ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ 2011
Η (επανα)γέννηση τη Λίµνης Κάρλας
Κωνσταντίνος Αρ. Κορµάς, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας
Μαρία Μουστάκα-Γούνη, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης
Ιφιγένεια Κάγκαλου, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας
Παναγιώτης Βερίλλης, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας
Ήρα Καραγιάννη, Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων
Δεκέµβριος 2011
1
1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η Ελλάδα είναι μια από τις χώρες με τη μεγαλύτερη ακτογραμμή σε σχέση με την επιφάνεια της. Ωστόσο, διαθέτει πολλά και ποικίλα οικοσυστήματα εσωτερικών νερών. Σε αυτά, ιδιαίτερη σημασία έχουν οι λίμνες της, οι οποίες χαρακτηρίζονται από ποικίλες τροφικές καταστάσεις αλλά και χρήσεις. Οι κυριότερες οικοσυστημικές υπηρεσίες των λιμνών είναι: (α) αλιεία, (β) αποθήκευση νερού, (γ) υδατοεκτροφές εδώδιμων και διακοσμητικών ειδών, (δ) αναψυχή (π.χ. ερασιτεχνική αλιεία, υδάτινα αθλήματα) (Moss 2010). Ωστόσο, κάθε μια από τις παραπάνω υπηρεσίες διατρέχει αντίστοιχους κίνδυνους όπως υπεραλίευση, ευτροφισμό, εισβολή ξενικών ειδών, ρύπανση μέσω υποβάθμισης της λεκάνης απορροής. Ως εκ τούτου, η μελέτη αλλά κυρίως η διαχείριση αυτών των συστημάτων οφείλει να είναι εξειδικευμένη για κάθε ένα από αυτά και σε κάθε περίπτωση οφείλει να περιλαμβάνει βιολογικές και αβιοτικές παραμέτρους. Οι λίμνες από τη στιγμή της γέννησής τους βρίσκονται σε μονόδρομη πορεία προς το φυσικό θάνατό τους, ο οποίος επέρχεται όταν η υδάτινη στήλη της λίμνης πληρωθεί, στο γεωλογικό χρόνο, από τα χερσογενή υλικά που εισρέουν σ' αυτήν (Scheffer 2004, Wetzel 2006). Η πλήρωση μιας λίμνης με νερό, όμως, μπορεί να παρακολουθηθεί μόνον στις περιπτώσεις τεχνητών υδροματιευτήρων ενώ για τις φυσικές λίμνες η διαθέσιμη πληροφορία σχετικά με την ιστορία τους προέρχεται από το αρχείο του ιζήματος (παλαιολιμνολογία). Στη χώρα μας, αυτήν τη στιγμή λαμβάνει χώρα η πλήρωση της αποξηρανθείσας Λίμνης Κάρλας, στη Θεσσαλία, παρέχοντας μια μοναδική ευκαιρία, σε παγκόσμιο επίπεδο, για την (επανα)γέννηση μιας φυσικής λίμνης. Η ιδιαιτερότητα αυτής της δράσης έγκειται σε δύο κυρίως σημεία: (α) από την αποξήρανσή της η Λ. Κάρλα χρησμιοποιήθηκε ως αγροτική γη και (β) ο κύριος όγκος του εισερχόμενου νερού προέρχεται από τον Ποταμό Πηνείο, ένα σύστημα το οποίο αντιμετωπίζει τα δικά του οικολογικά και διαχειριστικά προβλήματα. Η εκτροπή της φυσικής ροής του νερού του Πηνειού κι έτσι η χρήση του νερού του για την Κάρλα σε συνδυασμό με τον εάν η πλήρωσή της θα οδηγήσει σε μια βιώσιμη λίμνη είναι προς συζήτηση. Είναι χαρκατηριστικός ο τίτλος της ημερίδας που διοργανώθηκε τον Οκτώβριο 2011 από το Φορέα Διαχείρισης της Περιοχής Οικοανάπτυξης Κάρλας -­‐ Μαυροβουνίου -­‐ Κεφαλόβρυσου -­‐ Βελεστίνου: «Η νέα λίμνη Κάρλα: δημιουργία ενός προστατευόμενου υγρότοπου ή ενός ταμιευτήρα;». Μετά από περίπου δύο χρόνια από την έναρξη της επανπλήρωσης της, η νέα λίμνη Κάρλα είναι σαν ένα μωρό: δεν ξέρουμε ακόμη τι θα γίνει όταν μεγαλώσει! Με άλλα λόγια, εάν θα αποκτήσει τα χαρακτηριστικά ενός υδροταμιεύτηρα με διάφορες χρήσεις ή θα πρέπει να κατηγοριοποιηθεί ως προστατευόμενος υγρότοπος. Η πρόσφατα ανασυγκροτημένη/αποκατασταθείσα νέα λίμνη αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό οικοσύστημα για τη μελέτη των μικροσκοπικών πλαγκτικών οργανισμών, καθώς η οικολογική διαδοχή των βιοκοινοτήτων της διακόπηκε απότομα τη δεκαετία του ‘60 και επανεκκινήθηκε τεχνητά τα τελευταία δύο χρόνια περίπου. Ένα τέτοιο οικοσύστημα βρίσκεται υπό συνεχείς μεταβολές, μέχρι η λίμνη να σταθεροποιήσει την στάθμη της. Αυτές οι μεταβολές σε συνδυασμό με την επικρατούσα κλιματική αλλαγή καθιστούν αυτό το οικοσύστημα μοναδικό για τη μελέτη του εποικισμού και την επακόλουθη εγκατάσταση μικροοργανισμών και μικροοργανισμικών κοινοτήτων σε φυσική κλίμακα. Η παρούσα τελική έκθεση του έργου «H (επανα)γέννηση της Λίμνης Κάρλας» συγκεντρώνει τα αποτέλεσματα από τις μελέτες μας κατά την πρώτη χρονιά επαναπλήρωσής της λίμνης, στοχεύοντας στους μικροσκοπικούς οργανισμούς του πλαγκτού. Οι πλαγκτικοί αυτοί μικροοργανισμοί μπορούν να αποκρίνονται ταχύτατα όσο καμιά άλλη ομάδα οργανισμών στις έντονα μεταβαλλόμενες συνθήκες ενός τέτοιου οικοσυστήματος ενώ παρέχουν σημαντική πληροφόρηση τόσο για πιθανούς κινδύνους για το σύστημα αλλά και 2
επιτρέπουν ασφαλείς εκτιμήσεις για τη μελλοντική οικολογική ποιότητα της λίμνης αναγνωρίζοντας πιθανές αιτίες υποβάθμισής του. 2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2.1. Περιοχή μελέτης – δειγματοληψίες Η λίμνη Κάρλα (39ο 29΄02΄΄Ν, 22ο 51΄41΄΄Ε) βρίσκεται υπό καθεστώς πλήρωσης μετά την απόστράγγισή της το 1962 μέσω σήραγγας προς τον Παγασητικό Κόλπο. Ωστόσο, ακόμη και μέχρι την έναρξη της επαναπλήρωσής της στο τέλος της δεκαετίας 2000, είχαν παραμείνει μόνιμες ελώδεις περιοχές μικρής όμως έκτασης. Η δομή και η λειτουργία της λίμνης καθοριόταν κυρίως από Πηνειό ποταμό, μέσω των πλημυρικών περιστατικών που τροφοδοτούσαν τη λίμνη με θρεπτικά συστατικά. Αυτές οι εισορές θρεπτικών καθώς και η ποικιλότητα των ειδών ορνιθοπανίδας και ιχθυοπανίδας χαρακτήριζαν την λίμνη ως εύτροφη αλλά με μεγάλη σταθερότητα πριν από την αποξήρανσή της (Ananiadis, 1956). Η απόφαση για την επαναπλήρωση της λίμνης λήφθηκε στη δεκαετία του 1990 εκτρέποντας νερό από τον Πηνειό. Η επαναπλήρωσή της ξεκίνησε το Σεπτέμβριο του 2009, αφού πρώτα είχε κατασκευαστεί περιφερειακό φράγμα που περικλείει έκταση 38 km2. Οι μηνιαίες δειγματοληψίες περιελάμβαναν τη συλλογή νερού από το σημείο βυθομέτρησης στη νότιο-­‐ανατολική ακτή της λίμνης (Εικ. 1), από το Μάρτιο μέχρι και το Δεκέμβριο 2010. Σε κάθε δειγματοληψία συλλέγονταν 5 l νερού για τις παρακάτω αναλύσεις: ανάλυση φυτοπλαγκτού, μοριακές αναλύσεις μικροσκοπικών ευκαρυωτών και ηλεκτρονική μικροσκοπία. Τέλος, γίνονταν επιτόπιες μετρήσεις θερμοκρασίας, pH και αγωγιμότητας με αυτόματο μετρητή (WTW, Germany). Εικόνα 1. Ο σταθμός δειγματοληψίας στη Λίμνη Κάρλα (μαύρος κύκλος) και τα δύο σημεία εισροών της από τον 3
Πηνειό ποταμό (μαύρα τετράγωνα). 2.2. Μικροσκοπική ανάλυση φυτοπλαγκτού H μικροσκοπική ανάλυση του φυτοπλαγκτού πραγματοποιήθηκε σε ανάστροφο μικροσκόπιο Nikon ECLIPSE TE2000-­‐S φωτεινού πεδίου, αντίθεσης φάσης και φθορισμού. Χρησιμοποιήθηκαν ζωντανά και συντηρημένα με Lugol και φορμόλη δείγματα νερού. Η αναγνώριση και ταξινόμηση των οργανισμών του φυτοπλαγκτού στηρίχτηκε στη χρήση των ταξινομικών συγγραμάτων και εργασιών των Huber-­‐Pestalozzi (1938, 1941, 1942, 1950, 1955, 1961), Tikkanen (1986), Hindák & Moustaka (1988), Komárek (1991), Anagnostidis & Komárek (1988), Komárek & Anagnostidis (1986, 1989), Komárek & Anagnostidis (1999). Η καταμέτρηση των ειδών του φυτοπλαγκτού πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο του Utermöhl (1958) και την τροποποίηση κατά Sandgren & Robinson (1984) σε ανάστροφο μικροσκόπιο Nikon ECLIPSE TE2000-­‐S με μικροσκοπία φωτεινού πεδίου και αντίθεσης φάσης. Δείγματα συντηρημένα με Lugol εξετάστηκαν σε θαλάμους των 2, 5, 10 και 25 ml, αφού προηγήθηκε έλεγχος αυτών στο ανάστροφο μικροσκόπιο ως προς την πυκνότητά τους σε οργανισμούς (μεγάλη πυκνότητα οργανισμών → μικρότερος ο όγκος του υπό εξέταση δείγματος). Ο χρόνος καθίζησης των οργανισμών στους θαλάμους ήταν τουλάχιστον ίσος με 6 h (όπως ορίζεται στους Willen (1976) και Rott (1981). Η επιλογή της επιφάνειας του θαλάμου καθώς και της μεγέθυνσης του φακού που χρησιμοποιήθηκαν για την καταμέτρηση των οργανισμών, έγινε με βάση την κατανομή, την αφθονία και το μέγεθος των οργανισμών. Συγκεκριμένα, η καταμέτρηση των σπανιότερων και μεγαλύτερων σε μέγεθος οργανισμών (κύτταρα, τριχώματα, νήματα, αποικίες) πραγματοποιήθηκε με σάρωση του θαλάμου σε μεγέθυνση x10 (αντικειμενικός φακός: Nikon 10x/0.25, Ph1 DL, οο/-­‐ WD 7.0). Aφού εξετάστηκε ο θάλαμος για την ομοιογένεια της κατανομής των οργανισμών στην επιφάνειά του, η καταμέτρηση ι) των αφθονότερων και μικρότερων σε μέγεθος οργανισμών (κύτταρα, νήματα) πραγματοποιήθηκε με την εξέταση σε μεγέθυνση x40 (αντικειμενικός φακός: Nikon 40x/0.65, Ph2 DL, oo/-­‐ WD 0.57) τουλάχιστον 70 οπτικών πεδίων και ιι) των άφθονων μεγάλου μεγέθους ατόμων ή αποικιών με την εξέταση σε μεγέθυνση x10 ή x20 (αντικειμενικός φακός: Nikon 10x/0.25, Ph1 DL, oo/-­‐ WD 7.0 και Nikon 20x/0.40, Ph1 ΑDL, oo/1.2 WD 3.1 αντίστοιχα) τουλάχιστον 20 ή 30 οπτικών πεδίων αντίστοιχα. Η θέση των οπτικών πεδίων καθορίστηκε σύμφωνα με τη σχέση του εμβαδού της επιφάνειας της κεντρικής περιοχής προς το εμβαδόν της περιφέρειας του θαλάμου (Sandgren & Robinson 1984). Σε κάθε θάλαμο καταμετρήθηκαν τουλάχιστον 100 άτομα των πιο άφθονων ειδών και 400 άτομα συνολικά, με μέγιστο ποσοστό σφάλματος στην καταμέτρηση 20% και 10% αντίστοιχα (Willen 1976). Για τον υπολογισμό των κυττάρων ανά αποικία στα είδη του γένους Microcystis χρησιμοποιήθηκε η εξίσωση (Μουστάκα 1988): y= 1,4751 x διάμετροςαποικίας1,5453 Η αφθονία των οργανισμών του φυτοπλαγκτού εκφράστηκε σε άτομα·L-­‐1. Τα είδη που η συμμετοχή τους στη συνολική βιομάζα ήταν >10% χαρακτηρίστηκαν ως κυρίαρχα (Sommer 1981). 2.2. Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης Έγινε μονιμοποίηση νερού 50 ml με γλουταραλδεΰδη τελικής συγκέντρωσης 2.5% και 4
τοποθετήθηκε στους 4°C για τουλάχιστον 5 ώρες πριν την παρατήρηση. Στη συνέχεια 5-­‐10 ml του δείγματος αυτού διηθήθηκε υπό κενό σε πολυκαρβονικό ηθμό μεμβράνης ίσου πόρου 0,2 μm (Millipore, USA). Ο ηθμός ξηράνθηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε περιβάλλον χωρίς αιωρούμενα σωματίδια. Σε ένα μικρό τμήμα της μεμβράνης έγιναν διαδοχικές εμβαπτίσεις σε ανιούσα σειρά αλκοολικών υδατικών διαλυμάτων (20%, 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, 100%). Η κάθε εμβάπτιση διήρκησε 10 λεπτά, με την τελευταία να επαναλαμβάνεται εις διπλούν. Ακολούθησε ξήρανση κριτικού σημείου με διοξείδιο του άνθρακα και επιμετάλλωση της μεμβράνης. Τέλος έγινε παρατήρηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σαρώσεως (Cambridge Stereoscan 240) και λήφθησαν φωτογραφίες των μικροοργανισμών με τη βοήθεια προσαρμοσμένης φωτογραφικής μηχανής. 2.3. Μοριακές αναλύσεις Όγκος νερού 200 – 500 ml διηθήθηκε σχεδόν αμέσως (< 2 ώρες) μετά τη συλλογή του χρησιμοποιώντας συσκευή διήθησης χαμηλού κενού (<100 mm Hg) σε πολυκαρβονικό ηθμό μεμβράνης ίσου πόρου 0,2 μm (Millipore, USA). Είχε προηγηθεί προ-­‐διήθηση μέσω ηθμού πλέγματος 180 μm (Millipore, USA) ώστε να απομακρυθούν μεγάλα τεμάχια οργανικού υλικού και ζωοπλαγκτικοί οργανισμοί. Οι ηθμοί φυλάχτηκαν στους -­‐800C μέχρι την απομόνωση του DNA. Η απομόνωση του DNA πραγματοποιήθηκε από τους παραπάνω ηθμούς, αφού τεμαχίστηκαν σε λεπτές λωρίδες χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο νυστέρι, χρησιμοποιώντας το UltraClean Soil DNA isolation kit (MoBio Laboratories, USA). Το ολικό DNA φυλάχτηκε στους -­‐800C μετά το τέλος της απομόνωσης. Η ποσοτικοποίηση έγινε με χρήση φασματοφωτομέτρου NanoDrop ND-­‐1000. Για τον έλεγχο ενίσχυσης του γονιδίου 18S rRNA χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές EukA (5΄-­‐
AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-­‐3΄) και EukB (5΄-­‐TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-­‐3΄) οι οποίοι είναι ειδικοί για ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Medlin et al., 1988). Το μείγμα της PCR τελικού όγκου 50 μL περιείχε περίπου 5-­‐10 ng περιβαλλοντικού DNA, 10 μL buffer 5x (Green GoTaq Flexi buffer, Promega, USA), 200 μΜ από κάθε 5΄-­‐τριφωσφορικό δεοξυριβονουκλεοτίδιο, 1,5 mM MgCl2, 0,5 μΜ από κάθε εκκινητή και 1,25 U Taq πολυμεράσης (GoTaq DNA polymerase, Promega, USA). Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα για την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR ήταν αρχική αποδιάταξη στους 950C για 15 min, ακολουθούμενη από τρία στάδια: 1) της αποδιάταξης στους 950C για 45 sec 2) της υβριδοποίησης των εκκινητών στους 550C για 1 min και 3) της επιμήκυνσης των θυγατρικών κλώνων στους 720C για 2 min και 30 sec. Ο θερμοκρασιακός κύκλος των τριών παραπάνω σταδίων επαναλήφθηκε για 30 κύκλους. Έπειτα ακολούθησε το στάδιο της τελικής επιμήκυνσης στους 720C για 7 min. Τα προϊόν της αντίδρασης διατηρήθηκε προσωρινά στους 100C και είχε μοριακό βάρος περίπου 1800 bp. Μετά το πέρας της ενίσχυσης του επιθυμητού γονιδίου το αποτέλεσμα της όλης αντίδρασης οπτικοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% σε διάλυμα 1x ΤΑΕ και η συσκευή ηλεκτροφόρησης που έφερε το πήκτωμα αφέθηκε για 30 min στα 90 Volts. Η χρώση του πηκτώματος έγινε σε διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου. Ο καθαρισμός των προϊόντων της PCR έγινε με το τυποποιημένο kit Montage (Millipore, USA) ακολουθώντας τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε επιτρέπει την συμπύκνωση των προϊόντων από κάθε αντίδραση PCR και απομακρύνει εκκινητές και τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια που δεν αξιοποιήθηκαν κατά την PCR. Ο έλεγχος του καθαρισμού έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Τα καθαρά προϊόντα της PCR χρησιμοποιήθηκαν ώστε να κατασκευαστούν οι 5
βιβλιοθήκες κλώνων με τα γονίδια 18S rRNA. Χρησιμοποιήθηκε το τυποποιημένο Topo XL PCR cloning kit (Invitrogen Co.) και ο μετασχηματισμός πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροώσμωση (electroporation) με βάση το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Προσθήκη του προϊόντος της PCR έγινε στα πλασμίδια (φορείς κλωνοποίησης) και το μείγμα επωάστηκε στους 250C για 5 min ώστε να ενσωματωθεί το επιθυμητό γονίδιο στα πλασμίδια. Μετά το πέρας των 5 min διάλυμα αλάτων προστέθηκε ώστε να τερματιστεί η αντίδραση της ενσωμάτωσης. Ακολούθησε μετασχηματισμός των βακτηριακών κυττάρων με την διαδικασία της ηλεκτροώσμωσης και κατόπιν παρήχθη θρεπτικό μέσο ανάρρωσης στα κύτταρα και επωάστηκαν στους 370C για 1 h. Τρυβλία με θρεπτικό μέσο Luria-­‐Bertani agar και καναμυκίνη συγκέντρωσης 50 μg/ml επιστρώθηκαν ασηπτικά χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές ποσότητες (40 μL, 60 μL και 100 μL) από το βακτηριακό εναιώρημα και επωάστηκαν στους 370C για 16 h. H παρουσία του ενθέματος (γονίδιο 18S rRNA) ελέγχθηκε με PCR στις αποικίες που εμφανίστηκαν χρησιμοποιώντας το ζεύγος εκκινητών Μ13F (5΄-­‐GTAAAACGACGCCCAG-­‐3΄) και Μ13R (5΄-­‐CAGGAAACAGCTATGAC-­‐3΄). Οι εκκινητές είναι ειδικοί για το φορέα κλωνοποίησης που χρησιμοποιήσαμε και πλαισιώνουν εκατέρωθεν το ένθεμα. Το μείγμα της PCR τελικού όγκου 20 μL περιείχε 4 μL buffer 5x (Green GoTaq Flexi buffer), 40 μΜ από κάθε 5΄-­‐τριφωσφορικό δεοξυριβονουκλεοτίδιο, 1,5 mM MgCl2, 0,5 μΜ από κάθε εκκινητή και 0,5 U Taq πολυμεράσης (GoTaq DNA polymerase). Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα για την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR ήταν αρχική αποδιάταξη στους 940C για 4 min, ακολουθούμενη από τρία στάδια: 1) της αποδιάταξης στους 940C για 30 sec 2) της υβριδοποίησης των εκκινητών στους 52,5οC για 30 sec και 3) της επιμήκυνσης των θυγατρικών κλώνων στους 720C για 1min και 30 sec. Ο θερμοκρασιακός κύκλος των τριών παραπάνω σταδίων επαναλήφθηκε για 25 κύκλους. Έπειτα ακολούθησε το στάδιο της τελικής επιμήκυνσης στους 720C για 7 min. Το προϊόν της PCR είχε μοριακό βάρος περίπου 2000 bp. Μετά τον έλεγχο των αποικιών ως προς την παρουσία του γονιδίου 18S rRNA δημιουργήθηκαν ασηπτικά υγρές καλλιέργειες των βακτηριακών κλώνων που ήταν θετικοί στην τεχνική της colony PCR. Οι υγρές καλλιέργειες είχαν 1,4 ml υγρού θρεπτικού μέσου Luria-­‐Bertani και καναμυκίνη συγκέντρωσης 50 μg/ml. Η επώασή τους πραγματοποιήθηκε στους 370C για 18 h στις 180 στροφές/λεπτό. Η απομόνωση του πλασμιδίου πραγματοποιήθηκε με το Nucleospin Plasmid QuickPure kit (Macherey-­‐Nagel GmbH and Co. KG, Germany) όπως προτείνει ο κατασκευαστής. Τα απομονωμένα πλασμίδια φυλάχτηκαν στους -­‐200C. Τα γονίδια αλληλουχήθηκαν με ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς αγγείου στην εταιρεία Macrogen Inc. (Korea) σε συσκευή αλληλούχισης τριχοειδούς αγγείου με τη χρήση του ΒigDye Terminator kit (Applied Biosystems Inc., USA). Για κάθε κλώνο λήφθηκαν τρεις αλληλουχίες με επικάλυψη περίπου 200 βάσεων και μήκος ανάγνωσης περίπου 950 βάσεις. Η επικάλυψη των τμημάτων βοήθησε στην συνένωση των κομματιών και στην απόκτηση της αλληλουχίας του ενισχυμένου γονιδίου από κάθε κλώνο. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι Μ13F, 1179rE (5΄-­‐CCCGTGTTGAGTCAAATT-­‐3΄) και Μ13R. Οι αλληλουχίες στοιχήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα πολλαπλής στοίχισης CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) και χρησιμοποιώντας το κριτήριο ομοιότητας (>98%) (Stackebrandt & Goebel 1994). Με τη βοήθεια του προγράμματος BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) κάθε αλληλουχία συγκρίθηκε με διαθέσιμες αλληλουχίες στις βάσεις δεδομένων του NCBI και βρέθηκαν οι συγγενικά κοντινότεροι φυλότυποι της κάθε αλληλουχίας. Η κατασκευή των φυλογενετικών δέντρων έγινε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Η τοπολογία του 6
δένδρου βασίσθηκε στην μέθοδο Neighbour-­‐ Joining (NJ, Saitou & Nei 1987) και έγινε διόρθωση κατά Jukes-­‐Cantor. O έλεγχος της στατιστικής εγκυρότητας της τοπολογίας του δένδρου έγινε με την μέθοδο bootstrap, στην προκειμένη περίπτωση 1000 φορές. 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η σύσταση των κοινοτήτων των μικροσκοπικών ευκαρυωτών και κυανοβακτηρίων κατά τη διάρκεια των πρώτων μηνών επαναπλήρωσής της λίμνης Κάρλας. Η παρουσία αλλά και η σχετική αφθονία μερικών από τους οργανισμούς αυτούς αποτελούν μια πολύ πραγματική προσέγγιση για την τροφική κατάσταση αλλά και γενικότερη οικολογική κατάσταση του νεοσχηματιζόμενου αυτού υδάτινου συστήματος. Η εποχική διακύμναση των βασικών φυσικών και χημικών παραμέτρων (Πίν. 1) στη λίμνη έδειξε το αναμενόμενο πρότυπο για τη θερμοκρασία και pH. Ωστόσο, η αγωγιμότητα από τους μήνες Μάρτιο μέχρι και Σεπτέμβριο ήταν πολύ υψηλή ενώ τους επόμενους μήνες ήταν αρκετά χαμηλότερη. Έχει προταθεί ότι αυτές οι υψηλές τιμές μπορεί να οφείλονται στην παρατεταμένη γεωργική εκμετάλλευση της γης, κυρίως μέσω της χρήσης ανόργανων αλάτων ως λιπάσματα, κατά τη διάρκεια των ετών πριν την έναρξη επαναπλήρωσης της λίμνης (Oikonomou et al. in press). 7
Πίνακας 1. Βασικές φυσικές και χημικές παράμετροι στη λίμνη Κάρλα. pH Θερμοκρασία (0C) 17.03.2010 20.04.2010 28.05.2010 29.06.2010 22.07.2010 28.08.2010 28.09.2010 27.10.2010 25.11.2010 26.12.2010 8.5 8.0 8.0 8.5 8.5 8.5 8.4 8.9 8.8 8.6 15.6 17.2 19.7 28.7 30.3 31.7 25.1 17.5 12.2 8.6 Αγωγιμότητα (mS) 11.67 14.30 17.01 21.21 20.09 23.01 21.12 5.05 5.51 5.14 Η εκτίμηση των πληθυσμών των κυανοβακτηρίων και μικροσκοπικών ευκαρυωτών –
αυτότροφων κι ετερότροφων-­‐ φανέρωσε την επικράτηση διαφορετικών οργανισμών σε διαφορετικές εποχές (Εικ. 2). Την άνοιξη τα επικρατούντα κυανοβακτήρια ανήκαν στα γένη Anabaena και Anabaenopsis (Εικ. 3) Οι οργανισμοί είναι γνωστοί τοξινοπαραγωγοί (Huisman et al. 2005), ενώ άλλα δυνητικών τοξικά κυανοβακτήρια που επμφανίστηκαν σε χαμηλότερες Planktothrix cf. aghardii, Pseudoanabaena limentica. Αυτά τα τάξα έχουν βρεθεί στο παρελθόν σε άλλες ελληνικές λίμνες με προβλήματα τοξικότητας από κυανοβακτήρια (Vardaka et al. 2005, Moustaka-­‐Gouni et al. 2007, Papadimitriou et al. 2010). H μοριακή ανάλυση των Εικόνα 2. Ποσοστιαία συμμετοχή των κυριότερων ταξινιμικών ομάδων του φυτοπλαγκτού στη λίμνη Κάρλα. 8
κυανοβακτήριων (Εικ. 4-­‐6, Oikonomou et al. in press), πέρα από την επιβεβαίωση αυτών που βρέθηκαν με τη μικροσκοπική μέθοδο, αποκάλυψε και άλλα τάξα όπως Spirulina sp., Synechococcus sp. καθώς και μερικά νέα, μη ταξινομημένα κυανοβακτήρια. Όπως και σε άλλες περιπτώσεις, έτσι και στη λίμνη Κάρλα, η μοριακή ανάλυση των κυανοβακτηρίων έφερε στο φως και αρεκτούς φυλότυπους που ανήκουν στο φύλο των Verrucomicrobia. Η ομάδα αυτή είναι πιθανόν να περιλαμβάνει βακτήρια που ευδοκιμούν σε κυανοβακτηριακές ανθίσεις νερού (π.χ. Wu et al. 2007, Ye et al. 2009, Kormas et al. 2010, 2011). Άλλα σημαντικά, δυνητικώς τοξινοπαραγωγά τάξα που βρέθηκαν τους υπόλοιπους μήνες, αλλά ήταν τα Jaaginema sp., Limnothrix sp., Microcystis sp. Οι πλαγκτικές κοινότητες των μικροσκοπικών ευκαρυωτών αποτελούνται από αρκετά μεγάλο αριθμό ειδών/φυλοτύπων. Αυτό το συμπέρασμα προήλθε από το συνδυασμό της μικροσκοπικής αναγνώρισης (Εικ. 2, 3) με τη μοριακή ταυτοποίηση (Εικ. 7-­‐14, Oikonomou et al. in press) αυτών των οργανισμών, που θεωρείται σήμερα ο αποτελεσματικότερος τρόπος μελέτης της βιοποικιλότητας των πλαγκτικών προωτίστων (Caron et al. 2004). Από τους σημαντικότερους οργαισμούς που βρέθηκαν ήταν τα Prymnesium parvum και Pfiesteria piscicida. Είναι η πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία που αναφέρεται η συνύπαρξη των δυο αυτών τοξικών μικροοργανισμών (Oikonomou et al. in press). Αυτοί οι δύο οργανισμοί φαίνεται να ευνοούνται από τις σχετικώς υψηλές αλατότητες που επικράτησαν στη λίμνη Κάρλα το 2010. Εικόνα 3. Φωτογραφίες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης χαρακτηριστικών πλαγκτικών μικροοργανισμών στη λίμνη Κάρλα. (a) Gymnodinium sp., (b) Gymnodinium sp. που τρέφεται με ευγληνοειδές, (c) Peridiniopsis cf. quadridens, (d) Tetraedron minimum, (e) Eutrepsiella sp., (f) Cyclotella_menegheniana, (g) Scenedesmus sp., (h) Anabaenopsis sp., (i) Euglena sp. 9
Εικόνα 4. Φυλογενετικό δέντρο των Cyanobacteria, Μάιος 2010 στη λίμη Κάρλα. Πέρα όμως από τους παραπάνω δύο μικροοργανισμούς και τα κυανοβακτήρια, βρέθηκαν και άλλοι μικροογανισμοί με δυνητικώς παραστική και/ή τοξική δράση, που ανήκουν στις ομάδες των Alveolata, Mesomycetazoa και Chytridiomycota (μύκητες). Ορισμένοι από αυτούς έχουν ήδη βρεθεί στην πολύ υποβαθμισμένη λίμνη Κορώνεια (Genitsaris et al. 2009). H συχνή ύπαρξη χλωροφυκών, και μάλιστα σε υψηλές αφθονίες σε κάποιες δειγματοληψίες, όπως το χλωροφύκος Scenedesmus communis αλλά και του διατόμου Cyclotella meneghiniana, είναι ενδεικτικά υπερ-­‐εύτροφων οικοσυστημάτων που δέχονται υψηλές συγκεντρώσεις ανόργανων θρεπτικών αλάτων. Άλλοι οργανισμοί που επίσης ευδοκιμούν σε συστήματα με υψηλές συγκεντρώσεις οργανικού υλικού και έχουν βρεθεί στην παρούσα μελέτη είναι τα καταβλεφαριδωτά, τα χοανομαστιγωτά και τα ευγληνοειδή, τα οποία ήταν άφθονα σε αρκετές δειγματοληψίες. Μάλιστα, μερικά ευγληοειδή θεωρούνται ως δείκτες οργανικής ρύπανσης (Round 1984). H αύξηση του οργανικού υλικού σε ένα νέο ταμιευτήρα, όπως είναι η λίμνη Κάρλα, οφείλεται στη μεταφορά οργανικού υλικού από το έδαφος κατά την πλήρωση της λεκάνςη με νερό και αναμένεται να είναι υψηλότερη στην αρχή της επαναπλήρωσης (Paterson et al. 1997). H αύξηση του οργανικού υλικού αλλά και οι παρατεταμένες κυανοβακτηριακές και φυτοπλαγκτικές ανθίσεθς, όπως συμβαίνει και στη 10
Εικόνα 5. Φυλογενετικό δέντρο των Cyanobacteria, Αύγουστος 2010 στη λίμη Κάρλα. λίμνη Κάρλα, μπορεί να προκαλέσουν άμεση απόκριση στο βακτηριοπλαγκτό, με αποτέλεσμα τη θεαματική αύξηση στην αφθονία των βακτηριακών κυττάρων (Ye et al. 2011). Αδημοσίευτα δεδομένα μας, δείχνουν ότι η βακτηριακή αφθονία τους θερινούς μήνες στη λίμνη Κάρλα μπορεί να φτάσουν και τα 80 x 106 κύτταρα/ml. Αν και η παρούσα μελέτη στόχευε μόνο στην αναγνώριση των σημαντικότερων πλαγκτικών μικροοργανισμών και όχι στη μεταβολικής τους δραστηριότητα, οι υψηλές αφθονίες πολλών από αυτά τα καθιστά σημαντικά στην οικοσυστημική λειτουργία στη λίμνης Κάρλα. Συμπερασματικά, κατά τους πρώτους μήνες της επαναγέννησης της, η λίμνη Κάρλα χαρακτηρίζεται ως ένα υπερεύτροφο οικοσύστημα που φιλοξενεί αρκετούς παρασιτικούς και/ή τοξικούς μικροοργανισμούς, μερικοί από τους οποίους σχηματίζουν παρατεταμένες ανθίσεις νερού. Τέτοιοι μικροοργανισμοί απαντώνται συνήθως σε γηρασμένες ή 11
υποβαθμισμένες (π.χ. Λίμνη Κορώνεια, Genitsaris et al. 2009) και όχι σε νέες λίμνες, υποδηλώνοντας αμέσως ότι η βιολογική εξέλιξη της Λ. Κάρλας, όπως τη γνωρίζουμε σήμερα, είναι αβέβαιη. Η μεταφορά του νερού μπορεί επίσης να προκαλέσει μη προσδοκόμενη και μη ελεγχόμενη μεταφορά ειδών (ασπονδύλων και σπονδυλωτών, επιβλαβών και μη) ενώ η μείωση της ροής του νερού του ποταμού μπορεί να υποβαθμίσει την ποιότητά του ίδιου του ποταμού (Moss et al. 2010). Ο ρόλος των ξενικών ή εισβολικών ειδών αλλά και του τρόπου μεταφοράς τους, έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην εποχή μας λόγω των οικολογικών αλλαγών που ούτως ή άλλως συμβαίνουν λόγω της κλιματικής αλλαγής, αυξάνοντας ακόμη και την εξάλπωση μολυμσαμτκών ασθενειών (McMichael et al. 2006). Ο πιθανότερος λόγος για την αύξηση αυτών των μικροοργανισμών είναι το εισρέον νερό που χρησιμοποίεται για την επαναπλήρωση της λίμνης. Το νερό αυτό προέρχεται από τον Πηνειό ποταμό, ο οποίος είναι ήδη επιβαρυμένος, τουλάχιστον με υψηλές συγκεντρώσεις ανόργανων θρεπτικών αλάτων. Εφόσον η λίμνη βρίσκεται υπό καθεστώς πλήρωσης, η περιορισμένη απορροή της συμβάλλει στην αύξηση αυτών των μικροοργανισμών. 12
Εικόνα 6. Φυλογενετικό δέντρο των Cyanobacteria, Νοέμβριος 2010 στη λίμη Κάρλα. 13
Εικόνα 7. Φυλογενετικό δέντρο των Alveolata στη λίμνη Κάρλα, τους μήνες Μάιο, Αύγουστο και Νοέμβριο 2010. 14
Εικόνα 8. Φυλογενετικό δέντρο των Cerzozoa στη λίμνη Κάρλα, τους μήνες Μάιο, Αύγουστο και Νοέμβριο 2010. 15
Εικόνα 9. Φυλογενετικό δέντρο των Chlorophyta στη λίμνη Κάρλα, τους μήνες Μάιο, Αύγουστο και Νοέμβριο 2010.
16
Εικόνα 10. Φυλογενετικό δέντρο των Cryptophyta στη λίμνη Κάρλα, τους μήνες Μάιο, Αύγουστο και Νοέμβριο 2010.
Εικόνα 11. Φυλογενετικό δέντρο των Fungi στη λίμνη Κάρλα, τους μήνες Μάιο, Αύγουστο και Νοέμβριο 2010.
17
Εικόνα 12. Φυλογενετικό δέντρο των άγνωστων Fungi στη λίμνη Κάρλα, τους μήνες Μάιο, Αύγουστο και Νοέμβριο 2010.
Εικόνα 13. Φυλογενετικό δέντρο των Mesomycetazoa στη λίμνη Κάρλα, τους μήνες Μάιο, Αύγουστο και Νοέμβριο 2010.
18
Εικόνα 14. Φυλογενετικό δέντρο των Stramenopiles στη λίμνη Κάρλα, τους μήνες Μάιο, Αύγουστο και Νοέμβριο 2010.
19
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Anagnostidis K, Komárek J (1988) Modern approach to the classification system of cyanophytes. 3. Oscillatoriales. Arch. Hydrobiol. Suppl. 80: 327-­‐472. Ananiadis CI (1956) Limnological study of Lake Karla. Bull. Inst. Océanogr. 1083:1-­‐19 Caron DA, Countway PD, Brown MV (2004) The growing contributions of molecular biology and immunology to protistan ecology: Molecular signatures as ecological tools. J. Eukar. Microbiol. 51:38-­‐48 Genitsaris S, Kormas KA, Moustaka-­‐Gouni M (2009) Microscopic eukaryotes living in a dying lake (Lake Koronia, Greece). FEMS Microbiol. Ecol. 69:75-­‐83 Hindák F, Moustaka M (1988) Planktic cyanophytes of Lake Volvi, Greece. Arch. Hydrobiol. Suppl. 80: 497-­‐528. Huber-­‐Pestalozzi, G., 1930-­‐1961: Das Phytoplankton des Susswassers. Systematik und Biologie. In: Thienemann, A. Die Binnengewasser. Schwezerbart, Stuttgart Huisman J, Matthijs HCP, Visser PM (2005) Harmful cyanobacteria. Springer, Dordrecht Komárek J (1991) A review of water-­‐bloom forming Microcystis species, with regard to populations from Japan. Algol. Stud. 64: 115-­‐127. Komárek J, Anagnostidis K (1986) Modern approach to the classification system of cyanophytes. 2. Chroococcales. Arch. Hydrobiol. Suppl. 73: 157-­‐226. Komárek J, Anagnostidis K (1989) Modern approach to the classification system of cyanophytes. 4. Nostocales. Arch. Hydrobiol. Suppl. 82: 247-­‐345. Kormas KA, Gkelis S, Vardaka E, Moustaka-­‐Gouni M (2011) Morphological and molecular analysis of bloom-­‐forming Cyanobacteria in two eutrophic, shallow Mediterranean lakes. Limnologica 41:167-­‐173 Kormas KA, Vardaka E, Moustaka-­‐Gouni M, Kontoyanni V, Petridou E, Gkelis S, Neofitou C (2010) Molecular detection of potentially toxic cyanobacteria and their associated bacteria in lake water column and sediment. World J. Microbiol. Biotechnol. 26:1473-­‐
1482 McMichael AJ, Woodruff RE, Hales S (2006) Climate change and human health: present and future risks. Lancet 367:859–869 Moss B (2010) Ecology of freshwaters. A view for the twenty-­‐first century. Wiley-­‐Blackwell, Oxford Moustaka-­‐Gouni M, Vardaka E, Tryfon E (2007) Phytoplankton species succession in a shallow Mediterranean lake (L. Kastoria, Greece): steady-­‐state dominance of Limnothrix redekei, Microcystis aeruginosa and Cylindrospermopsis raciborskii. Hydrobiologia 575:129–140 Oikonomou A, Matsiapi M, Karayanni H, Moustaka-­‐Gouni M, Kormas KA (in press) Plankton microorganisms coinciding with two consecutive mass fish kills in a newly reconstructed lake. TheScientificWorldJournal Papadimitriou T, Kagalou I, Bacopoulos V, Leonardos ID (2010) Accumulation of microcystins in water and fish tissues: An estimation of risks associated with microcystins in most of the Greek Lakes. Environ. Toxicol. 25:418-­‐427 Paterson MJ, Findlay D, Beaty K, Findlay W, Schindler EU, Stainton M, McCullough G (1997) Changes in the planktonic food web of a new experimental reservoir. Canadian J. Fish. Aquat. Sci. 54:1088-­‐1102 Rott E. (1981) Some results from phytoplankton counting intercalibrations. Schwetz. Z. Hydrol. 43:34-­‐62. Round FE (1984) The ecology of algae. Cambridge University Press, Cambridge 20
Sandgren CD, Robinson JV (1984) A stratified sampling approach to compensating for non-­‐
random sedimentation of phytoplankton cells in inverted microscope settling chambers. Br. Phycol. J. 19: 67-­‐72. Scheffer M (2004) Ecology of shallow lakes. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28:2731-­‐2739 Tikkanen T (1986) Kasviplanktonopas. Suomen Luonnonsuojelun Tuki Oy, Helsinki. Utermöhl H (1958) Zur Vervollkommnung der quantitativen Phytoplanktonmethodik. Mit. Int. Verein. Theor. Angew. Limnology 9:1-­‐38. Vardaka E, Moustaka-­‐Gouni M, Cook CM, Lanaras T (2005) Cyanobacterial blooms and water quality in Greek freshwaters. J. Appl. Phycol. 17:391–401 Wetzel R (2006) Λιμνολογία. Λιμναία και ποτάμια οικοσυστήματα. Εκδόσεις Κωσταράκη, Αθήνα. Willén E (1976) A simplified method of phytoplankton counting. Br. Phycol. J. 11: 265-­‐278. Wu X, Xi W, Ye W, Yang H (2007) Bacterial community composition of a shallow hypertrophic freshwater lake in China, revealed by16S rRNA gene sequences. FEMS Microbiol. Ecol. 61:85–96 Ye W, Liu X, Lin S, Tan J, Pan J, Li D, Yang H (2009) The verticaldistribution of bacterial and archaeal communities in the water and sediment of Lake Taihu. FEMS Microbiol. Ecol. 70:263–276 Ye L, Shi X, Wu X, Zhang M, Yu Y, Li D, Kong F (2011) Dynamics of dissolved organic carbon after a cyanobacterial bloom in hypereutrophic Lake Taihu (China). Limnologica 41:382-­‐
388 21
H (επα)αναγέννηση μιας λίμνης: η περίπτωση της Λίμνης Κάρλας Τελική έκθεση Κ. Αρ. Κορµάς
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ
Συνέδρια / ημερίδες που προέκυψαν από το παρόν έργο Oikonomou A, Katsiapi M, Berillis P, Moustaka-­‐Gouni M, Kormas KA (2010) Microbial gangs are taking over the water column of a reconstructed lake. 14th International Conference on Harmful Algal Blooms, Crete, 01-­‐05/11/2010 Trikolas N, Kormas K, Kagalou I, Berillis P (2011) Contribution to the microscopic eykariote community structure of Lake Karla. 4th International Symposium on Hydrobiology and Fisheries, Volos, Greece, 9-­‐11/06/2011 21/10/2011 -­‐ Ημερίδα «Η νέα λίμνη Κάρλα: δημιουργία ενός προστατευόμενου υγρότοπου ή ενός ταμιευτήρα;». Τίτλος ομιλίας «Η λίμνη Κάρλα πλημμυρίζει με αόρατα επιβλαβή πλάσμαρα», Μουστάκα Μ, Κορμάς ΚΑ Δημοσιεύσεις σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά που προέκυψαν από το παρόν έργο Oikonomou A, Matsiapi M, Karayanni H, Moustaka-­‐Gouni M, Kormas KA (in press) Plankton microorganisms coinciding with two consecutive mass fish kills in a newly reconstructed lake. TheScientificWorldJournal Άρθρα στον περιοδικό τύπο κλπ που προέκυψαν από το παρόν έργο 1. Κορμάς ΚΑ (2010) Ανά(σύ)σταση της λίμνης Κάρλας; «THESSALIKI PRESS», 20/12/2010, σελ. 7 2. Συμβολή στο άρθρο της εφημερίδας «Real News» με τίτλο «Λάκκος με μικρόβια η Λίμνη Κάρλα», 24/12/2010, σελ. 4 3. Συμβολή στο άρθρο της εφημερίδας «Η Καθημερινή» με τίτλο ««Αργοπεθαίνει» η λίμνη Κάρλα Θεσσαλίας, πριν καλά καλά αναγεννηθεί», 04/06/2011, σελ. 21 Ιστοσελίδα που προέκυψε από το παρόν έργο https://sites.google.com/site/lakekarla/
Αλληλογραφία :: Inbox: 504135: Your manuscript has been ac...
https://webmail.uth.gr/horde/imp/message.php?actionID=print...
Η
Ημμεερροομμηηννίία
α:: Sun, 04 Dec 2011 07:34:32 +0000 [04/12/2011 09:34:32 EET]
Α
Απ
πόό:: Noha Sobhy <[email protected]>
Π
Πρροοςς:: [email protected]
Κ
Κοοιιννοοπ
ποοίίηησ
σηη:: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Θ
Θέέμμα
α:: 504135: Your manuscript has been accepted
Dear Dr. Kormas,
The review of the Research Article 504135 titled "Plankton microorganisms coinciding with two
consecutive mass fish kills in a newly reconstructed lake," by Andreas Oikonomou, Matina Katsiapi, Hera
Karayanni, Maria Mousta-Gouni and Konstantinos Ar. Kormas submitted to TheScientificWorldJOURNAL,
has been completed, and I am pleased to inform you that your manuscript has now been accepted for
publication in the journal.
Please login to the manuscript tracking system at http://mts.tswj.com/ in order to read the submitted
review reports including any written commentary detailing changes that you may want to make in order
to improve your manuscript before final publication. The production process of your manuscript will start
upon the receipt of the electronic files. To upload the electronic files of your final accepted version to the
MTS, please access "Articles in Press" in your account and upload the following within the next 2-3 days:
1- Source file (Word or TeX/LaTeX).
2- Final PDF file of the accepted manuscript.
3- Editable Figure files (each figure in a separate eps/postscript/word file) if any, taking into
consideration that tiff, jpg, jpeg, bmp formats are not editable.
Thank you again for submitting your manuscript to TheScientificWorldJOURNAL.
Best regards,
Noha Sobhy
Journal Publishing Editor
TheScientificWorldJOURNAL
http://www.tswj.com/
1 of 1
12/5/11 2:11 PM
1
Plankton microorganisms coinciding with two consecutive mass fish kills in a 2
newly reconstructed lake 3
4
Andreas Oikonomou1, Matina Katsiapi2, Hera Karayanni3, Maria Moustaka-­‐Gouni2, 5
Konstantinos Ar. Kormas1* 6
7
1 Department of Ichthyology and Aquatic Environment, School of Agricultural Sciences, 8
University of Thessaly, 384 46 Volos, Greece 9
10
2 Department of Botany, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, 541 24 11
Thessaloniki, Greece 12
13
3 Department of Biological Applications and Technology, University of Ioannina, 451 10 14
Ioannina, Greece 15
16
E-­‐mail: [email protected], [email protected], [email protected], 17
[email protected], [email protected] 18
19
*Corresponding author 20
21
Running head: Plankton related to lake fish kill 22
23
Keywords: Cyanobacteria, unicellular eukaryotes, fish kill, reconstructed lake -1-
24
ABSTRACT 25
26
Lake Karla, Greece, was dried up in 1962 and its refilling started in 2009. We 27
examined the Cyanobacteria and unicellular eukaryotes found during two fish kill 28
incidents, in March and April 2010, in order to detect possible causative agents. Both 29
microscopic and molecular (16S/18S rRNA gene diversity) identification was applied. 30
Potentially toxic Cyanobacteria included representatives of the Planktothrix and 31
Anabaena groups. Known toxic eukaryotes or parasites related to fish kill events were 32
Prymnesium parvum and Pfiesteria cf. piscicida, the latter being reported in an inland 33
lake for the second time. Other potentially harmful microorganisms, for fish and other 34
aquatic life, included representatives of Fungi, Mesomycetazoa, Alveolata and 35
Stramenopiles. In addition, Euglenophyta, Chlorophyta and diatoms were represented 36
by species indicative of hypertrophic conditions. The pioneers of L. Karla’s plankton 37
during the first months of its water refilling process included species that could cause 38
the two observed fish kill events. 39
-2-
40
INTRODUCTION 41
42
Plankton cyanobacteria and unicellular eukaryotes belonging to different 43
functional groups constitute key components of aquatic ecosystems [1]. Among the 44
unicellular plankton there are species that negatively influence the ecosystem 45
(ecosystem disruptive algal blooms, production of toxins, parasitic modes of life) [2,3]. 46
Several of these microorganisms lack distinct morphological features. Even if 47
taxonomically useful morphological features are present they may get lost throughout 48
sampling, preservation and examination procedures [4] making identification by 49
traditional microscopic methods difficult. Molecular techniques have spawned new ways 50
to access the diversity of the microbial world. Yet, molecular techniques have limitations 51
[5]. Therefore, a combination of molecular techniques and microscopy methods is 52
required in order to uncover the diversity of the microbial world [6]. 53
Mass fish kills are known to occur in eutrophic lakes. They have been attributed 54
mostly to hypoxic/anoxic conditions or uncommonly high/low temperatures. Other 55
factors, related or not to the eutrophication, include floods, droughts, cyclonic storms, 56
habitat loss, low water flow and abrupt water level fluctuations [7]. Due to the changes 57
of the grazing pressure, fish kills might lead to considerable changes in the food web 58
structure of the lake ecosystem, with diminishing consequences for the possibilities of 59
using the lake for recreation, fishing, or as a source of drinking water. Although such 60
mass mortality events are well documented in the literature, to the best of our 61
knowledge, there is no such data on newly reconstructed lakes. 62
In freshwaters, the haptophyte Prymnesium parvum is considered one of the most 63
dangerous microorganism and is responsible for adverse effects on aquatic organisms 64
[8] and in particular for several fish kill incidents [9]. It poses serious threat to several -3-
65
ecosystems since it survives in a wide range of salinities and blooms in coastal and 66
brackish inland waters worldwide [10,11]. In Lake Koronia, Greece, P. parvum coincided 67
with a mass death of birds and fish [12,2]. The dinoflagellate Pfiesteria species can harm 68
fish in coastal waters [14,15] and has caused fish kills under certain circumstance in 69
North Carolina, USA [14]. No Pfiesteria-­‐induced fish kills have ever been reported in 70
Mediterranean coastal waters while the only, and most unusual, inland ecosystem where 71
Pfiesteria has been reported is Ace Lake, Antarctica [16]. While acute fish kills due to toxic algae are well studied, another less obvious 72
73
impact of toxic/parasitic unicellular eukaryotes is that exposure of aquatic animals to 74
their toxins or parasitism might induce serious sublethal effects, including predisposing 75
these populations to various infectious diseases resulting in, e.g., reduction of growth 76
and reproduction [17,8]. This situation might be even more severe if one considers that 77
we know only a few of the toxic/parasitic eukaryotes that can cause fish kills while on 78
the other hand our concept on the existing species diversity of the microscopic 79
eukaryotes is still expanding [18]. This lead us to investigate the plankton cyanobacteria 80
and microeukaryotes of a newly reconstructed lake (Lake Karla, central Greece) during 81
two consecutive fish kill events which occurred in less than six weeks. The aims of this 82
study were to supplement the limited knowledge on the plankton cyanobacterial and 83
microeukaryotic diversity of newly reconstructed lakes and to identify potentially toxin-­‐
84
producing and parasitic taxa which coincided with the fish kill events and might have 85
deleterious effects on the ecosystem. 86
87
MATERIALS AND METHODS 88
-4-
89
Study area. Lake Karla (Figure 1) is located in central Greece (39029΄02΄΄Ν, 90
22051΄41΄΄Ε). It formerly covered an area of ca. 180 Km2 but in the beginning of 1960s it 91
was drained through a tunnel leading the lake’s drainage to the nearby Pagasitikos Gulf. 92
A small permanent marsh remained at the area that once covered the lake. The structure 93
and function of L. Karla was correlated with River Pinios, as the flooding events of the 94
river supplied the lake with water rich in nutrients [19]. Several biological and physical-­‐
95
chemical criteria characterized the lake as a eutrophic but with high stability before its 96
drainage [20]. It was not until the 1990s that the refilling of the lake was decided by 97
inflowing water from the nearby River Pinios. Its actual filling started in September 98
2009, after building a peripheral dam which covers 38 Km2. We sampled in L. Karla in 99
March and April 2010, during two fish kill events. As reported in local newspapers, the 100
101
dead fish floated in the lake and lined along the shores of a 3.5 to 5 km stretch. Water samples for microscopic analysis were collected on 17 March and 20 April 102
2010 at ca. 0.5 m depth from the water level pier at the south-­‐east end of the lake 103
(Figure 1). Three replicates of 500 ml each was collected in polyethylene bottles. Two of 104
them were fixed with Lugol’s solution and formaeldehyde while one was retained fresh 105
for direct microscopic analysis. Water temperature, dissolved oxygen, salinity and pH 106
were measured in situ using a WTW sensor. 107
For each sampling date, at least three replicates of live and preserved samples 108
were examined in sedimentation chambers using an inverted microscope with phase 109
contrast (Nikon SE 2000). Cyanobacteria and microscopic eukaryotes were identified 110
using classical taxonomic keys and previous works [21-­‐24]. Phytoplankton counts (cells, 111
colonies and coenobia) were performed using the Utermöhl’s sedimentation method 112
[25]. For biomass (mg l-­‐1) estimation, the dimensions of 30 individuals (cells, filaments 113
or colonies) of each species were measured using tools of a digital microscope camera -5-
114
(Nikon DS-­‐L1) while mean cell or filament volume estimates were calculated using 115
appropriate geometric formulae, as described previously [13,26]. Species and 116
taxonomical groups comprising more than 10% (w/w) of the total phytoplankton 117
biomass were considered to be dominant. 118
Water samples for DNA extraction were transported to the laboratory in 4-­‐L 119
collapsible plastic bottles (Nalgene, USA) and processed within 1 hour of collection. 120
After screening through a 180 μm mesh net to exclude larger eukaryotes and particles, 121
200-­‐250 ml of water was filtered through a 0.2 μm pore size polycarbonate isopore filter 122
(Sartorius, Germany). The filtration was conducted under low vacuum (≤100 mm Hg) to 123
prevent cell damage. Filters were stored immediately at -­‐800C until further analysis. 124
DNA was extracted using the UltraClean Soil DNA isolation kit (MoBio 125
Laboratories, USA) according to the manufacturer’s protocol after slicing the filter with a 126
sterile scalpel. The concentration of bulk DNA was estimated by spectrophotometry 127
(NanoDrop ND-­‐1000, NanoDrop Technologies, USA) and ranged between 11.9 and 15.4 128
ng μl-­‐1 for the March and April samples, respectively. For PCR amplification, 129
approximately 12 ng of environmental DNA were used as template for both samples. 130
The 18S rRNA gene was amplified using the eukaryote specific primers EukA (5’-­‐
131
AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-­‐3’) and EukB (5’-­‐GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-­‐3’) [27] 132
for the March sample while the primers EukA and Euk1633rE (5’-­‐
133
GGGCGGTGTGTACAARGRG-­‐3’) [28] were used for amplification of the 18S rRNA gene for 134
April sample. 135
PCR for the amplification of the March sample included an initial denaturation 136
step at 950C for 15 min, which was followed by 40 cycles consisting of denaturation at 137
950C for 45 s, annealing at 550C for 1 min and elongation at 720C for 2 min and 30 s; a 138
final 7-­‐min elongation step at 720C was included. The PCR protocol for the April sample -6-
139
included an initial denaturation step at 950C for 2 min followed by 40 cycles of 140
denaturating at 950C for 40 s, annealing at 500C for 40 sec and elongation at 720C for 2 141
min and 15 s, with an additional step of final elongation at 720C for 1 min. Each PCR 142
from the two samples was repeated with different cycle numbers (between 20 and 37). 143
The lowest number of cycles that gave a positive signal, i.e. 26 and 28 cycles for the 144
March and April sample, respectively, was further used in order to eliminate some of the 145
major PCR innate limitations [29,30] and to avoid differential representation of 18S 146
rRNA genes with low and high copy numbers. 147
For PCR amplification of the cyanobacterial 16S rDNAs, we used the 148
Cyanobacteria-­‐specific primers CYA106f (5’-­‐CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA-­‐3’), 149
CYA781r(a) (5’-­‐GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-­‐3’) and CYA781r(b) (5’-­‐
150
GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT-­‐3’) [31]. PCR included an initial denaturation step at 151
940C for 5 min, which was followed by 40 cycles consisting of denaturation at 940C for 152
30 s, annealing at 570C for 30 s and elongation at 720C for 3; a final 5-­‐min elongation 153
step at 720C was included. Cycle optimization was performed as above which resulted in 154
26 cycles for the March sample. In April 2010, no sample was analysed for 16S rRNA 155
gene diversity since the vast majority of the observed morphospecies was identified. 156
The PCR products from both the Eukarya-­‐ and Cyanobacteria-­‐specific 157
amplifications were visualized on a 1% agaroze gel under UV light, purified using the 158
Montage purification kit (Millipore Inc, USA). The purified PCR products were ligated 159
into the PCR XL TOPO Vector (Invitrogen Co., USA) and transformed in electrocompetent 160
Escherichia coli cells according to the manufacturer’s specifications. For each clone 161
library a maximum of 151 clones were sequenced, each containing an insert of ca. 1800 162
or 680 bp for the Eukarya and Cyanobacteria, respectively. These clones were grown in 163
liquid Luria-­‐Bertani medium with kanamycin and their plasmids were purified using the -7-
164
Nucleospin Plasmid QuickPure kit (Macherey–Nagel GmbH and Co. KG, Germany) for 165
DNA sequencing. Sequence data were obtained by capillary electrophoresis (Macrogen 166
Inc., Seoul, Korea) using the BigDye Terminator kit (Applied Biosystems Inc., USA) with 167
the set of primers M13F (5’-­‐GTAAAACGACGGCCAG-­‐3’) and M13R (5’-­‐
168
CAGGAAACAGCTATGAC-­‐3’). For the eukaryotic clones, intermediate sequencing was 169
performed using the primer 1179rE (5’-­‐ CCCGTGTTGAGTCAAATT-­‐3’) [32]. Each 170
sequence read was approximately 850 bp. For each individual clone, forward, reverse 171
and intermediate -­‐for the Eukarya-­‐ reads were assembled, and then the assembled 172
sequences were checked for chimeras. The Pintail program 173
(http://www.bioinformatics-­‐toolkit.org/Web-­‐Pintail/, [33]), was used for the detection 174
of putative chimeric sequences. Chimeras were discarded from the dataset. Using the 175
multiple alignment program CLUSTALW2 176
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) and based on 98% gene similarity 177
as a phylotype cutoff [18,34], clones were grouped together and considered members of 178
the same phylotype. All sequences were compared with the BLAST function 179
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) for the detection of closest relatives. Sequence 180
data were compiled using the MEGA4 software [35] and aligned with sequences 181
obtained from the GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) database, using the ClustalX 182
aligning utility. Phylogenetic analyses were performed using the MEGA version 4 183
software [35] and the topology of the tree was based on neighbour-­‐joining according to 184
Jukes-­‐Cantor. Bootstrapping under parsimony criteria was performed with 1,000 185
replicates. Sequences of unique phylotypes found in this study have GenBank accession 186
numbers JN090861 -­‐ JN090912 and JN090913 -­‐ JN090923 for the eukaryotes and 187
Cyanobacteria, respectively. -8-
Library clone coverage was calculated by the formula of the Good’s C estimator [1 188
189
-­‐ (ni / N)] [36], where ni is the number of phylotypes represented by only one clone and 190
N is the total number of clones examined in each library. The number of predicted 191
phylotypes for each clone library was estimated after the abundance-­‐based richness 192
formula SChao1 [37,38]. 193
194
RESULTS AND DISCUSSION 195
196
We investigated the composition of plankton Cyanobacteria and unicellular 197
eukaryotes by combing molecular, 18S/16S rRNA gene diversity, and microscopic 198
analysis in Lake Karla during two fish kill events which happened within the first year of 199
the lake’s partial reconstruction. The prevailing abiotic factors (Table 1) indicated that 200
dissolved oxygen (5.6 – 5.8 mg l-­‐1) was not limited while the elevated salinity (7.6 – 8.1 201
psu) possibly due to the drying out of the previous lake and the following intense 202
agricultural and livestock use four decades. Irrigation in the absence of leaching can 203
increase soil salinity [39] and continued application of livestock manure to agricultural 204
land may result in an accumulation of salt in soil [40]. 205
The two eukaryotic clone libraries revealed that 45 phylotypes occurred in March 206
and only seven in April 2010. However, in both cases, rarefaction curves (Figure 2) 207
reached saturation levels for both clone libraries according to the Good’s C estimator, 208
indicating that the majority of the existing phylotypes was revealed. Based on the 18S 209
rRNA gene diversity (Figures 3, 4), members of the Chlorophyta, Cercozoa, 210
Stramenopiles, Alveolata, Fungi, Euglenophyta, Choanoflagellata, Haptophyta, 211
Mesomycetazoa, Katablepharidophyta and Cryptophyta (Figures 2, 3) were found. -9-
212
Chlorophyta was the most phylotype-­‐rich group in both samplings, while the next most 213
abundant phylotypes belonged to the Cercozoa, Alveolata and Stramenopiles. 214
The Cyanobacteria 16S rRNA gene clone library coverage was satisfactory 215
(Figure 2) and showed (Figure 5) that Cyanobacteria were represented by phylotypes 216
related to the Planktothrix-­‐group, the Chroococcales and several algal plastids. Along 217
with these phylotypes, three Verrucomicrobia-­‐like phylotypes were also retrieved, 218
reinforcing the notion that some Verrucomicrobia are associated with Cyanobacteria-­‐
219
dominated waters [41,42]. 220
Microscopic analysis (Figure 6) of phytoplankton gave a slightly different picture 221
of the phytoplankton dominance. In March 2010, the diatom Cyclotella sp. dominated 222
followed by Prymnesium parvum (Haptophyta), Planktothrix cf. agardhii 223
(Cyanobacteria), Euglena sp. (Euglenophyta) and Anabaena sp. (Cyanobacteria) and 224
from Alveolata Pfiesteria cf. piscicida (the latter consisted 0.4% of the high 46.5 mgL-­‐1 225
total biomass and for this it is not included in Fig. 6). Most of these microorganisms were 226
also found in April 2010 but in lower biomass. Nevertheless, the phylotypes of these 227
organisms have been found in the respective clone libraries in both dates. 228
The slight discrepancy between the two approaches is expected [e.g. 43] as PCR-­‐
229
based phylotype abundance is not quantitative but rather shows relative differences and 230
can also be biased towards some groups. On the other hand, microscopic identification 231
of unicellular phytoplankton can be problematic for some organisms, especially for 232
these with complex/uncertain life cycles [e.g. 3,13]. Thus, both approaches provide 233
complementary rather redundant information. The gains of using both methods have 234
already been depicted in limnological analysis [e.g. 42] and especially for the unicellular 235
eukaryotes [6,4,43]. - 10 -
236
The occurrence of diverse Chlorophyta phylotypes in both samplings (Figures 3, 237
4), most of which were affiliated with well-­‐characterized species, is related to the 238
hypertrophic conditions prevailing in L. Karla. Chlorophyta are indicative of ecosystems 239
receiving high nutrient loadings [1]. They have been found to dominate the clone library 240
of a hypertrophic, polluted and heavily modified lake in Greece [3]. Some of these 241
phylotypes, e.g. Scenedesmus species, may constitute an important fraction of the 242
freshwater total phytoplankton biomass, particularly in nutrient-­‐rich ecosystems [44]. 243
Scenedesmus species have capabilities of successful air dispersal and colonization of new 244
aquatic habitats [45]. The hypertrophic conditions of the newly reconstructed L. Karla 245
render its future rather erratic, since the prediction of community and ecosystem 246
dynamics is decreased in eutrophic systems [46]. 247
Apart from the Chlorophyta, other microorganisms found in this study are 248
associated with eutrophic/hypertrophic conditions. The found Euglenophyta-­‐related 249
phylotypes (Figure 3c) were affiliated with the genera Colacium, Euglena and 250
Strombomonas. Members of the Euglenophyta are known to be abundant in highly 251
eutrophic environments and on sediments polluted with organic matter [47]. 252
Euglenophyta are considered biological indicators of organic pollution in seawater [48]. 253
Cryptophyta (Figure 3a) are also a group forming blooms in eutrophic environments, yet 254
their abundance are low due to high grazing rates of their protozoan predators [49]. 255
Katablepharidophyta (Figure 3a) which were formerly classified as a subgroup of 256
Cryptophyta, are now considered to be a sister group of Cryptophyta [50] and could 257
have similar environmental preferences. Choanoflagellata (Figure 3a) are epiphytic 258
microorganisms depending on the quality of available organic matter, and many 259
members of this group are adapted to using dissolved organic matter and colloidal 260
organic particles [51]. - 11 -
261
The Cercozoa-­‐related phylotypes (Figure 3c) were related to uncultivated 262
environmental clones. Some well-­‐characterized species such as Ebria tripartita, 263
Cercomonas plasmodialis, and species of the genus Protaspis were affiliated with our 264
retrieved sequences and fell in the Cercozoa taxonomic group. These taxa were also 265
identified microscopically. Phylotypes KRL01E17 and KRL01E4 formed a novel clade in 266
the Cercozoa, highly supported by the bootstrap test. Cercozoa phylotypes have been 267
recovered from many different environments [52] but most of them are defined by 268
molecular data and display huge morphological and ecological diversity [53]. They are 269
mainly heterotrophs, including bacterivorous and predaceous species that phagocytize 270
the cytoplasm of diatoms in marine ecosystems [54]. Cyst formation is a widespread 271
characteristic among the Cercozoa [55], which probably allows their presence in anoxic 272
sediments [56]. Members of the genus Protaspis, which was also recognized 273
microscopically, comprise common predators in benthic marine ecosystems [55]. 274
It is difficult to infer the trophic role of an organism by its phylogenetic position, 275
however the fact that most of the pre-­‐mentioned species/taxonomic groups have been 276
detected with light microscopy of fixed and fresh samples in high numbers enforces the 277
notion that these microorganisms are metabolically active in L. Karla. Based on the basic 278
principle of ecology that the function of an ecosystem is defined by its dominant taxa, it 279
is reasonable to characterize L. Karla on the basis of its plankton as a hypertrophic 280
system. Such systems tend to host various parasites, as well as known toxin producers. 281
Increased nutrient loadings are known to be associated with outbreaks of microparasitic 282
species and blooms of harmful microalgae can also be indirectly promoted by nutrients 283
inputs [57]. In the current study, such harmful eukaryotes belonging to the Alveolata, 284
Fungi, Mesomycetazoa and Haptophyta (Figures 3, 4) along with some toxin-­‐producing 285
Cyanobacteria (Figure 5), have been identified by both molecular and microscopic - 12 -
286
analysis representing a very interesting but not previously described taxonomic and 287
functional association [58]. 288
Strict parasites are grouped in the Alveolata (Figures 3c, 4), as suggested by [59]. 289
Colpodella edax can parasitize on Chlorophyta or Cryptophyta and can predate on 290
protozoans smaller in size sucking out their cell contents by means of a rostrum [60]. 291
[59] associated this trophic strategy (myzocytosis) with parasitism. The Fungi (Figures 292
3a, 4) are exclusively composed of saprotrophs, known parasites of the phytoplankton 293
community. Members of the Chytridiomycota can regulate the population of diatoms 294
[61,59]. Infection of certain phytoplankton species may suppress its development, thus 295
Fungi parasitisism can be an important factor controlling seasonal succession [61]. 296
The taxonomic group of Mesomycetazoa (Figure 3a) includes facultative or 297
obligate parasites [62]. Two orders have been described in Mesomycetazoa whereof 298
Dermocystida consists exclusively of pathogenic microorganisms infecting fish 299
(Dermocystidium sp.) as well as mammals and birds [62]. Members of this group have 300
been found in another degraded lake ecosystem [3]. 301
Known toxin producers such as Prymnesium parvum (Haptophyta) and Pfiesteria 302
cf. piscicida (Alveolata) were also observed both in the clone libraries and by 303
microscopic observations (Figures 3b, 6). To the best of our knowledge, it is the first 304
time that these species occur simultaneously in the same ecosystem. P. parvum may 305
form extensive blooms with major biogeochemical and ecological impact in brackish or 306
inland waters [63,9]. Massive kills of fish and birds have been attributed to blooms of 307
Prymnesium [64,13,9]. Pfiesteria piscicida and P. vonstochii are parasites with similar 308
feeding strategy and life cycle [65]. Temperature and salinity were suitable for the 309
presence of Pfiesteria cf. piscicida in the lake as the species is detected in salinity ranging 310
from 0.1-­‐17.8 psu and temperature ranging from 3.2 – 25.5οC [66]. Toxin production of - 13 -
311
the Pfiesteria species increases in high nutrient loadings [14,67,68]. The genus 312
Peridinium belonging to Stramenopiles (Figures 3b, 4) also includes species apparently 313
related with toxin production [69]. Finally, the harmful organisms community of L. Karla 314
hosts well known toxin-­‐producing cyanobacteria [70] like Planktothrix cf. agardhii, 315
Anabaena sp. and Anabaenopsis elenkinii (Figures 5, 6). 316
During our samplings, salinity of L. Karla was elevated, generating the hypothesis 317
that in L. Karla the occurrence of brackish or marine protists is feasible. Indeed, in both 318
samplings we found phylotypes that were closely related to marine Stramenopiles 319
[71,72]. Cyclotella meneghiniana present in the clone library of March, which was found 320
by microscopy dominant in March 2010 and was identified as Cyclotella sp., is a common 321
diatom species but tends to become abundant in organic, inorganic, heavy metal or toxin 322
polluted environments [73]. C. meneghiniana has been recorded as being predominant 323
or in remarkable occurrences in five polluted rivers and in four hypertrophic lakes [73]. 324
Thalassiosira genus constitutes primarily of marine species (about 180 described 325
species), while at least 12 species have been observed in freshwater ecosystems [74,75]. 326
The genus Skeletonema significantly contributes to phytoplankton blooms in many 327
regions [e.g. 76,77,78]. In particular, Skeletonema costatum is referred as a species that 328
flourishes in nutrient-­‐rich coastal waters throughout the world [79]. 329
The presence of marine species within the Stramenopiles (Figures 3b) poses the 330
issue of the origin of these species in our study site. Karla is a newly reconstructed lake 331
which is still under constant changes and new microscopic eukaryotes colonize that 332
ecosystem. Cyst formation is known for most of the groups observed like Cercozoa [54], 333
Haptophyta [80] and Alveolata [81], so some microorganisms could have remained in 334
the marsh and in the soil that formerly was the lakebed. The origin of the dominant 335
freshwater microscopic eukaryotes (C. meneghiniana, Scenedesmus species) can be - 14 -
336
attributed to the inflow of River Pinios (the species were observed in the River’s 337
plankton, Moustaka-­‐Gouni et al unpublished data). Air dispersal is another possible 338
vector for microorganisms. Chlorophyta have found to be dominant in aerobiological 339
studies [82] and are successful colonists in new aquatic habitats [83,45]. In conclusion our study showed that during two consecutive fish kill incidents 340
341
which occurred in the recently reconstructed Lake Karla, Greece, in six weeks interval, 342
the lake’s water represented a cocktail of potentially toxic, Planktothrix cf. agardhii, 343
Prymnesium parvum and Pfiesteria cf. piscicida and parasitic species including 344
Dermocystidium sp. Since the water temperature was far from freezing point and the 345
dissolved oxygen concentration was not even close to hypoxia, it is possible that the fish 346
kills were caused by some of the microorganisms we observed. Apart from this risk, 347
another problem for the ecosystem during the filling process of Lake Karla, is the 348
occurrence of other plankton, both freshwater and marine species, which are typical of 349
eutrophic -­‐ hypertrophic conditions. 350
351
ACKNOWLEDGEMENTS 352
353
354
Lake Karla map. Part of this work was supported by the John S. Latsis Public Benefit 355
Foundation. 356
357
358
359
360
361
362
363
364
REFERENCES 1.
Lepere, C., Domaizon, L. and Debroas, D. (2007) Community composition of lacustrine small eukaryotes in hypereutrophic conditions in relation to top-­‐
down and bottom-­‐up factors. FEMS Microbiol. Ecol. 61, 483-­‐495. 2.
Michaloudi, E., Moustaka-­‐Gouni, M., Gkelis, S. and Pantelidakis, K. (2009) Plankton community structure during an ecosystem disruptive algal bloom of Prymnesium parvum. J. Plankton Res. 31, 301-­‐309. Pantelis Sidiropoulos is acknowledged for providing an earlier version of the - 15 -
365
366
367
368
369
370
371
372
373
374
375
376
377
378
379
380
381
382
383
384
385
386
387
388
389
390
391
392
393
394
395
396
397
398
399
400
401
402
403
404
405
406
407
408
409
410
411
412
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Genitsaris, S., Kormas, K. andMoustaka-­‐Gouni, M. (2009) Microscopic eukaryotes living in a dying lake (Lake Koronia, Greece). FEMS Microbiol. Ecol. 69, 75-­‐83. Caron, D.A., Countway, P.D. and Brown, M.V. (2004) The growing contributions of molecular biology and immunology to protistan ecology: Molecular signatures as ecological tools. J. Eukar. Microbiol. 51, 38-­‐48. Zhu, F., Massana, R., Not, F., Marie, D. and Vaulot, D. (2005) Mapping of picoeucaryotes in marine ecosystems with quantitative PCR of the 18S rRNA gene. FEMS Microbiol. Ecol. 52, 79-­‐92. Stoeck, T., Fowle, W.H. and Epstein, S.S. (2003) Methodology of protistan discovery: From rRNA detection to quality scanning electron microscope images. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6856-­‐6863. Brönmark, C, and Hansson, L.-­‐A. (2005) The biology of lakes and ponds. Second edition. Oxford University Press, Oxford. Brooks, B.W., James, S.V., Valenti, J.T.W., Urena-­‐Boeck, F., Serrano, C., Berninger, J.P., Schwierzke, L., Mydlarz, L.D., Grove, J.P. and Roelke, D.L. (2011) Comparative toxicity of Prymnesium parvum in inland waters. J. Am. Water Res. Assoc. 46, 45-­‐62. Roelke, D.L., Grover, J.P., Brooks, B.W., Glass, J., Buzan, D., Southard, G.M., Fries, L., Gable, G.M., Schwierzke-­‐Wade, L., Byrd, M. and Nelson, J. (2011) A decade of fish-­‐killing Prymnesium parvum blooms in Texas: roles of inflow and salinity. J. Plankton Res. 33, 243-­‐253. Edvardsen, B and Paasche, E. (1998) Bloom dynamics and physiology of Prymnesium and Chrysochromulina. In Physiological ecology of harmful algae blooms. Anderson, D.M., Cembella, A.D., Hallegraeff. G.M. Eds. Springer-­‐Verlag, Berlin pp 193-­‐208. Baker, J.W., Grover, J.P., Brooks, B.W., Ureña-­‐Boeck, F., Roelke, D.L., Errera, R. and Kiesling, R.L. (2007) Growth and toxicity of Prymnesium parvum (Haptophyta) as a function of salinity, light, and temperature. J. Phycol. 43, 219-­‐227. Moustaka-­‐Gouni, M., Cook, C.M., Gkelis, S., Michaloudi, E., Pantelidakis, K., Pyrovetsi, M. and Lanaras, T. (2004) The coincidence of a Prymnesium parvum bloom and the mass kill of birds and fish in Lake Koronia. Harm. Algal News 26, 1-­‐2. Moustaka-­‐Gouni, M., Kormas, K.A., Vardaka, E., Katsiapi, M. and Gkelis S (2009) Raphidiopsis mediterranea Skuja represents non-­‐heterocytous life-­‐cycle stages of Cylindrospermopsis raciborskii (Woloszynska) Seenayya et Subba Raju in Lake Kastoria (Greece), its type locality: Evidence by morphological and phylogenetic analysis. Harmful Algae 8, 864-­‐872. Burkholder, J.M., Glasgow, Jr. H.B. and Hobbs, C.W. (1995) Fish kills linked to a toxic ambush-­‐predator dinoflagellate: distribution and environmental conditions. Mar. Ecol. Prog. Ser. 124, 43-­‐61. Jakobsen, K.S., Tengs, T., Vatne, A., Bowers, H.A., Oldach, D.W., Burkholder, J.M., Glasgow, Jr. H.B., Rublee, P.A. and Klaveness, D. (2002) Discovery of the toxic dinoflagellate Pfiesteria in northern European waters. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 269, 211-­‐214. Park, T.-­‐G., Bell, E.M., Pearce, I., Rublee, P.A., Bolch, C.J.S. and Hallegraeff, G.M. (2007) Detection of a novel ecotype of Pfiesteria piscicida (Dinophyceae) in an Antarctic saline lake by real-­‐time PCR. Polar Biol. 30, 843-­‐88. Noga, E.J. (1998) Toxic algae, fish kills and fish disease. Fish Pathol. 33, 337-­‐342. - 16 -
413
414
415
416
417
418
419
420
421
422
423
424
425
426
427
428
429
430
431
432
433
434
435
436
437
438
439
440
441
442
443
444
445
446
447
448
449
450
451
452
453
454
455
456
457
458
459
460
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
Caron, D.A., Countway, P.D., Savai, P., Gast, R.J., Schnetzer, A., Moorthi, S.D., Dennett, M.R., Moran, D.M. and Jones, A.C. (2009) Defining DNA based operational taxonomic units for microbial-­‐eukaryote ecology. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5797-­‐5808. Chatzinikolaou, Y., Ioannou, A. and Lazaridoum M, (2010) Intra-­‐basin spatial approach on pollution load estimation in a large Mediterranean river. Desalination 250, 118-­‐129. Ananiadis, C.I. (1956) Limnological study of Lake Karla. Bull. Inst. Océanogr. 1083, 1-­‐19. Carter, N. (1937) New or interesting algae from brackish water. Arch. Protist. 90, 1-­‐
68. Green, J.C., Hibberd, D.J. and Pienaar, R.N. (1982) The taxonomy of Prymnesium (Prymnesiophyceae) including a description of a new cosmpolitan species P. patellifera sp. nov. and further observations on P. parvum N. Carter. British Phycol. J. 17, 363-­‐382. Steidinger, K., Landsberg, J., Richardson, R., Truby, E., Blakesley, B., Scott, P., Tester, P., Tengs, T., Mason, P., Morton, S., Seaborn, D., Litaker, W., Reece, K. and Oldach, D. (2001) Classification and identification of Pfiesteria and Pfiesteria-­‐
like species. Environ. Health Persp. 109, 661-­‐665. Litaker, R.W., Vandersea, M.W., Kibler, S.R., Madden, V.J., Noga, E.J. and Tester, P.A. (2002) Life cycle of the heterotrophic dinoflagellate Pfiesteria piscicida (Dinophyceae). J. Phycol. 38, 442-­‐463. Utermöhl, H. (1958) Zur Vervollkommung der quantitativen Phytoplankton-­‐
Methodik. Ver. Int. Verein. Theor. Angew. Limnol. 9, 1–38. Katsiapi, M., Moustaka-­‐Gouni, M., Michaloudi, E. and Kormas, K.A. (2011) Effects of flushing on phytoplankton and water quality in a Mediterranean drinking-­‐
water reservoir (Marathonas Reservoir, Greece). Environ. Monit. Assess. 181, 563-­‐575. Medlin, L., Elwood, H.J., Stickel, S. and Sogin, M.L. (1988) The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-­‐like rRNA coding regions. Gene 71, 491-­‐499. Dawson, S.C. and Pace, N.R. (2002) Novel kingdom-­‐level eukaryotic diversity in anoxic environments. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8324-­‐8239. von Wintzingerode, F., Göbel, U.B. and Stackenbrandt, E. (1997) Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-­‐based rRNA analysis. FEMS Microbiol. Rev. 21, 213-­‐229. Spiegelman, D., Whissell, G. and Greer, C.W. (2005) A survey of the methods for the characterization of microbial consortia and communities. Can. J. Microbiol. 51, 355–386. Nübel, U., Garcia-­‐Pichel, F. and Muyzer, G. (1997) PCR primers to amplify 16S rRNA genes from Cyanobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 63, 3327-­‐3332. Brown, P.B. and Wolfe ,G.V. (2006) Protist genetic diversity in the acidic hydrothermal environments of Lassen Volcanic National Park, USA. J. Eukar. Microbiol. 53, 420-­‐431. Ashelford, K.E., Chuzhanova, N.A., Fry, J.C., Jones, A.J. and Weightman, A.J. (2005) At least 1 in 20 16S rRNA sequence records currently held in public repositories is estimated to contain substantial anomalies. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7724-­‐7736. - 17 -
461
462
463
464
465
466
467
468
469
470
471
472
473
474
475
476
477
478
479
480
481
482
483
484
485
486
487
488
489
490
491
492
493
494
495
496
497
498
499
500
501
502
503
504
505
506
507
508
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
Nebel, M., Pfabel, C., Stock, A., Dunthorn, M. and Stoeck, T. (2011) Delimiting operational taxonomic units for assessing ciliate environmental diversity using small-­‐subunit rRNA gene sequences. Environ. Microbiol. Rep. 3, 154-­‐158. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596-­‐1599. Good. I.J. (1953) The population frequencies of species and the estimation of population parameters. Biometrika 237-­‐264. Chao, A. (1984) Non-­‐parametric estimation of the number of classes in a population. Scand. J. Stat. 11, 265-­‐270. Chao, A. (1987) Estimating the population size for capture-­‐recapture data with unequal catchability. Biometrics 43, 783-­‐791. ILRI (1989) Effectiveness and social/environmental impacts of irrigation projects: a review. In Annual Report 1988 of the International Institute for Land Reclamation and Improvement (ILRI). Wageningen, The Netherlands, pp 18-­‐34 Hao X, Chang C (2003) Does long-­‐term heavy cattle manure application increase salinity of a clay loam soil in semi-­‐arid southern Alberta? Agr Ecosyst Environ 94:89-­‐103. Kormas, K.A., Vardaka, E., Moustaka-­‐Gouni, M., Kontoyanni, V., Petridou, E., Gkelis, S. and Neofitou, C. (2010) Molecular detection of potentially toxic Cyanobacteria and their associated Bacteria in lake water column and sediment. World J. Microbiol. Biotech. 26, 1473-­‐1482. Kormas, K.A., Gkelis, S., Vardaka, E. and Moustaka-­‐Gouni, M. (2011) Morphologic and molecular analysis of bloom-­‐forming Cyanobacteria in two eutrophic, shallow Mediterranean lakes. Limnologica 41, 167-­‐173. Luo, W., Bock, C., Li, H., Padisák, J. and Krienitz, L. (2011) Molecular and microscopic diversity of planktonic eukaryotes in the oligotrophic Lake Stechlin (Germany). Hydrobiologia 661, 133-­‐143. An, S., Friedl ,T. and Hegewald, E. (1999) Phylogenetic relationships of Scenedesmus and Scenedesmus-­‐like coccoid green algae as inferred from ITS-­‐2 rDNA sequence comparisons. Plant Biol. 1, 418-­‐428. Genitsaris, S., Moustaka-­‐Gouni, M. and Kormas, K.A. (2011a) Airborne microeukaryote colonists in experimental water containers: diversity, succession, life histories and established food webs. Aquat. Microb. Ecol. 62, 139-­‐152. Cottingham, K.L., Rusak, J.A. and Leavitt, P.R. (2000) Increased ecosystem variability and reduced predictability following fertilisation: evidence from palaeolimnology. Ecol. Lett. 3, 340-­‐348. Round FE (1984) The ecology of algae. Cambridge University Pres, Cambridge Stonik, V. and Selina, M.S. (2001) Species composition and seasonal dynamics of density and biomass of Euglenoids in Peter the Great bay, Sea of Japan. Russ. J. Mar. Biol. 27, 174-­‐176. Latasa, M., Scharek, R., Vidal, M., Vila-­‐Reixach, G., Gutierrez-­‐Rodriguez, A., Emelianov, M. and Gasol, J. (2010) Preferences of phytoplankton groups for waters of different trophic status in the northwestern Mediterranean Sea. Mar. Ecol. Prog. Ser. 407, 27-­‐42. Okamoto, N. and Inouye, I. (2005) The Katablepharids are a distant sister group of the Cryptophyta: A proposal for Katablepharidophyta divisio - 18 -
509
510
511
512
513
514
515
516
517
518
519
520
521
522
523
524
525
526
527
528
529
530
531
532
533
534
535
536
537
538
539
540
541
542
543
544
545
546
547
548
549
550
551
552
553
554
555
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
nova/Kathablepharida phylum novum based on SSU rDNA and beta-­‐tubulin phylogeny. Protist 156, 163-­‐179. Sherr, E., Sherr, B. and Fessenden, L. (1997) Heterotrophic protists in the central Arctic Ocean. Deep-­‐Sea Res. II 44, 1665-­‐1682. Romari, K. and Vaulot, D. (2004) Composition and temporal variability of picoeukaryote communities at a coastal site of the English Channel from 18S rDNA sequences. Limnol. Oceanogr. 49, 784-­‐798. Keeling, P.J. (2001) Foraminifera and Cercozoa are related in actin phylogeny: two orphans find a home? Mol. Biol. Evol. 18, 1551-­‐1557. Schnepf, E. and Kuhn, F. (2000) Food uptake and fine structure of Cryothecomonas longipes sp. nov., a marine nanoflagellate incertae sedis feeding phagotrophically on large diatoms. Helgol. Mar. Res. 54, 18-­‐32. Hoppenrath, M. and Leander, B.S. (2006) Dinoflagellate, euglenid or cercomonad? The ultrastructure and molecular phylogenetic position of Protaspis grandis n. sp. J. Euk. Microbiol. 53, 327-­‐342. Piwosz, K. and Pernthaler, J. (2010) Seasonal population dynamics and trophic role of planktonic nanoflagellates in coastal surface waters of the Southern Baltic Sea. Environ. Microbiol. 12, 364-­‐377. Johnson PT, Carpenter ST (2008) Influence of eutrophication on disease in aquatic ecosystems: Patterns, Processes and Predictions. In Infectious disease ecology. The effects of ecosystems on disease and of disease on ecosystems. Ostfeld, R.S., Keesing, F. and Eviner, V.T., Eds. Princeton University Press, Jersey, USA, pp 71-­‐101. Padisák, J., Crossetti, L and Naselli-­‐Flores, L. (2009) Use and misuse in the application of the phytoplankton functional classification: a critical review with updates. Hydrobiologia 621, 1-­‐19. Lefevre, E., Roussel, B., Amblard, C. and Sime-­‐Ngando, T. (2008) The molecular diversity of freshwater picoeukaryotes reveals high occurrence of putative parasitoids in the plankton. PloS ONE 3, 1-­‐10. Brugerolle, G. (2002) Cryptophagus subtilis: a new parasite of cryptophytes affiliated with the perkinsozoa lineage. Eur. J. Protist. 37, 379-­‐390. Ibelings, B., De Bruin, A., Kagami, M., Rijkeboer, M., Brehm, M. and van Donk, E. (2004) Host parasite interactions between freshwater phytoplankton and chytrid Fungi. J. Phycol. 40, 437-­‐453. Mendoza, L., Taylor, J. and Ajello, L. (2002) The class Mesomycetozoea: a heterogeneous group of microorganisms at the animal–fungal boundary. Ann. Rev. Microbiol. 56, 315-­‐344. Rublee, P.A., Remington, D.L., Schaefer, E.F. and Marshall, M.M. (2005) Detection of the dinozoans Pfiesteria piscicida and P. shumwayae: A review of detection methods and geographic distribution. J. Euk. Microbiol. 52, 83-­‐89. Lindholm, T., Ohman, P., Kurki-­‐Helasmo, K., Kincaid, B. and Meriluoto, J. (1999) Toxic algae and fish mortality in a brackish-­‐water lake in Alan SW Finland. Hydrobiologia 397, 109-­‐120. Steidinger, K.A., Burkholder, J.M., Glasgow, H.B., Hobbs, C.W., Garrett, J.K., Truby, E.W., Noga, E.J. and Smith, S.A. (1996) Pfiesteria piscicida gen. et sp. nov. (Pfiesteriaceae fam. nov.), a new toxic dinoflagellate with a complex life cycle and behavior. J. Phycol. 32, 157-­‐164. - 19 -
556
557
558
559
560
561
562
563
564
565
566
567
568
569
570
571
572
573
574
575
576
577
578
579
580
581
582
583
584
585
586
587
588
589
590
591
592
593
594
595
596
597
598
599
600
601
602
603
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
Rhodes, L., Adamson, J., Rublee, P. and Schaefer, E. (2006) Geographic distribution of Pfiesteria spp. (Pfiesteriaceae) in Tasman Bay and Canterbury, New Zealand (2002-­‐03). New Zealand. J. Mar. Freshw. Res. 40, 211-­‐220. Burkholder J, Glasgow H (1997) Pfiesteria piscicida and other Pfiesteria-­‐like dinoflagellates: behavior, impacts, and environmental controls. Limnol. Oceanogr. 42, 1052-­‐1075. Glasgow, H., Burkholder, J., Morton, S. and Springer, J. (2001) A second species of ichthyotoxic Pfiesteria. Phycologia 40, 234-­‐245. Rengefors K, Legrand C (2001) Toxicity in Peridinium aciculiferum -­‐ an adaptive strategy to outcompete other winter phytoplankton? Limnol. Oceanogr. 46, 1990-­‐1997. Huisman, J., Matthus, H.C.P. and Visser, P.M. (2005) Harmful cyanobacteria. Springer, Dordrecht. Diez B, Pedros-­‐Alio C, Massana R (2001) Study of genetic diversity of eukaryotic picoplankton in different oceanic regions by small-­‐subunit rRNA gene cloning and sequencing. Appl. Environ. Microbiol. 67, 2932-­‐2941. Massana R, Castresana J, Balague V, Guillou L, Romari K, Groisillier A, Valentin K, Pedros-­‐Alio C (2004) Phylogenetic and ecological analysis of novel marine Stramenopiles. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3528-­‐3534. Finlay, B., Monaghan, E. and Maberly, S. (2002) Hypothesis: the rate and scale of dispersal of freshwater diatom species is a function of their global abundance. Protist 153, 261-­‐273. Round, F., Crawford, R. and Mann, D. (1990) The diatoms biology and morphology of the genera. Cambridge University Press, Cambridge. Silva, P. and Hasle, G. (1994) Proposal to conserve Thalassiosiraceae against Lauderiaceae and Planktoniellaceae (Algae). Taxon 43, 287-­‐289. Karentz D, Smayda TJ (1984) Temperature and seasonal occurrence patterns of 30 dominant phytoplankton species in Narragansett Bay over a 22-­‐year period (1959 -­‐ 1980). Mar. Ecol. Prog. Ser. 18, 277-­‐293. Cloern, J.E., Cole. B.E., Wong, R.L. and Alpine, A.E. (1985) Temporal dynamics of estuarine phytoplankton: a case study of San Francisco Bay. Hydrobiologia 129, 153-­‐76 Ribera d’Alcala, M., Conversano, F., Corato, F., Licandro, P., Mangoni, O., Marino, D., Mazzocchi, M.G., Modigh, M., Montresor, M., Nardella, M., Saggiomo, V., Sarno, D. and Zingone, A. (2004) Seasonal patterns in plankton communities in a pluriannual time series at a coastal Mediterranean site (Gulf of Naples): an attempt to discern recurrences and trends. Sci. Mar. 68, 65-­‐83. Sarno, D., Wiebe, H., Kooistra, C., Medlin, L., Percopo, I. and Zingone, A. (2005) Diversity in the genus Skeletonema (Bacillariophyceae) II. An ssessment of the taxonomy of S. costatum-­‐like species with the description of four new species. J. Phycol. 41, 151-­‐176. Beltrami, O., Escobar, M. and Collantes, G. (2007) New record of Prymnesium parvum f. patelliferum (Green, Hibberd & Piennar) Larsen stat. nov. (Prymnesiophyceae) from Valparaiso Bay. Invest. Mar. 35, 97-­‐104. Leander, B., Kuvardiva, O., Aleshin, V., Mylnikov, A. and Keeling, P. (2003) Molecular phylogeny and surface morphology of Colpodella edax (Alveolata): Insights into the phagotrophic ancestry of Apicomplexans. J. Euk. Microbiol. 50, 334-­‐340. - 20 -
604
605
606
607
608
609
610
82.
83.
Genitsaris, S., Kormas, K.A. and Moustaka-­‐Gouni, M. (2011b) Airborne algae and cyanobacteria: occurrence and related health effects. Front. Biosci. E3, 772-­‐
787. Chrisostomou, A., Moustaka-­‐Gouni, M., Sgardelis, S. and Lanaras, T. (2009) Air-­‐
dispersed phytoplankton in a Mediterranean river-­‐reservoir system (Aliakmon-­‐Polyphytos, Greece). J. Plankton Res. 31, 877-­‐884. - 21 -
611
612
613
614
Table 1. Prevailing physical and chemical parameters in L. Karla. Temperature Salinity Dissolved oxygen pH (0C) (PSU) (mg/l) 17/03/2010 15.6 7.6 5.8 8.3 20/04/2010 17.2 8.1 5.6 8.0 - 22 -
615
616
617
618
619
620
Figure 1. Map of Lake Karla, Greece, and sampling point (black dot). Black squares show points of inflowing water for reconstruction purposes. Centre of the lake is at 390 29’ 00” N, 220 49’ 00” E. - 23 -
621
622
623
624
625
Figure 2. rRNA gene clone library coverage based on Good’s C estimator of the unicellular eukaryotes (Euk) and Cyanobacteria from Lake Karla, Greece. O/P = ratio of observed to predicted number of phylotypes.
- 24 -
626
627
628
629
630
631
632
633
634
635
Figure 3a. Phylogenetic tree of relationships of 18S rDNA (ca. 1800 bp) of the representative unique (grouped on ≥98% similarity) eukaryotic clones (in bold) of the taxa Fungi, Choanoflagellata, Mesomycetazoa, Katablepharidophyta and Cryptophyta, found in the Lake Karla water column, March 2010, based on the neighbour-­‐joining method as determined by distance Jukes–Cantor analysis. One thousand bootstrap analyses (distance) were conducted. GenBank numbers are shown in parentheses. Numbers in parentheses indicate the relative abundance in the clone library. Scale bar represents 2% estimated. - 25 -
636
637
638
639
640
641
642
643
644
645
646
Figure 3b. Phylogenetic tree of relationships of 18S rDNA (ca. 1800 bp) of the representative unique (grouped on ≥98% similarity) eukaryotic clones (in bold) of the taxa Chlorophyta, Haptophyta and Stramenopiles, found in the Lake Karla water column, March 2010, based on the neighbour-­‐joining method as determined by distance Jukes–
Cantor analysis. One thousand bootstrap analyses (distance) were conducted. GenBank numbers are shown in parentheses. Numbers in parentheses indicate the relative abundance in the clone library. Scale bar represents 2% estimated. - 26 -
647
648
649
650
651
652
653
654
655
Figure 3c. Phylogenetic tree of relationships of 18S rDNA (ca. 1800 bp) of the representative unique (grouped on ≥98% similarity) eukaryotic clones (in bold) of the taxa Cercozoa, Alveolata and Euglenophyta, found in the Lake Karla water column, March 2010, based on the neighbour-­‐joining method as determined by distance Jukes–
Cantor analysis. One thousand bootstrap analyses (distance) were conducted. GenBank numbers are shown in parentheses. Numbers in parentheses indicate the relative abundance in the clone library. Scale bar represents 2% estimated. - 27 -
656
657
658
659
660
661
662
663
664
Figure 4. Phylogenetic tree of relationships of 18S rDNA (ca. 1600 bp) of the representative unique (grouped on ≥98% similarity) eukaryotic clones (in bold) found in the Lake Karla water column, April 2010, based on the neighbour-­‐joining method as determined by distance Jukes–Cantor analysis. One thousand bootstrap analyses (distance) were conducted. GenBank numbers are shown in parentheses. Numbers in parentheses indicate the relative abundance in the clone library. Scale bar represents 2% estimated. - 28 -
665
666
667
668
669
670
671
672
673
Figure 5. Phylogenetic tree of relationships of 16S rDNA (ca. 660 bp) of the representative unique (grouped on ≥98% similarity) cyanobacterial clones (in bold), March 2010, based on the neighbour-­‐joining method as determined by distance Jukes–
Cantor analysis. One thousand bootstrap analyses (distance) were conducted. GenBank numbers are shown in parentheses. Numbers in parentheses indicate the relative abundance in the clone library. Scale bar represents 2% estimated. - 29 -
674
675
676
677
Figure 6. Relative biomass of the major taxa (90% dominance) recognized with light microscopy in the Lake Karla water column. - 30 -

εξώφυλλο Οδηγού Σπουδών.pptx - Τμήμα Μοριακής Βιολογίας και

Eισαγωγή στις Βασικές Τεχνικές της Μοριακής Γενετικής