Ανοσοϊστοχηµεία Aνοσοφθορισµός Ελντέµ Σαδίκογλου, MSc Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας Ανάπτυξης και Μοριακής Νευροβιολογίας Τµήµα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής Δηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης Ανοσοϊστοχηµεία Υπάχουν ποικίλοι τρόποι ανίχνευσης πρωτεϊνών σε ένα δείγµα.   ELISA   Στύπωµα κατά Western   Ανοσοκατακρήµνιση   Ενζyµικές αντιδράσεις   Ανοσοϊστοχηµεία-Ανοσοφθορισµός   Η Ανοσοϊστοχηµεία (IHC) χρησιµοποιείται για την ανίχνευση µιας συγκεκριµένης πρωτεΐνης (σε αρκετές περιπτώσεις και άλλων µορίων).   Η IHC στηρίζεται στην αρχή της επιλεκτικής αλληλεπίδτασης ανάµεσα σε ένα αντίσωµα και στο αντιγόνο που αναγνωρίζει σχηµατίζοντας ένα ειδικό σύµπλοκο το οποίο µπορεί να ανιχνευτεί.   Πλεονεκτήµατα: γρήγορη, ανίχνευση χωροχρονικού προτύπου έκφρασης, εντοπισµός σε κυτταρικό ή υποκυτταρικό επίπεδο.   Μειονεκτήµατα: απαιτεί αντίσωµα έναντι της συγκεκριµένης πρωτεϊνης/ επίτοπου Ανοσοϊστοχηµεία Η ICH χρησιµοποιείται:   Για την ανάλυση της κατανοµής και/ή ανίχνευση διαφορετικά εκφραζοµένων πρωτεϊνών σε διαφορετικά σηµεία ενός συγκεκριµένου ιστού.   Για την ανίχνευση του χωροχρονικού προτύπου έκφρασης µιας πρωτεϊνης κατά την ανάπτυξη.   Για την ανίχνευση ιϊκών, βακτηριακών λοιµόξεων   Για τη διάγνωση µη φυσιολογικών κυττάρων όπως αυτών στους καρκινικούς όγκους. Ιστορική αναδροµή   Η ιδέα της χρήσης αντισωµάτων για την ανίχνευση των πρωτεϊνών που αναγνωρίζουν διατυπώθηκε στις αρχές του 1930.   Το 1941 ο καθηγητής Coons στο πανεπιστήµιο Harvard χρησιµοποίησε σηµασµένα αντίσωµατα για την ανιχνεύση του πνευµονιόκοκκου.   Η µέθοδος του Coons στηριζόταν στην σήµανση των αντισωµάτων µε φθοριζουσες οµάδες (ανοσοφθορισµός) – αργότερα ανεπτύχθηκαν οι έµµεσες µέθοδοι. Ανοσοϊστοχηµεία – παράµετροι 1) Επιλογή αντισώµατος   Μονoκλωνικό   Πολυκλωνικό   Αραιώσεις 2) Μέθοδος   Άµεση µέθοδος ανίχνευσης   Έµµεση µέθοδος ανίχνευσης   Ανοσοένζυµική   Φθορισµός   Πολλαπλή χρώση 3) Προετοιµασία δειγµάτων   Μονιµοποίηση   Τοµές 4) Μάρτυρες   Ανάκτηση αντιγόνου   Περιορισµός των µη ειδικών αλληλεπιδράσεων Επιλογή Αντισώµατος   Τα πιο συχνά χρησιµοποιούµενα αντισώµατα στην IHC είναι της τάξης IgG, της κύριας οµάδας ανοσοσφαιρινών που περιέχονται στον ορό.   Τα αντισώµατα προσδένονται στα αντιγόνα µέσω των µεταβλητών περιοχών τους (σχηµατισµός υδρόφοβων, ιοντικών, Van der Waals ή δεσµών υδρογόνου).   Η χηµική συγγένεια περιγράφει την ισχύ της αλληλεπίδρασης µεταξύ του αντιγόνου και του ειδικού προς αυτό αντισώµατος. Επιλογή Αντισώµατος   Αντισώµατα υψηλή συγγένεια αλληλεπιδρούν µε περισσότερα µόρια αντιγόνου σε συγκεκριµένη χρονική περίοδο, µε αποτέλεσµα να χρησιµοποιούνται σε υψηλότερες αραιώσεις.   Τα αντισώµατα παράγονται µε ανοσσοποίηση (ένεση) ζώων µε καθαρό αντιγόνο (ολόκληρη ή µια περιοχή της πρωτεΐνης, πεπτίδιο, κ.λ.π.).   Πολυκλωνικά ή µονοκλωνικά Αντισώµατα   Τα αντισώµατα είτε παράγονται στο εργαστήριο είτε τα προµηθευόµαστε από εταιρείεςσε δυο τύπους: συγκεντρωµένα ή έτοιµα προς χρήση.   Τα αντισώµατα πρέπει να έχουν ελεγχθεί για ICH – υπάρχουν αντισώµατα που λειτουργούν σε ELISA και/ή στο στύπωµα κατά Western αλλά δεν λειτουργούν στην ICH.   Τίτλος χαρακτηρίζεται η µεγαλύτερη αραίωση του αντισώµατος µε το οποίο δίνει ισχυρή ειδική χρώση µε τη λιγότερη δυνατή µη ειδική χρώση.   Η αραίωση αναφέρεται στην αναλογία του συγκεντρωµένου αντισώµατος προς το συνολικό όγκο. Για παράδειγµα, 1:5 αραίωση σηµαίνει ένα µέρος συγκεντρωµένου αντισώµατος και τέσσερα µέρη διαλύτη.   Η ιδανική αραίωση διεξαγωγής πειραµάτων καθορίζεται µε τη τιτλοδότηση ή µε µια σειρά αραιώσεων. Πολυκλωνικά Αντισώµατα   Τα πολυκλωνικά αντισώµατα παράγονται από πολλούς κλώνους Β-λεµφοκυττάρων και αναγνωρίζουν διάφορους επίτοπους πάνω στο αντιγόνο.   Κουνέλι, αίγα, όνος, ποντικός   Καθαρισµός από τον ορό είτε µε χρωµατογραφία συγγένειας µε το αντιγόνο (αποµακρύνεται το µεγαλύτερο µέρος των µη ειδικών ανοσοσφαιρινών) ή µε καθαρισµό πρωτεΐνης (αποµακρύνεται το µεγαλύτερο µέρος των πρωτεϊνών του ορού αλλά όχι το κλάσµα των µη ειδικών ανοσοσφαιρινών).   Τα πολυκλωνικά αντισώµατα τείνουν να κάνουν πιο πολλές µη ειδικές αλληλεπιδράσεις σε σχέση µε τα µονοκλωνικά.   Η συγγένεια µπορεί να διαφέρει από παρτίδα σε παρτίδα ανοσοποίησης.   Ωστόσο, αναγνωρίζουν πιο συχνά το υπό µελέτη αντιγόνο. Μονοκλωνικά Αντισώµατα   Τα µονοκλωνικά αντισώµατα παράγονται συνήθως σε ποντικό και αρουραίο.   Παράγονται από έναν κλώνο Β-λεµφοκυττάρων και αναγνωρίζουν µονάχα ένα συγκεκριµένο επίτοπο ως αντιγόνο.   Την ανοσοποίηση ακολουθεί αποµόνωση διακριτών κλώνων Βλεµφοκυττάρων, καθένας εκ των οποίων παράγει ένα µόνο αντίσωµα µε την ίδια µοριακή δοµή, ειδικότητα και συγγένεια το οποίο αναγνωρίζει έναν συγκεκριµένο επίτοπο.   Το βασικό πλεονέκτηµα των µονοκλωνικών αντισωµάτων είναι η µεγάλη τους ειδίκευση. Η πιθανότητα σταυρωτής αντίδρασης του αντισώµατος µε αντιγόνα που φέρουν επιτόπους παρόµοιους µε αυτούς του υπό µελέτη αντιγόνου είναι πολύ µικρή. Μέθοδοι Άµεση µέθοδος Φθορίζουσα χρωστική προσδεµένη στο αντίσωµα (ιδέα του Coon) Σηµασµένο αντίσωµα έναντι του επίτοπου Άµεση µέθοδος   Η συγκεκριµένη µέθοδος χρησιµοποιεί µόνο ένα αντίσωµα και είναι µια απλή και γρήγορη µέθοδος.   Ωστόσο, σε σύγκριση µε τις έµµεσες µεθόδους η ευαισθησία είναι χαµηλότερη λόγω έλλειψης της ενίσχυσης του σήµατος.   Χρησιµοποιείται λιγότερο συχνά από τις έµµεσες µεθόδους. Σηµασµένο αντίσωµα έναντι του επίτοπου Έµµεση µέθοδος: δυο αντισώµατα Σηµασµένο (ένζυµο ή φθορισµός) δεύτερο αντίσωµα έναντι τις σταθερής περιοχής του τύπου IgG Πρώτο αντίσωµα έναντι του επίτοπου Έµµεση µέθοδος µε ενίσχυση σήµατος Σηµασµένο δεύτερο αντίσωµα έναντι τη σταθερή περιοχή του τύπου IgG Πρώτο αντίσωµα έναντι του επίτοπου Μονιµοποίηση 1. Με βάση τις αλδεΰδες (Δείγµατα παγωµένα ή µη)  10% Neutral Buffered Formalin  4% φορµαλδεϋδη  2% φορµαλδεϋδη µε πικρικό οξύ σεPBS  γλουταραλδεϋδη  Καλύτερα µονιµοποιητικά για τη διατήρηση της δοµής των ιστών 2. Μονιµοποιητικά µε βάση το ψευδάργυρο 3 Ακετόνη ή Μεθανόλη (συσσωµάτωση, διαπερατοποίηση) 4. Απλώς κατεψυγµένα δείγµατα  Υγρό Άζωτο  Ξηρός πάγος  Καλύτερο για αντιγόνα κυτταρικών µεµβρανών, κυτοκίνες 5. Αρκετά άλλα Μονιµοποίηση Ο χρόνος µονιµοποίησης είναι σηµαντικότερος παράγοντας ! Αναστολέας ουροκινάσης πλάσµατος– 48 ώρες µονιµοποίηση (αριστρερά) 7 ηµέρες µονιµοποίηση (δεξιά) Μονιµοποίηση 4% PFA 2.5 % Γλουταραλδεϋδη Πρωτεϊνάση K 0.05% 0.02% Νωτιαίος µυελός (ποντίκι) 0.005% 0.002% Τοµές Τοµές σε κρυοτόµο   Μονιµοποιηµένα ή κατεψυγµένα δείγµατα   Πάχος τοµών > 10 µικρόµετρα   Καλύτερη διατήρηση αντισωµάτων   Χαµηλής ποιότητας µορφολογία   Χαµηλή ανάλυση σε υψηλή µεγέθυνση   Μπορούν να αποθηκευτούν για αρκετούς µήνες   Δύσκολο να πραγµατοποιηθούν (σε σχέση µε τη παραφίνη) Τοµές Τοµές παραφίνης  Αυτοµατισµός  Χρησιµοποιούνται ευρύτατα  Πάντα µονιµοποιηµένοι ιστοί  Πάχος 5-6 µικρόµετρα  Θέρµανση και επώαση µε ξυλένιο και αλκοόλη–κάποια αντιγόνα επηρεάζονται   Οι τοµές δεν µπορούν να διατηρηθούν πολύ, ωστόσο τα µπλοκ διατηρούνται για πολύ µεγάλο χρονικό διάστηµα.   Απαιτεί επιπλέον βήµα ανάκτησης αντιγόνου . Τοµές Τοµές σε µικροτόµο παλλόµενης λεπίδας  Ζωντανοί ιστοί  Πάχος 50-2000 µικρόµετρα  Οι τοµές δεν επωάζονται µε οργανικούς διαλύτες ή υψηλή θερµοκρασία µε αποτέλεσµα να χάνουν την αντιγονικότητα τους.  Οι τοµές δεν υπόκεινται σε διαδικασία ψύξης ώστε να µπορούν να καλλιεργηθούν ή να πραγµατοποιηθούν λειτουργικές µελέτες.  Σπάνια χρσηιµοποιείται στη διάγνωση.  Α ργή διαδικασία κοπής των τοµών Διαπερατοποίηση   Για την ανίχνευση ενδοκυττάριων (κυτταροπλασµατικών, πυρηνικών) επιτόπων ή µεµβρανικών πρωτεϊνών µε τον επίτοπο στη κυτταροπλασµατική πλευρά απαιτείται διαπερατοποιήση της µεµβράνης.   Τα πιο κοινά αντιδραστηρια διαπερατοποίησης είναι: •  Απορρυπαντικά: Triton-X100, Tween-20 •  Ακετόνη ή Μεθανόλη •  Σαπονίνες   Η διαπερατοποίηση των µεµβρανών είναι παροδική Περιορισµός µη ειδικής Χρώσης Η µη ειδική αλληλεπίδραση οδηγεί σε µή ειδικό σήµα   "Ειδική" µη ειδική χρώση   Πολυκλωνικά αντισώµατα: το αντιγόνο που χρησιµοποιήθηκε για             ανοσοσποίηση δεν ήταν αρκετά καθαρό Ανεπαρκής µονιµοποίηση: διάχυση αντιγόνου, διάχυση σήµατος Πραγµατική µη ειδική χρώση Μη-ανοσολογική πρόσδεση, συνήθως οµοιόµορφη Ενδογενής υπεροξειδάση (βλ. Επόµενες διαφάνειες) Ενδογενής βιοτίνη (βλ. Επόµενες διαφάνειες) Κακή µονιµοποίηση Μάρτυρες Για την αξιοποίηση των αποτελεσµάτων χρειάζονται Θετικοί και Αρνητικοί µάρτυρες 1. Θετικός µάρτυρας α) Ένας ιστός µε γνωτή ειδικότητα για το αντίσωµα ή β) Ένα αντίσωµα το οποίο έχει δώσει χρώση µε τον συγκεκριµένο ιστο 2. Άρνητικός µάρτυρας α) IgG ίδιου είδους, ανοσοποιηµένο έναντι µη βιολογικού µορίου ή β) Ορός από το ίδιο είδος µη ανοσοποιηµένο (προανοσοποιήσης) Έµµεση Μέθοδος : δυο αντισώµατα Σηµασµένο (ένζυµο ή φθορισµός) δεύτερο αντίσωµα έναντι τη σταθερή περιοχή του IgG Πρώτο αντίσωµα έναντι του επίτοπου Ανίχνευση   Φθορισµός   Την επώαση µε το δέυτερο αντίσωµα ακολουθεί ανίχνευση στο µικροσκόπιο (το σήµα εξασθενεί)   Συνδεση µε Ένζυµο   Την επώαση µε το δεύτερο αντίσωµα ακολουθεί επώαση των τοµών µε υποστρώµατα τα οποία υδρολύονται προς έγχρωµα προϊόντα. Η ανίχνευση πραγµατοποιείται σε µικροσκόπιο φωτεινού πεδίου (το σήµα είναι σταθερό, φυλλάσεται σε θερµοκρασία δωµατίου)   Ένζυµα:Υπεροξειδάση ή Αλκαλική Φωσφατάση   Yποστρωµα για POD: DAB   Yποστρωµα για AP: BCIP, NBT Έµµεση Μέθοδος µε ενίσχυση σήµατος Σηµασµένο δεύτερο αντίσωµα έναντι της σταθερής περιοχής του τύπου IgG Πρώτο αντίσωµα έναντι του επίτοπου ABC µέθοδος Μέθοδος Τυραµιδίου (TSA)   Ε ν ί σ χ υ σ η Σ ή µ α τ ο ς µε Τυραµίδιο: ενισχύει το φθορισµό και χρωµογενές σήµα   Το τυραµίδιο παρουσία Η 2 Ο 2 αλληλεπιδρά µε την HRP και προσδένεται οµοιοπολικά µε τα κ α τ ά λ ο ι π α Τυ ρ ο σ ί ν η ς τ ω ν πρωτεϊνών.   To TSA προσδένεται σε πρωτεΐνες ακριβώς δίπλα στο στόχο, ως επί τούτου είναι ιδανικό για τον εντοπισµό των πρωτεϊνών µέσα τα διαµερισµατα των κυττάρων. Μέθοδος Τυραµιδίου   Ενίσχυση του σήµατος κατά 50-1000 φορές Αλλά..   Ενισχύονται και οι µη ειδικές αλληλεπιδράσεις   Είναι δύσκολο να εκτιµηθούν οι διαφορές µεταξύ δειγµάτων µετά TSA   Ακριβό κόστος BIBLIOGRAPHY • Coons AH, Creech HJ, Jones RN (1941) Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 47:200–202. • Coons AH. (1960) Immunofluoresence Public Health Rep. 75:937-43 • Coons AH & Kaplan MH. (1950) Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91(1):1-13. • Coons AH, Leduc EH & Connoly JM. (1955) Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. J Exp Med. 1955 Jul 1;102(1):49-60. • Nakane PK, Pierce GB. (1966) Enzyme-labeled antibodies; preparation and localization of antigens. J Histochem Cytochem 14:929–931. • Avrameas S, Uriel J. (1966) Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262:2543-5 • Mason DY, Sammons R. (1978) Alkaline phosphatase and peroxidase for double immunoenzymatic labelling of cellular constituents. J Clin Pathol. May;31(5):454–460. • Suffin, S. C., Muck, K. B., Young, J. C., et al. (1979) Improvement of glucose oxidase immunoenzyme technique: Use of a tetrazolium whose formazan is stable without heavy metal chelation. Am. J. Clin. Pathol. 71,492-496. • A. Bondi, G. Chieregatti, V. Eusebi, E. Fulcheri and G. Bussolati (1982). The use of β-galactosidase as a tracer in immunocytochemistry. Histochemistry 76:153-158. • Delves PJ, Martin SJ, Burton DR & Roitt IM. (2011) Roitt's Essential Immunology Ed. Wiley. • Adams JC. (1992) Biotin amplification of biotine and horseradish peroxidase signals in histochemical. J Histochem Cytochem. 40:1457-1463. • Dabbs DJ. (2008) Immunohistochemical protocols: back to the future. Am J Clin Pathol. 129:355-356. • Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. (2001) Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 24:173-190. • O’Leary TJ, Fowler CB, Evers DL, Mason JT. (2009) Protein fixation and antigen retrieval: chemical studies. Biotech Histochem. 84:217-221. • Hsu S-M, Raine L, Fanger H. (1981). Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J. Histochem Cytochem. 29:577-580. • Shi R., Shi Y., and Taylor CR. (2011) Antigen Retrieval Immunohistochemistry: Review and Future Prospects in Research and Diagnosis over Two Decades. Journal of histochemistry & Cytochemistry 59(1) 13–32. • Shi S-R, Key ME, Kalra KL. (1991) Antigen retrieval in formalin fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem. 39:741-748. • Floyd AD. Automated Immunostaining: The Technology and its Application. NHS Workshop, 1997. • Larsson L-I. In: Larsson L-I. Immunocytochemistry: Theory and practice .Boca Raton: CRC Press 1988:147-170.