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Dattilo et al., sommario

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Riassunto a cura dell'autore
Maurizio Dattilo, MD
Introduzione
La struttura della cromatina spermatica è
frequentemente compromessa come conseguenza di
danni di tipo ossidativo e condiziona una scarsa
efficacia riproduttiva sia per via naturale che in corso di
trattamenti PMA.
Trattandosi di un danno di natura ossidativa, il
supporto di tali pazienti con sostanze antiossidanti
appare come una promettente strategia. In effetti,
almeno venti studi clinici pubblicati negli ultimi 10
anni, pur se eterogenei tra loro e spesso
metodologicamente carenti, hanno tutti confermato
qualche effetto positivo di tali interventi sulla qualità
dell'eiaculato. Di contro, tali effetti positivi potrebbero
avere un mero valore cosmetico dal momento che
difficilmente si riesce a dimostrare un reale impatto sui
tassi di grevidanza.
Le recenti review sul tema hanno pertanto posto
l'accento sul rischio che le terapie con forti
antiossidanti, se da un lato migliorano certi parametri
spermatici, es. la mobilità, dall'altro creano
interferenze con i processi ossidativi fisiologici che
nello spermatozoo sono particolarmente importanti. È
stato visto in studi clinici che quando un intervento
antiossidante risulta in una riduzione della
frammentazione del DNA questa viene pagata con un
aumento dell'indice di decondensazione nucleare con
un effetto finale negativo. Questo fenomeno è stato
definito come "stress riducente" in opposizione al
tradizionale concetto di stress ossidativo.
Il problema può essere risolto utilizzando un approccio
di
attivazione
metabolica
basato
sulla
somministrazione di antiossidanti indiretti, ovvero di
sostanze che non sono dei veri antiossidanti ma
agiscono promuovendo e sostenendo l'attività dei
meccanismi antiossidanti fisiologici. In questo modo
l'effetto antiossidante si manifesta fino al
raggiungimento dell'equilibrio ossidoriduttivo. Si può
pertanto intervenire in maniera decisa senza rischiare
un effetto eccessivo e dannoso.
L'antiossidante fisiologico universale è il glutatione
(GSH) che perô non è attivo per somministrazione
orale. La sintesi del glutatione avviene nella via delle
trans-sulfurazioni che ha come substrato di partenza la
omocisteina, che è a sua volta il prodotto finale delle
reazioni di transmetilazione. L'enzima chiave per
l'avvio del processo é la cistationina beta-sintetasi
(CBS), un enzima unico nel suo genere che si attiva
spontaneamente quando viene ossidato (redox
regolato). In sostanza, la cellula attiva la sintesi del GSH
se e quando c'é un eccesso di carico ossidativo.
Tuttavia tale attivazione non basta, la CBS sarà
intensamente attiva solo se le sue 4 subunità legano
ciascuna una molecola di S-adenosyl-metionina
(SAMe). Questa è a sua volta il portatore del metile
attivato per le reazioni di transmetilazione e
precursore, dopo donazione del metile, della stessa
omocisteina. In conclusione, un'efficace difesa
antiossidante endogena è possobile solo se a monte vi
é una piena efficienza delle reazioni di
transmetilazione. Questo fa sì che la cellula attivi le
difese solo se è in grado di crescere e differenziarsi.
Pertanto, un efficace stimolo alle difese antiossidanti
può
essere
ottenuto
supportando
Pag. 1
contemporaneamente
sia
le
reazioni
di
transmetilazione (crescita e differenziazione
+
disponibilità di SAMe per l'attivazione di CBS) che
quelle di trans-sulfurazione (sintesi del GSH). Le
sostanze necessarie allo scopo sono: donatori di metile
per la sintesi di SAMe, acido folico; donatori di cisteina
per la sintesi del GSH, N-acetil-cisteina; ed i co-fattori
essenziali degli enzimi coinvolti: zinco e vitamine B2,
B3, B6 e B12.
Il presente studio ha valutato l'efficacia di tali sostanze
nel migliorare la capacità riproduttiva in uomini subfertili. Il supporto nutrizionale somministrato,
Condensyl®, conteneva anche piccole quantità di
vitamina E e di betalaine e quercetine di origine
naturale ad ulteriore prevenzione della perossidazione
dei lipidi di membrana.
Metodi
Lo studio ha reclutato 84 partners maschili di coppie
resistenti ad almeno 2 cicli di PMA (range 2-6) e con un
indice di frammentazione del DNA spermatico (DFI) e/o
un indice di decondensazione nucleare (SDI) > 20%
indipendentemente dallo spermiogramma (1 su 4
normospermico) e dalla presenza di un fattore
femminile.
Tabella 1 - Caratteristiche demografiche dei pazienti e
delle loro partners
Pazienti
Partners
femminili
35 (25-44)
Età media (range)
37 (25-63)
Normospermici, n (%)
19 (23%)
Astenospermici, n (%)
14 (17%)
Oligoastenosp., n (%)
51 (61%)
Fatt femminile, n (%)
28 (33%)
Precedenti cicli PMA (n
2.4 (2-6)
medio, range)
Ai pazienti é stato offerto un trattamento con
Condensyl®, 1 o 2 compresse al giorno per 4 mesi, in
preparazione di un nuovo ciclo PMA. Il DFI è stato
valutato con la metodica TUNEL e lo SDI con
colorazione con blu anilina, prima e dopo il
trattamento.
Le variabili continue sono state analizzate con Il
Wilcoxon test (intra-gruppo) o con il Mann-Witney test
(tra gruppi). L'indipendenza tra variabili categoriche è
stata analizzata con il Chi2 test.
Risultati
Gli 84 pazienti arruolati hanno assunto 1 (n=54) o 2
(n=30) compresse di Condensyl® per un periodo
varaibile tra 2 e 12 mesi (media 130 giorni). I
trattamenti brevi sono stati in larga parte dovuti
all'insorgere di una gravidanza, quelli più lunghi erano
legati ad esigenze di pianificazione familiare.
Il tasso di risposta al trattamento è stato del 71.4% per
DFI, del 64.3% per SDI e del 47.6% per entrambi
(Tabella 2).
Il trattamento non ha modificato la conta spermatica
(p = 0.69), la motilità (p = 0.52) e la morfologia (p =
0.1). Non vi sono state differenze nel tra
normospermici vs oligo- ed oligoasteno-spermici nel
tasso di risposta di DFI ed SDI e nei tassi di gravidanza.
Diciotto coppie (21%) hanno riportato una gravidanza
spontanea con nascita a termine prima del ciclo PMA
pianificato. Le rimanenti 66 coppie sono state
sottoposte a PMA (4 IUI; 18 IVF; 44 ICSI) ed hanno
ottenuto altre 22 gravidanze cliniche di cui 15 a
termine. Il tasso di gravidanze cliniche complessivo
(CPR) e quello di nati vivi (LBR) sono stati del 47.6% e
39.3%. I full responders, ovvero i 40 pazienti che hanno
migliorato sia DFI che SDI hanno riportato un CPR del
70% ed un LBR del 57.5% (p < 0.001 - Tabella 3).
I 28 pazienti partner di donne portatrici di fattore
femminile hanno generato solo 2 gravidanze cliniche di
cui 1 a termine. Tuttavia, essi non hanno neanche
migliorato gli indici DFI e SDI, probabilmente come
conseguenza di una scarsa compliance per cui i dati
non vanno assunti come una mancanza di efficacia in
presenza di un contemporaneo fattore femminile. I
tassi di gravidanza clinica e nati vivi nelle 56 coppie
senza fattore femminile sono stati rispettivamente del
68% e 57%.
Non è stato possibile definire dei valori di DFI e SDI
predittivi di gravidanza. I pazienti che hanno ottenuto
una gravidanza clinica (n = 40), il sottogruppo che ha
ottenuto una gravidanza spontanea (n = 18) ed il
sottogruppo che ha ottenuto una gravidanza da PMA
(n = 22) avevano un più basso SDI post-trattamento (p
< 0.001). Il sottogruppo che ha ottenuto una
gravidanza da PMA aveva anche un minore DFI di
significatività borderline (p = 0.046). Vedi Tabella 4
(Tabella 5 nella pubblicazione).
Pag. 2
Tabella 2 - Valori di DFI e SDI prima e dopo il trattamento, medie
Gruppi
n (%)
All Patients
84 (100)
DFI responders
60(71%)
SDI Responders
54 (64%)
DFI and SDI responders 40 (48%)
* p < 0.001, Wilcoxon test
Tabella 3 - Tassi di gravidanza
Condensyl®
Pre
29.7%
33.0%
28.5%
31.8%
DFI
Post
23.1%
20.0%
21.4%
18.8%
Diff. %
-6.6%*
-13.0%
-7.0%
-13.1%
Pre
40.1%
38.5%
42.0%
40.2%
SDI
Post
36.3%
34.6%
30.2%
28.9%
Diff. %
-3.8% *
-3.9%
-11.8%
-11.4%
in 84 pazienti PMA-resistenti trattati con
Categorie
n
Tutti i pazienti
Pz che migliorano sia DFI che SDI
Pz che migliorano SDI
Pz che migliorano DFI
Pz che non migliorano DFI ed SDI
Independence CHI² test
84
40
54
60
10
Gravidanze cliniche
n
Tasso
p
40
47.6%
28
70.0% 0.000
35
64.8% 0.000
33
55.0% 0.032
0
0.0%
0.001
Discussione
Il presente studio riporta un CPR del 47.6% ed un LBR
del 39.3% in coppie PMA-resistenti portatrici di un
fattore maschile a seguito di un intervento nutrizionale
con antiossidanti indiretti. È da notare che oltre la
metà delle nascite (18 su 33) sono state otenute
spontaneamente, ovvero ancora prima che ci fosse il
tempo per il ciclo PMA programmato e che lo studio, a
differenza di altri sull'argomento, includeva anche
coppie con fattore femminile (n=28, 33%).
Lo studio mancava di un gruppo di controllo per cui
non sono possibili conclusioni sul valore dei tassi di
gravidanza riportati, che comunque sono molto più alti
delle attese in considerazione del tipo di pazienti
trattati. Di contro, la correlazione delle gravidanze con
gli indici di danno spermatico è molto robusta. Tali
indici non si riducono in assenza di interventi e la loro
riduzione dimostra indirettamente che le gravidanze
erano legate al trattamento somministrato.
Per la prima volta a nostra notizia un trattamento
antiossidante ha prodotto la contemporanea riduzione
sia dell'indice di frammentazione (DFI) che di quello di
decondensazione (SDI) confermando che il trattamento
non ha causato il temuto "stress riducente".
La riduzione media degli indici, per quanto significativa,
sembra di modesta entità (-6.6% e -3.8%) ma questa
risente di una quota di totali non-responders (n=10)
n
33
23
30
26
0
Nati vivi
Tasso
p
39.3%
57.5%
0.001
55.6%
0.000
43.3%
0.23
0.0%
0.007
che sono fortemente sospettati di non aver assunto il
trattamento. Nel gruppo dei full responders le riduzioni
percentuali sono infatti di entità considerevole (-13%
per DFI e -12% per SDI) e giustificano ampiamente il
successo terapeutico (CPR 70%, LBR 57%).
Nel nostro modello sperimentale le gravidanze hanno
mostrato una correlazione molto forte con la riduzione
dello SDI mentre l'effetto della riduzione del DFI era
molto più modesto (Tabella 5). Pertanto il DFI, che
pure è un ottimo indicatore per stabilire una cattiva
prognosi riproduttiva, è più debole come criterio di
risposta al trattamento. Il danno al DNA misurato da
DFI può essere ampiamente riparato nello zigote la cui
capacità di DNA repair é per definizione di origine
ovocitaria. L'effetto finale della frammentazione
spermatica dipende quindi dalla variabile capacità di
DNA repair dell'ovocita, ovvero dalla sua qualità, il che
rende DFI una misura meno diretto della contribuzione
maschile all'infertilità di coppia. Di contro, i danni
all'organizzazione dei cromosomi di cui allo SDI hanno
ben poche probabilità di essere riparati nello zigote e
riflettono direttamente il contributo maschile. È
opportuno sottolineare che la misurazione dell'indice
di decondensazione con blu anilina è una metodica
semplice, non richiede apparecchiature complesse ed
ha bassi costi. Ciò nonostante questo test è ad oggi
largamente sottoutilizzato.
Pag. 3
Tabella 4 Risposta DFI e SDI in funzione della comparsa di una gravidanza clinica, medie
Gruppi
Tutte le gravidanze
SI
NO
n (%)
40 (47.6)
44 (52.4)
Gravidanze spontanee
SI
18 (21.5)
NO
66 (78.5)
Gravidanze da PMA
SI
22 (33)
NO
44 (67)
Mann-Whitney test
Pre
DFI
Post
Diff. %
p
Pre
SDI
Post
Diff. %
p
29.4% 20.1%
30.1% 25.9%
-9.3%
-4.2%
0.168 40.6% 29.3%
39.6% 42.6%
-11.3%
3.0%
0.000
23.2% 18.4%
31.5% 24.4%
-4.8%
-7.2%
0.571 44.8% 29.8%
38.8% 38.0%
-15.0%
-0.7%
0.000
34.4% 21.4%
30.1% 25.9%
-13.0%
-4.2%
0.046 37.2% 29.0%
39.6% 42.6%
-8.2%
3.0%
0.001
Le sostanze somministrate ai nostri pazienti
(Condensyl®) appartengono tutte alla classe degli
antiossidanti indiretti o molto indiretti.
Le vitamine B utilizzate sono tutte incapaci di ridurre
un'altra sostanza. Esse agiscono come donatore di
metile (acido folico - vit. B9) o come co-enzimi per le
razioni di transmetilazione (vit. B2, B3, B12) e si
limitano ad assicurare una ampia disponibilità di SAMe
essenziale per l'attivazione della CBS e sintesi del GSH
con conseguente aumento delle difese antiossidanti
endogene. Lo stesso vale per lo zinco. Sebbene un
tempo considerata un antiossidante, la N-acetilcisteina è anch'essa incapace di ridurre altre sostanze
ma agisce come precursore (cisteina) per la sintesi del
GSH e, una volta che questa sia saturata in funzione
della domanda, non esercita alcun altro effetto. La
vitamina B6 sostinene la sintesi del GSH agendo come
co-fattore essenziale per la CBS. Le betalaine sono
biodisponibili e si stratificano sui lipidi di membarana
dove si ossidano al loro posto prevenendo l'innesco
della cascata lipoperossidativa mentre le quercetine
agiscono chelando i metalli pro-ossidanti. Infine, la
vitamina E é attivamente antiossidante a partire dalla
dose di 300 mg die ma alla dose da noi impiegata può
solo agire da debole protettore dei lipidi di membrana.
L'effetto combinato di tutte queste sostanze é spingere
l'omeostasi cellulare verso una piena capacità
antiossidante mentre viene al contempo sostenuta la
crescita e differenziazione cellulare. Questo contrasta
fortemente con l'ambiente riducente artificiale
prodotto con la somministrazione di antiossidanti
diretti. Uno specifico vantaggio di questo approccio é
che la dose somministrata diventa meno critica
(autolimitante). Questo consente anche di allargare
indicazioni e durata del trattamento senza correre
rischi di effetti negativi (stress riducente).
Conclusioni
La forte correlazione tra il miglioramento della fertilità
e la riduzione dello SDI confermano l'importanza della
struttura cromatininca nella funzione riproduttiva e la
sua susceettibilità ai fattori ambientali, danno
ambientale da un lato e manipolazioni nutrizionali
dall'altro. Gli indici DFI e SDI confermano la capacità di
marcare una cattiva prognosi mentre la riduzione di
SDI manifesta la più forte correlazione con gli esiti
positivi. Le vitamine del gruppo B ed i loro co-fattori
(Condensyl®) appaiono sicure ed efficaci e possono
migliorare la prognosi riproduttiva sia per via naturale
che all'interno di pratiche PMA.
Infine, la delucidazione del complesso metabolismo dei
gameti ha il potenziale di produrre avanzamenti
decisivi nella comprensione della fisopatologia della
riproduzione umana.
Pag. 4
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