Citologia 20 – Trascrizione RNA-polimerasi Tutti i tipi di RNA vengono sintetizzati nel nucleo. A sintetizzarli è un enzima, detto RNA-polimerasi che, copiando su particolari tratti del DNA (geni per l’RNA), ne esegue una copia complementare di quelle sequenze. L’RNA-polimerasi è stata studiata bene nei procarioti e solo negli ultimi anni si è compreso il funzionamento negli eucarioti. Pertanto, nella trattazione verrà dapprima descritta la RNA-polimerasi dei procarioti e poi quella degli eucarioti. RNA-polimerasi nei procarioti I procarioti hanno un'unica RNA-polimerasi che sintetizza tutte le forme di RNA (rRNA, tRNA, mRNA). Il processo di trascrizione si svolge in 3 fasi. Inizio Per cominciare la trascrizione, l’RNA-polimerasi deve riconoscere e legare saldamente l'inizio di un gene. Per individuare il gene la molecola di RNA-polimerasi scivola (guidata da alcune proteine) lungo la doppia elica sino a quando incontra la regione del promotore, cioè una sequenza di nucleotidi che indica il punto d'inizio della trascrizione. Il riconoscimento ed il legame col promotore è favorito da un fattore proteico dell’RNA-polimerasi, chiamato fattore σ (sigma). Raggiunto il promotore, l’RNApolimerasi si lega ad esso in maniera orientata, cioè girata nella direzione della lettura (il legame in senso opposto è impossibile). Il legame al DNA produce un cambiamento di forma della RNA-polimerasi (da un complesso chiuso ad un complesso aperto). Tale cambiamento comporta la separazione dei filamenti di DNA (ad opera di una subunità interna detta rudder=timone) e lo srotolamento di circa 13 bp (si forma la bolla di trascrizione). All’interno della bolla avviene la lettura del DNA. Davanti alla RNA-polimerasi il DNA si svolge, mentre i filamenti che la polimerasi stessa si lascia dietro, si riavvolgono (ad opera di un’altra subunità interna detta zipper=cerniera). Il legame col promotore è importante per svariati motivi: Consente di individuare il sito di inizio del gene da leggere; Permette di stabilire il legame iniziale col DNA; Consente di modulare la velocità lettura dell’RNA-polimerasi stessa. Ci sono alcune sequenze altamente specifiche e critiche sul promotore tali da determinare non solo la specificità del legame tra DNA e RNA-polimerasi, ma anche influire sulla velocità di lettura di quest’ultima. Infatti, se queste sequenze critiche sono molto simili alla catena senso del DNA, l’enzima trascrive a velocità notevole; mentre, se sono molto diver1 Citologia 20 – Trascrizione se, la velocità di trascrizione è lenta. Nel primo caso i promotori si dicono forti, nel secondo caso deboli. In realtà, anche altre proteine regolatrici influenzano la velocità di trascrizione. Allungamento Questa fase consiste nell’ulteriore aggiunta di ribonucleotidi. Dopo la sintesi dei primi 9 nucleotidi, l’RNApolimerasi si stacca dal promotore (altrimenti non potrebbe procedere nella lettura del DNA) e va avanti con la trascrizione, leggendo e sintetizzando il gene in questione, dall’inizio alla fine, senza staccarsi. Il tutto procede ad una velocità media di 50 nucleotidi al secondo (inferiore rispetto a quella di duplicazione del DNA … 800 nucleotidi al secondo). La direzione di trascrizione è sempre 5’3’ (riferita all’RNA). Fine Quando finisce la lettura del gene, l’RNApolimerasi si stacca dal DNA. Questa operazione è imposta da elementi di controllo detti terminatori. I terminatori possono essere di due tipi: Terminatori Rho-indipendenti: formati da due sequenze consecutive, la prima ricca di basi C e G, la seconda una poli-A. A causa della prima sequenza si viene a formare una forcina che rallenta la corsa della RNA-polimerasi; a causa della seconda sequenza l’RNA si stacca dal DNA, in quanto il legame A-U è molto debole. Terminatori Rho-dipendenti: la proteina Rho (una ATPasi ad anello), effettua la separazione dell’RNA neosintetizzato dal DNA; questa proteina viene a sua volta attivata da una sequenza ricca di basi G sul tratto di DNA letto. RNA-polimerasi negli eucarioti Negli eucarioti il processo di trascrizione è molto più complesso per diversi motivi: L’RNA-polimerasi non è una, ma triplice (RNA-polimerasi I, RNA-polimerasi II e RNApolimerasi III). L’RNA-polimerasi per legarsi al promotore ha bisogno di più fattori (e non di uno solo, come il fattore σ nel caso dei procarioti), detti fattori generali di trascrizione; Altri fattori (attivatori e repressori), direttamente o tramite il complesso mediatore, esercitano un’influenza sul processo della trascrizione; Il promotore non è unico ma multiplo; Diversi altri elementi, detti elementi regolatori prossimali e distali, intervengono per modulare l’attività di trascrizione. Tipi di RNA-polimerasi A differenza dei procarioti (dove esiste un solo tipo di RNA-polimerasi), negli eucarioti ci sono molti tipi di RNA-polimerasi. Le varie RNA-polimerasi non sono solo chimicamente diverse tra loro, ma stanno anche in posti diversi (le polimerasi II e III nel nucleo, la polimerasi I nel nucleolo) e riconoscono promotori diversi. 2 Citologia 20 – Trascrizione Fattori di Trascrizione Generali (GTF=General Transcription Factors o TF=Transcription Factors) Si tratta di un gruppo di 6 proteine (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH) che hanno il compito di riconoscere il promotore e svolgere il DNA. La nomenclatura TFII sta per Trasnscription Factor of RNA-polymerase II. Senza di loro, la RNA-polimerasi II non può iniziare la trascrizione. Infatti, si parla di complesso di trascrizione iniziale (o macchinario di trascrizione) per indicare l’insieme dell’RNA-polimerasi II e dei TF. Il primo fattore di trascrizione ad entrare in azione durante la trascrizione è il TFIID. Si tratta di un grosso complesso proteico formato da 12 subunità; tra queste particolarmente importante è la subunità TBP (TATA binding protein), che si lega a livello del TATA-box. La TFIID piega di circa 80° la sequenza TATA e questo espone alcune regioni di essa al contatto con i fattori TFIIA e TFIIB, le quali si legano e stabilizzano il legame del TFIID. Successivamente, si lega l’RNA-polimarasi II assieme alla TFIIF. Gli ultimi a legarsi sono il TFIIE, TFIIJ (che è una subunità del TFIIA) ed il TFIIH (che ha la funzione di elicasi, cioè di srotolare ed aprire la doppia elica del DNA). Durante la fase di allungamento la RNA-polimerasi II si stacca da quasi tutti i fattori di trascrizione (TF). Gli unici TF a rimanere attaccati alla RNA-polimerasi sono il TFIID (che stabilizza il legame tra l’RNA-polimerasi ed il DNA) e il TFIIH (che ha il compito di svolgere ed aprire la doppia elica del DNA). Attivatori, repressori, coattivatori, co-repressori e complesso mediatore Gli attivatori e repressori sono una serie di proteine che interagiscono con particolari 3 Citologia 20 – Trascrizione sequenze del DNA, dette elementi regolatori prossimali e distali (vedi dopo), ed esercitano una funzione stimolante o inibente sul processo di trascrizione. Le proteine non agiscono mai direttamente sul macchinario della trascrizione ma si servono del complesso mediatore (che fa da mediatore, appunto, tra loro e vari TF) o di altre proteine, dette co-attivatori e co-repressori. Promoter L’apparato promoter varia a seconda della RNA-polimerasi considerata. La RNA-polimerasi I, che trascrive i geni dell’rRNA 28S-18S-5.8S, ha un apparato promotore formato da: Nucleo promotore (core) ricco in GC, che si estende da -45 a +20. A questo sito vi si lega un complesso formato da 4 subunità, la TBP (TATA binding protein) + 3 TAF (TBP-activating factor 1, 2, 3). Elemento a monte del promotore (UCE = upstream control element), ricco in GC, che si estende da -180 a -107. Ad esso si lega la proteina UBF (upstream binding factor), responsabile del ripiegamento del DNA e necessaria a portare l’UCE a contatto col nucleo promotore, al fine di attivare la RNA-polimerasi I. La RNA-polimerasi II, che trascrive i geni degli mRNA, snRNA, snoRNA e miRNA ha un apparato promoter formato da: Nucleo promotore (core promoter), rappresentato da solo 2 o 3 dei seguenti 5 elementi: BRE, una sequenza situata a -35 dal punto di inizio; rappresenta l’elemento riconosciuto dal TFIID. TATA box, una sequenza posta a -25 dal punto di inizio. Elemento iniziatore (Inr), una sequenza situata a ridosso del sito d’inizio della trascrizione, tra le posizioni –3 e +5. DPE (downstream promoter element), una sequenza che si trova a valle del sito d’inizio, a +30. MTE (motif ten element) situato tra +18 e +27. Esso interagisce con l’Inr per l’attivazione del TFIID. Elementi regolatori prossimali, sono posti tra -50 e -200 dal sito di inizio della trascrizione. Questi elementi vengono riconosciuti e legati dagli attivatori ed hanno la funzione di stabilizzare l’apparato di inizio della trascrizione e di modulare la reazione di inizio. Quelli più noti sono: CCAAT-box (generalmente localizzata a -80/-100), GC-box (GGGCGG, generalmente a -40/-70), CRE. Elementi regolatori distali (long-range regulatory elements), sono posti ad oltre -100.000 dal sito di inizio della trascrizione. Nonostante la loro notevole distanza dal gene da trascrivere, questi elementi, quando vengono attivati, si portano sempre in prossimità del gene. Gli elementi più noti sono: Esaltatori e silenziatori (enhancers e silencers), sono sequenze grandi (circa 500 bp) che attivano o reprimono il promotore, mediante l’interazione dei TF (Transcription Factors). Solitamente sono dislocati a notevole distanza dal promotore (a monte o a valle di esso); talvolta, però, gli enhancers e i silencer possono anche situarsi all’interno del gene da trascrivere. 4 Citologia 20 – Trascrizione Isolatori (insulators), sono sequenze molto grandi di DNA (da 300 a 2000 bp) che hanno la funzione di o Confinare ed isolare le varie regioni dell’eucromatina per evitare che il DNA di una regione vada a “mischiarsi” col DNA di altre regioni; o Impedire eventuali cross-reazioni attivanti da parte di geni vicini (mediante il blocco dei silencers e degli enhancers). Locus di controllo delle regioni (LCR = Locus control regions), è un sito regolatore situato molto lontano dal promotore ed indipendente dagli enhancers. La sua funzione è quella di rendere attivo un promotore ed il meccanismo consiste nell’aprire i nucleosomi del promotore, in modo che i TF possano legarsi ad esso (e quindi attivare il promotore stesso). Spesso gli LCR sono tessuto-specifici cioè, pur essendo presenti in tutte le cellule, funzionano solo in quelle di un determinato tessuto grazie all’intervento di proteine attivatrici, presenti solo in quel tessuto. Regioni di attacco alla matrice (MAR = Matrix attachment regions), sono sequenze di DNA alle quali si lega la matrice nucleare (una fitta rete proteica che fa parte del nucleoscheletro e che regola la disposizione della cromatina all'interno del nucleo). I MAR servono per organizzare la cromatina in domini (regioni) e giocano un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica. I geni attivi sono associati alle MAR nelle cellule dove sono espressi, mentre non sono associati alle MAR nelle cellule dove non sono espressi. Per la RNA-polimerasi III l’apparato promotore può essere di 4 tipi: Tipo 1 (promotore interno): è formato da 2 elementi di controllo a valle del punto d'inizio della trascrizione, detti boxA e boxC (sequenze di circa 10 basi); si trova nei geni per l'rRNA-5S. Tipo 2 (promotore interno): è formato da 2 elementi di controllo a valle del punto d'inizio, detti boxA e boxB; è presente nei geni per il tRNA. Tipo 3 (promotore a monte): è formato da 3 elementi (conservati) a monte del punto di inizio, detti Oct, PSE e TATA; è presente nei geni per gli snRNA. 5 Citologia 20 – Trascrizione Tipo 4 (promotore interno + a monte): è formato da due promotori interni simili a quelli del tipo 2 (boxA e boxB) e 2 promotori a monte (TF e TATA); è presente nei geni che trascrivono l’RNA-7SL1, uno degli RNA più piccoli presenti nelle cellule. In generale, i promotori si suddividono in due categorie, quelli contenenti e quelli non-contenenti le isole CpG (C=citosina, p=fosfato, G=guanina: sequenze nucleotidiche, da 20-50 bp, ricche di coppie C-G). I promotori con isole CpG sono frequenti nei geni housekeeping, cioè quei geni che gestiscono le funzioni basilari di tutte le cellule (ad esempio costruire membrane cellulari, le proteine del citoscheletro, etc). I promotori senza isole CpG sono frequenti nei geni altamente regolati (cioè che subiscono l’influenza di molti regolatori). Questi geni, di solito, gestiscono funzioni molto complesse (come la difesa immunitaria e i processi digestivi). Un numero elevato di geni (40-50% nell’uomo) è provvisto di promoter alternativi. Si tratta di geni dotati di promoter “opzionali” coi quali possono dare origine a proteine con caratteristiche biochimiche diverse, pur partendo dallo stesso gene. Questo meccanismo è coinvolto nella specificità di tessuto (cioè, uno stesso gene, in cellule appartenenti a tessuti diversi, può produrre più o meno la proteina codificata perché influenzato da diversi promoter). I promoter alternativi sono molto attivi durante la vita embrionale. Difetti nel funzionamento dei promotori alternativi, possono essere causa di gravi malattie genetiche. Un esempio significativo è la “distrofia muscolare di Duchenne”, dovuta alla mutazione del gene distrofina, che governa la produzione della omonima proteina, componente fondamentale della struttura delle fibre muscolari scheletriche e cardiache. Elementi regolatori prossimali e distali Vedi il paragrafo relativo alla RNA-polimerasi II. RNA polimerasi Introduzione nei negli procarioti a) Solo 1 tipo di RNA- polimeras i eucarioti Differenze c oi proc arioti b) Bolla di trasc rizione a) T ipi di RNA- polime rasi I, II, III (IV, V, mitoc ondriale, c ) Promotore b) Fattori di trasc rizione d) Fattore sigma e) Fasi della trasc rizone -Inizio -allungamento -fine c loroplatic a) generali c ) Attivatori, repressori, c o- attivatori, c orepressori e c omplesso mediatore. d) Promotori • per l’RNA- polimeras i c ore + UCE I • per l’RNA- polimeras i II nuc leo promotore BRE +T AT A-box + Elemento iniziatore + DPE + MT E elementi regolatori prossimali CCAAT -box + GC-box +CRE elementi regolatori distali Enhanc ers + silenc ers + insulators + LCR + MAR • per l’RNA- polimeras i - T ipo T ipo T ipo T ipo 1 2 3 4 III (int.): boxA, boxC (int.): boxA, boxB (est.): T AT A, Oc t , PSE (misto): T AT A, T F, boxA, boxB e) Elementi regolatori prossimali e distali …solo per la RNA- polimeras i II 1 L’RNA-7SL è il principale componente della particella di riconoscimento del segnale (SRP = signal recognition particle), una ribonucleoproteina (composta da RNA-7SL e circa 6 proteine) che si lega in corrispondenza dell’uscita del tunnel ribosomiale. Il suo compito è quello di riconoscere, legare e trasportare le proteine destinate al reticolo endoplasmatico (vedi paragrafo relativo nel capitolo sulla traduzione). 6 Citologia 20 – Trascrizione
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