Alternativni pristupi korištenju laboratorijskih životinja

Alternativni pristupi korištenju laboratorijskih
životinja
Doc. dr. sc. Ana Galov
Zavod za animalnu fiziologiju
Biološkog odsjeka
Prirodoslovno-matematičkog fakulteta
Sveučilišta u Zagrebu
1
Alternativni pristupi
1959. W. Russel i R. Burch
„Načela humanih pokusnih tehnika”
(„The Principles of Humane Experimental Technique”)
Princip “3 R-a”:
-poboljšanje (refinement)
-smanjenje (reduction)
-zamjena (replacement)
POBOLJŠANJE (Refinement) - svaka metoda koja smanjuje ili isključuje nanošenje boli životinjama tokom pokusa
- upotreba „nižih” vrsta
SMANJENJE (Reduction)
- korištenje manjeg broja životinja u pokusu
- broj životinje ne smije biti toliko mali da ugrožava dobivanje relevantnih rezultata
ZAMJENA (Replacement) - upotreba tehnika koje ne koriste životinje
2
Alternativni pristupi
1978. David Smyth - fiziolog
- “Alternatives to Animal Experiments”
(Alternativni pristupi u pokusima na životinjama)
- uveo pojam „alternative” za alternativne pristupe korištenju
laboratorijskih životinja
-svaka metoda ili postupak koji ima za posljedicu ili potpuno zamjenu
životinja, ili smanjenje broja korištenih životinja, ili poboljšanje postupaka
kojima se smanjuje patnja životinja
- Smythov izraz „alternative” je zapravo sinonim s Russell i Burchovim „3 R”
3
Alternativni pristupi
Poticaj za razvoj alternativnih metoda
-etičke prirode
-ali i praktične:
upotreba laboratorijskih životinja je skupa
eksperimenti traju dugo i
teško se standardiziraju
Istraživanja pri kojima se vodi briga o dobrobiti životinja vode do boljih znanstvenih rezultata !!
Alternativne metode je lakše uvesti u fundamentalna ili inovativna istraživanja nego u primijenjena istraživanja:
-večina primijenjenih istraživanja (npr. testiranje sigurnosti) zahtijeva stroge standardne procedure i
regulatorne smjernice
-uvođenje alternativnih metoda u područja primijenjenih istraživanja zahtijeva odobrenje od različitih
nacionalnih regulatornih agencija (npr. Food and Drug Administration) ili međunarodnih organizacija (npr.
Svjetske zdravstven organizacije ili OECD – Organization for Economic Coordination and Development)
4
Alternativni pristupi
Za dobivanje odobrenja relevantnih organizacija za regulatorna testiranja:
- svaka alternativna metoda mora proći provjeru (validaciju) prije no što može zamijeniti postojeću metodu
- validacija – proces kojim se dokazuje da je metoda testiranja prihvatljiva za ono čemu je namijenjena
- osnovni koraci za zamjenu postojećeg regulatornog testa novom metodom su:
-razvoj testa (kojemu su vjerojatno prethodila bazična istrživanja)
-predvalidacija
-validacija
-recenzija (neovisna procjena)
-regulatorno prihvaćanje
5
Alternativni pristupi
-u današnje vrijeme se razvija, a i postoji, sve veći broj metoda koje rezultiraju ili zamjenom, ili smanjenjem, ili
poboljšanjem upotrebe životinja
-prvo “poboljšanje”: upotreba anestetika
-1846. eter upotrijebljen na ljudskom pacijentu
-ubrzo nakon toga – upotreba na životinjama u eksperimentima
-od 1876. – u Velikoj Britaniji je obavezna upotreba anestetika za eksperimente u kojima životinje osjećaju bol
(Zakon o okrutnosti prema životinjama, Cruelty to Animals Act)
-do danas je razvijeno nekoliko alternativnih pristupa koji se zasnivaju na „zamjeni” – uključuju metode i postupke
koji ne koriste životinje:
6
Alternativi pristupi – “zamjena”
TEST PIROGENE AKTIVNOSTI
PIROGEN
- organska tvar koja uzrokuje porast tjelesne temperature
- najčešći pirogeni su komponente staničnih stijenki bakterija
(bakterijski endotoksini iz Gram-negativnih bakterija)
- zaostaju i nakon sterilizacije pripravaka
-farmaceutski proizvodi koji se daje parenteralno - obavezno testiranje da ne sadrže pirogen
7
Alternativi pristupi – “zamjena”
TEST PIROGENE AKTIVNOSTI
Test pirogene aktivnosti – in vivo – kunići
-injiciranje u vene – prati se tjelesna temperatura
-danas – stotine tisuća kunića godišnje (najviše za proizvode koji se nemogu testirati LAL testom)
8
Alternativi pristupi – “zamjena”
TEST PIROGENE AKTIVNOSTI
LAL test (Limulus Amoebocyte Lysate) - hemolimfa praklještara Limulus polyphemus (horseshoe crab, potkovičasti rak)
- 1970-tih
-hemolimfa se pomiješa s test-uzorkom
-ako su bakterijski pirogeni prisutni u uzorku – zgrušavanje
-veća osjetljivost od testa na kunićima
-oko 30.000 jedinki godišnje ugiba kao posljedica uzimanja hemolimfe (oko 1/3 V se uzima)
-ponekad daje lažno negativne rezultate, ponekad precijenjuje sadržaj pirogena
-ne detektira pirogene koji nisu bakterijski endotoksini
(npr. Gram-pozitivne egzotoksine, viruse, gljivice)
9
Alternativi pristupi – “zamjena”
TEST PIROGENE AKTIVNOSTI
Test pirogene aktivnosti na ljudskoj krvi (WBT, whole blood test)
-1996.
-potpuno zamijenjuje upotrebu životinja
-razrijeđenoj ljudskoj krvi se dodaje tvar koja se testira – prisutnost pirogena će potaknuti otpuštanje citokina
(npr. IL-1β) iz monocita u krvi
-razina proizvedenih citokina se kvantitativno određuje pomoću enzimskog imunotesta (ELISA)
-jeftiniji i osjetljiviji od testa na kunićima, može detektirati čitav niz različitih pirogena (za razliku od LAL testa)
-2005. je test internacionalno validiran od strane ECVAM-a (European Centre for the Validation of Alternative Methods)
10
Alternativi pristupi – “zamjena”
TEST PIROGENE AKTIVNOSTI
11
Alternativi pristupi – “zamjena”
PROIZVODNJA MONOKLONSKIH PROTUTIJELA
Monoklonska protutijela
široka primjena
proizvodnja – hibridoma stanice
u 1. koraku se koristi miš
kasnije se odabrani hibridomi propagiraju
12
Alternativi pristupi – “zamjena”
PROIZVODNJA MONOKLONSKIH PROTUTIJELA
Propagacija hibridoma – in vivo (miš ili štakor)
u trbušnu šupljinu životinje se injicira neka
iritirajuća tvar (mineralno ulje), nakon toga se
injiciraju hibridoma stanice
hibridomi se umnožavaju i izlučuju
monoklonska protutijela u ascitesnu tekućinu
koja se nakuplja u trbušnoj šupljini – snažna
nelagoda, bol
ascitesna tekućina se sakuplja pomoću igle i
šprice, a životinja se nakon toga humano
usmrćuje
Propagacija hibridoma – in vitro (kultura stanica)
protutijela se pročišćavaju iz medija za kulturu
stanica
napredak u tehnikama staničnih kultura
u Europi – zabrana ascitesne metode
13
Alternativi pristupi – “zamjena”
TESTIRANJE FOTOTOKSIČNOSTI
Fototoksičnost
-akutni toksični odgovor nakon izlaganja kože kem.
tvarima, a nakon toga vidljivoj ili UV svjetlosti
Standardni test fototoksičnosti – zamorčići
-prati se razvoj upale i oticanja
-ne daju se analgetici (da ne bi umanjili mogući
razvoj upalne reakcije)
Alternativna metoda – stanice kože miševa
uzgojene u kulturi
-tvar koja se testira se dodaje stanicama
-stanice se izlažu UV svjetlosti
-bojaju vitalnom bojom
-razlika u obojenosti stanica koje su bile izložene
svjetlosti i onih koje su se držale u mraku - mjera
razine fototoksičnosti testirane tvari
-ovaj zamjenski test - brz i jeftin
14
Alternativi pristupi – “zamjena”
Ljudske stanice i tkiva u kulturi
-sve veći značaj u razvoju metoda za zamjenu ima upotreba ljudskih stanica i tkiva u kulturi
-kultura tkiva je također alternativni pristup s dugom povijesti:
-1885. Wilhelm Roux je uspio održati stanice kokošjeg embrija živima u toploj fiziološkoj otopini
-1907. Ross Harrison opisao rast stanica in vitro
-tehnike kulture stanica i tkiva su značajno napredovale upotrebom antibiotika
-danas se razvijaju i sintetičke otopine za uzgoj, koje bi mogle zamijeniti serumske faktore (poput hormona, koji
značajno variraju u različitim serumima)
15
Alternativi pristupi – “zamjena”
Ljudske stanice i tkiva u kulturi
-često relevantniji podaci – nema razlike među vrstama
-razvoj novih lijekova, testiranje sigurnosti i učinkovitosti različitih tvari i proizvoda (hrane, pesticida, cijepiva,
kozmetičkih proizvoda i proizvoda za kućanstvo)
-banke humanog tkiva za istraživanje (koža, oči, jetra, placenta, pluća, bubrezi, srčani zalisci, krvne žile i krvne stanice)
UK Human Tissue Bank
“Posvećeni smo etičkom razvoju ovog servisa koji će učinkovito pridonositi poboljšanju
kvalitete ljudskog zdravlja, a istovremeno će olakšavati provođenje “tri R” koncepta u
testovima koji koriste laboratorijske
životinje.”
“We are commited to the ethical development
of the service as an effective contributor to the
improvement of human health, whilst facilitating
the refinement, reduction and replacement of
animal tests.”
http://www.ukhtb.org/en/Home
16
Alternativi pristupi
Vakcine – smanjenje, zamjena, poboljšanje
-znatno smanjen broj životinja u proizvodnji i testiranju vakcina
-većina vakcina se danas proizvodi bez upotrebe životinja (virusi se uzgajaju u staničnim kulturama i
oplođenim kokošjim jajima)
-kulture dobivene iz životinjskog tkiva (za koje je potrebno usmrtitit životinje) zamijenjene kulturama
staničnih linija
-kod proizvodnje vakcina: – testovi sigurnosti– modificirani tako da se koristi manje životinja, uvođenje
GMP-a (dobre proizvođačke prakse) je smanjilo mogućnost da se u vakcinama uopće nađu
nečistoče
(od 1997. Europska Pharmacopoeia ne zahtjeva testiranje sigurnosti vakcine za difteriju,
tetanus i pertusis)
– testovi učinkovitosti – koristi imunološke tehnike za praćenje razvoja
imunološkog odgovora testiranih životinja
17
Alternativi pristupi
Europska unija
EURL – Referentni laboratorij Europske unije (European Union Reference Laboratory)
ECVAM – Europsko središte za potvrđivanje alternativnih metoda (European Centre for the Validation of Alternative Methods),
osnovano 1992.
Nova Direktiva 2010/63/EU bi trebala ojačati ulogu EURL ECVAM-a. (Stupila je na snagu 1.1.2013.)
Njezine dužnosti i zadaci, definirani Člankom 48/Aneksa VII, su:
a. Koordiniranje i promicanje razvoja i korištenja alternativnih pristupa, i u području bazičnih i primijenjenih istraživanja i
regulatornih testiranja
b. Koordiniranje utvrđivanja valjanosti alternativnih pristupa na razini EU
c. EURL ECVAM bi trebao djelovati kao ključno mjesto za razmjenu informacija o razvoju alternativnih pristupa
d. Osnivanje, održavanje i upravljanje javnim bazama podataka i informacijskim sustavima o alternativnim pristupima i njihovim
fazama razvoja
e. Promicanje dijaloga između zakonodavaca, regulatora, i svih relevantnih zainteresiranih osoba ili skupina, posebno industrije,
znanstvenika u biomedicini, organizacija potrošaća i grupa za zaštitu živoitnja, vezanih za razvoj, potvrdu, regulatorno
prihvaćanje, međunarodnu prepoznatljivost i upotrebu alternativnih pristupa. EURL će također sudjelovati i u samom
utvrđivanju valjanosti alternativnih pristupa.
18
Alternativi pristupi
Europska unija
EURL – European Union Reference Laboratory
ECVAM – European Centre for the Validation of Alternative Methods
(EURL ECVAM – European Union Reference Laboratory on Alternatives to Animal Testing)
Scientifically Validated Methods
• Carcinogenicity
• Eye irritation
• Monoclonal antibodies production
• Haematotoxicity
• Reproductive toxicity
http://ecvam.jrc.it/index.htm
19
Alternativi pristupi
Europska unija
EURL – European Union Reference Laboratory
ECVAM – European Centre for the Validation of Alternative Methods
(EURL ECVAM – European Union Reference Laboratory on Alternatives to Animal Testing)
>Scientifically Validated Methods
>Regulatory Acceptance
 Acute aquatic toxicity
 Acute oral toxicity
 Eye irritation
 Genotoxicity
 Phototoxicity
 Pyrogenicity
 Skin absorption
 Skin corrosion
 Skin irritation
 Skin sensitisation
 Vaccines: potency and safety testing
http://ecvam.jrc.it/index.htm
20
Alternativi pristupi
Europska unija
Eye irritation
•
Isolated Chicken Eye (ICE) test method Regulation:
–
Commission Regulation (EC) No 440/2008
–
OECD Test Guideline 438: adopted on 7th September 2009
•
ESAC Statement:
–
27 April 2007: The ESAC Statement is based on the U.S. ICCVAM retrospective study
•
Remarks:
–
Partial replacement of the in vivo rabbit eye irritation test. The OECD TG 438 recommends ICE for the use as part of a tierd-testing strategy for regulatory
classification and labelling within a specific applicability domain. However, test substances can be classified as ocular corrosives or severe irritants under certain
circumstances and with specific limitations without further testing in rabbits. A substance that tests negative would need to be tested in rabbits using a sequential
testing strategy as outlined in OECD TG 405 corresponding to the Method B.5 of the Council Regulation (EC) No 440/2008.
•
Site Internal Links:
–
Validation Study Documents
–
INVITTOX Protocol (ICE)
•
•
•
•
•
The Bovine Corneal Opacity and Permeability test methods (BCOP) Regulation:
–
Commission Regulation (EC) No 440/2008
–
OECD Test Guideline 437: adopted on 7th September 2009
ESAC Statement:
–
27 April 2007: The ESAC Statement is based on the U.S. ICCVAM retrospective study
Remarks:
–
Partial replacement of the in vivo rabbit eye irritation test. The OECD TG 437 recommends BCOP for the use as part of a tierd-testing strategy for regulatory
classification and labelling within a specific applicability domain. However, test substances can be classified as ocular corrosives or severe irritants under certain
circumstances and with specific limitations without further testing in rabbits. A substance that tests negative would need to be tested in rabbits using a sequential
testing strategy as outlined in OECD TG 405 corresponding to the Method B.5 of the Council Regulation (EC) No 440/2008.
Site Internal Links:
–
Validation Study Documents
–
INVITTOX Protocol (BCOP)
http://ecvam.jrc.it/index.htm
21
Alternativi pristupi
u edukaciji
Cilj upotrebe laboratorijskih životinja u edukaciji je:
-usvajanje znanja
-stjecanje vještina (npr. kirurških)
Cilj upotrebe laboratorijskih životinja u edukaciji nije potvrđivanje znanstvenih hipoteza!
Stoga su eksperimenti na životinjama u edukaciji zapravo ponavljanja ranijih eksperimenata!
Zato se vrlo lako mogu zamijeniti!
Alternativne metode u edukaciji:
-upotreba kompjuterskih modeliranja
-zamjena kralježnjaka nižim vrstama
-upotreba in vitro sustava
-upotreba ljudskih modela (npr. BIOPAC)
-upotreba otpadnog materijala iz klaonica
....
22
Alternativi pristupi
u edukaciji
Međunarodna mreža za humanu edukaciju – InterNICHE (International Network for Humane Education)
-promiče humano, ali istovremeno i visokokvalitetno obrazovanje sudenata medicinskih (uključujući i
veterinarske) i bioloških znanosti
-podupire napredne metode podučavanja i alternativne pristupe korištenju životinja
Zavod za animalnu fiziologiju PMF- Sveučilišta u Zagrebu:
-više od desetljeća provodi princip „3 R” u nastavi
-smanjen broj životinja koji se koristi
-nastava iz Imunologije, Fiziologije – npr. Dondersov model pluća, BIOPAC, PhysioEx
23
Alternativi pristupi
u edukaciji
http://www.interniche.org/en/alternatives
24
Alternativi pristupi
u edukaciji
http://www.interniche.org/en/alternatives
25
Alternativni pristupi
26
Alternativni pristupi
27
Alternativni pristupi
“Upotreba životinja u istraživanju, podučavanju i testiranju je prihvatljiva samo u slučaju kada
obećava da će pridonijeti razumijevanju osnovnih bioloških principa, ili znanju za koje se
vjeruje da će biti od koristi ljudima ili životinjama.
Životinje se koriste samo u slučaju kada istraživač nije u svom najboljem nastojanju uspio naći
alternativni pristup.
Također je nužno kontinuirano razmjenjivanje znanja, pregledavanje literature i pridržavanja
Russell-Burchovih “3R” postavki.
Oni koji koriste životinje trebali bi koristiti najhumanije metode i na najmanjem mogućem broju
životinja da bi dobili relevantne informacije.
28

Download Report