Çok Düşük Frekanslı Elektromanyetik Alanların Etkisi ile Hücre Zar Potansiyelindeki Değişimlerin Floresan Spektroskopisi ile Belirlenmesi Esra Münire CÜCE1, Şule ÖNCÜL2, Burak AKSU3, Suna ÖZBAŞ TURAN4, G. Ayşe İNHAN GARİP1 1Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyofizik AbD. 2Medeniyet Üniversitesi, Tıp Fakültesi Biyofizik AbD. 3Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AbD. 4Marmara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji AbD . Giriş ve Amaç Çok düşük frekanslı elektromanyetik alanların (ÇDF- EMA) biyolojik sistemlere etkisi; farklı yöntem ve amaçlar ile uzun yıllardır incelenen konular arasında olup, araştırmacılar biyolojik sistemlerin elektromanyetik alanlar tarafından etkilendiğini bildirmektedirler. Hücre membranının dielektrik sabiti çok yüksek olduğundan, düşük frekanslı elektrik alan hücre içine nüfuz edemez ve çok düşük frekanslı elektromanyetik alanların elektrik bileşeninin hücre içini etkilemesini engelleyen bir bariyer işlevi görür (1). Bu nedenle elektromanyetik alanların etki mekanizmasının, bu alanların hücre zarında meydana getirdiği elektrokimyasal değişimlerle ve bu değişimlerin sinyal ileti sistemini etkilemesi ile açıklanabileceği görüşü kabul edilmiştir. Membranın farklı bileşenlerden oluşan homojen olmayan yapısı ve elektromanyetik alanın elektrik ve manyetik bileşenlerinden farklı şekilde etkilenir (2, 3). Bunun yanısıra membran, elektriksel veya kimyasal olarak uyarıldığında biyokimyasal reaksiyonlar oluşur. Membranın yarı geçirgen yapısı farklı molekül ve iyonlardan oluştuğu için elektrik alandan etkilenirler. Membran ile etkileşim, lipid ve protein yapısında konfigürasyon değişimine neden olmaktadır (4). Bilinen tüm bu bilgiler ışığında çalışmamızda, hem ökaryotik hem de prokaryotik hücre zarlarında meydana gelen elektrostatik değişimleri membran potansiyeline duyarlı Disc3-5 ve dipol potansiyeline duyarlı Di-8-Anepps floresan problar ile belirledik. Sonuç ve Tartışma MCF-7 YAPIŞMAYAN HÜCRELER MDA-MB-435 NON ATTACH MDA-MB- 231 NON ATTACH Bu çalışmada, ÇDF- EMA’ ların transmembran potansiyelinde ve dipol potansiyelinde meydana getirdiği değişimler araştırılmıştır. Çalışmamızda ökaryotik meme kanseri hücre soyları MCF-7, MDA-MB-231 ve MDA-MB-435 (ATCC) ile prokaryotik S.aureus (ATCC 29213) ve E.coli (ATCC 25922) hücre soyları kullanılmıştır. Bu alanların, insan meme kanseri hücrelerinin membran potansiyellerinde değişime neden olduğu gösterilmiştir. Membran potansiyelindeki bu değişimler hücre türüne göre spesifiktir. Bakteriler ile yapılan çalışmalarda, ÇDF- EMA’ ların iki bakteri türünü farklı etkilediği gösterilmiştir. DisC3-(5) floresan prob ile alınan ölçümlerde, S.aureus un deney grubu kontrole göre hiperpolarize olurken, E.coli nin deney grubunda kontrole göre depolarize olduğu saptanmıştır. Di-8ANEPPS ile alınan ölçümlerde, S.aureus’ un deney grubunun dipol potansiyeli kontrol grubuna göre azalırken, E.colinin deney grubunun dipol potansiyeli kontrol grubuna göre artmıştır. Dipol potansiyeli hücre fizyolojisinde rol oynayabilir. Lipid tabaka boyunca hidrofobik iyonların yer değiştirmesi membran dipollerini etkiler. Transmembran potansiyeli, yüzey potansiyeli ve dipol potansiyeli ile doğrudan ilişkilidir. Dipol potansiyeli, su ve lipid rezidülerinin dipolar olarak hizalanmasından kaynaklanır.Dipol potansiyeli hücre fizyolojisinde rol oynar. Lipid tabaka boyunca hidrofobik iyonların yer değiştirmesi membran dipollerini etkiler. Membran yüzeyindeki negatif yükler membranın içinde pozitif yükleri toplar ve böylece membranın içinde pozitif potansiyel oluşur (5). Daha önceki çalışmalarımızda, yüzey potansiyelinde (zeta potansiyeli) ÇDF- EMA etkisi ile S.aureusta pozitif değerler, E.coli de ise negatif değerlere kayma gözlemlemiştik. MCF-7 –YAPIŞAN HÜCRELER MDA-MB-435 ATTACH MDA-MB- 231 ATTACH Materyal ve Metod S.aureus (ATCC 29213) ve E.coli (ATCC 25922) bakteri kökenleri, triptik soy buyyon (TSB) besiyerinde, 37˚C’de bir gecelik inkubasyon ile üretildi. Üretilen kökenler, 108 hücre/ ml olacak şekilde, 5 mM HEPES ve 5 mM glikoz (pH: 7.2) çözeltisinde 2 saat süre ile 50 Hz, 1 mT manyetik alana maruz bırakıldı. MCF-7, MDA-MB-231 ve MDA-MB-435 (ATCC) meme kanseri hücre soyları, 0.03% L-glutamine, fetal bovin serum, and 0.1% antibiotik çözeltisi (penicillin, streptomycin, and amphotericin) eklenen MEM solüsyonunda, 37˚ C de CO2 etüvde üretildi. Tek bir tabaka halinde üretildikten sonra 5 dakika tripsinize edildi. 3 dakika boyunca 3000 rpm de santrifüj edildikten sonra toplanan hücreler tekrar medyuma alındı. 106 hücre/ kuyu olacak şekilde 24’lü platelere ekildi. Hemen ekimden sonra ve ekimden 3 saat sonra olmak üzere iki farklı grup halinde ÇDF- EMA’ya 3 saat süre ile maruz bırakıldı. Çok düşük frekanslı elektromanyetik alan, 32 cm uzunluğunda 400 sarımdan oluşan 15 cm yarıçapa sahip selonoid ile üretildi. Alan ölçümü F.W. Bell Sypris 5100 serisi gaussmetre (Florida, U.S.A) ile alındı. Selonoid CO2 etüve yerleştirildi. Sıcaklık ve alan stabilize edildikten sonra numuneler selonoide yerleştirildi ve ÇDF- EMA’ ya maruz bırakıldı. ÇDF-EMA uygulaması sonrası hücreler, polarizasyona duyarlı DisC3-(5) (Molecular Probes, A.B.D ) floresan boya ile 10 dakika ve dipol potansiyeline duyarlı di-8ANEPPS (Molecular Probes, A.B.D ) ile 15 dakika karanlıkta inkübe edildi (DisC3-(5) Eksitasyon: 620 nm, Emisyon:635- 750 nm) (di-8-ANEPPS Eksitasyon: 350600 nm, Emisyon: 645 nm).İnkübasyon sonrası floresan spektroskopi (Quanta Master, Kanada) ölçümleri alındı. Transmembran potansiyelinin, yüzey potansiyeli ve dipol potansiyeline bağımlılığı aşağıdaki denklemde gösterilmiştir. E.coli DisC3-(5) S. aureus DİSC3-(5) ΨT= ΨS – ΨD ΨT : transmembran potansiyeli ΨS: yüzey potansiyeli ΨD: dipol potansiyeli E.coli di-8- ANEPPS Zeta potansiyelinde ve dipol potansiyelinde meydana gelen değişimler teorik olarak birbirlerini desteklemektedir. Örneğin, DisC3(5) ölçümlerinde S.aureus’ un transmembran potansiyeli hiperpolarize olurken, yüzey potansiyeli pozitif değerlere yönelmiştir ve bu yönelmeden dolayı dipol potansiyelinde azalma meydana gelmesi sonuçlarımızın tutarlılığını göstermektedir. S. aureus Dİ-8- ANEPPS REFERANSLAR 1. 2. 3. 4. 5. Blank M, Goodman R. (1997). Do electromagnetic fields interact directly with DNA?. Bioelectromagnetics, 18: 111-115. Blank M. (1995b). Electric stimulation of protein synthesis in muscle. Adv Chem, 250: 143-153 Luben RA. (1995). Membrane signal-transduction mechanisms and biological effects of low energy electromagnetic fields. Adv Chem, 250: 437-450. Yalçın S, Erdem G. (2012). Biological effect of electromagnetic fields. African journal of biotechnology, 11(17): 3933-3941 Measurements and Implications of the Membrane Dipole Potential Liguo Wang