close

Enter

Log in using OpenID

2. K29 Μετάφραση του mRNA

embedDownload
Μετάφραση του mRNA
mRNA Translation
Βιοσύνθεση πρωτεϊνών
Πολυμερισμός αμινοξέων
1
Γενικά χαρακτηριστικά
A. Μετάφραση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του mRNA
σε αλληλουχία αμινοξέων- Γενικές έννοιες
1. Γενετικός κώδικας: Οι κανόνες μετάφρασης/αποκωδικοποίησης
2. Ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF): Η αλληλουχία διαδοχικών
κωδικονίων (τριάδες νουκλεοτιδίων) από το εναρκτήριο έως το τερματικό.
3. Τα μεταφορικά RNAs (tRNAs) είναι τα κλειδιά της αποκωδικοποίησης, που
λειτουργούν ως «προσαρμοστές/adaptors»
προσαρμοστές/adaptors μεταξύ κωδικονίων και αμινοξέων
Κάθε αμινοξύ συνδέεται με το δικό του μόριο tRNA, και το αμινοακυλ- tRNA που σχηματίζεται συνδέεται
εξειδικευμένα
ξ
μ
μόνο
μ
με
μ το αντίστοιχο
χ κωδικόνιο.
2
Αντίδραση πολυμερισμού
4. Η αμινο-ομάδα του νέο-εισερχόμενου αμινο-ακυλ-tRNA προσβάλλει τον
αμινο-ακυλ εστερικό δεσμό του προ-υπάρχοντος αμινοακυλ- ή πεπτιδυλtRNA (κατεύθυνση
(
ύθ
Ν’ -> C’)
5. Το mRNA μεταφράζεται με κατεύθυνση 5’ -> 3’
ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑC
Lys Lys Lys Lys Asn
3
Δομικά στοιχεία των tRNAs
Δομικά χαρακτηριστικά των tRNAs
1. Το ~ ½ των νουκλεοτιδίων συνδέονται
σε ζεύγη βάσεων
2. Το 3’ άκρο CCA, βραχίονας υποδοχής
3. Η θηλιά ΤψC (ριβο Τ - ψευδο U - C)
4. Ο «μεταβλητός» επιπλέον βραχίονας
5. Η θηλιά διυδροουρακίλης (DHU)
6. Η θηλιά αντικωδικονίου
7. Πολλές
7
Π λλέ μονο- και δι-μεθυλιωμένες
δ
θ λ
έ
βάσεις A,U,C,G.
Ουρακίλη
Διυδροουρακίλη
DHU
Ψευδο ουρακίλη
Ψ
4
Adaptor Structure
Η δομή των tRNAs ανταποκρίνεται στο ρόλο του απόλυτα ειδικού
«προσαρμοστή» (Adaptor)
1. Διαθέτει ελεύθερα άκρα αφενός για τη σύνδεση του
αμινοξέος
μ ξ ς (CCA)
(
) και αφετέρου
φ ρ για
γ συμπληρωματικό
μ ηρ μ
ζευγάρωμα με το αντίστοιχο κωδικόνιο μέσω του
αντικωδικονίου.
2. Αναγνωρίζεται εξειδικευμένα από ΜΙΑ αμινοακυλtRNA συνθετάση
θ ά
5
αα – tRNA συνθετάσες
B. Οι Αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες είναι τα ένζυμα που
διαβάζουν/ερμηνεύουν τον γενετικό κώδικα
α)) Προσαρτούν
ρ
ρ
κάθε αμινοξύ
μ ξ
αυστηρά στο αντίστοιχο tRNA
(με το ΣΩΣΤΟ αντικωδικόνιο)
β) Ενεργοποιούν το σωστό αμινοξύ
((αμινοακυλ-tRNA
μ
= εστέρας
ρ ς αμινοξέοςμ ξ ς tRNA))
ωστε να είναι ενεργειακά επιτρεπτή
στη συνέχεια η δημιουργία πεπτιδικών
δεσμών
Συνθετάσες τάξης Ι και ΙΙ:
Εστεροποίηση στο 2-ΟΗ ή
3-ΟΗ,
3
ΟΗ, αντίστοιχα,
μονομερείς και διμερείς
6
Αδενυλίωση
Οι αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες καταλύουν δύο επιμέρους
διαδοχικές αντιδράσεις
Α. Τα αμινοξέα ενεργοποιούνται αρχικά με αδενυλίωση
1. αμινοξύ
μ ξ + ΑΤΡ -> αμινοακυλο-ΑΜΡ
μ
+ ΡΡj
2. ΡΡj -> 2Ρj
Το αμινο-ακυλο αδενυλικό (μικτός ανυδρίτης)
είναι
ί
ένα
έ ενεργοποιημένο
έ ενδιάμεσο,
δά
μεταβατικό,
β
ό προιόν
ό
Β Και στη συνέχεια εστεροποιούνται με το tRNA
Β.
3 αμινοακυλο-ΑΜΡ + tRNA -> αμινοάκυλο-tRNA + ΑΜΡ
3.
7
Λιπο ακυλ αδενυλικό
Ενεργοποιημένα ακυλοαδενυλικά ενδιάμεσα δημιουργούνται και σε άλλες
βιοχημικές
β
χημ ς πορείες
ρ ς
πχ ενεργοποίηση λιπαρών οξέων για σύνθεση τριακυλογλυκερολών
R-COOH +ATP
Æ
ΡΡjj
2Ρj
8
Εξειδίκευση tRNA αμινοακυλίωσης
Οι αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες αναγνωρίζουν τα αμινοξέα τους
με εξαιρετική ακρίβεια: Το παράδειγμα της θρεονυλ-tRNA συνθετάσης
Zn
ZN
H θρεονυλ
θρεονυλ- tRNA συνθετάση διακρίνει
τη θρεονίνη απ’ τη βαλίνη με βάση το
σύμπλοκο συναρμογής Zn – OH - NH3
Δεν μπορεί όμως να διακρίνει,
με αυτόν το μηχανισμό, τη θρεονίνη απ΄τη σερίνη
9
Διορθωτική ικανότητα
Η διορθωτική ικανότητα των αμινοακυλ-tRNA συνθετασών εξασφαλίζει
μεγαλύτερη εξειδίκευση
Πείραμα: Ser έχει συνδεθεί λανθασμένα/τεχνητά
με tRNA Thr και το λάθος αμινοαλυλ-tRNA επωάζεται
με θρεονυλ-tRNA συνθετάση
Th ---> Ser
Th
Ser-tRNA
S
tRNA Thr
S + tRNAThr
θρεονυλ-tRNA συνθετάση
Συμπέρασμα: Το
Τ αμινοακυλ-tRNA
λ tRNA παλινδρομεί
λ δ
ί μεταξύ
ξύ
κέντρου ενεργοποίησης και κέντρου διόρθωσης
και , αν είναι λανθασμένο, μπορεί να υδρολύεται
στα συστατικά του ((αα = tRNA))
10
Αναγνώριση αντικωδικίου
Στην εξειδίκευση συμβάλλει η αναγνώριση της θηλιάς του αντικωδικίου
ή/και τoυ βραχίονα υποδοχής των μορίων tRNAs
Θ
Θρεονυλο-tRNA
λ tRNA συνθετάση
θ ά
Γλουταμινυλο-tRNA συνθετάση
11
Ριβόσωμα
Γ. Ριβόσωμα :
Η μοριακή μηχανή που πολυμερίζει αμινοξέα
ρ ζ
ς mRNA και αμινοακυλ-tRNAs
μ
συνταιριάζοντας
Προκαρυωτικό
~20 aa/sec
Ευκαρυωτικό
2 aa/sec
~2/3
~1/3
Αυτο-συγκρότηση !!
12
Ρόλος της κάθε υπομονάδας
Η μικρή υπομονάδα συνταιριάζει το mRNA με το tRNA ενώ η μεγάλη
υπομονάδα καταλύει τη δημιουργία πεπτιδικών δεσμών
Mεγάλη
υπομονάδα
Μικρή
υπομονάδα
A: aminoacyl- Αcceptor
P: Peptide
E: Exit
13
Καταλυτικός ρόλος του rRNA
Tα rRNAs σχηματίζουν το μεγαλύτερο
μέρος
έ
των θέσεων
θέ
Α,
Α Ρ και Ε και
παίζουν κύριο καταλυτικό ρόλο
στη πρωτεϊνισύνθεση,
To 16S rRNA της 30S
L19
σε αντίθεση με τις απλούστερης
–γενικά- δομής ριβοσωμικές
πρωτείνες.
ρ
ς
14
Mεταφραστική έναρξη
Shine-Dalgarno και εναρκτήριο AUG προσδιορίζουν το σημείο
έναρξης της βακτηριακής μετάφρασης
Α) η αλληλουχία Shine-Dalgarno AGGAGG (U) ζευγαρώνει με την συμπληρωματική
CCUCC στο 3
3’ άκρο του 16S rRNA
Β) το αντικωδικόνιο CAT του Met- tRNAf ζευγαρώνει με το κωδικόνιο έναρξης AUG
Πείραμα προστασίας
από RNase
15
πολυκιστρονικά mRNAs
Θυμηθείτε !!,
Τα βακτηριακά mRNAs είναι πολυκιστρονικά και μεταφραστική έναρξη
συντελείται και εσωτερικά !!
Shine-Dalgarno
Τι θα συμβεί εάν οι θέσεις ριβοσωμικής πρόσδεσης
μετατραπούν είτε σε ασθενέστερες, είτε σε ισχυρότερες ??
16
Met-tRNAf
fMet-tRNAf
H βακτηριακή μετάφραση αρχίζει με
φόρμυλο-μεθειονυλ-tRNA (fMet-tRNAf)
To tRNAf διαφέρει από το tRNAm
που μεταφέρει Met σε εσωτερικά
κωδικόνια,, παρ’
ρ όλο που και τα δυο
αναγνωρίζονται από την ίδια συνθετάση
μπορεί
ρ να φ
φορμυλιωθεί
ρμ
μόνον όταν
μ
H Met μ
είναι προσαρτημένη στο tRNAf
σε αντίθεση με την Met που
προσαρτάται στο tRNAm
Αυτό είναι αποτέλεσμα της
εξειδίκευσης της τρανσφορμυλάσης, που
αναγνωρίζει
ί
tRNAf αλλά
άό
όχι tRNAm
Τι εξυπηρετεί
Τ
ξ
ί η φορμυλίωση
λί
??
Θα το δούμε σε λίγο !!
17
IF2
IF2
O παράγοντας έναρξης IF2 είναι ένας
μοριακός διακόπτης (G protein) που
τοποθετεί το fMet
fMet-tRNA
tRNA στη θέση Ρ κατά το
IF2
σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης 70S
Εναλλάσσεται μεταξύ δυο μορφών:
Συνδεδεμένος είτε GTP, είτε με GDP
Ο IF2-GTP σε συνδυασμό με το fMet-tRNA
oρίζει το πλαίσιο ανάγνωσης στο mRNA
οδηγώντας το fMet-tRNA στη θέση Ρ
Μεταπίπτει στην μορφή IF2-GDP,
αποσυνδέεται, και προκαλεί τη σύνδεση
της 50S υπομονάδας και σχηματισμό
συμπλόκου έναρξης 70S
70S. παραγ.
παραγ
IF2
Αποσύνδεση IF2
και άλλων IFs
Σύνδεση 50S
υπομονάδας
18
EF-Tu
EF-Tu
O παράγοντας επιμήκυνσης EF-Tu (G protein), ένας δεύτερος μοριακός
διακόπτης παραδίδει τα αμινοακυλο
διακόπτης,
αμινοακυλο-tRNAs
tRNAs στη θέση Α
Ο EF-Tu δεν αναγνωρίζει fMet-tRNAf .
Γι΄αυτό , fMet-tRNAf δεν μεταφέρεται
στη θέση Α (αλλά στη Ρ) και fMet δεν
ενσωματώνεται σε εσωτερικές θέσεις
θ
19
Proofreading -EF-Tu
ανακύκλωση
Ο EF-Tu - GTP μ
μεταπίπτει στη
ημ
μορφή
ρφή
EF-Tu - GDP και αποσυνδέεται μόνο
αν το tRNA ζευγαρώσει σωστά με το
αντίστοιχο κωδικόνιο
EF-Tu
GTP
GTP
EF-Tu
GDP
EF-Ts
EF-Tu + GDP
Ο παράγοντας EF
EF-Ts
Ts επάγει την
απελευθέρωση του GDP επιτρέποντας
στον EF-Tu να επανασυνδεθεί με GTP
20
N1 Ranεy
Το αντικωδικόνιο του αμινοακυλ-tRNA και όχι το αμινοξύ καθορίζει την
αναγνώριση του αντίστοιχου κωδικονίου στο mRNA,
mRNA και επομένως το
αμινοξύ που τελικά ενσωματώνεται στην πρωτείνη που συντίθεται
Πείραμα:
Εάν η κυστείνη του Cys-tRNAcys μετατραπεί χημικά/τεχνητά σε αλανίνη τότε
το Ala-tRNAcys θα συνεχίζει να αναγνωρίζει κωδικόνιο κυστείνης και κατά
την πρωτεινοσύνθεση θα ενσωματώσει αλανίνη στη θέση της κυστείνης
Εφαρμογή: σύνθεση «αφύσικων» πρωτεϊνών in vitro !!!
Σχηματισμός
πεπτιδικού δεσμού
21
Η αντίδραση σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού
Η αμινική ομάδα του νέο-εισερχόμενου αμινοακυλο-tRNA στη θέση Α
προσβάλλει την καρβονυλική ομάδα του εστερικού δεσμού του προηγούμενου
άκυλο-tRNA στη θέση Ρ
22
Ρόλος φορμυλίωσης
Ο πιθανός ρόλος της φορμυλίωσης στην εναρκτήρια μεθειονίνη είναι η
προστασία του πρώτου πεπτιδυλ-tRNA
πεπτιδυλ tRNA δεσμού
στη πρωκαρυωτική μετάφραση
Η προσβολή του πεπτιδικού δεσμού από την -ΝΗ2 της μεθειονίνης θα οδηγούσε στο
σχηματισμό σταθερού εξαμερούς δακτυλίου,
δακτυλίου υδρόλυση του πεπτίδυλ-tRNA
πεπτίδυλ tRNA εστερικού δεσμού
και τερματισμό της μετάφρασης
Γιατί αυτό δεν είναι πρόβλημα στην ευκαρυωτική μετάφραση ???
23
EF-G
EF-G
O παράγοντας επιμήκυνσης
EF-G είναι επίσης μια
πρωτείνη
ί G,
G
που υδρολύοντας GTP
μετατοπίζει
το ριβόσωμα κατά
τρία νουκλεοτίδια.
Μετακινεί το
απο-ακυλιωμένο tRNA
στη θέση Ε και το
πεπτιδυλ-tRNA στη θέση Ρ,
Ρ
ενώ η μετακίνηση
του mRNA
ανοίγει τη θέση Α
στο επόμενο κωδικόνιο
24
τερματισμός της μετάφρασης
RFs:Οι πρωτεϊνικοί παράγοντες τερματισμού RF1, RF2, Rf3
(Release
factors) αναγνωρίζουν τα κωδικόνια τερματισμού UAA, UGA, UAG
Επιτρέπουν τη διέλευση ενός μορίου Η2Ο
((προσαρτημένο
ρ
ρ ημ
σε Gly-Gly-Gln)
y y
) στην
η Α θέση
η
RF
με αποτέλεσμα
την αυτόματη
υδρόλυση
δ όλ
του
πεπτιδυλ-tRNA
εστερικού δεσμού
Ο αποκλεισμός του Η2Ο από το κέντρο της πεπτιδυλμεταφοράσης προστατεύει τον πεπτιδυλ-tRNA εστερικό
δεσμό από αυθόρμητη υδρόλυση
25
Ταλάντευση
Ταλάντευση-wobble: Στερεοχημική χαλαρότητα στο ζευγάρωμα της πρώτης
βάσης του αντικωδικονίου με την τρίτη βάση του κωδικονίου
Εάν η αναγνώριση κωδικονίου-αντικωδικονίου
προϋπέθετε ζευγάρωμα και των τριών βάσεων
βάσεων,
τότε κάθε tRNA θα αναγνώριζε μόνο ένα κωδικόνιο.
Όμως π.χ ένα αλανυλ-tRNA μεταφέρει αλανίνη
σε τρία διαφορετικά κωδικόνια
-
Μηχανισμός αποκωδίκευσης:
Δύο αδενίνες (Α 1492 και Α 1493) στο 3’
3 άκρο του 16S rRNA της υπομονάδας 30S
ελέγχουν μέσω δεσμών υδρογόνου εάν έχουν ζευγαρώσει οι δυο πρώτες θέσεις του
δίκλωνου τμήματος κωδικίου-αντικωδικίου.
Μ
Μηχανισμός
ό ελέγχου
λέ
δ υπάρχει
δεν
ά
για την τρίτη
ί θέση
θέ
!!!
26
Ευκαρυωτική Μετάφραση
5. Η ευκαρυωτική μετάφραση είναι πιο σύνθετη και διαφέρει απο την
προκαρυωτική
ρ
ρ
ή κυρίως
ρ ς στο μηχ
μηχανισμό
μ έναρξης
ρξης
Προκαρυωτικό
~20 aa/sec
Ευκαρυωτικό
2 aa/sec
~2/3
~1/3
Πού συγκροτούνται
οι ευκαρυωτικές ριβοσωμικές υπομονάδες ?
27
eIF4E – Cap
eIF2-GTP - Met-tRNAi - 40S
eIF4E – Cap
eIF2-GTP - Met-tRNAi - 40S
Ο ευκαρυωτικός παράγοντας
έναρξης eIF4E αναγνωρίζει το 5
5’
κάλυμμα και ο eIF2-GTP σε
σύμπλοκο με το Met-tRNAi και
την 40S ριβοσωμική
υπομονάδα σχηματίζει το
σύμπλοκο προέναρξης 43S,
ρ
το mRNA
που σαρώνει
ψάχνοντας για AUG
eIF2
eIF4E
Αναφορά στην Kozak consensus
-3A, +4G
eIF2-GDP - 80S
28
Η συγκρότηση του 80S συμπλόκου
έναρξης
ρξης πραγματοποιείται
ρ γμ
μ
με τη
η
σύνδεση της 60S ριβοσωμικής
υπομονάδας, αφού προηγηθεί
υδρόλυση του eIF2-GTP σε
eiF2-GDP
Η διεργασία επιμήκυνσης και
τερματισμού είναι μηχανιστικά
ανάλογες με αυτές των
προκαρυωτικών συστημάτων
29
Tι είναι τα πολυσώματα ?
Πολλά ριβοσώματα μεταφράζουν συγχρόνως το ίδιο μόριο
30
folding
Πώς αποκτούν οι πρωτεΐνες την τρισδιάστατη δομή τους ?
1. Αυθόρμητα
31
Hsps
2. Με κατανάλωση ενέργειας (ΑΤΡ)
Οι πρωτείνες θερμοπληξίας συντελούν στην αναδίπλωση
νεοσυντιθέμενων πρωτεινών
32
Αντιβιοτικά
Αντιβιοτικά στοχεύουν την προκαρυωτική μετάφραση
Η στρεπτομυκίνη παρεμβαίνει στη δέσμευση
φόρμυλο
φ
ρμ
μ
μεθειονυλο-tRNA,, ενώ άλλες
ς
αμινογλυκοσίδες (νεομυκίνη, γενταμυκίνη,
καναμυκίνη) παρεμβαίνουν στη θέση
αποκωδίκευσης (θέση 1492 του 16S rRNA)
Η πουρομυκίνη, που μοιάζει με το
αμινο-ακυλικό άκρο ενός αμινοακυλ-tRNA
αποσυνδέει την
η πολυπεπτιδική
ή αλυσίδα
από το ριβόσωμα
33
διφθερίτιδα
Τοξίνες στοχεύουν μεταφραστικούς παράγοντες
Η τοξίνη της διφθερίτιδας
(Corynebacterium diphtheriae)
προσθέτει
θέ ADP-ριβόζη
ADP βόζ στο
διφθαμίδιο (τροποποιημένη His)
του EF2 με αποτέλεσμα την
απόλυτη αδρανοποίησή του
Η τοξίνη της χολέρας
ADP- ριβοσυλιώνει
πρωτείνες
ί
G προκαλώντας
λώ
μαζική έκκριση υγρών
από το λεπτό έντερο,
αφυδάτωση
φ
η και θάνατο
34
Ασκήσεις
Stryer Σελ. 946-947
2, 4, 10, 14, 17, 18.
Lehninger Kεφ.
Kεφ 27
5, 6, 7, 12.
Επίσης σκεφθείτε και το παρακάτω πρόβλημα:
O Mπάμπης και ο Ερμάνος,
Ερμάνος δίδυμοι που ζουν στο ίδιο άγονο νησί,
νησί προσβάλλονται από
το ίδιο –πιθανότατα- παθογόνο βακτήριο.
Στον Ερμάνο ο αγροτικός γιατρός χορηγεί χλωραμφενικόλη και σε λίγες μέρες αναρρώνει.
Ο Μπάμπης, με υπόδειξη και βοήθεια της «φίλης» του, παίρνει μερικα mgs κυκλοεξιμίδιο
και το ίδιο βράδυ πεθαίνει.
Ο Βιολόγος του σχολείου ισχυρίζεται ότι και οι δύο χημικές ουσίες αναστέλλουν ισχυρά την
σύνθεση πρωτεϊνών, ενώ ο φαρμακοποιός του νησιού βεβαιώνει ότι το κυκλοεξιμίδιο δεν
διατίθεται ποτέ σε ασθενείς.
Γιατί πέθανε ο Μπάμπης ??
35
Ταλάντευση-wobble
Η ινοσίνη,
ινοσίνη που προκύπτει από μετα-μεταγραφική απαμίνωση αδενοσίνης,
αδενοσίνης
έχει τη μεγαλύτερη ευελιξία γιατί μπορεί να ζευγαρώσει με C,U,A στη τρίτη
θέση του κωδικονίου
36
Author
Document
Category
Uncategorized
Views
23
File Size
4 236 KB
Tags
1/--pages
Report inappropriate content