McFarland opasite standardı hazırlanması

ULUSAL MİKROBİYOLOJİ STANDARTLARI (UMS)
McFarland Baryum Sülfat
Bulanıklık Standardı
Hazırlanması
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu 11
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri (AMD)
Bölüm
Test prosedürleri
Standart No
AMD-TP-02
Sürüm No
1.0
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no
Tarih
Değişiklik
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ.................................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR ................................................... 3
GENEL BİLGİ ........................................................................ 4
TEKNİK BİLGİLER .................................................................. 4
1
2
3
4
Asgari laboratuvar koşulları .................................................
Bulanıklık standardının hazırlanması .....................................
Kalite kontrol ....................................................................
Olası sorunlar/kısıtlılıklar .....................................................
4
5
6
7
EKLER.................................................................................. 8
Ek-1 Wickerham Eşeli .......................................................... 8
KAYNAKLAR .......................................................................... 9
McFarland bulanıklık standardı hazırlanması
Kapsam ve Amaç
Özellikle
antimikrobiyal
duyarlılık
testlerin
yapımında
hazırlanan
bakteri
süspansiyonlarında bakterinin belirli sayıda olması istenmektedir. Bakterilerin sıvı
ortamdaki sayıları ile paralel oluşturduğu bulanıklığın McFarland baryum sülfat
bulanıklık
standartları
ile
karşılaştırılarak
standart
ve
tekrarlanabilir
bir
değerlendirmenin yapılması amaçlanmaktadır. Bu doküman, McFarland baryum sülfat
bulanıklık standartlarının hazırlaması, saklanması ve standartlar ile bakteri
süspansiyonlarının değerlendirilmesi için gereken işlemleri kapsamaktadır.
Kısaltmalar ve Tanımlar
BaCl2.2H20
Baryum klorit
H2SO4
Sülfürik asit
cfu
Colony Forming Unit
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
AMD Testleri / Test Prosedürleri / AMD-TP-02 / Sürüm: 1.0 / 01.01.2014
Sayfa 3 / 9
Genel Bilgi
McFarland baryum sülfat bulanıklık standardı sıvı ortamda oluşturulan bakteri
süspansiyonlarında bulanıklık ile oluşturulan McFarland standartlarının gözle
karşılaştırılarak
içerdikleri
bakteri
sayısını
yaklaşık
olarak
saptamayı
sağlamaktadır. McFarland standartları, baryum klorit ve sülfürik asitin karışımı
suçu oluşan baryum sülfatın neden olduğu bulanıklık esasına dayanır. Baryum
klorit ve sülfürik asidin farklı volümlerde karıştırılması ile oluşan farklı bulanıklık
düzeyleri ile bakterilerin farklı sayıları ile oluşturduğu bulanıklıkların
karşılaştırılarak standardize edilmesi sağlanır. McFarland Standartlarının karşılık
geldiği bakteri sayıları bakteri türlerine göre değişiklik gösterebilmektedir(1).
Bu standart en sık McFarland 0.5 değeri ile klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında
antimikrobiyal duyarlılık testleri için kullanılacak bakteri yoğunluğunu ayarlamak
için kullanılır. McFarland 0.5; süspansiyon içinde 1,5X108 cfu/mL (genellikle
1,0X108 ile 2,0X108 arasında cfu/mL) bakteri varlığını ifade etmektedir(1).
Laboratuvarda bu test prosedürü doğrultusunda hazırlanacak McFarland baryum
sülfat bulanıklık standardı kullanılabileceği gibi ticari olarak geleneksel olarak
baryum sülfat ile veya lateks partikülleri ile hazırlanmış ürünler de
kullanılabilmektedir.
McFarland standartlarına göre
spektrofotometrik ölçüm esası
kullanılmaktadır.
bakteri sayısını değerlendirmek amacıyla
ile çalışan cihazlarda bu amaçla yaygın
Teknik Bilgiler
1 Asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
McFarland baryum sülfat bulanıklık standardı hazırlanması için laboratuvarın
minimum biyogüvenlik düzeyi 1 olmalıdır.
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Hedef mikroorganizmalarla çalışacak personelin; en az Sağlık Meslek Yüksek
Okulu mezunu Sağlık Tekniker veya Sağlık Meslek Liselerinin Tıbbi Laboratuvar
programından mezun olan Sağlık Teknisyeni statüsünde, biyogüvenlik eğitimi
almış ve bakteriyoloji laboratuvarında en az bir aylık eğitim sürecini tamamlamış
olması gerekir.
1.3. Reajen, Ekipman
Reajen

Sülfürik asit (%1’lik) H2SO4

Baryum klorit (%1,175) BaCl2.2H20
McFarland bulanıklık standardı hazırlanması
Diğer materyal, ekipman

Burgulu kapaklı tüp (13x100mm)

Spektrofotometre cihazı

Vorteks
2 Bulanıklık standardının hazırlanması
2.1. %1’lik Sülfürik asit hazırlanması

Distile su
100 mL

H2SO4
1.0 mL

100mL’lik ölçekli şişeye 90 mL distile su konulup üzerine 1.0 mL H 2SO4
eklenip karıştırılır ve hacim 100mL’ye distile su ile tamamlanır.

Laboratuvar
önemlidir.

Ağzı kapalı şişelerde 1 yıl süreyle saklanabilir.
güvenliği
açısından
sülfürik
asitin
suya
eklenmesi
2.2. %1.175’lik Baryum kloridin hazırlanması

Distile su
100 mL

BaCl2.2H20
1.175 mg

BaCl2.2H20 tartılarak 100 mL’lik ölçekli şişeye aktarılır. Şişeye 50 mL
distile su konularak karıştırılarak BaCl2.2H20’ün erimesi sağlanıp hacim
distile su ile 100 mL’ye tamamlanır.

Ağzı kapalı şişelerde 1 yıl süreyle saklanabilir.
2.3. McFarland standartları hazırlanması

%1’lik H2SO4

%1.175’lik BaCl2.2H20

Burgulu kapaklı tüplere Tablo 1’de yer alan volümlerde karşım
sağlanarak McFarland Standartları hazırlanır.

Tüpün burgulu kapağı kapatılarak, uygun şekilde etiketlenir.

Hazırlanan standart tüpleri oda sıcaklığında ve 3 ay saklanabilir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
AMD Testleri / Test Prosedürleri / AMD-TP-02 / Sürüm: 1.0 / 01.01.2014
Sayfa 5 / 9
Tablo 1: McFarland standartlarının hazırlanması için kullanılacak %1.175’lik
BaCl2.2H20 ve %1’lik H2SO4 oranları(2 uyarlanmış)
Hacim (mL)
Standart no
BaCl2 .2H2O (%1.175)
H2SO4 (%1)
Bakteri/mL
sayısı (X108)*
0.5
0,5
99,5
1,5
1
0,1
9,9
3
2
0,2
9,8
6
3
0,3
9,7
9
4
0,4
9,6
12
5
0,5
9,5
15
6
0,6
9,4
18
7
0,7
9,3
21
8
0,8
9,2
24
9
0,9
9,1
27
10
1,0
9,0
30
*Bakteri türlerine göre değerler değişmekle beraber E. coli için değerler tabloda sunulmuştur.
2.4. McFarland standartlarının kullanılması

Karşılaştırılacak McFarland Standart tüpü önce vorteks cihazı yardımı
ile kabarcık oluşturmadan karıştırılmalıdır.

McFarland standardı ile karşılaştırılacak bakteri süspansiyonu iyi bir ışık
altında beyaz zeminde yer alan siyah bantlar üzerinde veya Wickerham
eşeli kullanılarak karşılaştırılır(3). Test edilen bakteri süspansiyonunun
yer aldığı tüp ve McFarland standart tüpünün bulanıklığı eşit ise
süspansiyonda hedeflenen bakteri sayısı elde edilmiş olduğu kabul
edilir. Bulanıklık eşit değil ise bakteri süspansiyonuna bakteri ilave
edilerek veya süspansiyon dilüe edilerek bulanıklığın eşitlenmesi
sağlanır.
3 Kalite kontrol

0.5 McFarland standart süspansiyonu spektrometrede 625nm’de 0,080,10 arası absorbans göstermelidir(4).

E. coli’den inokülum hazırlanıp bulanıklığı McFarland 0.5’ye
ayarlandıktan sonra 1/10 ve 1/100 kat sulanırılıp ekim yapılır. Bir
gecelik inkübasyondan sonra koloni sayımı yapılarak 10 ya da 100 ile
çarpılarak McFarland 0.5 standartında kaç koloni bulunduğu kontrol
edilir. Beklenen koloni sayısı 1,5X108 cfu/ml olmalıdır(4).

Diğer McFarland standart no’ları için de yine E. coli’den inokülum
hazırlanıp McFarland 0.5 için 1/100 kat sulandırım, diğerleri için artan
seri sulandırım yapılır ve ekilir. Ekim sonrası üreyen koloni sayısı
sulanırım oranı ile çarpılarak elde edilen cfu tablodaki beklenen sayı ile
McFarland bulanıklık standardı hazırlanması
karşılaştırılır(4).
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Laboratuvarda hazırlanmış McFarland baryum sülfat bulanıklık standart
tüplerinin uygun şekilde etiketlenmesi, son kullanma tarihleri içinde
kullanılması ve oda ısısında, karanlıkta saklanması gerekmektedir. Bu
koşullara
uyulmadığında
yapılacak
değerlendirmelerde
sorun
yaşanacaktır.

Ticari olarak hazırlanmış McFarland standartları üreticinin öngördüğü
son kullanma tarihi geçtikten sonra kullanılmamalı, kullanım süresi
içinde oda sıcaklığı ve karanlıkta muhafaza edilmelidir.

McFarland baryum sülfat bulanıklık standartları yerine, McFarland
ölçümü yapmak üzere geliştirilmiş cihazların kullanımı önerilmektedir.
Bu amaçla kullanılacak cihazların üretici önerileri doğrultusunda ve
kalibre edilerek kullanılması gerekmektedir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
AMD Testleri / Test Prosedürleri / AMD-TP-02 / Sürüm: 1.0 / 01.01.2014
Sayfa 7 / 9
Ekler
Ek-1 Wickerham Eşeli (2)
McFarland bulanıklık standardı hazırlanması
Kaynaklar
1
2
Lynne S. Garcia. Clinical microbiology
Washington, DC, 2010.
K. C. Chapin and T. Lauderdale.
bacteriology,p.358. In P. R. Murray, E.
Pfaller, and R. H. Yolken (ed.), Manual
ASM Press, Washington, D.C., 2003.
procedures handbook.-3rd ed.
Reagents, stains, and media:
J. Baron, J. H. Jorgensen, M. A.
of CZinical Microbiology, 8th ed.
3
L. J. Wickerham. 1951. Taxonomy of yeasts, p. 11. In Technical bulletin no.
1029. U.S.Department of Agriculture, Washington, D.C.
4
Bildirimi zorunlu bulaşıcı hastalıkların laboratuvar tanısına yönelik standart
uygulama prosedürleri. Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Salgın
Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü, s:93-95, 2008.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
AMD Testleri / Test Prosedürleri / AMD-TP-02 / Sürüm: 1.0 / 01.01.2014
Sayfa 9 / 9

Download Report