) Photo-induced cytotoxicity of malo­
nic acid [C60]fullerene derivatives and its m echanism. Toxicology in
Vitro 16: 41-46
20. Bensasson RV, Brettreich M, Frederiksen J, G öttinger H, Hirsch A,
Land EJ, Leach S, McGarvey DJ, Schonberger H (2000) Reactions of
e‘ , COy / HO', 0 2 and O/'A^) w ith a dendro[C60]fullerene and
C ^[C (C O O H )Jn (n = 2-6). Free Radic Biol M ed 29: 26-33
95
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
http://rcin.org.pl
21. Sijbesma R, Srdanov G, W udl F, Castoro JA, W ilkins C, Friedm an SH,
DeCamp DL, Kenyon GL, (1993) Synthesis of a fullerene derivative for
the inhibition of HIV enzymes. J Am Chem Soc 115: 6510-6512
UVA irradiation but not visible-light-catalyzed cytotoxicity in hum an
skin keratinocytes. Bioorg M ed Chem Lett 16:1590-1595
22. Friedm an SH, DeCamp DL, Sijbesma RP, Srdanov G, W udl F, Kenyon
GL (1993) Inhibition of the HIV-1 protease by fullerene derivatives:
m odel building studies and experim ental verification. J A m Chem Soc
115: 6506-6509
30. Xiao L, Takada H, M aeda K, H aram oto M, M iwa N (2005) A ntioxidant
effects of w ater-soluble fullerene derivateves against ultraviolet ray
or peroxylipid through their action of scavenging the reactive oxygen
species in h u m an skin keratynocytes. Biomed Pharm acother 59: 351358
23. Brettreich M, Hirsch A (1998) A highly
dendro[60]fullerene. Tetrahedron Lett 39: 2731-2734
31. Zhao Q, Li Y, Xu J, Liu R, Li W (2005) Radioprotection by fullerenols of
Stylonychia mytilus exposed to y-rays. Int J R adiat Biol 81:169-175
water-soluble
24. Schuster DI, W ilson LJ, Kirschner AN, Schinazi RF, Schlueter-W irtz
S, T ham ish P, Barnett T, Ermolieff J, Tang J, Brettreich M, Hirsch A
(2000) Evaluation of the anti-HIV potency of a w ater-soluble dendrimeric fullerene. Proc Electrochem Soc PV2000-9:267-270
32. M irkov SM, Djordjevic AN, Andric NL, A ndric SA, Kostic TS, Bogdanow ic GM, Vojinovic-M iloradov MB, Kovacevic RZ (2004) Nitric
oxide-scavenging activity of polyhydroxylated fullerenol, C60(OH)24.
Nitric O xide 11: 201-207
25. Rajagopalan P, W udl F, Schinazi RF, Boudinot FD (1996) Pharm aco­
kinetics of a water-soluble fullerene in rats. A ntim icrob Agents Chem other 40: 2262-2265
33. Ali SS, H ardt JI, Q uick KL, Kim -Han JS, Erlanger BF, H uang T, Epstein
CJ, D ugan LL (2004) A biologically effective fullerene (CM) derivative
w ith superoxide dism utase m im etic properties. Free Rad Biol M ed 37:
1191-1202
26. M archesan S, Da Ros T, Spalluto G, Balzarini J, Prato M (2005) AntiHIV properties of cationic fullerene derivatives. Bioorg M ed Chem
Lett 15: 3615-3618
27. Bartosz G (2003) Druga tw arz tlenu. W olne rodniki w przyrodzie.
Wyd. II zmienione, W ydaw nictw o N aukow e PWN, W arszawa.
28. Bosi S, Da Ros T, Spalluto G, Prato M (2003) Fullerene derivatives: an
attractive tool for biological applications. Eur J M ed C hem 38:913-923
34. G harbi N, Pressac M, H adchouel M, Szwarc H, W ilson SR, M oussa F
(2005) [60]Fullerene is a pow erful antioxidant in vivo w ith no acute or
subacute toxicity. N ano Lett 5: 2578-2585
35. H uczko A, Lange H, Calko E (1999) Fullerenes: experim ental evidence
for a null risk of skin irritation and allergy. Full Sci Techn 7:935-939
29. Xiao L, Ta'kada H, Gan XH, Miwa N (2006) The w ater-soluble fuller­
ene derivative 'Radical Sponge®' exerts cytoprotective action against
Fullerenes in biology
A nita K rokosz
D epartm ent of M olecular Biophysics, U niversity of L odz, 12/16 Banacha Str., 90-237 Lodz, Poland
Ee-mail: krokosz@ biol.uni.lodz.pl
Key words: fullerenes, antioxidants, toxicity, antiviral properties, photosensitizers
A BSTRACT
Fullerenes are chemical structures made of carbon atoms. The stable form is m olecule com posed of 60 carbon atoms arranged in a soccer
ball-shaped structure. With respect to its electron donor and acceptor capability and photochemical behavior fullerenes can be effective anti­
oxidants and radical scavengers or prooxidants and photosensitizers. T hese properties of fullerenes have paid attention on their p ossible bio­
logical applications. Results of previous studies point to the great dépendance of fullerenes activity upon quality, quantity and geometry of
substituents in fullerene derivatives. Some of fullerene derivatives sh ow antiviral and antimicrobial activity, including anti-HIV properties.
and its derivatives are able to exhibit cytotoxic and enzym e-inhibiting abilities as w ell as radical-quenching and antioxidative abilities.
Generation of reactive oxygen species under influence of visible light is another ability of fullerene derivetives desired in photodynamic
therapy.
96
w w w .postepybiochem ii.pl
http://rcin.org.pl
WSKAZÓWKI
Prace przeznaczone do publikacji w „Postępach Biochemii" m ogą
mieć charakter artykułów m onograficznych, krótkich not o najnow ­
szych osiągnięciach i poglądach oraz listów do Redakcji. Redakcja nie
ogranicza objętości m an uskryptów , jakkolw iek w każdym p rz y p ad k u
zalecana jest zwięzłość stylu, bez utraty jasności przekazu.
A utorzy odpow iadają za praw idłow ość i ścisłość podaw anych infor­
macji oraz popraw ność cytow anego piśm iennictw a. Ujęcie prac w inno
być syntetyczne, a p rzed staw io n e zagadnienia zilustrow ane za pom ocą
tabel i rycin (wykresy, schem aty, reakcje, w zory chem iczne, fotogra­
fie), w u z asadnionych p rz y p ad k a ch kolorow ych. W przy p ad k u , gdy
A utorzy zam ierzają w łączyć do sw ego a rtykułu ilustracje publikow ane
p rzez au to ró w cytow anych prac oryginalnych, do czego Redakcja za­
chęca, n ależy uzyskać i przekazać nam zgodę na p rzedruk, zarów no od
autorów , jak i z w ydaw nictw a. Niem niej konstruow anie oryginalnych
rycin i zbiorczych tabel na p odstaw ie d anych z p iśm iennictw a jest rów ­
nież m ile w idziane. Przekazanie a rtykułu do redakcji jest rów noznacz­
ne z ośw iadczeniem , że nad esłan a praca nie była publikow ana ani nie
została zgłoszona do publikacji w innym czasopiśm ie, natom iast jeżeli
zostanie ogłoszona w „Postępach Biochemii", jej publikacja w całości
lub w e fragm entach w in n y m czasopiśm ie w ym agać będzie uprzedniej
zgody Redakcji.
R edaktor N aczelny lub R edaktor P row adzący pracę podejm uje de­
cyzję o przyjęciu lub od rzu cen iu m an u sk ry p tu na podstaw ie własnej
opinii i opinii dw óch niezależnych recenzentów , w ciągu 6 tygodni od
m om entu otrzym ania a rtykułu. W przy p ad k u , kiedy praca w ym aga
p o p ra w ek odautorskich, A u to rzy otrzym ują drogą elektroniczną opi­
nie recenzentów i proszeni są o przygotow anie popraw ionej wersji
m an u sk ry p tu i odesłanie go do Redakcji w ciągu 8 tygodni. O statecz­
ną decyzję o przyjęciu pracy podejm uje Redaktor N aczelny w ciągu 2
tygodni od otrzym ania popraw ionej wersji m anuskryptu.
A utorzy są zobow iązani do w ykonania korekty autorskiej i poinfor­
m ow ania Redakcji o koniecznych zm ianach, pocztą elektroniczną lub
faksem , w ciągu 3 dni od chw ili otrzym ania.
K ażdy z A utorów otrzym uje jeden egzem plarz nu m eru „Postępów
Biochem ii", w którym ukazał się jego artykuł.
WSKAZÓWKI SZCZEGÓŁOWE:
Przed przystąpieniem do napisania artykułu A utorzy są prosze­
ni o zapoznanie się z najnow szym num erem „Postępów Biochemii",
aby przygotow ać pracę p o d w zględem edytorskim , językow ym oraz
jakości m ateriału ilustracyjnego, które będą o dpow iadały aktualnym
w ym ogom Redakcji. A rtykuły pow inny być pisane językiem nauko­
w ym , lecz zrozum iałym dla niespecjalistów. P opraw ność logiczna i
stylistyczna tekstu w arunkuje jego jednoznaczność i czytelność. A uto­
rzy w inni unikać składni obcojęzycznej, gw ary laboratoryjnej, a także
ograniczać stosow anie skrótów naw et, jeśli byw ają u żyw ane w p ra ­
cach specjalistycznych. K ażda z prac nadesłanych do Redakcji podlega
ocenie specjalistów i opracow aniu redakcyjnem u. Redakcja zastrzega
sobie praw o dokonania skrócenia tekstu i w prow adzenia koniecznych
zm ian, rów nież w m ateriale ilustracyjnym .
PRZYGOTOWANIE MANUSKRYPTU:
P rosim y o nadsyłanie prac pocztą elektroniczną. W w yjątkow ych
p rz y p ad k a ch dopuszcza się przysyłanie prac na dyskietce lub płycie
CD. Tekst w inien być zapisany jako *.doc w form acie IBM PC, a pliki
zaw ierające ryciny jako: *.tif, *.cdr, *.psd lub *.eps. Tekst pow inien być
napisany z zachow aniem podw ójnego odstępu m iędzy w ierszam i, z
użyciem czcionki Times N ew Rom an 12 lub Arial 12. Sym bole i zna­
ki specjalne prosim y w staw iać kom endą „insert". W tekście prosim y
w skazać miejsce um ieszczenia figur i tabel.
ORGANIZACJA MANUSKRYPTU:
W skazany jest podział a rty k u łu na nienum erow ane rozdziały i p o d ­
rozdziały.
Strona 1 (tytułowa) zaw iera tytuł artykułu, im iona i nazw iska A u­
torów (ze w skazaniem a u to ra korespondującego), tytuł n a ukow y każ­
dego z A utorów i ich m iejsce pracy z adresem pocztow ym , num erem
telefonu i adresem poczty elektronicznej, słow a k luczow e (do 6), w ykaz
DLA
AUTORÓW
stosow anych skrótów (do 10) w p o rząd k u alfabetycznym (ograniczony
do niezbędnego m inim um ) oraz skrócony ty tu ł pracy (do 25 znaków ).
Kolejno numerowane strony obejm ują streszczenie (do 150 w y ra­
zów), tekst pracy i piśm iennictw o. N a kolejnych stronach w inny być
um ieszczone tabele oraz tytuły i objaśnienia rycin. O statnia strona w in­
na zaw ierać następujące inform acje w języku angielskim : tytuł arty k u ­
łu, im iona i nazw iska A utorów oraz miejsca pracy, słow a kluczow e (do
6) i krótkie streszczenie a rtykułu (do 150 w yrazów ).
Piśmiennictwo: N ależy unikać nadm iernej liczby cytow ań orygi­
nalnych prac, odsyłając czytelników w m iarę m ożliw ości do artykułów
przeglądow ych. Redakcja zaleca zacytow anie co najw yżej 70 p ublika­
cji, w w iększości pochodzących z ostatnich 10 lat. W ykaz piśm ienni­
ctw a obejm uje prace w kolejności ich cytow ania. W tekście, zaznacza
się je liczbam i p orządkow ym i ujętym i w naw iasy kw adratow e, np.
[3,7,9-26], Sposób cytow ania prac oryginalnych (1) i przeglądow ych
(2), książek (3), rozdziałów z książek jednotom ow ych (4), rozdziałów
z tom ów serii opracow anych przez różnych re daktorów (5) w skazują
poniżej podane przykłady:
1.
2.
3.
4.
5.
Jiang QX, W ang D N , M acK innon R (2004) Electron m icroscopic analysis o f Kv A P
voltage-d ep en d en t K+ channels in an o p en conform ation. N ature 430: 806-810
T o yoshim a C, Inesi G (2004) Structural basis o f ion p u m p in g b y Ca2+-A TPase of
the sarcoplasm ic reticulum . A n n u Rev B iochem 73: 269-292
D o ło w y K, S zew czyk A, Pikuła S (2003) Błony biologiczne, W y d a w n ic tw o N a u ­
k o w e Śląsk, Katow ice, W arszaw a
M ichalak M, N akam ura K, Papp S, O p as M (2000) Calreticulin and d ynam ics
of the en d oplasm ic reticulum lum enal environm ent, W: Pochet R (red) Calcium:
the m olecular basis of calcium action in b io lo g y and m edicine. K luw er A cad em ic
Publishers, D ordrecht, Boston, London, str. 191-205
D a rżyn k iew icz E, Jankow sk a-A n y szk a M (2000) Struktura i funkcja końca 5'
(KAPU) m R N A i U snR N A , W: Koroniak H, B arciszew ski J (red) N a pograniczu
ch em ii i b iologii, t IV. W y d a w n ic tw o N a u k o w e U n iw ersytetu im . A dam a Mick­
iew icza w Poznaniu, Poznań, str. 143-179
Tabele w inny być opatrzone jednoznacznym tytułem i ew entualnie
także niezbędnym i objaśnieniam i um ieszczonym i pod tabelą. W ielkość
tabel pow inna być dostosow ana do szerokości jednego łam u (8,5 cm)
lub strony (18 cm).
Ilustracje: ryciny w in n y być zapisane jako: *.tif, *.cdr, *.psd, lub
*.eps. Ryciny pow inny być w ykonane w skali 1:1. W ielkość ryciny po­
w inna być dostosow ana do szerokości jednego łam u (8,5 cm) lub stro­
ny (18 cm). Na rycinach nie należy um ieszczać opisów słow nych, lecz
posługiw ać się skrótam i. O pisy na rysunkach pow inny być w ykonane
czcionką Arial 8. Ilustracje i tabele prosim y przesyłać w osobnych pli­
kach. Bitm apy (pliki tif, psd) pow inny mieć m inim alną rozdzielczość
300 dpi dla obrazów kolorow ych i skali szarości (zdjęcia czarno białe)
oraz 600 dpi dla ilustracji czarno-białych (schem aty, w zory stru k tu ral­
ne zaw ierające tylko czerń i biel).
Prace w form ie elektronicznej prosim y przesyłać na adres:
[email protected]
W przy p ad k ach uzasadnionych, np. brakiem odpow iedniego opro
g ram ow ania, prosim y o przysłanie pracy na dyskietce lub płycie CD;
zabezpieczonej p rzed uszkodzeniem w czasie tran sp o rtu , na adres:
Sławom ir Pikuła
redaktor naczelny kwartalnika „Postępy Biochemii"
Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego N enckiego PAN
ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa
Opłata za druk: Z godnie z decyzją Z arz ąd u G łów nego Polskiego
T ow arzystw a Biochem icznego, od 1 stycznia 2006 roku, T ow arzystw o
pobiera od A utorów opłatę pokryw ającą częściow o koszt d ru k u
artykułu. O płata za w yd ru k o w an ie jednej strony arty k u łu w ynosi 150
zł.
Szczegółowe
inform acje
zam ieściliśm y
pod
adresem
w w w .p o ste p y b io ch e m ii.p l/o p laty .h tm .
Postępy Biochemii 53 (1) 2007
97
http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
Optymalizuj swoje wyniki
Nowość: Zestawy BD™ Calcium Assay
Helping all people
live healthy lives
Kombinacja Dająca Sukces
• Nowość: Zestawy BD™ Calcium ¡ PBX Calcium
Assay: Zw iększony stosunek sygnału do tła w
p o ró w n a n iu d o m e to d sta n da rd o w ych .
• BD Falcon™ i BD Bio C o a t™ V ie w in g Plates
d o Oznaczeń Fluorescencyjnych: W y b ó r
p rzyg o to w a n y c h do h o d o w li i g o to w y c h d o
użycia, b iologicznie pokrytych p o w ie rzch n i
• BD A C T O n e ™ cA M P Assay: Stabilnie
tra n sfe ko w a n e k o m ó rk i HEK293 posiadające
ekspresję o p a te n to w a n e g o biosensora typu
CNG (cydic n u d e o tid e -g a te d ) i re c e p to ró w
GPCR połączonych z białkiem Gs lub Gi.
w zm acniających przyleganie ko m ó re k , ich
rozprzestrzenianie i wzrost.
Skontaktuj się z nami aby dowiedzieć się
więcej o optymalizacji oznaczeń!
BD Biosciences
http://rcin.org.pl
BD, BD Logo i wszystkie Inne znaki handlowe są własnością Becton, Dickinson and Company. @2007 BD
A712-00
Becton Dickinson Polska Sp.z o.o.
ul. Królowej Marysieńki 90,
02-954 Warszawa
tek: +48 22 651 75 88
faks: +48 22 651 75 89
w w w .b d b e uro p e .co m
BD Pathaway HT™ Bioimager
Badania Żywych Komórek Za Pomocą Automatycznego
Obrazowania Konfokalnego
jBD
Helping all people
live healthy lives
Szybko rozwijane metody oparte na
komórkach do tworzenia nowych leków i badań podstawowych
• Pokrycie pełnego spectrum z użyciem 16 filtr ó w
w zbudzenia i 8 f ilt r ó w w torze emisji
• A u to fo k u s i a u tom atyczna identyfikacja
śledzenia ko m ó rki
Przełączanie pom ię d zy trybem ko n fo ka ln ym
szerokim polem
M ożliw o ść bezpośredniego oglądania
próbki jak w m ikroskopie
• Pomiary kinetyki lub p u n k tu k o ń co w e g o
Skontaktuj się z nami po więcej informacji!
Zinte g ro w an a kon tro la te m p e ra tu ry i C 0 2
• M ożliw o ść obrazo w a n ia za ró w n o k o m ó re k jak
i tka n ek
Do Badań Naukowych. Nie używać do diagnostyki lub leczenia
BD, BD Logo i wszystkie inne znaki handlowe są własnością Becton, Dickinson and Company.
A 7 12-00
http://rcin.org.pl
BD Biosciences
BD
Becton Dickinson Polska Sp.z o.o.
ul. Królowej Marysieńki 90,
02-954 Warszawa
te l.: +48 22 651 75 88
faks: +48 22 651 75 89
w w w .bdbeurope.com
Document
Category
Infarction
Views
818
File Size
9 375 KB
Tags
1/--pages
Report inappropriate content