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ANTICORPI MONOCLONALI - e

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“Tecniche basate sull’impiego degli anticorpi”
Il materiale presente in questo documento viene distribuito solamente per
uso interno ed esclusivamente a scopo didattico.
Anticorpo o immunoglobulina!
IL legame antigene-anticorpo e’una reazione reversibile!
Ag + Ab
Ag-Ab!
AFFINITA’: la forza
d’interazione tra il sito
combinatorio di un
anticorpo e l’epitopo
antigenico ed e’ la
sommatoria di tutte le
interazioni non covalenti !
Si esprime come la
concentrazione di antigene
necessaria per saturare il
50% dei siti combinatori
ANTIGENE
ANTICORPO
AVIDITA’: e’ la somma della interazioni!
Avidita’
bassa
Affinita’ !
=!
Avidita’!
alta
molto alta
PRODUZIONE CLONALE DEGLI ANTICORPI
ANTIGENI MULTIVALENTI
LA RISPOSTA ANTICORPALE IN VIVO E’ DI TIPO POLICLONALE!
popolazione linfocitaria!
proteina esprimente!
2 epitopi antigenici !
espansione clonale dei linfociti B!
specifici per l’antigene !
!
Kohler G, Milstein C.
Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.
Nature. 1975 Aug 7
ANTICORPI MONOCLONALI (mAb)
• Specificità definita e omogenea
• Isotipo omogeneo
• Elevata affinità
• Produzione in grande quantità
• Disponibilità illimitata
• Elevata purezza
The Nobel Prize in
Physiology or Medicine
1984
"for theories concerning the
specificity in development and
control of the immune system
and the discovery of the
principle for production of
monoclonal antibodies"
Georges J. F. Khöler
César Milstein
L’anticorpo monoclonale è omogeneo
VANTAGGI
Disponibilità praticamente illimitata
Basso costo
-Specificità per un singolo
epitopo
-Affinita’
-Isotipo
Come vengono prodotti gli anticorpi monoclonali?
1. Immunizzazione di un topo con l’antigene A
Antigene A
Prelievo della milza
Purificazione dei linfociti
Come vengono prodotti gli anticorpi monoclonali?
1
2
Cellule della milza Cellule di mieloma
che producono che hanno perso
anticorpi
l’enzima HGPRT
3
Fusione cellulare (ibridoma)
Come vengono prodotti gli anticorpi monoclonali?
1
2
4
Trasferimento nel medium HAT
Cellule della milza Cellule di mieloma
che producono che hanno perso
anticorpi
l’enzima HGPRT
Soltanto le cellule “IBRIDE”
sopravvivono
5 Selezione cellule d’ibridoma che producono
gli anticorpi specifici per l’antigene A
3
Cellule mischiate e fuse
6
Clone dell’ibridoma selezionato
Caratteristiche della linea di mieloma
1.  E’ immortale
2.  Non secerne immunoglobuline
3.  Manca dell’enzima HGPRT (hypoxanthine guanine
phosphorybosyl transferase) e quindi:
NON CRESCE IN TERRENO SELETTIVO HAT (Hypoxanthine,
Aminopterin, Thymidine)
GLI ANTICORPI MONOCLONALI (mAb)
Sono prodotti da una singola plasmacellula immortalizzata
mediante fusione somatica con una cellula tumorale B mutante
IBRIDOMA
ANTICORPI MONOCLONALI
selezione in terreno HAT
i sopranatanti di coltura vengono sottoposti
a screening: ELISA, citofluorimetria, Western
Blot
selezioni di cloni ad elevata affinità
PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI
Generazione di ascite
(5-20 mg/ml)
Biofermentatori (5 mg/ml)
purificazione mediante cromatografia di affinità
ANTICORPI UTILIZZATI IN LABORATORIO
specie di produzione
- monoclonale
topo, ratto - policlonale uomo, coniglio,
capra, pecora, ratto…
APPLICAZIONI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI
In vitro (diagnostica)
• Identificazione di popolazioni cellulari immunoistochimica
microscopio
ottico
immunocitochimica
esprimenti marcatori specifici
immunofenotipo
citofluorimetria
• Identificazione e dosaggio
Elisa, ria
•  di antigeni solubili
In vivo (diagnostica o terapeutica)
• Diagnostica per immagine
• Terapia (farmaci biologici)
a flusso
Su vetrino
IMMUNOFENOTIPO
In sospensione
sospensione cellulare
da tessuti solidi
CD4
Immunofenotipo
leucocitario
•  L’immunofenotipizzazione è basata sull’identificazione di
antigeni di superficie, citoplasmatici o nucleari, per mezzo di
anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromi.
La presenza di un dato antigene è, infatti, un indicatore
dell’appartenenza di una cellula ad uno stipite e/o ad un definito
stadio differenziativo o funzionale.
•  Mediante immunofenotipizzazione e’ possibile quantificare
diverse popolazioni cellulari.
CD3
Analisi del fenotipo linfocitario
1. 
2. 
3. 
4. 
Valutazione della % di diverse popolazioni o sottopopolazioni
Valutazione della distribuzione nei tessuti
Monitoraggio dei linfociti nel corso di patologie o terapie
Valutazione funzionale dei linfociti
Gli stipiti cellulari
ematopoietici sono
identificabili mediante
anticorpi monoclonali
PANNELLO DI ANTICORPI MONOCLONALI UTILIZZATI PER
L’ANALISI DEL FENOTIPO DI LEUCOCITI DI SANGUE PERIFERICO
Anti-CD45
leucociti
Anti-CD3
Anti-CD4
Anti-CD8
linfociti T
Anti-CD19
linfociti B
Anti-CD56
Anti-CD16
cellule NK
Anti-CD14
monociti
La tipizzazione delle cellule emopoietiche
può essere eseguita su materiale
proveniente da vari compartimenti:
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Sangue periferico;
Midollo osseo;
Liquido cefalorachidiano;
Liquido pleurico;
Liquido pericardico;
Broncolavaggio alveolare;
Tessuto solido dopo allestimento di una sospensione cellulare
monodispersa
PERCENTUALE DI LEUCOCITI NEL SANGUE
- Neutrofili
- Eosinofili
- Basofili
- Monociti
- Linfociti
60-70
2-5
<1
3-7
20-30
LINFOCITI T
CD3
58-88%
LINFOCITI B
2-19 %
CELLULE NK
2-28%
CD3+CD4+
CD3+CD8+
30-62%
17-42%
Il campione biologico: Sangue intero eparinato o PBMC
(PBMC)
Immunofluorescenza
–  Diretta:
Le cellule in sospensione vengono marcate con un anticorpo
fluorescente (anticorpo coniugato)
– Indiretta:
Le cellule in sospensione vengono marcate con un anticorpo non
coniugato (anticorpo primario) seguito da quello coniugato
(anticorpo secondario)
I Fluorocromi
•  Ogni fluorocromo ha spettri di eccitazione e di
emissione caratteristici.
•  Se vengono usati più fluorocromi per analisi
multiparametriche, le loro emissioni devono
essere sufficientemente distanti tra loro per potere
essere distinte da ciascun fotomoltiplicatore
(PMT).
LA PRESENZA DI PIU’ LASER
CONSENTE L’ANALISI
CONTEMPORANEA
DI OLTRE 10 PARAMETRI
(ANTIGENI)
Il citometro a flusso: consente di identificare le singole cellule in base
all’espressione di antigeni di superficie
1 Una miscela di cellule è marcata con anticorpi fluorescenti
2
Le cellule vengono fatte
passare attraverso un foro
formando un flusso continuo
che passa attraverso un
raggio laser
3
Un tubo fotomultimetro capta
la luce diffusa da ogni
singola cellula dando
un’idea della grandezza e
della granulosita’ della
cellula stessa, e l’emissione
dei diversi coloranti
fluorescenti
Flusso continuo delle cellule
marcate con anticorpi
4
Computer:
analisi
dati
Rappresentazione della fluorescenza:
Istogramma ad un parametro e a due parametri
Two Parameter Histogram
Number of Cells
Unstained cells
FITC-labeled cells
Green Fluorescence Intensity
Green Fluorescence Intensity
One Parameter Histogram
Red Fluorescence Intensity
“GATING” sui PARAMETRI FISICI
Le cellule isolate dal
sangue periferico si
colorano con anticorpi
coniugati a
fluorocromi:
?
Determiniamo qual’e’
la % di linfociti T CD3+CD8+ in un
campione di sangue periferico.
Anti-CD3-APC+
Anti-CD8-PE
Citometro a flusso
monociti
linfociti
?
Determiniamo qual’e’
la % di linfociti T CD3+CD8+ in un
campione di sangue periferico.
monociti
linfociti
38%
19%
CD3+CD838%
CD3
10%
CD8
3%
CD3-CD810%
CD3+CD8+
19%
CD3-CD8+
3%
ANALISI CITOFLUORIMETRICA DEI LINFOCITI T CD4+ E CD8+
DI UN PAZIENTE CON INFEZIONE DA HIV
CD4+
CD4+
Studio dei basofili attivati in Citofluorimetria a Flusso
CD63 FITC/CD123 PE/HLA-DR PerCP
CD63
Strategia di gating
Espressione di marcatori tipici per leucemie e linfomi
Agammaglobulinemia di BRUTON
legata al cromosoma X
Analisi funzionale: produzione di citochine
Stimolazione, Permeabilizzazione, Colorazione per
l’analisi delle citochine intracellulari
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