Pokusni modeli Prof. dr. sc. Nada Oršolić Zavod za animalnu fiziologiju Nužnost uporabe pokusnih životinja • • • • • • • • • U istraživanju fizioloških procesa U mikrobiološkim istraživanjima U istraživanja rasta tumora i metastaza U proizvodnja cjepiva protiv zaraznih bolesti U istraživanje lijekova U istraživanjima u području toksikologije U istraživanju imunotoksičnost U istraživanju karcinogena i mutagena U neurofiziologiji i ponašanju životinja Mišji modeli za tumore ljudi • http://www.nih.gov/science/models/mouse/res ources/hcc.html • Emice website: http://emice.nci.nih.gov/ • Cancer Models Database: http://cancermodels.nci.nih.gov/ • Cancer Images Database: http://cancerimages.nci.nih.gov/ • http://www.jax.org/ Nužnost uporabe pokusnih životinja u biomedicinskim istraživanjima • U biologiji, veterini i agronomiji znanstvena istraživanja uz uporabu pokusnih životinja temelje se na prikupljanju informacija za životinju ili životinjsku vrstu. • Biomedicinska istraživanja pokusne životinje rabe u istraživanju: – – – – – lijekova (20-25%), provjere valjanosti cjepiva (15-20%), istraživanju toksičnosti različitih pripravaka (15-20%), istraživanju karcinoma (10-15%) 30% za druge svrhe: bazična medicinska istraživanja, genetička istraživanja, dijagnoza, pokusne operacije, edukacija i dr. Cjepiva-načelo aktivne imunizacije • Načelo aktivne imunizacije protiv velikih boginja uveo Edward Jener prije 200 god. • “živa atenuirana vakcina” prema uputama WHO (World Health Organisation) • Cjepivo protiv brojnih bolesti • Pojava “davnih” iskorjenjeni bolesti i pojava novih bolesti • Pogodujući čimbenici: promjena ljudskog ponašanja, povećano kretanje ljudi, demografske promjene, iskorištavanje okoliša, smanjena pozornost na mogućnost zaražavanja, smanjen opseg istraživanja i nadzora zaraznih bolesti te mutacija virusa. • broj životinja smanjen ali životinje su nezamjenjive u istraživanju kakvoće, valjanosti i neškodljivosti cjepiva (dobra laboratorijska praksa-rekombinantne vakcine) Cijepljenje- aktivna imunizacije stečena umjetnim načinom • Osnovni oblici specifične imunosti • Prema izvršnim (efektornim) mehanizmima djelovanja – Humoralna imunost (posredovana protutijelima) – Stanična imunost (posredovana stanicama) • Prema načinu stjecanja – Aktivna imunost (stečena djelovanjem organizma) • Stečena prirodnim načinom (preboljenje bolesti, izloženost infekciji • Stečena umjetnim načinom (cjepljenje) – Pasivna imunost (stečena prijenosom seruma) • Stečena prirodnim načinom (putem posteljice, kolostrum) • Stečena umjetnim načinom (imunosni serumi) – Adoptivna imunost (stečena prijenosom limfocita Glavne komponente obrambenog odgovora kralješnjaka PRIROĐENA (NESPECIFIČNA) OTPORNOST Brzi odgovor na niz mikrobnih patogena Vanjska obrana; prva linija obrane Napad patogenih mikroorganizama Unutrašnja obrana; druga linija obrane Koža Fagocitne stanice Mukozne membrane Antimikrobni proteini Izlučevine (sekreti) Upalna reakcija Stanice prirođene ubojice (NK stanice) STEČENA (SPECIFIČNA) IMUNOST Sporiji odgovor na specifične patogene mikroorganizme; treća linije obrane Humoralni odgovor (protutijela) Stanična imunost (citotoksični) Precizno prepoznaje bakterije pomoću membranskih receptora na limfocitima koji se specifično vežu na epitope karakteristične za pojedine sojeve bakterija ADAPTIVNA IMUNOST Epitopi karakteristični za pojedine sojeve bakterija Bakterija A Bakterija B Bakterija C Bakterija D Zajednički sastojak različitih sojeva bakterija Grubo prepoznaje bakterije pomoću membranskih receptora koji se vežu na neke zajedničke molekularne obrasce tipične za različite sojeve mikroorganizama UROĐENA IMUNOST Komunikacija stanica prirođene i stečene imunosti IL18 IL12 TH1 limfocit IFNg IFNg TNFb Prvenstveno reguliraju i potiču staničnu imunost IL2 CD40L CD40 APC CD4 MHC TCR TH0 CD28 B7.1 CTLA-4 B7.2 IL4 IL10 TH2 limfocit IL5 Prvenstveno reguliraju i potiču humoralnu IL4 imunost IL10 IL13 regulacija putem citokina MHC Treg TCR ? ? Treg IL-10 ? Tpat CTLA-4 TGF-b CD80/86 ? APC regulacija doticajem (kontaktom) Tef IFNg IL2 CD8 T IFNg TH1 limfocit IFNg TNFb IL2 TNFb IL2 IFNg NK MONOCIT IFNg TNFb IL2 MAKROFAG Rast i diferencijacija u citotoksički T Aktivacija Aktivacija Fagocitoza Stvaranje reaktivnih radikala kisika i dušik oksida Ubijanje intracelularnih bakterija Iskazivanje MHC molekula klase II Iskazivanje FcR receptora Prezentacija antigena IFNg TNFb IL10 TH2 limfocit IL5 IFNg TNFb NEUTROFIL ENDOTEL IL4 IL10 IL5 EOZINOFIL IL13 IL4 IL13 B Stvaranje reaktivnih kisikovih intermedijera i dušik oksida Stvaranje katjonskih proteina i hidrolaza Iskazivanje adhezijskih molekula Mobilizacija i aktivacija leukocita Iskazivanje MHC molekula klase II Rast i diferencijacija Aktivacija Stvaranje IgA Rast i diferencijacija Aktivacija Stvaranje IgE ADCC sa IgE posredovan eozinofilima Prirođena imunost Stečena imunost mastocit Th2 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 IFN- g antigen/ mz makrofag polimorfonuklearni neutrofili MHC + Ag NK stanica Th0 Th1 IFN-g IL-5 Humoralni odgovor IL-4 eozinofil medijatori mastocit IL-4 IgE imunokompleksi B plazma B stanica Stanični odgovor citotoksična makrofag T stanica IFN-g aktivacija komplementa citotoksičnost Istraživanje lijekova • uvođenje “meta“ dobivenih biotehnološkim inžinjeringom • Završni dio postupka istraživanja novih lijekova i njegove učinkovitosti i neškodljivosti mora biti proveden in vivo –rezultati in vitro nisu vjerodostojni • De Boer i sur. (1997) istraživanje lijekova kroz krvno-moždanu barijeru • Istraživanja na području toksikologije- in vitro modeli ne zadovoljavaju • Imunotoksične tvari- prema učinku na imunološki sustav čovjeka i životinja djele se na: imunosupresivne, imunostimulativne ili imunosenzibilizirajuće Istraživanje lijekova • Combes (1997) –istraživanja in vivo na glodavcimajedini prikladni model za prepoznavanje negenotoksični i genotoksični kancerogena • Draizeov očni test (Draize rabbit eye irritation test) nezaobilazni je postupak u provjeri svih kozmetičkih proizvoda -složenost mehanizama koji uzrokuju iritaciju • valjanost proizvoda u kozmetičkoj industriji, njihovu sigurnost i neškodljivost nemoguće potvrditi bez istraživanja in vivo. Okoliš Kemijska karcinogeneza ORGANIZAM Indukcija Sustav P-450 Aktivacija Prekarcinogenik Karcinogenik Inicijacija Stanica Promotori Endogeni promotori Zloćudni tumor Zloćudni tumor Glodavci (Rodentia) Red Podred Porodica Rod Vrsta Mus M. Musculus Ratus R. Norvegicus (Norwegian rat) Muridae Myomorpha Mesocricetus Rodentia Critcetidae Hysrticomorpha Caviidae Meriones Cavia M. Auratus (Syrian hamster)-hrčak M. Unguculatus (gerbil) C. Porcellus (guinea pig)zamorac Uporaba velikog broja životinja • Sisavci 1800 vrsta (glodavci, kunić, pas, mačka, svinja, ovca, koza, primati). • Glodavci čine 75-80% laboratorijskih životinja (miš, štakor, hrčak, zamorac, gerbil). • Osim sisavaca rabe se i: ptice, gmazovi, vodozemci i ribe. • Miš (Mus musculus) – više od 1000 genetički definirani srođenih miševa Miš-kao pokusni model Prednosti uporabe miša kao pokusnog modela: Mala životinja Dobro podnose život u zatočeništvu Ima veliko leglo i kratko generacijsko razdoblje Troškovi uzgoja relativno niski Brojni srođeni sojevi, rasprostranjeni po cijelom svijetu, rezultati usporedivi Dobivanje rezultati usporedivi, bez velikih varijabilnosti (stalna genetska podloga) Nedostaci Mala veličina Kratki životni ciklus Fiziologija Zašto uporabiti miša kao pokusni model • Prednosti – Model za proučavanje sisavaca, posebice njihovih specifičnih procesa kao što su: • Inaktivacija X kromosoma • Genomski ispis – – – – – Mala veličina Pripitomljenost Kratki životni ciklus Dobro proučena biologija Jednostavna manipulacija i stvaranje velikog broja potomaka – Mogućnost planiranja – Sekvencioniran genom i dobro poznat – Mogućnost stvaranja visokosrodnih sojeva – Široki rang genetičke raznolikosti • Podsojevi • Srođeni sojevi – a/kada se grane odvoje prije 40 generacije (između 20-40)-ostatak herterozigotnosti) – b/razlike nastale mutacijom – c/genska razlika između grana • Podlinije – a/procesima rukovanja:hranjenja putem majke, presađivanje jajne stanice, umjetnim hranjenjem, presađivanjem jajnika ili pohranjivanjem u smrznutom stanju – b/prenošenjem skupine drugom istraživaču • Koizogeni, kongeni srođeni sojevi ili segregirajući Pokusne životinje • 1.Čisti sojevi životinja – visokosrođene životinje (sparivanje braće i sestara iz istog legla kroz najmanje 20 generacija – Singenične životinje – Kongenični miševi- životinje koje se razlikuju samo u jednom kromosomskom lokusu ili regijidragocjen model za proučavanje tog gena • 2. Životinje s posebnim genskim obilježjima – Transgenični miševi – Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom) • 3. Imunodeficijentni miševi Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji Soj A AKR BALB/c Podsoj A/ He A/J A/WySn Osobitost AKR/J AKR/N AKR/Cum Visoka pojavnost leukemija (Thy 1.2 alel u AKR/Cum, i Thy 1.1 alel u drugim podsojevima (ovi geni kodiraju površinske proteine stanica T) BALB/cj BALB/cAnN Osjetljivi na zračenje Uporaba u tehnologiji svaranja hibridoma Mnoge mijeloidne stanične linije su proizvedene u ovim miševima BALB/cBy CBA CBA/J CBAH CBA/N Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine u CBA/J Gen (xid) uzrokuje imunodeficijenciju vezano za X kromosom u CBA/N miševa Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak) C3H C3H/He C3H/HeJ C3H/HeN Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde u mnogim podsojevima (nositelji virusa koji prouzrokuje tumor mliječne žlijezde, prijenos preko mlijeka majke u potomstvo C57BL/6 C57BL/6J C57BL/6By C57BL/6N Visoka pojavnost hepatoma (tumor jetre) poslije zračenja Visoka aktivnost komplementa C57BL/10 C57BL/10J C57BL/10ScSn Bliski s C57BL/6 ali se razlikuju u najmanje 2 lokusa Česti partner u pripremi kongenični miševa C57BL/10N Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak) C57BR C57BR/cdj Učestali tumori hipofize i jetre Rezistentan na x-zračenje C57L C57L/J C57LN Osjetljivi na eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE) Visoka frekvencija tumora hipofize i stanica mrežnice C58 C58/J C58/LwN Visoka pojavnost leukemija DBA/1 DBA/1J DBA/1N Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde DBA/2 DBA/2J DBA/2N Slabi imunosni odgovor na neke antigene Slabi imunosni odgovor na pneumokokne polisaharide tipa III Neki visokosrođeni sojevi miševa primjenjeni u imunologiji (nastavak) HRS NZB NZW P HRS/J NZB/BINJ NZB/N NZW/N P/J SJL SJL/J SWR SWR/J 129 129/J 129/SvJ Hairless (hr)gen obično u heterozigotnom stanju Visoka pojavnost autoimunih hemolitičkih anemija i nefritisa sličnom sistemskom lupusu eritematozusu (SLE) autoimune bolesti slične SLE u F1 generaciji križanih s NZW SLE-tip autoimunostiu F1 generaciji križanih s NZW Visoka pojavnost leukemija Visoka razina agresije i borbe to smti, posebice mužjaci Naginju razvoju autoimuni bolesti, posebice EAE Visoka pojavnost spontanih teratokarcinoma NOD C57BL/6 CBA Agouti coat Goli miš (nude mouse) Genetički promjenjeni “zeleni miševi” Dodatne kopije gena mogu nositi biljege genske aktivnosti, primjerice fluorofori koji svijetle u vidljivom dijelu spektra pod ultraljubičastim svjetlom; GFP-green fluorescent protein ili bakterijski protein lacZ čiji proizvod β-galaktozidaza mijenja boju supstrata x-gal u plavu Zašto transgenične životinje Za otkrivanje uloge pojedinih gena Povećana ekspresija ciljnog gena, knock –out, knock-in, mutageneza Za proučavanje genskih mutacija in vivo Za razumjevanje kontrole genske ekspresije Za proučavanje bolesti Transgenične životinje kao modeli bolesti Za genetičko obilježavanje organizma Zeleni flourocentni protein Za proizvodnju biofarmaceutika –Pharm animals Primjerice, inzulin u kravljem mlijeku Hormona rasta, interleukina, laktoferina…… Usporedba transgeničnih i knock-out miševa Osobitosti Transgenični miševi Knockout miševa Stanice koje primaju DNA Uporabljeni DNA konstrukti Način dostave zigote Embrionalne matične stanice (ES) Mutirani geni Mikroinjekcija unutar zigote i implantacija unutar lažno gravidne majke Transfer embrionalne matične stanice do blastocite i implantacija unutar lažno gravidne majke Ishod Unos gena Gubljenje gena Prirodni geni ili cDNA Imunodeficijentni miševi• U imunolologiji su posebice zanimljivi različiti imunodeficijentni miševi, upravo zbog svojih nedostataka: – nedostatne imunoreaktivnosti na određene antigene – zbog nedostatka, T, B, NK stanica ili citokina – neadekvatnog stromalnog okoliša. • Primarna imunodeficijencija – -životinje s urođenim nedostatkom određeni imunosnih stanica ili čimbenika imunosti (primjerice, goli miševi, SCID, CBA/N) – -genetski modificirane životinje (trangeni ili knouck-out) • Induciranoj imunodeficijenciji – (obrada životinja s određenim protutijelima, toksičnim lijekovima, zračenjem, timektomija…) Gdje se koriste imunodeficijentni miševi? • Koristi se kao modeli u imunološkim i onkološkim istraživanjima. – Razumjeti ulogu imunološkog sustava u nekoj bolesti. – Održavanje tumorskih staničnih linija Osobitosti imunodeficijentni miševa Soj CD-1 goli miš NU/NU BALB/c goli miš NIH-III miš Fox chase SCID mouse Fox chase SCID beige mouse NOD SCID miš Osobitost Dobiven prenosom gena golih miševa u CD-1 miša. Bez timusa, nedostatak stanica T. Porijeklom od NIH, kongeničan s BALB/c Bez timusa, nedostatak stanica T. Bez timusa, nedostatak stanica T. Deficijentan u stanicama T, NK (bg mutacija), te Bstanicama-neovisnim o stanicama T(xid mutacija) Podrijetlo od SCID miša, SCID. posjeduje genetičku autosomalnu mutaciju Prkdc Imunodeficijencija u stanicama T i B. Posjeduje genetičku autosomalnu mutaciju scid i beige. Životinje homozigotne za SCID mutaciju na NOD osnovi,oštećenu T i B limfocitnu funkciju i nedostatak NK funkcije i sposobnosti aktivacije aktivnosti komplementa. Ovaj model ne razvija tip 1 dijabetesa. Osobitosti imunodeficijentni miševa Soj CNA/N W/Wv Sl/Sld NZB Nude-xid Osobitost B-imunodeficijentni miš, mutacija na kromosomu x, neadekvatna odgovornost na timus-neovisne antigeneTh-1, Th-2, nedostatak prekursora za proizvodnju IgG3 i IgM, broj C3 stanica manji u slezeni Genetički anemični miševi za praćenje ontogeneze i diferencijacije eritrocita, hematološki mikrookoliš normalan, matične stanice defektne Genetički defekt u mikrookolišu (stromi), važnom čimbeniku za diferencijaciju matičnih stanica, posebice proteoglikanske sastavnice stromalnog vanstaničnog matriksa. Spontano razvijaju autoimunosnu bolest sličnu sistemskom lupusu eritromatozosu. Imaju manjak supresorskih stanica T, nedostatak faktora rasta T i B stanica i IL-3 Imunodeficijencija u zrelim stanicama T i B.Normalan broj CFU-S ali nedostaju 2 rana pre B-stanična markera, osjetljivost na transformaciju sa Abelsonovim virusom leukemije i proizvodnja µ lanca (cµ) Beige mouse Komparacija imunodeficijentnih sojeva Osobitosti Imunodeficijentni sojevi Dlaka Timus Tstanice Bstanice NKstanice Fiksacija komplementa CD-1 goli miš - - - + + + NU/NU goli miš - - - + + + BALB/c goli miš - - - + + + NIH-III goli miš - - - - - + Fox chase SCID mouse + + - - + + Fox chase SCID beige mouse + + - - - + NOD SCID miš + + - - - - Goli štakor (Nude rat) - - - + + + Pokusni modeli • I ako znanstveno istraživačka djelatnost nosi stupanj individualne slobode i kreativnosti, svaki istraživač nosi i stupanj osobne odgovornosti prema metodama rada i predmetu istraživanja. Točnije, svatko je u svom djelokrugu rada dužan raditi u sukladu s profesionalnim i etičkim normama i svojom savješću!!! Shematski prikaz pitanja koja si svaki znanstvenik mora postaviti prije nego se odluči koristiti pokusne životinje u svom istraživanju. Istraživanje na životinjama je temeljeno na metodama kritičke provjere teoretskih počela i načela medicinske prakse!!! • Istraživanja i rad s životinjama treba provesti u sukladu sa etičkim principima, koji su važeći u Republici Hrvatskoj (Pravilnik o uvjetima držanja pokusnih životinja, posebnim uvjetima za nastambe i vrstama pokusa, Narodne Novine br. 19/1999; Zakon o zaštiti životinja, Narodne novine br. 135/06) i prema Vodiču za držanje i korištenje laboratorijskih životinja (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHHS Publ. (NIH) # 86–23 1985). Prilikom izbora modela treba voditi računa o: • • • • • • • • • • • • • • • • • -pogodnosti modela kao analoga, -mogućnosti transfera informacija -genetskoj uniformnosti modela -dosadašnjim saznanjima -cijeni i pristupačnosti životinja -mogućnosti generalizacije dobivenih rezultata -lakoći i mogućnosti prilagodbe pokusnih tehnika -ekološkim posljedicama pokusa -etičkim posljedicama pokusa -mogućnostima smještaja životinja -veličini životinja -potrebnom broju životinja -spolu životinja -dužini životnog vijeka životinja -količini podataka koje je potrebno pokusima prikupiti -starosti životinja broju potrebnih potomaka koje je moguće dobiti -mogućim bolestima ili fiziološkim stanjima odabranih životinja koje bi mogle utjecati na rezultate pokusa Animal Models of Cardiovascular Disease Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova Miševi Štakori Hrčci Temperatura (°C) 20-24 20-24 20-24 Relativna vlažnost (%) 50-60 60 50-60 Ventilacija /(promjene/sat) 15 10-15 10-15 Svjetlo/mrak (sati) 14/10 12-14/12-10 12-14/12-10 Minimalna veličina dna kaveza (cm2) -jedna odrasla jedinka -rasplodna životinja s mladima -grupa (cm2/odrasla jedinka) 180 200 80 350 800 250 180 650 n/a Minimalna visina kaveza (cm) 12 14 12 Okolišni zahtjevi Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova Miševi Štakori Hrčci 20-40 25-40 300-500 250-300 120-140 140-160 Životni vijek (godine) Frekvencija srca (/min) 1-2 2-3 2-3 300-800 300-500 250-500 Frekvencija disanja (/min) Tjelesna temperatura (°C) 100-200 70-110 40-120 36.5-38.0 37.5-38.5 37-38 Broj kromosoma (2n) 40 42 44 Površina tijela (cm2) 20 g:36 50 g:130 130 g:250 200 g:325 125 g:260 Opći fiziološki parametri Težina odrasli (g) -mužjak -ženka Miševi Štakori Hrčci Unos vode (ml/100 g) 15 10-12 8-10 Pubertet (tjedni) -Ženke -mužjaci 5 - 6-8 - 4-6 7-9 Plodno doba (tjedni) -Ženke -mužjaci 8-10 8-10 12-16 12-16 6-8 10-12 Oestrus ciklus (dani) Trajanje oestrusa (sati) 4 (2-9) 4-5 14 14 4 2-24 Trajanje trudnoće 19 (18-21) 21-23 15-17 6-12 6-12 6-8 0.5-1.5 10 21-28 5 40-50 21 2-3 30-40 20-22 Opći fiziološki parametri Veličina legla Težina kod rođenja (g) Težina kod sisanja (g) Prestanak sisanja (dani) Okolišni zahtjevi i fiziološki parametri miševa, štakora i hrčkova Miševi Štakori Hrčci Krvni volumen (ml/kg) 70-80 60 80 Hemoglobin (g/100 ml) 10-17 14-20 10-18 Hematokrit (vol %) 39-49 36-48 36-60 Leukociti (x 1000/mm3) 5-12 6-17 3-11 Glukoza (mg/100 ml) 124-262 134-219 60-150 Krvni parametri Pretvorba doze za životinje prema dozi za čovjeka na temelju površine tijela Vrsta Čovjek Odrasli dijete Pavijan Pas majmun zec zamorčić Štakor hrčak miš Težina (kg) 60 20 12 10 3 1,8 0,4 0,15 0,08 0,02 Površina tijela Km (m2) faktor 1,6 0,8 0,6 0,5 0,24 0,15 0,05 0,025 0,02 0,007 37,5 25 20 20 12 12 8 6 5 3 Vrijednosti na temelju podataka iz FDA (nacrt smjernica ). Za pretvaranje doza u mg / kg do doze u mg/m2, pomnožite Km vrijednosti Doza ekvivalentna za čovjeka (mg/kg) = animalna doza (mg/kg) x (Animal Km/Čovjek Km) Doze: odnos čovjek -životinja 1. Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research. (2002) Estimating the safe starting dose in clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers, U.S. Food and Drug Administration, Rockville, Maryland, USA 2. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008 ;22(3):659-61. 3. Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers (U.S. Department of Health and Human Services,Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research -CDER), 2005,Pharmacology and Toxicology 4. STICKLER GB, PINKEL D.Calculation of nutritional allowances for infants and children on the basis of body surface. J Pediatr. 1958;53(4):464-6. 5. PINKEL D.The use of body surface area as a criterion of drug dosage in cancer chemotherapy. Cancer Res. 1958 18(7):853-6. Animalni modeli koji se danas rabe u biomedicinskim istraživanjima • S obzirom na način razvijanja promjenjene homeostaze/bolesti, animalni modeli koji se danas rabe u biomedicinskim istraživanjima podjeljeni su kako slijedi: • 1. Inducirani (pokusni) modeli • 2. Spontani (genetski) modeli • 3. Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom (transgenične i knock-out životinje) • 4. Negativni modeli bolesti • 5. “Orphan” model bolesti Inducirani (pokusni) modeli • Takvi modeli dobiju se primjenom kemijskih, fizičkih i bioloških tvari na zdrave životinje u cilju prouzrokovanja neke bolesti sličnih značajki bolesti nazočnih u ljudima. • Smatra se da mali broj induciranih animalnih modela u potpunosti oponaša etiologiju (podrijetlo), tijek i patologiju ciljane bolesti u ljudi. • Inducirani model dijabetesa • Inducirani model osteoporoze • Inducirani model psorijaze • Inducirani model upalnih bolesti crijeva Inducirani model dijabetesa inducirani model dijabetesa I može se prouzročiti: odstranjivanjem gušterače (pankreatektomijom) injiciranjem preko 300 različitih dijabetogenih kemijskih spojeva (aloksan, streptozotocin, vakor, ditizon, i 8-hidroksikvinolon). različiti lijekovi (jatrogenI dijabetes). Za dijabetes melitusa tipa II: prekomjerno opterećenje organizma glukozom i masnim kiselinama (stvaranje slobodnih kisikovih radikala i oštećenje stanica, te u konačnici njihovu neosjetljivost na inzulin; hiperglikemija potiče pojačano lučenje inzulina i postupno iscrpljenje β-stanica što rezultira njihovim propadanjem Klasifikacija dijabetesa Tip I dijabetesa • -oštećenje b-stanica vodi nedostatku inzulina (10-15%) Tip II dijabetesa • -heterogen >85% ljudi Gestacijski dijabetes • -šećerna bolest u trudnoći Drugi specifični • primjerice, genetički, lijekovi, operacije infekcije oblici, Inducirani animalni modeli bolesti za diabetes mellitus -tip 1 Tip diabetesa Tip 1 Animalni modeli bolesti Inducirani (pokusni životinjski) modeli Stvaranje animalnih modela Primjeri Dijabetes prpouzročen u zdravim životinjama Tvari s dijabetogenim učinkom u eksperimentalnim životinjama: Aloksan Streptozotocin Vakor Ditizon 8-hidroksikvinolon Animalni model hiperglikemije; pankreaktomija, diabetogene tvari Animalni model glikozurije (florizin, prirodni flavonoid ,sc) vezuje se za Na/glukoza prijenosnike u proksimalnim tubulima bubrega i inhibira resorpciju glukoze-masivna glikozurija i poliurija Mehanizmi djelovanja aloksana streptozotocina na β-stanica gušterače Mehanizam aloksan-induciranih reaktivnih kisikovih radikala u β-stanicama gušterače štakora. GKa, GKi - glukokinaze aktivna i neaktivna, HA • - aloksan radikali, [Ca2 +] unutarstanična koncentracija kalcija i Mehanizam streptozotocinom (STZ)-induciranog oštećenja β-stanica gušterače štakora. MIT mitohondrije; XOD – ksantin oksidaze Inducirani animalni modeli bolesti za diabetes mellitus –tip 2 Model Obese Dietom/prehranom inducirani Pustinjski štakor (Sand rat) Non obese C57/BL 6J miš Ježasti miš (spiny mouse) Kemiski inducirani GTG obrađeni obese miš (gold thioglukoza) Male doze aloksana ili streptozotocina u odraslog štakora miša ili dr. Neonatalni štakor induciran s STZ Operacijski inducirani lezija ventromedialnog hipotalamusa dietom induciranog obese miša Parcijalno ostranjivanje gušterače (pankreatomija) u psa, primata, svinje i štakora Doze kemijski diabetogenih tvari u različitih vrsta Diabetogena tvar Vrsta Doza (mg/kg) Aloksan Štakor 40-200 (iv; ip) Miš Zec 50-200 (iv; ip) 100-150 (iv) Pas Štakor Miš Hrčak Pas Svinja 50-75 (iv) 35-65 (iv; ip) 100-200 (iv; ip) 50 (ip) 20-30 (iv) 100-150 (iv) Primati 50-150 (iv) Streptozotocin APC MHC-II ß-Ag IL-12 “imunološki signali" B7 ß-Ag ß-st. ß-Ag MHC-I citoliza O 2H2O2 NO IL-1 TNF- TNF-b IFN-g Tip 1 dijabetesa Mø + IL-2 IFN-g + T-Ly Th2 + IL-4 IL-10 + Th1 Općenite značajke dijabetesa Osmotski simptomi -žeđ i suha usta -učestalo uriniranje -učestalo uriniranje tijekom noći, -nedostatak sna -gubljenje na težini -malaksalost, -umor i smanjena proizvodnja energije -zamućeni vid -infekcije Komplikacije nazočne kod dijabetesa -oštećenja krvnih žila -srčani udar -smanjeni dotok kisika -oštećenje bubrega -gubitak osjetljivosti na podražaje -komplikacije s očima -ponavljjuće infekcije -slabo i sporo zacjeljivanje rana Mikrovaskularne komplikacije Komplikacije s očima Retinopatija Makulopatija Oštećenja bubrega Dijaliza Uzročnik smrti Smanjena provodljivost živaca Gubljenje osjeta Nastajanje čira (ulceracija) Makrovaskularne komplikacije -Miokardijalni infarkt -Hipertenzija -Srčani udar -Periferne vaskularne bolesti (ishemija donjih udova; nedostatak kisika zbog loše obskrbe krvlju) -Slabo zacjeljivanje rana -Visoka razina kolesterola Druge komplikacije • Akutne komplikacije-sekundarna hipoglikemija kao posljedica uzimanja lijekova • Dijabetična ketoacidoza –tip I šećerne bolesti • Drugi čimbenici Inducirani model osteoporoze ovarijektomijom, tiroidni hormone, primjenom glukokortikoida antikonvulzivni lijekovi, retinoične kiseline primjenom agonista gonadotropin otpuštajućeg hormona inhibitora aromataze; antagonista estrogenskih receptora lijekovi u liječenju šećerne bolesti (Tiazolidinedioni), lijekovi za liječenje gastointestinalnih bolesti (inhibitori protonski pumpi), inhibitori kalcineurina Izravni i neizravni učinak glukokortikoida u indukciji osteoporose i lomljivosti kosti Osteoporoza i oksidativni stres oksidativni stres potiskuje diferencijaciju osteoblasta, Spojevi s aktivnim kisikom uključeni su u svaranje osteoklasta Oksidativni stres uključen u potiče patogenezu metaboličkih koštani bolesti Oksidativni stres smanjuje zacjeljivanje kostiju nakon frakture Inducirani model psorijaze Kemijski iritanati: dekanol, propionaldehid, bromoheksan, di-n-propil disulfid, heksil salicilat i Heptaldehid primjenom TLR7/8 agonista imikvimoda . Prednosti i nedostaci mišjih modela za psoriazu • Pozitivna strana životinjskog modela je i izbjegavanje svih čimbenika koji mogu utjecati na patološke pokazatelje psorijaze, primjerice, dob, spol, životni uvjeti, životne navike, izloženost stresnim čimbenicima, uzimanje lijekova, klimatske i temperaturne promjene i drugo. • Negativna strana: većina modela na miševima ne odražava kompleksnu patogenezu psorijaze, djelomično i zbog razlika između ljudske i mišje kože, poput debljine epidermisa, gustoće folikula dlaka, programa diferencijacije keratinocita i drugo Ključni događaji u patogenezi psorijaze Danilenko D M Vet Pathol 2008;45:563-575 Primjena termografije u procjeni upale FLNM0033.SIT Di-n-Propil Di-n-Propil Disulfid++Kurkumin Kurkumin–– 1,00 Disulfid 23,0 I-mjerenje I-mjerenje 19.01.2011 Filename: Emissivity: Background: Date: Time: Emissivity Avg Temp °C Min Temp °C Max Temp °C Delta Ref. °C 1:52:14 PM Circle 1 1,00 35,8 34,3 36,5 FLNM0169.SIT Di-n-Propil Disulfid++Kurkumin Kurkumin–– Di-n-Propil 1,00Disulfid 23,0 II-mjerenje II-mjerenje 21.01.2011 Filename: Emissivity: Background: Date: Time: Emissivity Avg Temp °C Min Temp °C Max Temp °C Delta Ref. °C 9:03:57 AM Circle 1 1,00 37,4 36,2 38,1 Inducirani model upalnih bolesti crijeva Većina modela temelji se na: • kemijskoj indukciji, • prenosu imunoloških stanica • ili ciljanju gena • samo u nekim modelima bolest se javlja bez egzogene manipulacije. Prema grešci u mukoznoj imunosti mišje modele možemo svrstani u tri kategorije najvažnije za početak bolesti: • (1) nedostaci u epitelnoj cjelovitosti / propusnosti, • (2) nedostaci u stanicama urođene imunosti I • (3) nedostatci u stanicama adaptivnog imunosnog sustava. Indukcija kolitisa na štakorskom modelu pomoću kemijskog iritanta: • octena kiselina (AA), • trinitrobenzen sulfonska kiselina (TNBS) i/ili • natrij dekstran sulfata (DSS). Upalne bolesti crijeva (engl. Inflammatory bowel disease, IBD) Upalne bolesti obuhvaća dva različita patološka područja: Crohnova bolest (engl. Crohn's disease, CD) i ulcerozni kolitis (engl. Ulcerous colitis, UC) Inducirani pokusni modeli u autoimunim bolestima Životinjski model Moguća bolest-ljudi Antigen Prenos bolesti (Tstanice) Pokusno prouzročene autoimune bolesti Miastenia gravis Miastenia gravis Acetilkolinski receptor Da Encefalomijelitis Multipla skleroza Mijelinski bazični protein Proteolipidni protein Da Autoimuni artritis Reumatoidni artritis Mycobacterium tuberculosis (proteoglikan) Da Autoimuni tiroiditis Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da Povezanost nekih autoimunoloških bolesti s prisutnošću određenih antigena MHC Autoimuna bolest Povezana s prisutnošću HLA-alela Addisonova bolest Gravesova bolest Pemphigus Hashimotova bolest Dijabetes ovisan o inzulinu Myasthenia gravis Reumatoidni artritis Sjögrenov sindrom Sustavni lupus erythematosus DR3 B8/DR3 DR4 DR5 DR3 i DR4 DR3 DR4 Dw3 DR3 Spontani (genetski) modeli bolesti • Spontani (genetski) modeli jesu najbolji pokazatelji razvoja patogeneze određene bolesti u životinjskim modelima a slični su ili se podudaraju s razvojem bolesti u ljudi. • ovakvi sojevi imaju urođene poremećaje; nose genetske varijacije (mutacije) koje su podloga nizu bolesti u ljudi i životinja. Spontani Modeli (Prirodni)-model u kojem životinja naravno stječe bolest koja oponaša ljudsku bolest • Doberman Pincher - von Willebrands bolest NZW x NZB F1 - autoimuna bolest Hrčak, miš, zlatni retriver - mišićna distrofija BB štakor i NOD miš - šećerna bolest Spontani (genetski) modeli za dijabetes tipa 1 Tip diabete sa Tip 1 Animalni modeli bolesti Stvaranje animalnih modela Spontani (genetski) modeli Animalni modeli Tipa 1 diabetes mellitus: NOD (non-obese diabetic) mouse Nasljedni BB (bio breeding) rat poremećaji slični LETL (Long Evans Tokushima lean) štakor uvjetima nastanka New Zealand white rabbit dijabetesa u ljudi Keeshond pas (engl. Keeshond dog) Kineski hrčak (engl.Chinese hamster) Celebes black ape (Macacca nigra) Primjeri Razaranje b-stanica Langerhansovih otočića gušterače u NOD miševa pomoću autoreaktivnih stanica T Spontani (genetski) modeli za dijabetes tipa 2 Tip diabetesa Tip 2 Animalni modeli bolesti Spontani (genetski) modeli Stvaranje animalnih modela Primjeri Nasljedni poremećaji slični uvjetima nastanka dijabetesa u ljudi Animalni modeli of Tipa 2 diabetes mellitus: Ob/Ob miš—monogenski model pretilosti (nedostatak leptina), db/db miš—monogenetski model pretilosti (leptin resistentan), Zucker (fa/fa) štakor—monogenetski model pretilosti (leptin resistentan), Goto Kakizaki štakor KK miš NSY miš OLETF štakor Israeli sand štakor Mastima-hranjeni streptozotocin-obrađeni štakor, CBA/Ca miš Diabetični Torri štakor New Zealand obese miš Spontani kolitis u knock-out (KO) i transgeničnih glodavaca • Spontani kolitis u knock-out (KO) i transgeničnih glodavaca omogućuju pokusni modeli za proučavanje razvoja mukozne upale i upalnih bolesti crijeva. • Genetski i okolišni čimbenici, osobito normalna crijevna flora, važni su čimbenici u razvoju upale sluznice. • Normalna homeostaza mukoze je poremećena – – – – citokinskom neravnotežom, ukidanjem oralne tolerancije, promjenama u epitelnoj barijeri i funkciji ili gubitaku imunoregulacijskih stanica. Uloga crijevne flore 1. Metabolička Sinteza vitamina Stvaranje kratkolančanih masnih kiselina 2. Trofička Stimulacija epitelne proliferacije angiogeneze i obnavljanja epitela Citoprotektivni učinak Stimulacija razvoja imunološkog sustava 3. Zaštitna Regulacija prirođene imunosti Regulacija stečene imunosti Kompetitivni učinak za patogene Utjecaj probiotika na: • • • • • • • • • • 1. Infektivni proljev 2. Infekcija Helicobacterom pylori 3. Upalne bolesti crijeva 4. Karcinomi 5. Opstipacija 6. Alergije 7. Kardiovaskularne bolesti 8. Vaginitis uzrokovan bakterijama 9. Vaginitis uzrokovan gljivicama 10. Infekcije mokraćnih putova Mehanizam kemopreventivnog učinka Laktobacilusa Upalne bolesti crijeva u geneskih modificiranih (transgeničnih i knock-out) miševa Mutant Abnormalnosti Organi zahvaćeni upalom Transgenični štakor s genom za ljudski HLA-B27/ β2m Ag predočavanje Kolon, tanko crijevo, želudac, zglobovi, koža IL-2 i IL-2Rα KO miševi Imunoregulacija, pogrešna timusna selekcija Kolon IL-10 KO miševi Imunoregulacija, (Th1 put) Kolon, tanko crijevo TGF-β1 KO miševi Imunoregulacija, Gastrointestinalni sustav i drugi organi TCR- KO miševi Imunoregulacija, pogrešna timusna selekcija Kolon Gi2-deflcientni miševi G-proteinska transmembranska signalizacija Kolon N-kadherin transgenični miševi Epitelna barijera Tanko crijevo Upalne bolesti crijeva u geneskih modificiranih (transgeničnih i knock-out) miševa Mutant Abnormalnosti Organi zahvaćeni upalom N-kadherin transgenični miševi Epitelna barijera Tanko crijevo Keratin-8 KO miševi Epitelna barijera Kolon IL-7 transgenični miševi Limfo-hematopoetske promjene Kolon gp39 transgenični miševi Limfo-hematopoetske promjene, pogrešna timusna selekcija Kolon, želudac i drugi organi Višestruko otporni na lijek (MDR) 1a KO miševi Narušena epitelna barijera Kolon Wiskott-Aldrich sindrom protein KO miševi Limfo-hematopoetske promjene vezane za X gen Kolon Stat3 (makrofagi i neutrofili) KO miševa Th1 put Kolon Transgenski miš s tirozin kinazom virusa Herpes simplex (ciljane astroglialne stanice) Ablacija enteričkih glija stanica Tanko crijevo Spontani pokusni modeli u autoimunim bolestima Životinjski model Moguća bolest-ljudi Antigen Prenos bolesti (Tstanice) Spontane autoimune bolesti Nonobese dijabetični miš (NOD) Inzulin –ovisni dijabetes Nepoznat Da (NZBxNZW)F1 miš Sistemski lupus eritematosuz (SLE) Nepoznat Da Obese -pilići Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da Modeli bolesti stvoreni genetskom modifikacijom • Zašto su potrebne transgenične životinje? • Za otkrivanje uloge pojedinih gena: a) knock–out (inaktivacija gena u genomu ugradnjom strane DNA ili zamjena postojećeg gena mutiranom varijantom, b) knock-in mutageneza (uvođenje nove funkcije) • Za proučavanje fenotipskih učinaka ekspresije transgena – proučavanja hormonskih gena, onkogena, gena uključenih u razvoj embrija i fetusa, gena važnih u imunosnom sustavu, virusnih gena, itd. • Za proučavanje genskih mutacija in vivo • Novi modeli za testiranje mutagena • Pročavanje sposobnosti kloniranih gena da komplementiraju mutacije u mišu • Za razumjevanje kontrole genske ekspresije • Za proučavanje bolesti (transgenične životinje kao modeli za razne ljudske bolesti • Za genetičko obilježavanje organizma (zeleni flourocentni protein) • Za proizvodnju biofarmaceutika –Pharm animals (primjerice, inzulin u kravljem mlijeku, hormona rasta, interleukina, laktoferina i dr.) Modeli dijabetesa stvoreni genetskom modifikacijom Tip 1 i Tip 2 ‘knockout’ životinje Tehnika ciljanog razaranja gena (engl. Gene targeting); proces u kojem jedan gen može biti poremećen u embrionalnoj matičnoj stanici, a zatim prenesen u liniju zametnih stanica- „knockout” životinje. Genetičke „knockout” životinje za: inzulinski receptor, PPARγ, GLUT4, IGF1 Tip 1 i Tip 2 Transgenične životinje Transgenične tehnike; transgenik znači uključivanje modificiranih gena (transgenea) u pronukleus zigote.Transgen se nasumce ugrađuje u genom domaćina, a neki potomci će iskazati promjenjeni gen. Ugradnja novih gena kao što su inzulinski receptori, IRS1, IRS2, glukokinaze, GLUT4, c-mic, TNF i drugi. Uloga ROS-a u aloksanom induciranom uništenju β-stanica je potkrijepila zaključak da su transgenični miševi s prekomjernom ekspresijom antioksidansa zaštićeni od aloksan induciranog dijabetesa. Transgenične životinje kao modeli bolesti • Miš glavni odabir – Fiziologija slična ljudskoj – Razvijena tehnologija • Onkomiš-sadrži onkogen c-myc i dijelove mišjeg tumorskog virusa mliječnih žlijezda – Model bolesti za rak dojke • Transgenični miševi kao model za rak prostate • Transgenični miševi kao model za Alzheimerovu bolest • Transgenični miševi kao model teški kombinirani sindrom imunodeficijencije Knock-out i transgenični miševi pomažu u razumjevanju genoma ljudi i njihove uloge u bolesti Disease Mode Cystic Fibrosis Gene CFTR Atherosclerosis Apo E, apo (a), Apo A-II Technique Gene-Targeted Gene-targeted, Transgentic anti-Atherosclerosis Gene Therapy B-Thalassemia Sickle Cell Anemia Apo AI, Ape E, LDLR Transgenic ß -globin ßs (and variants) Interleukin-10 and TInflammatory Bowel Disease Interleukine-2, cell Receptor ,ß ; MHC II Severe Combined Rag-1, Rag-2 Immunodeficiency Disease Muscluar dystrophy Gene Dystrophin Theraphy Alzheimers disease ß -amyloid Amyotrophic lateral neurofilament heavy chain sclerosis (ALS) Insulin Dependent Diabetes interferonMellitus many oncogenes and tumor supressor Cancer genes Gene-Targeted Transgenic Gene-Targeted Gene-Targeted Transgenic Transgenic Transgenic Transgenic Transgenic Transgenični ili delecijom izazvani mutanti u patogenezi psorijaze • Najčeće rabljeni mišji modeli: • K5-Tie2 (prekomjerna izražajnost endotelial specifičnih receptora tirozin kinaze u bazalnim keratinocitima), • imiquimod (topikalna primjena agonistaTLR receptora imiquimod (IMQ) • K14-AREG (prekomjerna izražajnost ljudskog amfiregulina u bazalnom epidermalnom sloju) • K5-Stat3C (mutant s konstitutivno aktivnim prijenosom signala i aktivacijom transkripcijskog čimbenika 3 u bazalnim keratinocitima • K5-TGFbeta1 (pojačana ekspresija latentnog oblika transformacijskog čimbenika rasta beta 1 u bazalnim keratinocitima Psorijazne lezije u laboratorijskim miševima Svaki model miša pokazuje crvenilo, pokrivenost s ljuskastim nakupinama kože s makroskopskim značajkama sličnim s kliničkim oblikom psorijaze kod ljudi. 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetatom–inducirana epidermalna hiperplazia u uhu K5.Stat3C transgeničnog miša Kontrola IgG Anti-IL-17A Anti-12/23p40 Anti-IL-23p19 IL-23/Th17 igra važnu ulogu u patogenezi psorijaze; točni doprinosi IL-23 i IL-17 in vivo nejasni K Stat3C transgenični miševi konstitutivno izražavaju aktivirani Stat3 unutar keratinocita; životinje razvijaju oštećenja kože s histološkim i citokinskim profilom sličnim psorijazi u ljudi. 5.Stat3C transgeničnog Hipoteza citokinske hijerarhije za razvoj psorijaze IL-17 Th17 IL23 NK-22 ? IL-22 Keratinocite X J Immunol 2011; 186:4481-4489 Drugi članovi IL-20 obitelji (IL-20, 19, 22, 24, 26) Psoriatičke promjene Negativni modeli bolesti • U ovom modelu rabe se određene vrste, soj ili pasmina životinja u kojih se određena bolest ne pojavljuje. • Ovakvi modeli se rabe u istraživanjima mehanizma otpornosti na određene bolesti. Negativni Modeli (non-model)-modeli gdje određeni bolest ne može biti proizvedena • • • • • • Oposum otporan na bjesnoću Rhesus majmuna otporne na hepatitis B Štakor (wood) imun na ugriza zmija Morski psi su otporni na rak Gerbili su otporni na zračenja zec ne može biti inficiran s gonorejom. „Orphan“ model bolesti • “Orphan“ model bolesti rabi se u opisu funkcionalnih poremećaja koji se javlaju u životinja a nisu opisani u ljudi. • Primjerice, spongiformna encefalopatija goveda (engl. Bovine spongiform encephalophaty, BSE) te virusna leukemija mačke (engl.Feline immunodeficientncy virus, FIV). • Ukoliko se i u ljudi otkriju bolesti slične ovim opisanim u životinjama, spoznaje prikupljene u veterinarskoj medicine pomoći će u rasvjetljavanju etiologije, patogeneze i liječenja novootkrivene bolesti u ljudi. Nespecifična otpornost – upalna reakcija Kemijska tvar Fizička tvar Ozljeda tkiva Patogeni mikroorganizam Posrednici (medijatori) upalne reakcije Širenje kapilare (dilatacija) Povećava kapilarna propusnost Privlačenje leukocita Sustavni odgovor (permeabilnost) Groznica Povećan protok krvi Oslobađanje tekućine Temperatura Crvenilo Migracija leukocita na mjesto ozljede Osjetljivost Proliferacija leukocita Otok Bol Upala; shematski prikaz Bakterijska invazija Ili oštećenje tkiva Oslobađanje histamina od mastocita Lokalna arterijska vazodilatacija Povećanje lokalne propusnosti kapilara Povećanje krvnog dotoka u Oštećeno tkivo crvenilo toplina Povećanje plazmatskih proteina; čimbenika koagulacije u tkivu Lokalna akumulacija tekućina otok bol Povećanje fagocitoze u tkivu Obrana protiv stranih napadača; popravak tkiva Fagocitna sekrecija Sustavni odgovori, kao što je povećanje temperature Patogeni Kemijski signali U tkivo ulaze fagociti, tekućina, i faktori grušanja krvi Fagociti Krvna kapilara Ozljeda tkiva, ispuštanje biološki aktivnih tvari (histamina, prostaglandina, itd) Vazodilatacija, povećana propusnost krvnih žila, migracija fagocita u ozlijeđeno područje Fagociti (makrofagi i neutrofili) uklanjaju patogene i ostatke oštećenog tkiva fagocitozom, tkivo zacjeljuje Podjela upalnih reakcija s obzirom na vremensko trajanje upale, vrstu etiološkog čimbenika, patološke značajke upalne reakcije i zahvaćenost tkiva upalom Klasični životinjski upalni modeli Akutna upala UV-eritem Kronična upala Model granuloma izazvanog potkožnom implantacijom (vata, spužva, stakleni štapić) Pojavnost upalnih medijatora Model akutne sustavne anafilakse (ovalbumin) Model propusnosti krvnih žila Schultz-Daleova reakcija Model edema uške (oksazolon, Model pasivne kožne anafilakse (ovalbumin) Model edema šape Arthusov tip neposredne preosjetljivosti (ovalbumin) Model upale poplućnice Model odgođenog tipa preosjetljivosti (ovalbumin, pikril klorid) krotonsko ulje, kantaridin, IL-1, arahidonska kiselina, forbolni esteri) (karagenin,formaldehid, dekstran, albumin, kaolin) histamin, bradikinin, karagenin,prostaglandin, dekstran, turpentin) ( Model kožnog granuloma (krotonsko ulje, karagenin) Model adjuvantnog artritisa (Freudov adjuvant) Primjeri upalnih reakcija akutne upala uške izazvana s PMA (forbol 12-miristat 13 acetat pokusa oksazolonom izazvanog odgođenog tipa preosjetljivosti kronične upale uške izazvane višestrukim nanošenjem oksazolona pokusa liposaharidom (LPS) izazvane plućne neutrofilije pokusa liposaharidom (LPS) izazvane endotoksemije pokusa liposaharidom (LPS) izazvanog septičkog šoka Adjuvants: • tvari koje pomješane s antigenom i injicirane pojačavaju imunogeničnost antigena (lat. adjuve-pomoći) • produžavaju vrijeme otpuštanja antigena • pojačavaju kostimulatorne signale • stvaraju formiranje granuloma • stimuliraju nespecifičnu proliferaciju limfocita Suvremeni životinjski upalni modeli Psorijaza Atopičkog dermatitisa KOBP-a Sepse Transplantacija psorijatične kože imunodeficijentnim AGR129 miševima Model kroničnog dermatitisa (različite vrste haptena) Modeli bronhitisa (sumporni dioksid, virusi, bakterije) Model odgođenog tipa preosjetljivosti (ovalbumin) Model odgođenog tipa preosjetljivosti (ovalbumin) Modeli emfizema pluća (elastaza, papain, dim cigarete, dušični dioksid, endotoksini) Modeli septičkog šoka (LPS, mikroorganizmi, feces, crijevni sadržaj, zimozan) Model NC/Nga miševa Model emfizema pluća nastali genetskim injženjeringom Model iakutne ozljede pluća (LPS, sadržaj crijeva) Model kroničnog iritantnog kontaktnog dermatitisa (TPA) Modeli psorijaze nastali genetskim injženjeringom Model dermatitisa u štakora izazvanog nedostatkom magnezija Modeli plućne neutrofilije (LPS, dim cigarete) Model dermatitisa u golokožih zamoraca izazvan superantigenom Modeli plućne fibroze (bleomicin, mikroorganizmi, pesticid, azbest) Model pasivne kožne anafilakse (ovalbumin) Modeli plućne hipertenzije (monokrotalin, kronična hipoksija Modeli atopičkog dermatitisa nastali genetskim injženjeringom Model endotoksemije (LPS) Animalni modeli u tumorskoj imunologiji Inducirani Inducirani toksinima, virusima ili zagađenjem Injiciranje tumorskih stanica u životinje Topička primjena kemikalija koje prouzrokuju tumor Transplantacija spontanih tumora Animalni modeli u tumorskoj imunologiji S obzirom na nastanak tumora, tumori mogu biti: Spontani tumori • idiopatski • karcinogenom inducirani • transgeni/knock-out životinje: p53, Rb, … Transplantirani tumori • Animalni tumori: Lewis-ov karcinom pluća, karcinom mliječne žlijezde miša, S 180 sarkom, Ehrlichov solidni i/ili asctični tumor • Ljudski „ksenograft“ model: ljdske tumorske stanične linije imlantirane u imunodeficijentne životinje (primjerice, SCID miševa kao nositelja leukemijskih stanica ljudi) • Transplantacija tkiva tumora ljudi u šupljine ili tkiva miševa Ostali tumorski animalni modeli Orthopic animalni modeli • dobiju se implantacijom tumorskih stanica u ciljne organe. • reproducira aspekte mikrookoliša tumora i oponaša niz važnih bioloških značajki progresije tumora, angiogeneze, metastaziranja i otpornosti stanica tumora na terapiju (rezistencija). transgenični tumorski modeli, • primjerice knock out miševi za p53 ili neki drugi tumor supresor gen kao i razvoj endogenih tumorskih stanica. izlaganje životinja kroničnom stresu može potaknuti rast tumora i angiogenezu. • Neuroendokrini stres • utječe na rast i aktivnost malignog tkiva putem receptora za hormone na stanicama tumora (karcinom ovarija) Različiti oblici upale i njena uloga u tumorogenezi b i o c h e m i c a l pharma c o logy 7 2 ( 2 0 0 6 ) 1 6 0 5– 1 6 21 Veza između upale i razvoja karcinoma Molekularni mehanizmi kemoprevencije kolorektalnog tumora prirodnim hranidbenim komponentama Slijed pojava premalignih promjena u intestinalnom tipu karcinoma Karcinogeneza je stupnjevit proces nastanka tumora ISTRAŽIVANJE SPONTANOG METASTAZIRANJA Supresija metastaza Supresija tumora Proces metastaziranja Primary malignant neoplasm Angiogenesis Invasion/ transport Extravasation Adherence to capillary endothel Tumor cell emboli (interactions with thrombocytes and other blood cells) Establishment of microenvironment Transport Proliferation Metastases Design by dr. Zoran Tadić Proizvodnja tumorskih stanica u plućima Tumorska angiogeneza Tumorska angiogeneza Usporedba normalnih i angiogeničnih krvnih žila A B Normalno krvožilje s organiziranim venulama, arteriolama i kapilarima (A) Tumorska mikrovaskulatura s nedostatkom konvencionalne hijerarhije krvnih žila (B). Preuzeto iz: McDonald and Choyke, 2003 Peritonealna karcinomatoza Višestruko modulatorni učinak kemoterapeutski spojeva na imunološki sustav Menard et al. Cancer Immunol Immunother (2008)57:1579-1587) Proizvodnja monoklonskih protutijela Kultura stanica mijeloma Antigen Izolacija stanica slezene Uzgoj stanica u selekcijskom mediju Selekcija hibridnih stanica (hibridoma) Selekcija stanica koje proizvode željeno antitijelo Poticanje nastanka tumora Uzgoj u staničnoj kulturi M o n o k l o n s k a a n ti ti j e l a Pokus o porijeklu limfocita Test na odgovor limfocita T Imunizacija antigenom A Izolacija stanica iz limfnog čvora nakon 5 - 10 dana bez antigena antigen A antigen B Uzgoj stanica s antigenima A i B antigen A Mjerenje proliferacije limfocita T antigen B bez antigena 1 3 Dani u kulturi 5
© Copyright 2024 Paperzz
