close

Enter

Log in using OpenID

(i) Α

embedDownload
ΠΡΟΤΥΠΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ
ΓΕΝΕΤΙΚΗ & ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ
ΜΥΚΗΤΩΝ
Πλεονεκτήματα
Ταχεία αύξηση με μορφή αποικιών (2-3h χρόνος διπλασιασμού)
Μαζική παραγωγή. Απλά θρεπτικά Οικονομικά συστήματα
Moνοκύτταροι οργανισμοί (ζύμες)-μονοπυρηνικά σπόρια (νηματοειδείς)
Κατάλληλοι για γενετική ανάλυση, καθώς είναι απλοειδείς οργανισμοί
αλλά μπορούν να υπάρξουν και σε διπλοειδή κατάσταση – Γενετικοί χάρτες
Μικρό γονιδίωμα
(1/100(1/100-1/200 ανθρώπινου)
ανθρώπινου)
S. cerevisiae 1.4 x 107 bp
A.nidulans 2.7 x 107 bp
Ικανότητα μετασχηματισμού – «αντιστροφή» γενετική
Ποικιλία εξωγονιδιωματικών φορέων, συστημάτων στοχευμένης
ενσωμάτωσης – αντικατάστασης γονιδίων, knock-outs, κλπ.
Κυτταρικοί ή μοριακοί μηχανισμοί όμοιοι με αυτούς των αντίστοιχων
ανώτερων ευκαρυωτικών (>30% γονιδίων ομόλογα με ανθρώπινα γονίδια)
Συστήματα έκφρασης γονιδίων από ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς
ΟΙ ΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ…..
Ζύμες
Saccharomyces cerevisiae
Schizosacharomyces pombe
Νηματοειδείς μύκητες
Aspergillus nidulans
Neurospora crassa
ΛΙΓΑ ΙΣΤΟΡΙΚΑ….. Μερικά από τα καλύτερα στιγμιότυπα
Πρώτο μισό του αιώνα, S. cerevisiae, A. nidulans & N. crassa, θεμελιώνονται ως
εξαιρετικά συστήματα γενετικής ανάλυσης – Φυλετικός κύκλος, διασταυρώσεις,
ανάλυση ασκών, γενετικοί χάρτες, κλπ
1941, Beadle & Tatum, μεταλλαγές αυξοτροφίας στη N. crassa, θεμελίωση του
δόγματος ένα γονίδιο-ένα ένζυμο (πρωτεΐνη). Η αρχή της σύγκλισης γενετικήςβιοχημείας.
1949, Lindegren, Συζευκτικοί τύποι στο S. cerevisiae
1952, Ανακάλυψη του παραφυλετικού κύκλου στον A. nidulans από Pontecorvo &
Roper
1960-1970’s Eδραίωση του γενετικού κώδικα και αναλόγων ρυθμιστικών
κυκλωμάτων (Scazzocchio, Arst, Hershkowitz, Guarente) αλλά και της έλλειψης
οπερονίων στα ευκαρυωτικά
1970-1980’s, Επίτευξη γενετικού μετασχηματισμού στη ζύμη (1978) και σε νηματοειδείς
(1984), Απαρχή της Μοριακής Γενετικής σε ευκαρυωτικά. Μεταλλαγές ρύθμισης του
κυτταρικού κύκλου cdc σε S. cerevisiae & S. pombe (Nurse, Nasmyth , Hartwell)
Μεταλλαγές ελατωματικής έκκρισης sec (Sheckman), Μεταλλαγές μεταφραστικής &
μεταγραφικής ρύθμισης (Hinnebush, Struhl, Fink, Cooper) στον S. cerevisiae .
Μεταλλαγές κιρκαδικής ρύθμισης και επιγενετικών φαινομενένων RIP, MIP, quelling,
(Selker, Faugeron, Rosignol), μεταλλαγές ρύθμισης κυτταροσκελετού (Morris, Osmani)
σε Neurospora, Aspergillus, Podospora, Ascobolus
1990’s Γονιδίωμα Saccharomyces cerevisiae (Goffeau, 1996). Two-hybrisd system
(Fields & Song 1990). Μεταλλαγές ρύθμισης της μεταγραφής μέσω τροποποίησης της
χρωματίνης στον S. cerevisiae
2000’s Πρώτη πλήρης συλλογή απενεργοποιημένων γονιδίων (knock-outs) στον S.
cerevisiae. Γονιδιώματα Aspergillus nidulans, Schizosaccharomnyces pombe,
Neurospora crassa. Γονιδιώματα συγγενών παθογόνων μυκήτων.
ΤΟ ΠΡΩΤΟ ΜΕΓΑΛΟ ΒΗΜΑ ΣΤΗΝ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ– Η
ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ ΤΟΥ S. cerevisiae
~ 6000 γονίδια
(~2κβ Μ.Ο.)
120 rRNAs
40 sRNA
274 tRNA
51 ρετρομεταθετά
στοιχεία Τy
Ιντρόνια μόνο σε rRNA
1 cM~ 3kb
28% γνωστές λειτουργίες
26% ορφανά γονίδια
σε Β.Δ.
11% μόνο στον Saccharomyces
15% ομόλογα με γνωστές
πρωτεΐνες
14% ομόλογα μοτίβα
6% Α.Π.Μ. ??
>30% γονίδια ομόλογα
ανθρώπινων γονιδίων
περιλαμβανομένων και
γονιδίων «ασθενειών»
Chromosomes
Per haploid
cell
Organism
Zea mays
(corn)
10
H. sapiens
(human)
23
C. elegans
8
1.05 x 10
14000 γονίδια
D. melanogaster
(fruit fly)
4
2.7x 107 bp
14000 γονίδια 8
A. nidulans
S. cerevisiae
(yeast)
1.4 x 10 7 bp
4 x 10 6 bp
E. coli
106
16
1
107 108 109 1010
DNA content per cell (bp)
Οικογένειες πρωτεϊνών
Signal transduction
Organelle biogenesis
Nuclear structure
Cell rescue
Not clearclear-cut
Amino acids
Cytoplasmic structure
Nitrogen/
Nitrogen/Sulfur
Nucleotides
Cell envelope
Phosphate
Intracellular trafficking
Transport facilitators
Protein shaping
Translation
Transcription,
Transcription, transcription
control
Carbohydrates
Lipids
Cofactors
Energy metabolism
Cell growth,
growth, cell division,
division,
DNA synthesis
14 Κατηγορίες Πρωτεϊνών του Σακχαρομύκητα
1/3 ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΓΙΑ ΕΠΙΒΙΩΣΗ
ΦΥΛΕΤΙΚΟΣ & ΑΦΥΛΕΤΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΣΤΟΥΣ ΜΥΚΗΤΕΣ ΜΟΝΤΕΛΑ
Απομόνωση μεταλλαγών, ταξινόμηση σε επικρατούσες-υπολειπόμενες,
θετικές-αρνητικές
Η «φύση» μιας μεταλλαγής
μπορεί να μελετηθεί με 4 γενετικά Τεστ
•Γενετικού Διαχωρισμού. Ένα γονίδιο;
Διασταύρωση με φυσιολογικό τύπο (wt) &
αναζήτηση του 1:1
•Επικράτειας. Φαινότυπος σε διπλοειδή.
•Γενετικής Συμπλήρωσης. Τεστ
λειτουργίας σε διπλοειδή. Είναι δυο
μεταλλαγές λειτουργικά
συμπληρωματικές;
•Γενετικής Σύνδεσης. Τεστ τοπολογίας.
Είναι δυο μεταλλαγές γενετικά
συνδεδεμένες (στο ίδιο γονίδιο);
Ανάλυση απογόνων
Υπάρχουν εξαιρέσεις όπου τα
τεστ δίνουν «περίεργα»
αποτελέσματα;
•Ενδογονιδιακή
συμπληρωματικότητα
•Μη-συνδεδεμένη μησυμπληρωματικότητα
ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ S. cerevisiae
Μεθοδολογία όμοια του χημικού μετασχηματισμού βακτηρίων
Μεθοδολογία επιλογής μετασχηματισμένων: γενετική (λειτουργική) συμπλήρωση
μεταλλαγής
Βασική προϋπόθεση: Στέλεχος μεταλλαγμένο στο γονίδιο επιλογής Χ- (προτιμότερα με
Μεταλλαγή ολικής έλλειψης) και πλασμίδιο με φυσιολογικό γονίδιο επιλογής Χ+
Κύτταρα στη λογαριθμική φάση αύξησης (OD=0.5)
Επώαση σε οξικό Li (ανάλογο του Ca++, Rb++ στα βακτήρια)-ρευστοποίηση μεμβράνης
Πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG)+DΝΑ (πλασμίδιο)
Θερμικό σοκ 42 ο C
Eπώαση σε επιλεκτικό θρεπτικό (συνήθως θρεπτικό χωρίς
Απόδοση: διαφέρει ανάλογα το πλασμίδιο (αυτόνομο ή ενσωμάτωσης),
μέγιστη 105-6 τ/μg
ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ S. cerevisiae
Πλασμίδια που αντιγράφονται σε βακτήρια
(Ε.coli) και στον S. cerevisiae
Περιέχουν γονίδια επιλογής σε E. coli
(συνήθως Αr) και σε S. cerevisiae (LEU2,
TRD1, HIS3, URA3, κλπ).
Πλασμίδια ενσωμάτωσης στο
γονιδίωμα
CEN
ARS
2μ
Πλασμίδια αυτόνομης αντιγραφής που
περιέχουν αλληλουχίες αυτόνομης
αντιγραφής ARS από το γονιδίωμα του S.
cerevisiae ή το φυσικό πλασμίδιο 2μ
Τα πλασμίδια 2μ υπάρχουν >12
αντίγραφα/κύτταρο και είναι σταθερά.
Τα πλασμίδια ARS υπάρχουν επίσης σε
πολλαπλά αντίγραφα αλλά
είναι ασταθή εκτός εάν περιέχουν και
αλληλουχίες CEN από το κεντρομερές του
S. cerevisiae. Τα πλασμίδια ARS-CEN: 1-2
αντίγραφα/κύτταρα.
ΓΟΝΙΔΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΣΤΟΝ S. cerevisiae
-
Απαραίτητοι για την αναγνώριση των γενετικά τροποποιημένων
κυττάρων – κλώνων.
Κυρίως γονίδια ενζύμων του μεταβολισμού αμινοξέων και
βάσεων που αρχικά κλωνοποιήθηκαν σε βακτήρια.
Leu2 +
Mετασχηματισμός
στελέχους
Leu2-
Leu2+
Ανάλογο σύστημα με αυτό των
βακτηρίων όπου κυρίως
χρησιμοποιούνται γονίδια
ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά.
Κυριότερα Γονίδια Επιλογής στον S. cerevisiae
γονίδια βιοσύνθεσης αμινοξέων-πυριμιδινών
YEAST
SELECTABLE
ΜARKERS
G ENE
E NZYME
S ELECTION
HIS3
Imidazole glycerolphosphate dehydratase
histidine
LEU2
β - Isopropylmalare dehydrogenase
leucine
LYS2
a - Α minoadipate reductase
lysine
TRP1
N - (5 ΄ - phosphoribosyl)
tryptophan
URA 3
Orotidine - 5 ΄ - phosphate decarboxylase
- anthranilate isomerase
uracil
Ο ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΝΗΜΑΤΟΕΙΔΩΝ (Α. nidulans)
Μεθοδολογία όμοια αλλά και με σημαντικές διαφορές του μετασχηματισμού ζυμών
Επιλογή μετασχηματισμένων: γενετική (λειτουργική) συμπλήρωση μεταλλαγής.
Βασική προϋπόθεση: Στέλεχος μεταλλαγμένο στο γονίδιο επιλογής Χ- και πλασμίδιο με
φυσιολογικό γονίδιο επιλογής Χ+ . Σπανιότερα χρησιμοποιούνται και γονίδια
ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά όπως η ολιγομυκίνη, φλυομυκίνη, υγρομυκίνη.
Διάκριση υπολειπόμενων και κυρίαρχων γενετικών στοιχείων επιλογής
μετασχηματισμένων στελεχών
Mετασχηματισμός πρωτoπλαστών)σε ισοοσμωτικό περιβάλλον. Το κυτταρικό
τοίχωμα καταστρέφεται με ενζυμική πέψη (μέσω λυτικών ενζύμων).
Οι πρωτόπλαστες, που μπορεί να προέρχονται από μυκήλιο (πολυπύρηνοι) ή
κονιδιοσπόρια (1-2 πυρήνες), απομονώνονται από το μείγμα, προστίθεται DNA
(πλασμίδιο) και PEG. Η σύντηξη πρωτόπλαστων οδηγεί σε «είσοδο» του DNA.
Αναγέννηση πρωτόπλαστων – μετασχηματισμένων πυρήνων
Χαμηλής – Μέσης απόδοσης : 10-104 t/μg DNA. Εξαρτημένη από το πλασμίδιο.
Πλασμίδια ενσωμάτωσης: 10-1000 τ/μg
Πλασμίδια αυτόνομης αντιγραφής: 100.000 τ/μg
Αλλες μέθοδοι: Ηλεκτροδιάτριση, Βιολιστικός βομβαρδισμός. Οχι ιδιαίτερα
αποδοτικότεροι των κλασσικών μεθόδων.
ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ A. nidulans
Πλασμίδια που περιέχουν αλληλουχίες
αντιγραφής (OriC) και επιλογής (Αr) σε E.
coli και γονίδιο επιλογής στον A. nidulans
(ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά ή
συμπλήρωση μεταβολικής ανεπαρκείς π.χ.
argB, amdS, pyrG)
Τα πλασμίδια αυτά ενσωματώνονται στο
γονιδίωμα σε ομόλογες ή μη ομόλογες
περιοχές. Η ενσωμάτωση τους μπορεί να
οδηγήσει σε απλή ή πολλαπλή
ενσωμάτωση του πλασμιδίου ή
αντικατάσταση ολοκλήρου ή μέρους του
γονιδίου από το γονιδίωμα
Πλασμίδια τύπου ARS χρησιμοποιούνται αλλά είναι ιδιαίτερα ασταθή και δεν
χρησιμοποιούνται ευρέως
Η ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΤΟΥΝ A. nidulans
Στον S. cerevisiae, πλασμίδια που δεν φέρουν αλληλουχίες 2μ ή ARS ενσωματώνονται
κυρίως με ομόλογο ανασυνδυασμό. Ο ετερόλογος (τυχαίος;) ανασυνδυασμός είναι
πολύ σπάνιος
Στον A. nidulans, τα πλασμίδια ενσωματώνονται με
ομόλογο και/ή ετερόλογο ανασυνδυασμό
Η ενσωμάτωση μπορεί να είναι απλή ή πολλαπλή
Μ
γονιδιωματικό
αντίγραφο argB
τ1 τ2
τ3
Απλή ετερόλογη
ενσωμάτωση
(μάρτυρας)
Απλή ομόλογη ενσωμάτωση
Τριπλή ομόλογη ενσωμάτωση
Σε όλους τους μύκητες, γραμμικό πλασμιδιακό DNA ενσωματώνεται με διπλό ομόλογο
ανασυνδυασμό που συνήθως οδηγεί σε γονιδιακή αντικατάσταση στο γονιδίωμα.
ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ
ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ ΜΥΚΗΤΩΝ
Ετερόλογος Ανασυνδυασμός
Ομόλογος Ανασυνδυασμός
Α
Χ
Χ
απλό
cross-over
απλό
cross-over
Α΄
Εάν η θέση ενσωμάτωσης
αντιστοιχεί σε γονίδιο =
απενεργοποίηση
Διπλασιασμός γονιδίου Α
Γονιδιακή αντικατάσταση
Α
Χ
Χ
Α΄
Α΄
ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ
ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ και ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ
Σπουδαίο «εργαλείο» για την λειτουργική ανάλυση γονιδίων
α) Αντικατάσταση – με γραμμικό
ομόλογο DNA, το οποίο «διορθώνει» το
μεταλλαγμένο γονίδιο και επιτρέπει την
άμεση επιλογή μετασχηματισμένων
στελεχών.
μεταλλαγή
-
Α
Χ
Χ
Α+
Α+
β) Στοχευμένη ενσωμάτωση μέσω συγκεκριμένων αλληλουχιών π.χ. ένα πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο
επιβολής Α και το γονίδιο υπό μελέτη Β προτιμούμε να ενσωματωθεί μέσω αλληλουχιών Α, ώστε το
υπό μελέτη γονίδιο Β να παραμείνει όπως έχει χωρίς να ανασυνδυαστεί – Το γονίδιο Β του πλασμιδίου
είναι ελλειπές ή φέρει μεταλλαγή, άλλη από αυτή του γονιδίου Β του γονιδιώματος.
Επιλέγοντας στελέχη Β+, επιλέγουμε τους παραπάνω ανασυνδυασμούς...
Β-
-
Β
Χ
Χ
ΒΔ
-
Β
Α
Α
Β--
Α
Β -Δ
Α
Β+
γ) Στοχευμένη απενεργοποίηση γονιδίου∗
∗ Σε περίπτωση θνησιγόνων απενεργοποιήσεων ο μετασχηματισμός γίνεται σε διπλοειδή κύτταρα...
Α+
1) Χρησιμοποιόντας γραμμικό DNA που
φέρει γονίδιο επιλογής το οποίο
«διακόπτει» το Α.Π.Μ. του γονιδίου που θα
αντικατασταθεί
Χ
Β+
Χ
Α-, Β+
Α+
x
Α-
x
2) Χρησιμοποιώντας πλασμίδιο που φέρει μέρος
του γονιδίου για απενεργοποίηση.
ΧhoI
+
A
3) Ενσωμάτωση μέσω δράσης περιοριστικού ενζύμου
(REMI). Τα άκρα XhoI του πλασμιδίου, παρουσία του
ενζύμου XhoI, ανασυνδυάζονται σε θέσεις XhoI στο
γονιδίωμα. Αν το γονίδιο μας έχει θέση XhoI οι πιθανότητες
απενεργοποίησης του μέσω ενσωμάτωσης του πλασμιδίου
είναι μεγάλες.
Χ
B
B+
+
«ΔΙΑΣΩΣΗ» ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΑΠΟ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ A. nidulans ή S. cerevisiae
Ar
Προϋπόθεση της μελέτης γονιδίων που
μετασχηματίζουν στελέχη μυκητών και τους
προσδίδουν ενδιαφέροντες φαινοτύπους είναι η
απομόνωση των πλασμιδίων που εμπεριέχουν τα
γονίδια αυτά. Η «διάσωσή» τους γίνεται σε
βακτήρια E. coli.
x
Ar
απομόνωση DNA
Στον S. cerevisiae όπου χρησιμοποιούνται κυρίως
αυτόνομα αντιγραφικά πλασμίδια αυτό είναι απλό.
Τα κύτταρα λύονται και μετασχηματίζουμε
βακτήρια επιλέγοντας Αr καθώς όλα τα πλασμίδια
του S. cerevisiae φέρουν το γονίδιο Αr.
μετασχ.
βακτηρίων
EcoRI
EcoRI
Ar
+ T4 λιγάση
EcoRI
Ar
Στον A. nidulans όπου τα πλασμίδια ενσωματώνονται
στο γονιδίωμα, η «διάσωσή» τους είναι
δυσκολότερη αλλά εφικτή λόγου μιτωτικής ή
μειωτικής «εξωσωμάτωσης» (excision) των
πλασμιδίων – κυρίως όταν αυτά δημιουργούν
διπλασιασμούς γονιδίων. Εναλλακτικά μπορούμε
να «αποκόψουμε» την περιοχή ενσωμάτωσης και
να την απομονώσουμε
ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΣΗ
Πλεονεκτήματα
Ύπαρξη εκατοντάδων
μεταλλαγμένων στελεχών
στους μύκητες...
Η ευκολία απομόνωσης νέων
μεταλλαγμένων στελεχών.
Η ευκολία παραγωγής πλήρων
γενωμικών βιβλιοθηκών λόγω
του μικρού γονιδιώματος
και της απουσίας ιντρονίων (ή
παρουσίας μικρών ιντρονίων).
Η δυνατότητα κλωνοποίησης
γονιδίων μικρής ομοιότητας ή
μη-ομολόγων γονιδίων
από άλλους οργανισμούς.
ΑΝΑΓΝΩΡΙΖΟΝΤΑΣ ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙ ΜΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ
ΈΝΑ ΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙ ΜΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ ΔΕΝ ΕΊΝΑΙ ΑΝΑΓΚΑΣΤΙΚΑ
ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥ ΕΧΕΙ ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΕΙ Η ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ……
…και η σημασία της γενετικής ανάλυσης
ΙΔΙΑΙΤΕΡΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ
ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ – ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΜΕΣΩ ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗΣ
(ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΜΕΣΩ ΠΟΛΛΩΝ ΑΝΤΙΓΡΑΦΩΝ)
Μπορούμε να υπερ-εκφράσουμε γονίδια στον S. cerevisiae χρησιμοποιώντας
φορείς 2μ ή ARS ή χρησιμοποιώντας «δυνατούς υποκινητές». [Στον A. nidulans αυτό
μπορεί να γίνει με πολλαπλή ενσωμάτωση εν σειρά πλασμιδίου ή με ισχυρούς
υποκινητές όπως ο alcA (αφυδρογονάση αλκοόλης)]. Η υπερ-έκφραση ενός γονιδίου
οδηγεί σε «εμφανείς» φαινοτύπους – συχνά μπορεί να «παρακάμψει» την ανάγκη
άλλων γονιδίων ή να καταστείλει μεταλλαγές π.χ. (i) Α Æ(ενεργοποίηση) Β Æ Γ.
Σ’ ένα στέλεχος Α-, η υπερέκφραση του Β καταστέλλει την έλλειψη του Α. (
Υπερέκφραση μπορεί να οδηγήσει και σ’ αρνητικούς φαινοτύπους όταν
το προϊόν που υπερεκφράζεται συμμετέχει σε περισσότερο από ένα μονοπάτι
Β
ΒΑ
Α
Γ
ΓΑ
Εάν υπερεκφραστεί ο Β όλο το Α θα υπάρχει δεσμευμένο με το Β
ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΣΕ ΔΥΟ ΒΗΜΑΤΑ
ΘΝΗΣΙΓΟΝΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ
MΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ
ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΔΙΠΛΟΥ ΥΒΡΙΔΙΟΥ ΣΤΟΝ S. cerevisiae (1989, Fields & Song)
Βασίζεται στο ότι δομικά & λειτουργικά διακριτές περιοχές (domains) μιας πρωτεΐνης μπορούν
να «συναρμολογηθούν» λειτουργικά ακόμη και αν εκφράζονται από διαφορετικους φορείς
ΥΒΡΙΔΙΟ 1:
Πρωτεΐνη Χ – GAL4 μοτίβο
δέσμευσης DNA
ΥΒΡΙΔΙΟ 2:
Πρωτεΐνη Υ-GAL4 μοτίβο
ενεργοποίησης μεταγραφής.
Εάν Χ-Υ σχηματίσουν σύμπλοκο, τα
δύο μοτίβα του GAL4 έρχονται σε
επαφή-συναρμολογούνται και
ενεργοποιούν το γονίδιο
Τα Χ & Υ μπορεί να είναι γνωστά ή
άγνωστα…
Ζύμη:>1000γονίδια, >4500 αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών
ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΔΙΠΛΟΥ ΥΒΡΙΔΙΟΥ ΣΤΟΝ S. cerevisiae
THE SPLIT-UBIQUITIN MEMBRANE YEAST TWO-HYBRID SYSTEM
Fusions of ubiquitin and a target protein are
recognized and cleaved by ubiquitin-specific proteases
(UBPs) after a double glycine motif (Gly-Gly-X)
located at the C-terminus of ubiquitin. As opposed to
many other proteases, UBPs do not recognize a
specific sequence of a polypeptide chain but instead
recognize the folded ubiquitin.
Ubiquitin can be expressed in yeast as an N-terminal
half (Nub) as well as a C-terminal half (Cub). The two
halves retain their affinity for each other and
spontaneously reassemble to form the so-called splitubiquitin. If the Nub and Cub moieties are coexpressed within a single cell, the reporter protein that
is fused to the C-terminus of ubiquitin will be cleaved
off upon re-assembly of the Nub and Cub moieties into
split-ubiquitin A point mutation in the N-terminal half
of ubiquitin (NubG) completely abolishes the affinity
of the two halves for each other. As the separate NubG
and Cub parts are not recognized by ubiquitin-specific
proteases (UBPs), no cleavage of the reporter protein
takes place. The bait protein is fused to the Cub
domain followed by a reporter protein, and a prey
protein is fused to a mutated NubG domain. If bait
and prey interact, their interaction brings the NubG
and Cub domains close enough together to
reconstitute split-ubiquitin, resulting in the release of
the reporter protein (red) by the action of the UBPs.
ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ-ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
ΜΕΛΕΤΩΝΤΑΣ ΓΟΝΙΔΙΑ ΤΩΝ ΟΠΟΙΩΝ Η ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΊΝΑΙ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΗ ΓΙΑ
ΤΗΝ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ
ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΜΕΡΙΚΗΣ ΑΠΩΛΕΙΑΣ Η ΤΡΟΠΟΠΟΗΜΕΝΗΣ
ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ
ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ
Ένα μοναδικό εργαλείο για την in vivo μελέτη ενδογονιδιακών ή διαγονιδιακών
αλληλεπιδράσεων
Κατασταλτικές μεταλλαγές είναι οι μεταλλαγές που τροποποιούν ή καταστέλλουν το
αποτέλεσμα (φαινότυπο) που προκαλεί μια αρχική μεταλλαγή
Μια κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να είναι:
1.Ενδογονιδιακή
2.Διαγονιδιακή
• Οι Ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:
1.Ανaστροφή της αρχικής μεταλλαγής
2.Μεταλλαγή «Δεύτερης θέσης»
Οι μεταλλαγές δεύτερης θέσης μπορεί να είναι:
1.
Εξειδικευμένες ως προς την αρχική
μεταλλαγή (allele-specific)Υποδηλώνουν «επαφές».
2.
Μη-εξειδικευμένες ως προς την αρχική
μεταλλαγή (allele non-specific)
Υποδηλώνουν εναλλακτικούς
μηχανισμούς (by-pass)
Οι Διαγονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:
1. Σε γονίδιο παρόμοιας-εναλλακτικής λειτουργίας (by-pass)
2. Σε γονίδιο που κωδικεύει πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με την
αρχικά μεταλλαγμένη πρωτεΐνη
Μεταφραστική καταστολή
ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ
Η γενετική απομόνωση in vivo κατασταλτικών μεταλλαγών αποτελεί ισχυρή μεθοδολογία
καθορισμού περιοχών, ή συγκεκριμένων αμινοξέων, που αλληλεπιδρούν εντός της ίδιας
πρωτεΐνης (ενδογονιδιακά) ή μεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών (διαγονιδιακά). Πιο
συγκεκριμένα, μία ενδογονιδιακή κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να διαχωριστεί σε
μεταλλαγή πρώτης θέσης (first-site suppressor mutation) ή σε μεταλλαγή δεύτερης θέσης
(second-site suppressor mutation). Οι ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές πρώτης
θέσης είναι αυτές που «διορθώνουν» μία αρχική μεταλλαγή που προϋπάρχει στην πρωτεΐνη
(αναστροφή), και επομένως προσδίδουν συνήθως φαινότυπο φυσικού τύπου. Οι
ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές δεύτερης θέσης αφορούν σε ένα άλλο αμινοξύ
της ίδιας πρωτεΐνης. Η δεύτερη κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να τροποποιεί τη δομή ή
τη λειτουργία της πρωτεΐνης είτε αλληλεπιδρώντας άμεσα με το αρχικά μεταλλαγμένο
αμινοξύ, είτε παρακάμπτοντας το πρόβλημα που είχε δημιουργήσει η αρχική μεταλλαγή.
Μέσω των κατασταλτικών μεταλλαγών αποκαλύπτονται αμινοξέα που αλληλεπιδρούν ή
βρίσκονται «κοντά» στο ενεργό κέντρο ή σε άλλες λειτουργικές περιοχές της πρωτεΐνης.
Συχνά, οι κατασταλτικές μεταλλαγές δεύτερης θέσης προσδίδουν νέες ιδιότητες στην
πρωτεΐνη.
Οι διαγονιδιακές μεταλλαγές, είναι κατασταλτικές μεταλλαγές οι οποίες χαρτογραφούνται σε
ένα γονίδιο διαφορετικό από αυτό που φέρει την αρχική μεταλλαγή. Μπορεί απλά να
επαναφέρουν το φυσικό τύπο, αλλά επίσης συχνά οδηγούν σε πλειοτροπικές αλλαγές στο
κύτταρο. Μπορεί να αφορούν στην ενεργοποίηση ή την τροποποίηση ενός εναλλακτικού
ενζύμου, ή μια μεταλλαγή που «διορθώνει» την αλληλεπίδραση της αρχικά μεταλλαγμένης
πρωτεΐνης με κάποιο παράγοντα.
Περιληπτικά, κατασταλτικές μεταλλαγές είναι οι μεταλλαγές που τροποποιούν ή καταστέλλουν
το αποτέλεσμα (φαινότυπο) που προκαλεί μια αρχική μεταλλαγή.
•
•
•
Οι ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:
1.
Αναστροφή της αρχικής μεταλλαγής.
2.
Μεταλλαγή δεύτερης θέσης.
Οι μεταλλαγές δεύτερης θέσης μπορεί να είναι:
1.
Εξειδικευμένες ως προς την αρχική μεταλλαγή (allele-specific)-Υποδηλώνουν
«επαφές».
2.
Μη-εξειδικευμένες ως προς την αρχική μεταλλαγή (allele non-specific)
Υποδηλώνουν μηχανισμούς by-pass.
Οι διαγονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:
1.
Σε γονίδιο παρόμοιας-εναλλακτικής λειτουργίας.
2.
Σε γονίδιο του οποίου η μεταλλαγμένη λειτουργία έχει επιγενετικό αποτέλεσμα στην
αρχική μεταλλαγή. Πολλαπλοί μηχανισμοί by-pass.
Μεταφραστική καταστολή.
ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ
ΜΕΣΩ ΑΠΛΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΉΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
…..και με με τη βοήθεια του PCR για τις ενδογονιδιακές μεταλλαγές
ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΥΝΘΕΤΙΚΗΣ ΘΝΗΣΙΜΟΤΗΤΑ
Αναζητώντας αλληλεπιδράσεις…..
Ο S. cerevisiae ή ο A. nidulans ΣΑΝ ΠΡΟΤΥΠΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ
«ΞΕΝΩΝ» ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΠΟ ΑΝΩΤΕΡΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ
Ενα γονίδιο από οποιοδήποτε οργανισμό έχει τη δυνατότητα να εκφραστεί στους προτύπους
μύκητες εάν (i) κλωνοποιηθεί σ’ ένα υποκινητή κατάλληλο για τους μύκητες (ii) δεν έχει
ιντρόνια, δηλαδή είναι cDNA ή προέρχεται από οργανισμό που δεν έχει ιντρόνια
Η συμπλήρωση γενετικών / λειτουργικών μεταλλαγών στους μύκητες με ξένα γονίδια μπορεί
να οδηγήσει στην αναγνώριση ανάλογων γονιδίων από άλλους οργανισμούς. Δεν χρειάζεται τα
γονίδια να είναι ομόλογα
Η έκφραση φυτικών ή ζωικών γονιδίων στους μύκητες επιτρέπει την μελέτη τους με
απλούστερες τεχνικές και επιτρέπει την γενετική ανάλυση τους π.χ. Ras και άλλα ογκογονίδια,
γονίδια κυτταρικού κύκλου, γονίδια ασθενειών, γονίδια μεταφορέων
Οι μύκητες αποτελούν πρότυπα συστήματα κλωνοποίησης, αναγνώρισης και λειτουργικής
ανάλυσης γονιδίων φυτών ή ζώων.
cDNA «ξένου» γονίδιο
Ρ
Τ
ΣΥΖΕΥΚΤΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ ΣΤΟΝ S. cerevisiae
Πρότυπο σύστημα μελέτης μηχανισμών αναπτυξιακού καθορισμού συζευκτικών
τύπων και της μεταγωγής ορμονικών σημάτων κατά τη διάρκεια κυτταρικής
«συνομιλίας» πριν το σεξ
Δύο συζευκτικοί τύποι: α και a. Τρία γονίδια στη σειρά. Ένα ενεργό γονίδιο στη
μέση: ΜΑΤα και MATa. Δύο «σιωπηλά» ακριανά γονίδια: ΜΑΤα και ΜΑΤa
(«ιδιόμορφα») (HML ή HMR θέσεις)
Αντιγραφή και μετάθεση σιωπηλού γονιδίου αντίθετου τύπου στην περιοχή του
ενεργού γονιδίου ΜΑΤ οδηγεί στην ενεργοποίηση του σιωπηλού γονιδίου και την
εναλλαγή συζευκτικών τύπων. Αυτή η εναλλαγή συμβαίνει κατά την εκβλάστηση
και εγγυάται ότι το νέο κύτταρο θα είναι αντιθέτου τύπου από το πατρικό
Βασικά χαρακτηριστικά κυττάρων α και a
α: Ενεργό ΜΑΤα, ενεργοποιεί την παραγωγή της α-Φερομόνης και του υποδοχέα για
την a-Φερομόνη. Δεν σποριώνει και διασταυρώνεται με κύτταρα a.
a: Ενεργό ΜΑΤa, ενεργοποιεί την παραγωγή της a-Φερομόνης και του υποδοχέα για
την α-Φερομόνη. Δεν σποριώνει και διασταυρώνεται με κύτταρα α.
ΣΕΝΑΡΙΟ ΣΥΖΕΥΞΗΣ
Στα κύτταρα α η α-Φερομόνη παράγεται συνεχώς, διαχέεται και αναγνωρίζεται από
ειδικό υποδοχέα στα κύτταρα a. Ο υποδοχέας μεταγάγει το ορμονικό σήμα στα γονίδια
του κυττάρου ώστε η κυτταρική διαίρεση να σταματήσει στην «αρχή» της G1 φάσης.
Στη φάση αυτή τα κύτταρα a παράγουν a-Φερομόνη που με τη σειρά της διαχέεται στα
κύτταρα α, αναγνωρίζεται από ειδικό υποδοχέα και το σήμα μετάγεται στα γονίδια του
κυττάρου α. Ακολουθεί η παραγωγή μικρών εκφύσεων (γλυκοπρωτεΐνες) που
λειτουργούν σαν σωληνώσεις σύζευξης, τα κύτταρα προσκολούνται με τη βοήθεια
αγλουτινών. Ακολουθεί πλασμογαμία και καρυογαμία, δηλαδή παράγεται ένα
διπλοειδές κύτταρο
Το διπλοειδές α/a έχει ενεργά και τα δύο
ιδιόμορφα γονίδια ΜΑΤα και ΜΑΤa, τα
προϊόντα των οποίων σχηματίζουν ένα
ετεροδιμερές, την πρωτεΐνη MATα/MATa. H
λειτουργία της πρωτεΐνης αυτής καταστέλλει
γονίδια της απλοειδούς φάσης. Ετσι, εκτός
άλλων, δεν παράγονται φερομόνες και υποδοχείς,
και άλλες πρωτεΐνες αναγκαίες για την σύζευξη.
Το διπλοειδές μπορεί να συνεχίσει τη ζωή του ή
να μειωθεί και να σποριώσει. Η σπορίωση
ευνοείται από διατροφικές συνθήκες «πείνας».
Τα ιδιόμορφα ΜΑΤα και ΜΑΤa είναι ρυθμιστικά μεταγραφικά
γονίδια που ελέγχουν την έκφραση πολλαπλών γονιδίων που
καθορίζουν τον τύπο του κυττάρου. Αλλά και γονιδίων ασχέτων με τη
σύζευξη, όπως το ρετρομεταθετό στοιχείο Ty1 και άλλα που
εμπλέκονται στον σχηματισμό ψευδομυκηλίου.
Τα ιδιόμορφα ΜΑΤα και MATa είναι διπλά γονίδια που κωδικεύουν
τις πρωτεΐνες
α1 και α2 και a1 και a2
Το σενάριο αυτό είναι από τα απλούστερα. Στους ετεροθαλλικούς
νηματοειδείς μύκητες υπάρχουν πολυπλοκότερες διαδικασίες που σε
πολλές περιπτώσεις εμπλέκουν δεκάδες ιδιόμορφων με εκατοντάδες
συνδυασμούς, άλλοι των οποίων είναι γόνιμοι και άλλοι όχι.
Author
Document
Category
Uncategorized
Views
0
File Size
1 006 KB
Tags
1/--pages
Report inappropriate content