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09-Metodi in proteomica diff.

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METODI IN PROTEOMICA
DIFFERENZIALE
PRINCIPIO COMUNE:
ANALISI SIMULTANEA DEI CAMPIONI DA CONFRONTARE
•Proteine di diversa provenienza sono modificate in maniera
differenziale.
•Le alterazioni prodotte differenzialmente sulle proteine o non
interferiscono con la loro analisi o interferiscono in maniera
analoga.
•Le caratteristiche delle modificazioni sono tali da poter essere
rintracciate.
DIGE:
2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis
Campione di controllo, campione trattato e standard interno
vengono
colorati
con
sonde
fluorescenti
diverse
(CyDye;
Amersham Bioscences) prima della prima dimensione, ed applicati
sullo stesso gel 2-D.
Molti problemi legati alla variabilità dei gel sono eliminati!
Sensibilità elevata e compatibilità con tecniche di spettrometria
di massa rendono questa metodica ottimale per gli studi di
proteomica differenziale.
λex 488nm λem 520 BP40 Filters
FLUOROFORI USATI:
Cy2, Cy3, Cy5
Massa (circa 500) e Carica (+) dei fluorofori
sono uguali
λex 532nm λem 580 BP30 Filters
Gli spettri (eccitazione ed emissione) sono
DIVERSI
MULTICOLOR DETECTION
Linearità di risposta fino a 4 ordini di
grandezza
Sensibilità elevata (≤125 pg di transferrina)
λex 633nm λem 670 BP30 Filters
Possibili gruppi reattivi:
•N-idrossisuccinimidil estere
(NHS estere)
•Maleimide
LYS
CYS
I fluorofori usati per la tecnica DIGE si legano
ai gruppi ε-NH2 di residui di lisina delle
proteine presenti nel campione. Nelle condizioni
sperimentali usate (minimal labelling reaction),
protein
mediamente si lega una molecola di colorante
per proteina (1-2% dei residui di Lys).
Non si hanno variazioni apprezzabili né di
peso molecolare né di punto isoelettrico.
protein
PREPARATIVE GEL LABELING
Il gruppo reattivo reagisce con le cisteine.
Si lavora in condizioni di “maximal labeling” (alto rapporto
fluoroforo/proteine).
Si cerca di ottenere la derivatizzazione di tutte le cisteine disponibili
(saturation labeling).
Le proteine vengono modificate prima di effettuare la corsa elettroforetica!!!
Lo standard interno viene preparato derivatizzando con uno dei fluorofori una
miscela 1/1 dei due campioni in analisi (“controllo” e “trattato/patologico”).
ESEMPIO DI APPLICAZIONE: determinazione “rapida”
di marker proteici associati a stati patologici
TIPICA PROCEDURA PER ANALISI DIGE
I
GEL
ottenuti
seguendo
la
procedure
DIGE
possono
anche
essere
sottoposti
a
colorazioni
successive
(es.
Deep Purple Total
Protein Stain)
Vantaggi della tecnica DIGE:
9 L’uso di standard interno elimina problemi dovuti alla variazione
del sistema.
9 Le misure delle variazioni di espressione delle proteine meno
abbondanti sono più accurate.
9 Minori problemi relativi al
“rumore di fondo” (lo stesso per
entrambi i campioni da comparare); le differenze osservate
sono relative solo alle variazioni biologiche e non a “variazioni
tecniche”.
9 Con
il sistema DIGE è possibile rilevare e quantificare
differenze fra i campioni inferiori al 10%.
Problemi della tecnica DIGE:
9 Condizioni di “labeling” critiche.
9 È richiesto l’uso di un software “dedicato”.
9 Per la normalizzazione è sempre richiesto un terzo campione
(standard interno).
9 Si possono verificare piccoli incrementi di peso molecolare
delle proteine (cambio di posizione sul gel legato vs non legato).
9 Dal momento che i reattivi si legano solo a residui di lisina o
cisteina, alcune proteine possono essere non rivelate (~13% ).
9 Costi elevati.
LIMITI DELLO STUDIO
PROTEOMICO “CLASSICO”
In ogni cellula c’è un enorme e dinamico divario di
espressione e di tipologia (es. PM, pI, idrofobicità,
compartimentazione…)
fra
le
varie
proteine;
il
“metodo ideale” di analisi dovrebbe essere in grado
di IDENTIFCARLE e QUANTIFICARLE tutte!
2-D PAGE:
... non necessariamente è la migliore tecnica per
l’analisi proteomica
Svantaggi della 2-D PAGE:
• Limitata all’analisi di proteine con 104 Da < P.M. > 106 Da.
• Non adatta alla separazione di proteine idrofobiche (es. di membrana).
• Scarsa risoluzione per proteine con 4 > pI > 10.
• Non si rilevano proteine espresse a bassi livelli.
• Buona separazione solo per un max di 600-800 spots.
• Scarsa riproducibilità fra gel.
• Quantificazione difettosa (dipende dal sistema di rivelazione).
• L’analisi non è accoppiata direttamente alla separazione.
CROMATOGRAFIA MULTIDIMENSIONALE
Nella cromatografia multidimensionale (MudPIT, multidimensional protein
identification technology) due (o più) tecniche con proprietà “ortogonali”
vengono combinate in modo da incrementare il potere di separazione.
PRIMA DIMENSIONE:
Nano-HPLC
es. Esclusione molecolare, Scambio ionico, elettroforesi capillare, ….
SECONDA DIMENSIONE:
es. Fase inversa, Scambio ionico, Esclusione molecolare,…
SPETTROMETRIA DI MASSA:
Ionizzazione: ESI
Analisi: triplo quadrupolo, trappola ionica, analizzatori ibridi
(Q-TOF)…..
Si analizzano direttamente
i
peptidi
prodotti
proteolisi specifica!
per
GENES
35,000
PROTEINS
200,000
TRYPTIC PEPTIDES
4,000,000
2D - LC/LC
La miscela peptidica ottenuta per digestione specifica delle proteine contenute in un
campione*, viene “separata” mediante 2D-LC bidimensionale, prima dell’analisi
MS/MS.
* Può anche essere un
campione ottenuto dopo
2D-E/”digestione in gel”
(trypsin)
I peptidi vengono fatti legare
ad una colonna a SCAMBIO
CATIONICO; la successiva
eluizione con un gradiente
salino, separa i peptidi in
funzione della loro carica
I peptidi vengono quindi
separati in funzione della
loro idrofobicità su una
colonna a FASE INVERSA
Stable isotope labeling methods
- Isotope-Coded Affinity Tagging (ICAT)
- Hydrogen vs deuterium (8 Da separation)
- 13C vs
12C
(9 Da separation)
- Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation (iTRAQ)
- Four isobaric reagents
- Compare quantity of reporter molecule in MS/MS
-Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)
-Cell growth in stable isotope-enriched media
(13C Glucose, 15N Ammonium, 2H Water)
Esempio di un reagente ICAT
Biotin Affinity tag:
Gruppo reattivo:
La reattività verso gruppi tiolici
permette il legame con residui di
cisteina
Permette il legame
selettivo ad una resina
di streptavidinaagarosio
O
Linker: la versione “pesante”
ha atomi di deuterio nei punti
contrassegnati con *; negli
stessi punti, la versione
“leggera” ha atomi di idrogeno
NH
NH
H
N
*
S
O
*
O
O
*
O
*
H
N
I
O
I campioni proteici da confrontare, dopo ESTRAZIONE,
vengono TRATTATI col reagente “pesante” o con quello
“leggero”.
I
due
campioni
vengono
MISCELATI,
DIGERITI, ISOLATI ed ANALIZZATI.
Gruppo reattivo: forma un legame covalente
con residui di Cys di proteine o peptidi
Isotope-labeled linker
(“pesante” o “leggero”)
Affinity tag: permette di isolare proteine o
peptidi legati all’ICAT mediante cromatografia
di affinità in un unico step
Campione A
Campione B
Derivatizzato
con reagenti
ICAT leggeri (L)
Derivatizzato
con reagenti
ICAT pesanti (H)
Digestione
con enzimi
proteolitici
Digestione
con enzimi
proteolitici
Unione dei digeriti
Purificazione mediante affinità dei
peptidi recanti il gruppo derivatizzante
Analisi LC/MS (nano HPLC - MuDPIT)
MS
Comparazione
abbondanze peptidi
(L & H) => dati
quantitativi sui
livelli d’espressione
MS/MS
identificazione
Quantification
MS
NH2-EACDPLR-COOH
Light
100
Identification
MS/MS
100
Heavy
0
550
570
m/z
590
0
200
400
m/z
600
Vantaggi
•
Quantifica i livelli di
proteina fra campioni
diversi, con un elevato grado
di accuratezza
•
Il legame “Cys-specifico”
riduce la complessità del
campione
•
•
Costoso
•
Frammentazione del Tag
•
Assenza di residui di cisteine o non
accessibilità al reagente
Può essere usato con miscele
complesse di proteine
•
vs Svantaggi
I peptidi possono essere
sequenziati direttamente con
tecniche MS-MS
(solo ~8% dei peptidi contiene Cys)
•
Limitate interferenze nella corsa
cromatografica
Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation (iTRAQ)
- Si possono marcare differenzialmente ed analizzare fino a 4 campioni.
- Le proteine vengono digerite prima della marcatura.
- Il marcatore reagisce con i gruppi N-terminali.
- La composizione aminoacidica non influenza la possibilità di analisi
TUTTI I PEPTIDI VENGONO ANALIZZATI
-Gli ioni dei peptidi modificati possono essere selezionati per esperimenti
MS/MS. Il gruppo reporter viene perso durante la frammentazione.
- L’abbondanza ionica relativa dei peptidi può essere valutata
direttamente
reporter.
dall’abbondanza
ionica
relativa
dei
4
gruppi
iTRAQ
Ross, P. L. et al. (2004) Mol Cell Proteomics 3(12): 1154-69
iTRAQ
- Peptides have the same mass from each of the samples
- MS/MS of selected mass yields
- Fragmentation spectra for the identification of
peptide
- Reporter group gives relative abundance information
iTRAQ
Reduce & Trypsin
Alkylate
digest
Label w/
114 tag
Sample 1
Label w/
115 tag
Mix, dilute in
SCX buffer
Sample 2
Label w/
116 tag
SCX
Capillary
RPLC-MS
Sample 3
Label w/
117 tag
Sample 4
Ross, P. L. et al. (2004) Mol Cell Proteomics 3(12): 1154-69
Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture
(SILAC)
- Cells grown in media enriched with stable isotope-containing
amino acids
- Only works in cells that require addition of essential amino acids
- Quantification limited to proteins/peptides that contain labeled
amino acid
Unlabeled cells
Labeled cells
Combined cells
Protein purification
Trypsin digestion
Mass spec identification/quantification
NB: campione deve essere
normalizzato in partenza =>
stesso numero di cellule dallo
stato A e dallo stato B
Dalle abbondanze relative
dei peptidi derivati dalla/e
stessa/e proteina/e, si può
risalire a variazioni nei livelli
d’espressione di più proteine
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