Le proteine del latte fonte di biopeptidi per la salute umana Umberto Bernabucci e Alessandro Nardone ( [email protected]; [email protected] ) Dipartimento di scienze e tecnologie per l’Agricoltura, le Foreste, la Natura e l’Energia (DAFNE) Università della Tuscia, Viterbo, Italia 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Indice 1. Le proteine del latte 2. Biopeptidi: cosa sono, dove si trovano, come si formano 3. Funzionalità e significato biologico a. Leganti i minerali b. Oppioidi c. Immunomodulatori e antimicrobici d. Antitrombotici e ipotensivi 4. Possibili utilizzazioni 5. Sviluppi futuri 6. Conclusioni 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Le proteine del latte 95% circa sintetizzate dalla mammella il resto di origine ematica La#e bovino g/l % PT Proteine Totali 34,0 100 Caseine 27,0 80 αs-‐caseina 13,5 40,0 β-‐caseina 7,9 23,2 Κ-‐caseina 4,5 13,2 ϒ-‐caseina 1,1 3,2 Siero proteine 4-‐5 11,8-‐14,7 α-‐la7oalbumina 1,2 3,5 β-‐la7oglobulina 3,2 9,4 Origine emaCca 2-‐3 5,9-‐8,8 Sieroalbumina 0,4 1,2 Immunoglobuline 0,2 0,6 La7oferrina 0,9 2,6 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Indice 1. Le proteine del latte 2. Biopeptidi: come si formano, cosa sono, dove si trovano 3. Funzionalità e significato biologico a. Leganti i minerali b. Oppioidi c. Immunomodulatori e antimicrobici d. Antitrombotici e ipotensivi 4. Possibili utilizzazioni 5. Sviluppi futuri 6. Conclusioni 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Formazione di pepDdi bioaFvi del la7e DigesDone gastro-‐ intesDnale Idrolisi enzimaDca Produzione e stagionatura dei formaggi Fermentazione microbica LaF fermentaD PepCdi bioaGvi “sono specifici frammenD di proteine che hanno un impa7o posiDvo sulle funzioni dell’organismo ed in ulDmo influenzano la salute” (Ki7s e Weiler, 2003) 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 been made in recent years to elucidate the biochemical and genetic characterization of these enzymes. The fact that the activities of peptidases are affected by growth conditions makes it possible to manipulate the formation of peptides digestion of the above samples with pepsin and try resulted in the release of several strong ACE-inhibi peptides derived primarily from as1-casein and b-ca Gobbetti, Ferranti, Smacchi, Goffredi, and Addeo (2 BiopepDdi rilasciaD da microrganismi Korhonen e Pihlanto, 2006, IDJ. Table 1 Examples of bioactive peptides released from milk proteins by various microorganisms and microbial enzymes Micro-organisms used Precursor proteina Peptide sequence Bioactivity References Lactobacillus helveticus, Saccharomyces cerevisiae b-cn, k-cn Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro ACE inhibitory, antihypertensive Lactobacillus GG enzymes+pepsin & trypsin Lb. helveticus CP90 proteinase Lb. helveticus CPN 4 Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus SS1 Lactococcus lactis subsp. cremoris FT4 Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus IFO13953 Lb. rhamnosus +digestion with pepsin and Corolase PP b-cn, as1-cn Tyr-Pro-Phe-Pro, Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-GlnArg, Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-(Glu) Tyr-Pro Many fragments Opioid, ACE inhibitory, immunostimulatory ACE inhibitory ACE inhibitory ACE inhibitory Nakamura et al. (1995 Nakamura, Yamamot Sakai, and Takano (1 Rokka et al. (1997) Antioxidative Kudoh et al. (2001) ACE inhibitory Herna´ndez-Ledesma e (2004a) b-cn Ala-Arg-His-Pro-His-Pro-His-Leu-Ser-PheMet Asp-Lys-Ile-His-Pro-Phe, Tyr-Gln-Glu-ProVal-Leu, Val-Lys-Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys Ser-Lys-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly Pro-Ile Antioxidative ACE inhibitory Ashar and Chand (20 b-cn Ser-Lys-Val-Tyr-Pro ACE inhibitory Ashar and Chand (20 Skim milk hydrolysate Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro ACE inhibitory Pan et al. (2004) Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus Streptococcus thermophilus+Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis Lb. helveticus ICM 1004 cellfree extract a b-cn Whey proteins b-cn, k-cn k-cn b-cn Abbreviations: cn ¼ casein, ACE ¼ angiotensin I-converting enzyme. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Maeno et al. (1996) Yamamoto et al. (199 Gobbetti et al. (2000) ARTICLE IN PRESS 950 H. Korhonen, A. / International Dairy Journal 16 (2006) 945–960 BiopepDdi idenDficaD in Pihlanto prodoF laFero caseari Korhonen e Pihlanto, 2006, IDJ. Table 2 Bioactive peptides identified in fermented milk products Product Formaggi Cheese type Parmigiano–Reggiano Cheddar Italian varieties: Mozzarella, Crescenza, Italico, Gorgonzola Gouda Festivo Emmental Manchego Emmental Fermented milks Sour milk Yoghurt Dahi a Examples of identified bioactive peptidesa Bioactivity References b-cn f(8–16), f(58–77), as2-cn f(83–33) as1- and b-casein fragments b-cn f(58–72) Phosphopeptides, precursor of bcasomorphin Several phosphopeptides ACE inhibitory Addeo et al. (1992) as1-cn f(1–9), b-cn f(60–68) as1-cn f(1–9), f(1–7), f(1–6) as1- and b-casein fragments ACE inhibitory ACE inhibitory Immunostimulatory, several phosphopeptides, antimicrobial ACE inhibitory Saito et al. (2000) Ryha¨nen et al. (200 Gagnaire et al. (200 ACE inhibitory Parrot et al. (2003) Antihypertensive Nakamura et al. (1 Weak ACE-inhibitory ACE inhibitory Meisel et al. (1997) Ashar and Chand ( Ovine as1-, as2- and b-casein fragments Active peptides not identified b-cn f(74–76, f(84–86), k-cn LaF fermentaD f(108–111) Active peptides not identified Ser-Lys-Val-Tyr-Pro Singh et al. (1997) Smacchi and Gobb Gomez-Ruiz et al. ( Abbreviations: as1-cn ¼ as1-casein, b-cn ¼ b-casein, k-cn ¼ k-casein. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 but starts to decline when proteolysis exceeds a certain level. Accordingly, ACE-inhibitory activity was low in products having a low degree of proteolysis, such as of plasmin on b- and as2-caseins, two other seem to be involved in the hydrolysis of a Emmental cheese: cathepsin D originating fro BiopepDdi isolaD da idrolizzaD proteici di caseine e proteine del siero Urista et al., 2011, Food Sci. Tech. Int. Table 1. Peptides isolated from proteins hydrolysate of casein and whey of milk Downloaded from fst.sagepub.com at UPC (CSIC) on September 15, 2011 Protein source Enzymes/microorganisms Peptide sequence Biological–physiological activity References b-Lg, a-La Trypsin ACE inhibitory Pihlanto-Leppa ¨la ¨ et al. (2000 Na-Casein, b-casein, B-Lg, a-La as2-Casein Pepsin, trypsin, K-proteinase, thermolysin LDAQSAPLR, VFK, VGINXW, LAHK LYQQP ACE inhibitory Otte et al. (2007c) Lactobacillus different LKKISQYYQKFAWPQYLKT Antibacterial AAHPHPHLSPM Antioxidative ALIHPP, TGGVL, VLGAMAPL SLVTPPPGPI SLVTP ACE inhibitory Antioxidative ACE inhibitory ACE inhibitory b-Casein a-Casein b-Lg Lactobacillus delbrueckii bulgaricus IFO13953 Lactobacillus rhamnosus, pepsin and corolase PP Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus þ Lactococcus lactis biovar diacetylactis Proteinase from E. faecalis Trypsin Thermolysin ´ pez-Expo ´ sito and Recio Lo (2006) Kudoh et al. (2001) LHLPLP PPVAPPPVPGT VTP, VTPPPG, LLP ACE inhibitory ACE inhibitory ACE inhibitory b-Casein Na-casein Na-casein Na-casein Whey proteins b-Lg Pepsin Alcalase Enzyme culture of bacterium and plants Alcalase Alcalase N-proteinase Not mentioned CPP Not mentioned PPGIA, PLPLL ACE inhibitory Antioxidative Antioxidative ACE inhibitory Antioxidative ACE inhibitory k-Casein b-Lg b-Casein b-Casein SAPLVT Notes: ACE, angiotensin, Lg, Lactoglobulin and La, lactoalbumin. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 ´ndez-Ledesma et al. Herna (2002) Ashar and Chand (2004) Gobbetti et al. (2000) ´ s et al. (2007) Quiro Townsend et al. (2004) ´ndez-Ledesma et al. Herna (2002) Miguel et al. (2009) Kim et al. (2007) Phelan et al. (2009b) Mao et al. (2007) Peng et al. (2009) Ortiz et al. (2009) 306 Indice 1. Le proteine del latte 2. Biopeptidi: come si formano, cosa sono, dove si trovano 3. Funzionalità e significato biologico a. Leganti i minerali b. Oppioidi c. Antimicrobici e Immunomodulatori d. Antitrombotici e ipotensivi 4. Possibili utilizzazioni 5. Sviluppi futuri 6. Conclusioni 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Funzione ed effe7o sulla salute di biopepDdi del la7e Controllo peso corporeo Depressione, memoria, controllo dello stress, insonnia Sistema cardiovascolare Metabolismo tessuto osseo InducenD sazietà GlicomacropepDde Oppioidi ACE-‐Inibitori AnDtromboDci AnDcolesterolemici AnDossidanD LeganD il Ca La7oferricina Casomorfine e altri oppiodi PepDdi bioaFvi del la7e Immunomodulatori GlicomacropepDde Citomodulatori AnDmicrobici InducenD sazietà Immunomodulatori GlicomacropepDde Oppioidi Difese immunitarie Modulazione tra7o gastrointesDnale AnDmicrobici LeganD il Ca Prevenzione carie 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 PepDdi leganD i minerali a. Biodisponibilità di Ca++ e altri elemenR b. AnRcariogeneRci Derivano principalmente dalla α-‐ e β-‐CN: caseinofosfopep*di (CPPs) Cara7erizzaD da sequenza di residui di fosfo-‐serina e acido glutammico -‐Ser(P)-‐Ser(P)-‐Ser(P)-‐Glu-‐Glu-‐ CPPs stabilizzano il fosfato di calcio amorfo e solubilizzano il Ca++ Abilità chelanC i macro-‐ e oligoelemenC (Ca, Mg, Fe, Zn, Cr, Co, Se; Meisel, 1998) αs2-‐CN > αs1-‐CN > β-‐CN > k-‐CN 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 PepDdi leganD i minerali a. Biodisponibilità di Ca++ e altri elemenR b. AnRcariogeneRci Esempio di CPPs derivaD da digesDone enzimaDca di αs2-‐ αs1-‐ e β-‐CN Caseina β β β β αs1 αs1 αs2 Peptide ƒ(1-‐25)4P ƒ(1-‐25)4P ƒ(1-‐28)4P ƒ(1-‐29)4P ƒ(35-‐79)4P ƒ(59-‐79)8P ƒ(1-‐21)5P Enzima Tripsina Pepsina e Tripsina Tripsina Tripsina Tripsina Enzimi gastro-‐intesDnali Tripsina Fonte In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro Ileo di ra7o In vitro 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 PepDdi leganD i minerali a. Biodisponibilità di Ca++ e altri elemenR b. AnRcariogeneRci DaD contrastanD sono riportaD riguardo agli effeF su: assorbimento e bilancio del Ca e sul metabolismo del tessuto osseo in soggeF giovani e in salute EffeF posiDvi su: In vivo: Donne nella post-‐menopausa In vitro: Differenziazione, crescita e mineralizzazione osteoblasD (Tulipano et al., 2010) Migliorano: L’assorbimento del Fe dello Zn (Hansen et al., 1997; Meisel e Bockelman, 1999; Bouhallab e Bouglé, 2004) 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 PepDdi leganD i minerali a. Biodisponibilità di Ca++ e altri elemenR b. AnRcariogeneRci I CPPs prevengono la carie promuovendo la ricalcificazione e modulando la demineralizzazione dello smalto dentale. CPPs in presenza di Ca3(PO4)2-‐amorfo colloidale: -‐ Azione anDcariogeneDca in vitro, ex vivo ed in vivo in raF e uomo -‐ azione mulDpla: -‐ Inibizione dei ba7eri odontopatogeni (es. Sterptococcus sobrinus, e St. mutans); -‐ Migliorando la capacità tampone della superficie dentale; -‐ Riducendo la demineralizzazione dello smalto; -‐ Promuovendo la re-‐mineralizzazione dello smalto. Proteine minori (LFe, Lisozima, Ig, laKoperossidasi) Prevengono la carie dentale inibendo i ba7eri odontopatogeni. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 AFvità oppioide Sistema nervoso BiopepDdi prodoF dalla idrolisi enzimaDca di caseine e proteine del siero hanno aFvità oppioide. Rispe7o agli oppioidi endogeni sono definiD come ‘Oppioidi ACpici’. Sono cara7erizzaD da una sequenza AA che prevede la presenza di un residuo di Tyr nel N-‐terminale e la presenza di Phe o Tyr in posizione 3 o 4 della catena pepDdica. La lunghezza di quesD bioppeDdi va da 4 a 8 AA Il primo e più conosciuto biopepDde è la β-‐Casomorfina -‐ β-‐CN f(60-‐64) 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 AFvità oppioide Sistema nervoso BiopepDdi oppioidi agonisC: azione su specifici rece7ori (σ, μ, κ) ed effeF fisiologici (Madureira et al., 2010, JDS). INVITED REVIEW: WHEY BIOPEPTIDES μ σ Tyr Tyr X1 X1 X2 Phe X2 Phe Comportamento emozionale MoDlità intesDnale Comportamento emozionale 445 β-‐casomorfina (β-‐CN) α-‐la7orfina (α-‐Lab) β-‐la7orfina (β-‐Lgb) β-‐la7otensina (β-‐Lgb) Esorfine (αs1-‐CN) κ Tyr X1 X2 Phe Sedazione Controllo ingesDone Figure 5. Action of atypical opioid peptides onto specific receptors (σ, µ, κ) and physiological effects thereof. X1 and X2 represent generic endo amino acid residues. C-terminus yielded a peptide with even stronger bactericidal activity against the gram-negative bacteria Escherichia coli and Bordetella bronchiseptica, but a significantly reduced antibacterial capacity resulted toward B. subtilis. After a database search centered on 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Whey proteins also induce oral tolerance: β-LG (mainly) and peptides obtained from enzymatic hydrolysis of whey proteins (e.g., tryptic peptides of bovine β-LG) are able to induce oral tolerance in mice (Pecquet et al., 2000). Oral tolerance is the mucosal and systemic tides in the medium (Roufik et al., 2006); performing in vivo studies is important to confirm the true potential role of peptides for nutraceutical applications. (Meisel et al., 1997). The high concentration of negative charges of phosphate peptides makes them resistant to further proteolyAFvità oppioide sis (FitzGerald, 1998; Clare and Swaisgood, Sistema nervoso Lista di biopepDdi oppioidi agonisD e antagonisD (Tidona et al., 2009, IJAS). Table 2. Opioid milk peptides. Modified from Clare and Swaisgood (2000). Protein substrate Bio-peptide Amino acid segment Reference Exorphin f90-95, f90-96, f91-96 Loukas et al., 1983 β-Casomorphin (4,5) f51-54, f51-55 Brantl, 1984 Bovine & Human α-LA α-Lactorphin f50-53 Chiba and Yoshikawa, 1986;; Fiat and Jolles, 1989 Bovine β-Lg β-Lactorphin f102-105 Fiat et al.,1993;; Bovine αs1-CN Human β-CN Yoshikawa et al., 1986 Bovine β-CN Mofphicetin f60-63 Chang et al., 1981;; Mierke et al., 1990 Bovine & Human k-CN Casoxin A, B, C f25-34, f35-41, f57-60 Yoshikawa et al., 1986;; Chiba et al.,1989 Lactotransferrin Lactoferroxin A, B, C f318-323, f536-540, f673-679 Tani et al., 1990 Human αs1-CN Casoxin D f158-164 Yoshikawa et al., 1994 Bovine serum albumin Serorphin f399-404 Tani et al., 1994 322 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 ITAL.J.A NIM.SCI. VOL. 8, 315-340, 2009 Effe7o anDmicrobico e Immunomodulatorio Sistema immunitario Effe7o ba7ericida su Gram-‐posiDvi Effe7o ba7ericida su Gram-‐negaDvi Bacillus subRlis Escherichia coli SDmolo proliferazione linfocitaria Try-‐Gly-‐Gly Biopeptidi da α-La e β-Lg Aumento produzione di Ig (IgA, IgG) Riduzione della ipersensibilità ad anDgeni di origine alimentare Aumento produzione di IFN-‐γ modulazione secrezione citochine 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Pellegrino et al., 1999; Madureira et al., 2010 Effe7o anDmicrobico e Immunomodulatorio Sistema immunitario Effe7o ba7ericida su Gram-‐posiDvi GMP: previene adesione di ba7eri cariogenici Biopeptidi da α-, β- e k-CN Effe7o ba7ericida su Gram-‐negaDvi 1. SDmolo proliferazione linfocitaria e aumento aFvità fagocitaria dei macrofagi; 2. Try-‐Gly (k-‐CN): uDlizzato per migliorare la reazione immunitaria in pazienD affeF da AIDS; 3. Oppioidi (β-‐CN): sDmolo proliferazione linfocitaria; 4. CPP-‐III: migliora la risposta proliferaDva e la produzione di Ig; 5. GlicomacropepDde (k-‐CN): aumento proliferazione e aFvità fagocitaria. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Pellegrino et al., 1999; Tidona et al., 2009; Madureira et al., 2010 Effe7o anDmicrobico e Immunomodulatorio TIDONA et al. Table 3. Sistema immunitario Antimicrobial milk peptides. Milk peptide fragment Release protease Gram (+) activity Chymosin and Tripsin Staphylococcus aureus Sarcina Bacillus subtilis Diplococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Synthetic peptide Staphylococcus carnosus Isracidin αs1-CN (f 1-23) Chymosin and Tripsin Staphylococcus aureus Caseicin αs1-CN A (f 21-29) B (f 30-38) C (f 195-208) Synthetic peptide Synthetic peptide Synthetic peptide Kappacin k-CN (f106-169) Chymosin Casecidin κ-CN (f 17-21) αs1-CN Casocidin-I αs2-CN (f 165-203) Lactoferricin B Lactoferrin (f17-41) Listeria innocua Pepsin Streptococcus mutans Gram (-) activity Yeast and fungi* E. coli Candida albicans E. coli, E. sakazakii E. coli, E. sakazakii E. coli Bacillus E. coli 0111 Candida Listeria E. coli albicans Streptococci 0157H:7 Dermatophytes: Pellegrino e t a l., 1 999; T idona e t a l., 009; Madureira et al., 2010 Staphylococci Klebsiella 2*Cryptococcus Proteus unigulattulus Pseudomo*Penicillum 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Effe7o anDmicrobico e Immunomodulatorio Sistema immunitario Previene carie ba7eri Streptococcus mutans Gram(+) : -‐ Bacillus -‐ Listeria -‐ Streprococcus -‐ Staphylococcus Lfe f(106-169) Lfe f(265-264) Lattoferricina B Lattoferrampina Gram(-‐) : -‐ E. coli 0111 -‐ E. coli O157H:7 -‐ Klebsiella -‐ Proteus -‐ Pseudomonas -‐ Salmonella LieviD e funghi. -‐ Candida albicans -‐ Dermatophytes -‐ Penicillum pinophilum -‐ Trichophyton mentagrophytes 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Korhonen e Pihlanto, 2006; Tidona et al., 2009; Madureira et al., 2010 Effe7o anDmicrobico e Immunomodulatorio Sistema immunitario Lfe f(106-169); Lfe f(265-264) Lattoferricina B Lattoferrampina Maccanismi di azione: 1. Legame sulla superficie della cellula (E. coli; Bacillus subRlis); 2. Distruzione della membrana cellulare (ba7eri); alterazione delle cara7erisDche ultrastru7urali (funghi); 3. Rilascio di LPS con distruzione della membrana esterna; 4. Interazione con i fosfolipidi di membrana; 5. Distruzione delle funzioni essenziali della membrana, es. trasporto ioni; 6. Effe7o nel citoplasma con conseguente azione sulla membrana cellulare. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Korhonen e Pihlanto, 2006; Tidona et al., 2009; Madureira et al., 2010 Effe7o anDmicrobico e Immunomodulatorio Sistema immunitario 448 MADUREIRA ET AL. Table 5. Specific targets of antimicrobial features of lactoferricin and lactoferrampin both derived from lactoferrin hydrolysis Peptide and antimicrobial activity target Lactoferricin Gram-negative Escherichia coli O157:H7 Salmonella spp. Klebsiella pneumoniae Yersinia enterocolitica Pseudomonas aeruginosa Gram-positive Listeria monocytogenes Bacillus spp. Clostridium spp. Corynebacterium spp. Enterococcus faecalis Streptococcus spp. Yeasts Candida albicans Trichosporum cutaneum Dermatophytes Trychophyton spp. Nannizzia spp. Other filamentous fungi Aspergillus spp. Penicillium spp. Parasites Toxoplasma gondi Viruses Human cytomelogalovirus Hepatitis C virus Herpes simplex virus 1 and 2 Feline calcivirus Adenovirus Echovirus Lactoferrampin Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Candida albicans Reference Shin et al. (1998); Bellamy et al. (1992a,b); Tomita et al. (1992) Dionysius and Milne (1997) Shin et al. (1998); Bellamy et al. (1992a) Bellamy et al. (1992a) Yamauchi et al. (1993); Bellamy et al. (1992a,b) Bellamy et al. (1992b) Shin et al. (1998); Bellamy et al. (1992a) Bellamy et al. (1992a) Bellamy et al. (1992a) Bellamy et al. (1992a) Bellamy et al. (1992a) Azione antivirale della lattoferricina Bellamy et al. (1994) Viejo-Díaz et al. (2005); Bellamy et al. (1992b) Bellamy et al. (1994) Bellamy et al. (1994) Bellamy et al. (1994) Bellamy et al. (1994) Andersen et al. (2001) Ikeda et al. (2000) Andersen et al. (2001) McCann et al. (2003) di Biase et al. (2003) Pietrantoni et al. (2006) van der Kraan et al. (2004) 2004). However, no inhibitory effect was observed on The N-acylated, D-enantiomer peptide derivatives the alternative complement pathway by other 7° authors of BLFcin are believed (Wakabayashi etOal., 1999)2to Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 7obre, 014 (Mattsby-Balzer et al., 1996; Vorland et al., 1999); this possess antimicrobial activities greater than those of was explained by the capacity of BLFcin to inhibit LPS- the native peptide against both bacteria and fungi; the induced cytokine response in human monocytic cells. potent peptide, conjugated with an 11-carbon Korhonen emost Pihlanto, 2006; Tidona et al., 2009; Madureira et al., 2010 Lactoferricin exhibits a synergistic capacity with an- chain-acyl group, showed 2 to 8 times lower MIC than tifungal compounds such as azole agents (Wakabayashi BLFcin. et al., 1996). Lactoferricin also exerts antiviral activSeveral other LF-derived peptides exist (Table 5), ity (Table 5) against human cytomegalovirus and is indicating that LF hydrolysates besides LFcins may Effe7o anDtromboDco Malage cardiovascolari In sintesi l’alterazione della parete vascolare, del flusso ematico e ipercoagulabilità del sangue sono le cause principali di trombosi (arteriosa e venosa) Trombosi: condizione patologica per cui l’alterazione dei meccanismi emostatici portano alla formazione di coaguli o trombi nelle arterie, nelle vene, nei capillari o nelle cavità cardiache: Tre tipi di trombi: 1. Trombi bianchi – arterie / piastrine 2. Trombi rossi – vene / fibrina e globuli rossi 3. Trombi misti – fibrina e piastrine Inibire aggregazione delle piastrine – alterando il legame tra fibrinogeno e αIIbβ3 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Effe7o anDtromboDco Malage cardiovascolari Catena-γ del fibrinogeno e la k-CN o il suo glicomacropeptide hanno omologie di tipo funzionale e di sequenza AA. Peptidi della k-CN con sequenza simile alla catena-γ del fibrinogeno sono chiamate casopiastrine Questi pepetidi sono capaci di inibire sia la piastrine ADP-attivate sia il legame tra catena-γ del fibrinogeno e l’integrina (recettore) αIIbβ3 che si trova sulla superfice delle piastrine. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Phelan e Kerins, 2011 Funzione ipolipidemica: sensibilità insulina e ox di acidi grassi, LDL/VLDL, lipogenesi e assorbimento colesterolo View Article Online Food & Function (Howard e Udenigwe, 2013; Tulipano et al., 2014) Review PERIPHERAL TISSUES shed on 22 October 2012. Downloaded on 24/09/2014 11:14:22. Insuline sensitivity Absorbed Peptides Fig. 1 Proposed mechanisms of the hypolipidaemic functions of food protein hydrolysates and peptides in hepatocytes, adipocytes and intestinal tract. FAS, fatty acid synthase; G6PDH, glucose 6-phospahte dehydrogenase; PAP, phosphatidate phosphohydrolase; SCD, stearoyl-CoA desaturase; ACAT, acyl-CoA cholesterol acyl transferase; AdipoR2, adiponectin receptor; PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor; CPT, carnitine palmitoyltransferase; ACOX1, acyl-coenzyme A oxidase; UCP, uncoupling proteins; CYP7A1, 7a-hydroxylase; LDL-R, low density lipoprotein receptor; ApoB, apolipoprotein B; PGC-1a, PPAR-g coactivator-1a; MCAD, medium chain acyl-CoA dehydrogenase; LCAD, long-chain acyl-CoA dehydrogenase. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 w Effe7o ipolipidemico della la7ostaDna in animali da laboratorio e in vitro (Caco2 and HepG2) (Howard e Udenigwe, 2013) Food & Fu AFvazione della MAPK/ERK AFvazione del segnale di trasduzione del CA2+ Riduzione dell’assorbimento di colesterolo (Caco-‐2) View Arti Fa7ore di trascrizione-‐ proteina-‐chinasi LATTOSTATINA β-Lg f71-75 Ile-Ile-Ala-Glu-Lys AFvazione della colesetrolo 7α-‐idrolasi (CYP7A1) Catalizza il legame acidi biliari nel fegato Riduzione della solubilità micellare del colesterolo (riduzione assorbimento colesterolo) Capacità legante degli acidi biliari Molecular roles of milk-derived lactostatin in lowering lipids based on in vitro and cell culture studies. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 to inhibit FAS activity and pre-adipocyte differentiation genesis), characterized by decreased lipid accumulation different mechanism mediated by neurotensin NT2 r and possibly by induction of bile acid secretion.72 Based Effe7o anDpertensivo Malage cardiovascolari 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 s than 20 mmol L!1.119 pressure is reduced. Aldosterone antagonists such as spiro nin-angiotensin and Kallikenin-kinin system. ACE: angiotensin converting enzyme, ARB: angiotensin II receptor blockers, AC verting enzyme I, NO: nitric oxide. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 d Funct., 2011, 2, 153–167 e KRoyal erins, 2Society 011 of Chem This journal isPhelan ª The Ricerche presso il DAFNE Primo studio Concentrazione di tripeptidi ad azione ACE-inibitoria e attività ACE-inibitoria di estratto-solubile acquoso (WSE) da Grana Padano e Parmigiano Reggiano 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 24 campioni: 12 GP e 12 PR; -‐ a due differenD stagionature (12 e 32 mesi) Materiali e metodi Estrazione della frazione solubile (WSE) e ultrafiltrazione a < 3.000 Da AGvità ACE-‐inibitoria: -‐ Metodo colorimetrico -‐ La concentrazione del composto necessaria per inibire il 50% della aFvità dell’enzima ACE (IC50, espressa in μg di pepDdi/ml) Valina-‐prolina-‐prolina (VPP) e isoleucina-‐prolina-‐prolina (IPP) della WSE: Liquid Chromatography/Electrospray IonizaDon-‐High ResoluDon Mass Spectrometry (LC/ESI-‐HRMS) QuanDficazione uDlizzando standard esterni di VPP e IPP di sintesi (GenScript, Piscataway, NJ). 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Contenuto di Val-Pro-Pro (VPP) e Ile-Pro-Pro (IPP) e attività ACE-inibitoria (IC50) della WSE da Grana Padano (GP) e Parmigiano Reggiano (PR) VPP IPP * 12 10 12 µg peptidi/ml WSE 14 mg/kg di formaggio IC50 * * 8 ab b b 8 6 4 2 0 * 6 10 12 32 GP 4 a 12 32 PR 2 0 12 32 GP 12 32 PR *P < 0,05 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 VPP, mg/kg Formaggio 38,3 ± 48,0 0 – 224,1 IPP, mg/kg Formaggio 14,5 ± 21,8 0 – 95,4 IC50""ACE"ac-vity"(mg"cheese/mL"test"solu-on)" Poli."(IC50""ACE"ac-vity"(mg"cheese/mL"test"solu-on))" 35" 30" IC50" y"="0.0001x2")"0.0786x"+"15.623" R²"="0.21199" " r"=")0.45;"P"<"0.05" r = -‐0.16 n.s. 25" 20" 15" r = -‐0.56 P<0.01 10" 5" * 0" 0" 50" 100" 150" 200" 250" VPP"+"IPP,"mg/kg"of"cheese" 300" 350" 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 BüRkofer et al., 2007 Assenza di relazione tra la concentrazione di Val-Pro-Pro (VPP) o Ile-Pro-Pro (IPP) e l’attività ACE-inibitoria (IC50) di WSE da Grana Padano (a, b) and Parmigiano Reggiano (c, d). b) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.00 IC50, ng/ml IC50, ng/ml a) 2.00 4.00 6.00 8.00 VPP, mg/kg 10.00 12.00 1.00 2.00 3.00 4.00 IPP, mg/kg 5.00 6.00 7.00 d) 14 14 12 12 10 10 IC50, mg/kg IC50, ng/ml c) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.00 8 6 4 2 0 0.00 8 6 4 2 5.00 10.00 VPP, mg/kg 15.00 20.00 0 0.00 2.00 4.00 6.00 IPP, mg/kg 8.00 10.00 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Considerazioni Il GP e il PR hanno mostrato un alto valore ACE-inibitorio nonostante un contenuto di IPP e VPP più bassi rispetto ad altri formaggi, pertanto IPP e VPP non sembrano spiegare i bassi valori di IC50 osservati. La stagionatura è inversamente correlata con la concentrazione di IPP e VPP 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Ricerche presso il DAFNE: Secondo studio Grana Padano e Parmigiano Reggiano (WSE) < 3.000 Da liofilizzata AFvità ACE-‐inibitoria : -‐ Metodo colorimetrico Studio in vivo aFvità anD-‐ipertensiva: -‐ Metodo tail cuff non-‐invasivo per misurare la pressione sanguigna; -‐ 4 gruppi di 5 SH-‐Rats tra7amento giornaliero per 10 seFmane: -‐ Acqua disDllata: Controllo NegaDvo; -‐ Captopril 50 mg kg-‐1: Controllo PosiDvo; -‐ WSE liofilizzata da Parmigiano Reggiano, 200 mg ra7o-‐1: gruppo PR; -‐ WSE liofilizzata da Grana Padano, 200 mg ra7o-‐1: gruppo GP. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Materiali e metodi Valutazione dell’attività ipotensiva della WSF in Spontaneously Hypertensive Rat (SHR, maschi di 10-13 settimane di età) Prodotto testato PROVA • PR 32 mesi WSF TQ • GP 32 mesi WSF TQ N° ratti per trattamento 5 Dosaggio mg/ ratto/giorno 200 Durata trattamento 10 settimane (effetto cronico) Misurazione pressione Una volta a settimana MISURAZIONE DELLA PRESSIONE tramite sistema non invasivo tail cuff 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Prova in vivo ACE-‐inibizione in vitro Commento Nonostante la consistente aFvità ACE-‐ inibitoria della WSE in vitro, la WSE non ha mostrato effe7o ipotensivo in vivo dopo 10-‐seFmane di tra7amento. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Considerazioni Lo studio ha dimostrato che una consistente attività ACEinibitoria di peptidi bioattivi naturalmente formati non ha effetti anti-ipertensivi in vivo. L’attività ACE-inibitoria, come in altri casi, non può essere il criterio esclusivo per valutare il potenziale ipotensivo di peptidi, di estratti o di altre sostanze. Invece, è assolutamente necessario testare gli effetti antiipertensivi in vivo, per definire i reali benefici. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Ricerche presso il DAFNE Terzo studio Approfondire la composizione in peptidi ipotensivi di GP e PR e studiarne il trasporto attraverso il sistema epiteliale dell’intestino (Caco-2 in vitro) 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Materiali e metodi 6 campioni di Parmigiano Reggiano a 12 mesi di stagionatura da 6 differenD caseifici della zona di Modena, Reggio Emilia e Parma Estrazione della frazione solubile (WSE) e ultrafiltrazione a < 3.000 Da 2,5 g di ciascun campione sono staC digeriC in vitro. Fase orale (pH 7,0) α-amilasi umana 150 UI/mL 2 min a 22°C Fase gastrica (pH 3.0) Pepsina suina 1000 UI/mL 2 h Fase duodenale (pH 7.0) α-amilasi pancreatica 200 U/mL 2 h Tripsina 100 UI/mL α-Chimotripsina pancreatica 50 UI/mL Lipasi intestinale 2000 UI/mL Co-lipasi (2:1 co-lipasi/lipasi) Sali biliari 10 mM Estrazione della frazione solubile (WSE) e ultrafiltrazione a < 3.000 Da a 37°C a 37°C 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Materiali e metodi Esperimento trasferimento transepiteliale (colture Caco2) Caco2 cell line 3×105 cell/cm2 21 giorni a 37°C, 95% modello di epitelio aria / 5% CO2 intestinale In doppio ComparDmento Apicale: WSE del PR digerito ComparDmento basolaterale 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Quantificazione dei peptidi Materiali e metodi Liquid Chromatography/Electrospray IonizaDon-‐High ResoluDon Mass Spectrometry (LC/ESI-‐HRMS) ! 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 De Noni et al., 2014 Concentrazione di pepDdi ACE-‐inibitori in WSE di PR e WSE di PR digerito e concentrazione degli stessi pepDdi dopo trasporto transepiteliale (ComparDmento basolaterale) a7raverso monostrato di Caco-‐2 (n = 6, in doppio) VPP WSE Delta WSE-‐digerito ComparDmento basolaterale Carry-‐over, % IPP RYLG RYLGY AYFYPE HLPLP AYFYPEL LHLPLP (μg/ml) 0,439 0,289 0,057 + + 0,000 0,000 0,115 0,000 0,437 ++ ++++ ++ ++++++++ 0,000 0.606 7,781 0,634 303,836 -‐ 0,462 0,298 0,000 n.d. n.d. n.d. -‐ n.d. 0,116 n.d. 0,514 -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ 1,50 -‐ 0,17 VPP (Val-‐Pro-‐Pro), IPP (Iso-‐Pro-‐Pro), RYLG (Arg-‐Tyr-‐Leu-‐Gly), RYLGY (Arg-‐Tyr-‐Leu-‐Gly-‐Tyr), AYFYPE (Ala-‐Tyr-‐Phe-‐Tyr-‐Pro-‐Glu), AYFYPEL (Ala-‐Tyr-‐Phe-‐Tyr-‐Pro-‐Glu-‐Leu) HLPLP (His-‐Leu-‐Pro-‐Leu-‐Pro), LHLPLP (Leu-‐His-‐Leu-‐Pro-‐Leu-‐Pro) 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 IC50 (μg/ml) 7,410 3,222 Considerazioni La digestione modifica in modo significativo la composizione peptidica della WSE (valutazioni del semplice estratto di formaggio non sono sufficienti). La digestione migliora l’attività ACE-inibitoria della WSE e questa sembra più correlata con la presenza di LHLPLP e HLPLP che di IPP e VPP come di solito indicato. Le nostre ricerche hanno dimostrato il passaggio (biodisponibilità) di LHLPLP e HLPLP presenti in digerito di formaggio. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Indice 1. Le proteine del latte 2. Biopeptidi: come si formano, cosa sono, dove si trovano 3. Funzionalità e significato biologico a. Leganti i minerali b. Oppioidi c. Antimicrobici e Immunomodulatori d. Antitrombotici e Ipotensivi 4. Possibili utilizzazioni 5. Sviluppi futuri 6. Conclusioni 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 ARTICLE IN PRESS 952 H. Korhonen, A. Pihlanto / International Dairy Journal 16 (2006) 945–960 Table 3 Commercial dairy products and ingredients with health or function claims based on bioactive peptides Brand name Type of product Claimed functional bioactive peptides Health/function claims Manufacturers Calpis Sour milk Reduction of blood pressure Calpis Co., Japan Evolus Calcium enriched fermented milk drink Reduction of blood pressure Valio Oy, Finland BioZate Hydrolysed whey protein isolate Whey protein isolate Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, derived from b-casein and k-casein Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, derived from b-casein and k-casein b-lactoglobulin fragments Reduction of blood pressure Prevention of dental caries, influence the clotting of blood, protection against viruses and bacteria Reduction of stress effects Davisco, USA BioPURE-GMP k-casein f(106–169) (Glycomacropeptide) PRODIET F200/Lactium Flavoured milk drink, confectionery, capsules Festivo Cysteine Peptide Fermented low-fat hard cheese Ingredient/hydrolysate C12 Ingredient/hydrolysate as1-casein f (91–100) (TyrLeu-Gly Tyr-Leu-Glu-GlnLeu-Leu-Arg) as1-casein f (1–9), as1-casein f (1–7), as1-casein f (1–6) Milk protein derived peptide Casein derived peptide Capolac Ingredient Caseinophosphopeptide PeptoPro Ingredient/hydrolysate Casein derived peptide Vivinal Alpha Ingredient/hydrolysate Whey derived peptide No health claim as yet Aids to raise energy level and sleep Reduction of blood pressure Helps mineral absorption Improves athletic performance and muscle recovery Aids relaxation and sleep Davisco, USA Ingredia, France MTT Agrifood Research Finland DMV International, the Netherlands DMV International, the Netherlands Arla Foods Ingredients, Sweden DSM Food Specialties, the Netherlands Borculo Domo Ingredients (BDI), the Netherlands 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Schrezenmeir, 2000). Many animal and human studies have reported the presence of CPPs in vivo following ingestion of milk, fermented dairy products, casein and e Pihlanto, fermented whey and Kohronen the tripeptides VPP and2006 IPP stimulated the proliferation of osteoblasts in vitro, whereas sour-milk whey and calcium had no effect. The fermented Indice 1. Le proteine del latte 2. Biopeptidi: come si formano, cosa sono, dove si trovano 3. Funzionalità e significato biologico a. Leganti i minerali b. Oppioidi c. Antimicrobici e Immunomodulatori d. Antitrombotici e Ipotensivi 4. Possibili utilizzazioni 5. Sviluppi futuri 6. Conclusioni 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Sviluppi futuri Ad oggi pochi sono gli sviluppi commerciali presenti sul mercato, ma il trend è in crescita e continuerà di pari passo con l’aumento delle conoscenze sulle proprietà funzionali degli alimenti a base di latte e derivati. L’utilizzo di peptidi bioattivi per la nutrizione e la salute umana è fonte di sfide scientifiche e tecnologiche. I peptidi bioattivi possono offrire una eccellente base per un nuovo concetto di ‘nutrizione personalizzata’. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Sviluppi futuri Alcune questioni di carattere scientifico, tecnologico e regolamentare devo essere risolte: 1. Sviluppare nuove tecnologie per arricchire le frazioni di peptidi attivi da idrolisati proteici; 2. Stabilire il migliore processo per produrre peptidi: fermentazioni microbiche o idrolisi enzimatica; 3. Studiare le proprietà tecnologiche dei peptidi bioattivi e sviluppare alimenti modello contenenti peptidi che mantengono la loro attività per un periodo garantito; 4. Studiare le interazioni tra biopeptidi e componenti l’alimento come lipidi e zuccheri, come anche l’effetto di trattamenti termici sulla attività e biodisponibilità di tali peptidi; 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Sviluppi futuri Alcune questioni di carattere scientifico, tecnologico e regolamentare devo essere risolte: 5. Studi con approccio molecolare (omico) sono indispensabili per comprendere meglio i meccanismi di azione dei diversi biopeptidi; 6. Approfondire il meccanismo di azione a livello locale nel tratto gastro-intestinale e la biodisponibilità dei peptidi; 7. Implementare gli studi su latte prodotto da specie ‘minori’ come ovini, caprini, camellidi, bufali, equidi …. 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Indice 1. Le proteine del latte 2. Biopeptidi: come si formano, cosa sono, dove si trovano 3. Funzionalità e significato biologico a. Leganti i minerali b. Oppioidi c. Antimicrobici e Immunomodulatori d. Antitrombotici e Ipotensivi 4. Possibili utilizzazioni 5. Sviluppi futuri 6. Conclusioni 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Conclusioni z Risulta chiaro che i biopeptidi derivanti dalle proteine del latte svolgono attività fisiologiche e hanno, o potenzialmente possono avere, un effetto positivo sulla salute. z Numerosi studi sono focalizzati sulla individuazione di peptidi bioattivi, ma molti aspetti devono ancora essere approfonditi: « associare agli studi in vitro studi in vivo (spesso conclusioni solo con risultati prevalentemente derivanti da studi in vitro: es. ACE-inibizione, oppioidi, ipolipidemici, etc…; « validazione da risposte fisiologiche in vivo con studi clinici sull’uomo; « testare e accertare la resistenza alle reali condizioni del tratto gastrointestinale di peptidi candidati ad essere definiti bioattivi; « implementare gli studi per testare la salubrità, la eventuale tossicità, citossicità e allergenicità di peptidi bioattivi (mai citati negli studi). 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014 Grazie della attenzione 7° Convegno Nazionale ARNA, Cagliari 2-‐4 O7obre, 2014
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