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4A MED mer 29 ottobr..

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Le molecole di RNA hanno strutture
che non corrispondono a
dei minimi di energia potenziale
La formazione della loro struttura
tridimensionale è guidata
Anche la loro degradazione è
guidata
Nell’exosoma hanno un ruolo fondamentale gli
enzimi :
• Polinucleotide fosforilasi (PNP), che hanno
attività di RNAsi
• RNA elicasi, che sono compatti macchinari
proteici​​ in grado di sfruttare l'energia liberata
dall’idrolisi dell’ATP per rimodellare in modo
dinamico le strutture tridimensionali di RNA
/e di complessi RNA/proteina
Il complesso PM/Scl (spesso chiamato semplicemente
exosoma) è un complesso multiproteico in grado di degradare
diversi tipi di RNA che è presente negli archea e negli eucarioti,
mentre nei batteri svolge funzioni analoghe un complesso più
semplice chiamato degradosoma.
Il core dell’exosoma è costituito da una struttura ad anello a
sei membri a cui sono attaccate altre proteine​​. Nelle cellule
eucarioti, gli exosomi si trovano nel citoplasma, nel nucleo e
soprattutto nel nucleolo. La loro attività è controllata da varie
proteine presenti in quei compartimenti cellulari.
L’exosoma degli eucarioti non degrada soltanto a partire
dall’estremità 3’, ma anche in siti all'interno della molecola di
RNA.
La sua struttura ricorda il complesso proteico che ​degrada le
proteine, il proteasoma.
J Biomed Sci. 2007 Jul;14(4):523-532. Lin-Chao et al. - The PNPase, exosome and RNA helicases as the
building components of evolutionarily-conserved RNA degradation machines
Nature 511, 435–439 (24 July 2014) doi:10.1038/nature13406. Wasmuth et al. - Structure of an Rrp6–RNA
exosome complex bound to poly(A) RNA
Le proteine componenti d​ell’exosoma sono il bersaglio di :
• autoanticorpi nei pazienti con specifiche malattie
autoimmuni specifiche (specialmente la PM/Scl overlap
syndrome)
• alcuni chemioterapici antitumorali funzionano bloccando
l'attività degli exosomi
• inoltre, mutazioni nella proteina 3 dell’exosoma causa
l’ipoplasia ponto-cerebellare e la spinal motor neuron disease
Exosoma archea (a sinistra) ed eucariotico (a destra).
La numerazione delle proteine mostra che l’exosoma archea contiene solo
quattro ​proteine diverse, mentre l’exosoma eucariotico ha la stessa struttura
tridimensionale ma contiene nove proteine diverse​​.
Le RNA elicasi, componenti fondamentali di
complessi macromolecolari (come gli exosomi),
partecipano praticamente a tutti i processi
associati con l'espressione dell'informazione
genetica in quanto controllano :
• la struttura tridimensionale degli RNA
• la maturazione e la qualità degli RNA
• la degradazione degli RNA
• la formazione di complessi RNA/proteine
RNA Biol. 2013 Jan;10(1):56-70. doi: 10.4161/rna.22270. Hardwick & Luisi - Rarely at rest: RNA helicases
and their busy contributions to RNA degradation, regulation and quality control
La miriade di processi biologici
della vita non sono mai fermi
Ad esempio il controllo dell'espressione genica è dinamico:
il pool dei trascritti è in continuo mutamento e risponde in
modo sensibile alle variazioni del bilanciamento tra sintesi
e degradazione.
In tutti i regni della vita la regolazione della degradazione dei
trascritti è un meccanismo fondamentale dello sviluppo e
della risposta alle diverse condizioni ambientali.
Le RNA elicasi manipolano la struttura dell'RNA, rimodellano i
complessi ribonucleoproteici, e collaborano con una varietà di
ribonucleasi (RNasi).
Le RNA elicasi A condividono il motivo
“DExD/H box" che è presente, oltre che in
archea ed eucarioti, anche nei batteri.
Il mantenimento nel
corso dell’evoluzione
di complessi proteici
mette in evidenza il
ruolo fondamentale
della loro attività per
soddisfare le esigenze
cellulari di controllo
dinamico del
metabolismo dell'RNA.
RNA Biol. 2013 Jan;10(1):56-70. doi: 10.4161/rna.22270. Hardwick & Luisi - Rarely at rest: RNA helicases
and their busy contributions to RNA degradation, regulation and quality control
Schema di interazione tra
RNA elicasi e RNAasi nel
degradosoma.
(in alto) particolare di un
degradosoma a riposo
(al centro) cattura di un RNA
strutturato e legame di ATP
(in basso) svolgimento
dell’RNA che viene processato
dalla RNAsi e/o idrolizzato
dalla PNPasi.
L’Angiogenina (ANG), nota anche come ribonucleasi 5 (RNAsi
5), è un membro di una superfamiglia di RNAsi secrete,
specifica per i vertebrati.
ANG era stata originariamente identificata come un fattore
angiogenico dei tumori, ma la sua attività biologica è stata
estesa ad indurre l’angiogenesi per stimolare la proliferazione
cellulare e, più recentemente, per promuovere la sopravvivenza
delle cellule.
In condizioni di crescita, ANG viene traslocata nel nucleo
dove si accumula nel nucleolo e stimola la trascrizione dell'RNA
ribosomiale (rRNA), facilitando così la crescita e la
proliferazione cellulare.
J Cell Physiol. 2012 Jul;227(7):2822-6. doi: 10.1002/jcp.23051. Li & Hu - Emerging role of angiogenin in
stress response and cell survival under adverse conditions
In condizioni di stress, ANG si accumula nei compartimenti
citoplasmatici e modula la produzione di tiRNA, una nuova
classe di piccoli RNA che è derivata dai tRNA ed è indotta dallo
stress. I tiRNA sopprimono globalmente la traduzione delle
proteine ​inibendo sia la traduzione cap-dipendente che capindipendente, compresa quella mediata da IRES deboli. Non
viene invece interessata la traduzione mediata da forti IRES, un
meccanismo spesso utilizzato dai geni anti-apoptotici che
inducono la sopravvivenza.
Così, la riprogrammazione della sintesi da parte dei tiRNA
mediata da ANG​, consente di risparmiare energia per
l’anabolismo e promuovere la sopravvivenza delle cellule.
Questa funzione di ANG recentemente scoperta presenta un
nuovo meccanismo d'azione nella regolazione della crescita e
della sopravvivenza cellulare.
J Cell Physiol. 2012 Jul;227(7):2822-6. doi: 10.1002/jcp.23051. Li & Hu - Emerging role of angiogenin in
stress response and cell survival under adverse conditions
Meccanismo d'azione di ANG.
I segnali di crescita stimolano la
traslocazione nucleare di ANG,
mentre i segnali di stress
dirigono ANG ai granuli di
stress. Entrambi i percorsi sono
mediati da un recettore di
membrana che ancora non è
stato identificato. Nel nucleo
ANG stimola la trascrizione
degli rRNA, consentendo la
biogenesi dei ribosomi e quindi
la crescita e la pproliferazione
cellulare. In condizioni di stress,
ANG non viene traslocato nel
nucleo, ma è piuttosto
accumulato in compartimenti
citoplasmatici quali i granuli di
stress, in cui si media la
produzione di tiRNA,
reprogramming la sintesi
proteica ​e promuovendo la
sopravvivenza.
Il Citosol è quella componente liquida colloidale che si trova
all’interno della cellula e che circonda gli organuli subcellulari
(nucleo, reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi, lisosomi,
mitocondri, ecc.).
Il Citosol è la parte della cellula dove si trovano i meccanismi
molecolari per la regolazione del ciclo cellulare, per la
regolazione della trascrizione e per l’assemblaggio
dell’apoptosoma che avvierà la cellula all’autodistruzione
Nel Citosol si realizza la glicolisi, il ciclo dei pentosi fosfati, la
sintesi dei desossiribonucleotidi, la formazione degli
amminoacil-tRNA, la sintesi proteica, la trasduzione del
segnale nel corso della comunicazione tra cellule, ecc.
H
glicina
alanina
prolina
C
C
C
N
C H2
cisteina
istidina
C
N
C H2
triptofano
La corretta sintesi della proteina dipende dal fatto che ogni tRNA leghi
l’amminoacido corrispondente alla tripletta che lo codifica
Le Amminoacil-tRNA sintetasi sono veri e
propri fossili molecolari, enzimi
antichi miliardi di anni
In ogni cellula è presente almeno
una diversa Amminoacil-tRNA
sintetasi, una per ogni amminoacido
Ogni Amminoacil-tRNA sintetasi
riconosce in modo specifico
sia l’amminoacido che il suo
corrispondente tRNA
La maggior parte degli elementi di
riconoscimento del tRNA sono nella
regione delle estremità 5’ e 3’ (che
contiene la sequenza CCA) e nel
lobo inferiore che contiene la
sequenza detta anticodone
2
|
H
|
CH3
|
CH
CH3
GLICINA
ALANINA
CH3
VALINA
|
CH
CH3 CH2
|
CH3
ISOLEUCINA
La cellula eucariote ha ben oltre 20
differenti amminoacil-tRNA sintetasi
La reazione catalizzata è legare,
con un legame ad alta energia, il
giusto amminoacido al giusto
tRNA con l’anticodone usando
l’energia della molecola di ATP
Durante la sintesi proteica, l’idrolisi
del legame ad alta energia tra
amminoacido e tRNA è sufficiente
per formare il legame peptidico
AMMINOACIL-tRNA-SINTETASI
AMMINOACIDO + ATP + tRNA
AMMINOACIL-tRNA + AMP + PiPi
STADIO VELOCE : amminoacido + ATP
STADIO LENTO:
amminoacil-AMP + tRNA
oppure
stato di transizione
amminoacil-AMP + PiPi
amminoacil-tRNA + AMP
oppure
amminoacido + tRNA + AMP
• Lo stato di transizione rappresenta
quel momento della reazione in cui
i nuovi legami chimici si stanno
formando ed i vecchi legami chimici
si stanno rompendo
• Se tutto è perfetto, la reazione va verso
destra con la formazione dei prodotti;
bastano però differenze infinitesime e la
reazione torna indietro verso sinistra
Esistono due classi di Amminoacil-tRNA sintetasi:
• gli enzimi della classe I, generalmente monomerici,
legano alcuni amminoacidi (Arg, Cys, Gln, Glu, Ile, Leu,
Met, Trp, Tyr, Val) ai corrispondenti tRNA in posizione 2’
• gli enzimi della classe II,
dimerici, legano gli altri amminoacidi (Ala, Asn, Asp,
Gly, His, Lys, Phe, Ser, Pro, Thr) ai corrispondenti
tRNA in posizione 3’
• gli enzimi della classe I e
della classe II si legano in
modo diverso ai loro
corrispondenti tRNA
Ribosoma
Nota:
- le dimensioni dei ribosomi degli Archea sono simili a quelle degli Eubatteri;
- sembra che sia funzionante il ribosoma chimerico Archea/Eucariote,
ma non il ribosoma chimerico Eubattere/Eucariote
- i ribosomi dei mitocondri e dei cloroplasti sono simili a quelli dei
procarioti ma più piccoli;
L’assemblaggio del ribosoma eucariotico è uno
spettacolare esempio di processo altamente dinamico
e regolato. Le subunità ribosomali minore (40S) e
maggiore (60S) sono il risultato dell’assemblaggio di
circa 80 proteine ribosomali e quattro diversi rRNA.
La costruzione e la localizzazione intracellulare delle
particelle pre-ribosomali coinvolgono una moltitudine
di fattori transitoriamente associati ed enzimi che
consumano energia in oltre 50 step, fattori di trasporto
(come Bud20) che viaggiano con le particelle
ribosomali pre-60S per raggiungere il citoplasma
dove vengono rilasciati prima dell’ inizio della
traduzione.
Targeted proteomics reveals compositional dynamics of 60S pre-ribosomes after nuclear export- Mol Syst Biol.
2012;8:628. doi: 10.1038/msb.2012.63 - Altvater et al.
Oltre 200 fattori non-ribosomali coinvolti in assemblaggio,
maturazione e trasporto intracellulare delle particelle pre-40S
e pre-60S mentre viaggiano dal nucleolo al citoplasma
I pre-rRNA prodotti dalla Pol I
subiscono modificazioni
co-trascrizionali nel
nucleolo dove avviene
l’assemblaggio con le
proteine ribosomali.
Le particelle pre-60S
incontrano ~ 100 fattori
mentre viaggiano verso il complesso del poro nucleare
(NPC) seguitando a subire variazioni della composizione; al
contrario, le particelle pre-40S subiscono un minor numero di
modificazioni mentre viaggiano verso gli NPC
Targeted proteomics reveals compositional dynamics of 60S pre-ribosomes after nuclear export- Mol Syst Biol.
2012;8:628. doi: 10.1038/msb.2012.63 - Altvater et al.
La maturazione finale delle particelle pre-40S e pre60S avviene nel citoplasma dove arrivano trasportate
separatamente agli NPC da varie esportine
NegIi step finali di maturazione si ha rilascio dei
fattori di trasporto e non, assemblaggio delle proteine
ribosomali​​ mancanti ed il completamento della
maturazione dei pre-rRNA
Questi passaggi sono fondamentali perché un
mancato rilascio e riciclo dei fattori porta alla loro
deplezione nel nucleolo con conseguente
compromissione dell’assemblaggio e produzione di
ulteriori subunità ribosomali
Targeted proteomics reveals compositional dynamics of 60S pre-ribosomes after nuclear export- Mol Syst Biol.
2012;8:628. doi: 10.1038/msb.2012.63 - Altvater et al.
• Il ribosoma dei batteri
è costituito da una subunità
maggiore 50S ed una
subunità minore 30S
• Nel ribosoma sono
legati (i) una molecola
di mRNA tra le due subunità,
(ii) una molecola di tRNA con
legato l’amminoacido nel
sito A, (iii) una molecola di
tRNA con la proteina in
formazione nel sito P,
il tRNA senza
amminoacido nel sito E
S = unità Svedberg
Ribosoma eucariotico
La subunità minore possiede una cavità per ospitare
l’mRNA che interagisce con il suo rRNA
Le molecole di tRNA sono ospitate in una cavità che si
forma tra le subunità minore e maggiore
immagine della
subunità minore di
un ribosoma di
Archea:
rRNA in grigio,
proteine colorate
Nella subunità maggiore le molecole di tRNA sono ospitate in
una cavità che si forma con la subunità minore
Nella regione dove avviene
la formazione del legame
peptidico non ci sono
proteine
La proteina in sintesi esce da
un tunnel formato da rRNA e
da proteine ribosomali
Le proteine sono disposte
sulla superficie con qualche
motivo che entra all’interno
Per iniziare la sintesi proteica nei batteri:
• i fattori di inizio (IF1) legano la
subunità minore
• il tRNA contenente la formil-metionina
(fMet) si lega al sito P
• altre proteine (IF2 e IF3) assemblano
la subunità maggiore utilizzando
l’energia liberata dall’idrolisi del GTP
• i ribosomi si legano in qualsiasi
punto dell’mRNA
• l’AUG di inizio di ogni sequenza da
tradurre è preceduto dalle sequenze di
Shine e Dalgarno che attivano la
subunità minore che si fermerà al primo
AUG che successivamente incontrerà
Negli eucarioti, l’inizio della traduzione è più complesso perché numerosi
fattori guidano il reclutamento della subunità minore e la scansione di un
mRNA, la selezione di un tRNAmet iniziatore, l’assemblaggio della subunità
maggiore per formare il ribosoma 80S
Il tRNAmet iniziatore è legato da eIF2-GTP (eukaryotic Initiation Factors) che
lo posiziona nella subunità ribosomiale 40S. A questo punto intervengono
eIF1, eIF1A, eIF3 ed eIF5 per formare il complesso di pre-inizio 43S che si
lega al cap al 5’ di un mRNA guidato da eIF4F ed eIF3 per iniziare la
scansione di un mRNA fino a trovare il primo AUG
Raggiunto il primo AUG, la scansione si ferma e l’energia liberata dall’idrolisi
del GTP da parte di eIF1 consente di fissare il tRNAmet iniziatore all’AUG
ed innesca la dissociazione di eIF1 e di eIF2-GDP
Il successivo assemblaggio della subunità maggiore 60S è facilitato da eIF5B
che idrolizza GTP e si dissocia dalla subunità minore 40S insieme ad
eIF1A, lasciando il ribosoma posizionato e pronto per la fase di
elongazione
The initiation of mammalian protein synthesis and mRNA scanning mechanism - Nature. 2013 Aug 15;500(7462):307-11.
doi: 10.1038/nature12355 - Lomakin IB, Steitz TA.
Nelle cellule di lievito in crescita esponenziale, un forte controllo è esercitato
dai fattori di allungamento (eEF1A, eEF2, eEF3). Altri due forti punti di
controllo sono il reclutamento di mRNA e dei tRNA per la subunità
ribosomale 40S (eIF4F, eIF2) e per la terminazione (ErF1, Dbp5)
Ci sono molti fattori che promuovono l'efficienza della scansione di mRNA
nella regione 5‘-untranslated (eIF1, eIF1A, Ded1, eIF2B, eIF3 e eIF5) per
permettere alla cellula di operare una rapida scansione di 5’UTR
particolarmente lunghi
La sintesi proteica è il processo cellulare che consuma più energia
E’ stato stimato che in una singola cellula di Saccharomyces cerevisiae
sono sintetizzate con grande precisione fino a 13.000 proteine al secondo
Il controllo preciso della traduzione è alla base della crescita e della
competitività dei viventi, quindi le proprietà quantitative del macchinario di
traduzione e l'evoluzione delle sue componenti molecolari sono strettamente
accoppiati
An in vivo control map for the eukaryotic mRNA translation machinery - Mol Syst Biol. 2013;9:635. doi:
10.1038/msb.2012.73 - Firczuk et al.
mRNA maturo (dopo splicing ed eventuale
editing) che può essere esportato nel
citoplasma per essere tradotto in proteina
La coda di poli-A all'estremità 3' dell’mRNA forma
un anello chiuso con il cap al 5’ a cui si lega il PIC
(pre-initiation complex) all’inizio della traduzione.
L'integrità di questo anello di mRNA circolarizzato
è un bersaglio per il controllo della traduzione
Negli eucarioti, l’inizio è la fase più regolata della traduzione:
- formazione del PIC, con la subunità ribosomiale 40S e vari
fattori di inizio associati per legare l’mRNA
- una volta legato l’mRNA, il PIC scansiona l'mRNA per
individuare il codone di inizio AUG, il cui riconoscimento innesca
una serie di eventi che portano ad assemblare la subunità
maggiore ed alla formazione del complesso d'inizio 80S. La
complessità del percorso di inizio della traduzione offre molte
opportunità di regolazione
Translational control decrypted - Nature Structural & Molecular Biology, Focus on Translational Control, Editorial, vol. 19, 559, 2012 - (http://www.nature.com/nsmb/focus/translation/index.html)
- (http://www.nature.com/nsmb/focus/translation/library/index.html)
Un controllo traduzionale mRNA-specifico è
determinato da elementi regolatori cis-acting, presenti
essenzialmente nella regione 3' non tradotta (3'UTR)
dell’mRNA.
Questi elementi regolatori assemblano una miriade di
fattori regolatori che modulano la lunghezza della
coda di poli-A che, a sua volta, definisce la quantità di
traduzione dell'mRNA.
Questo meccanismo è importante per modulare
l'espressione genica in processi fisiologicamente
importanti, come l'infiammazione, l'apprendimento e
l'acquisizione della memoria, e lo sviluppo embrionale
Translational control decrypted - Nature Structural & Molecular Biology, Focus on Translational Control, Editorial, vol. 19, 559, 2012 - (http://www.nature.com/nsmb/focus/translation/index.html)
- (http://www.nature.com/nsmb/focus/translation/library/index.html)
In arancione un membro di una superfamiglia di GTPasi che regolano un gran
numero di funzioni nella cellula eucariotica.
Gli enzimi di questa superfamiglia condividono lo stesso meccanismo:
1) passano da una
conformazione
all’altra scambiando
GDP con GTP
quando interagiscono
con un target
predeterminato,
in questo caso tRNA-aa
2) idrolizzano il GTP
(liberando solo il
fosfato e
trattenendo nel
sito attivo il
prodotto GDP) quando interagiscono con un target predeterminato, in questo
caso il ribosoma
Nella cellula esistono particolari GTPasi che appartengono
ad una grande superfamiglia genica, due classi e numerose
famiglie che presentano forti omologie nonostante che le
sequenze possano essere abbastanza differenti.
Questi enzimi condividono lo stesso mecccanismo tipico ed
inusuale:
• idrolizzano il substrato GTP solo quando interagiscono con
un opportuno bersaglio, diverso per i vari membri di ogni
sottofamiglia
• solo il fosfato prodotto dalla reazione di idrolisi viene
liberato, il GDP viene invece mantenuto nel sito attivo
• solo a seguito di una interazione molecolare con un
bersaglio diverso per i vari membri della famiglia, l’enzima è
in grado di liberare il prodotto GDP ed assumere la forma
giusta per legare una nuova molecola del substrato GTP
• possono esistere in almeno due conformazioni differenti
G protein-GTP (active)
GDP
GDP Exchange
Factor (GEF)
GEF
GTP
GAP
GTPase Activating
Protein (GAP)
Pi
G protein-GDP (inactive)
due conformazioni differenti = due differenti interazioni
si comportano come una specie di interruttore ON/OFF
Famiglie di piccole GTPasi e loro ruoli:
• Proteine G (eterotrimeri a, b, g): signalling
• IF-2, EF-Tu, EF-G, RF-3: Initiation Factors,
Elongation Factors, Releasing Factors
• Ras: signalling dei fattori di crescita
• Rab: indirizzamento e corretta fusione di vescicole
• ARF: gemmazione di vescicole rivestite da proteine
• Ran: trasporto di proteine dentro e fuori dal nucleo
• Rho: Regolazione assemblaggio del citoscheletro
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