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10. Proteine ricombinanti

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Cromosoma
del batterio
“donatore”
Trasferimento della ORF
nel vettore di espressione
PRODUZIONE DELLA
PROTEINA RICOMBINANTE
Abbondante e facilmente purificabile
Contiene una
ORF continua !!
Retrotrascrizione
in
cDNA
5’ NT “non tradotto”
3’ NT
PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE polyA+
Catene di oligo dT
legate alla matrice
Si generano
estremità “piatte”
TESSUTO O COLTURA CELLULARE
COSTRUZIONE DI UNA
“LIBRARY” DI cDNA
mRNA
cDNA
Inserimento nel vettore
Trasformazione
in cellule batteriche
“SCREENING”
PIASTRA “PETRI” DA 10 cm
Fosforilazione al 5’OH
i deossi-oligonucleotidi sintetici
hanno sempre il 5’ con solo un OH
Nitrocellulosa
trattata con NaOH:
•Lisi delle cellule batteriche
• Legame covalente
del DNA al supporto
• Denaturazione del DNA
1. “Ibridazione” in liquido
2. Lavaggi
3. Autoradiografia
ds cDNA
sonde
degenerate
Denaturazione (NaOH)
e
ibridazione
5’
5’
5’
Fosforilazione al 5’OH
i deossi-oligonucleotidi sintetici
hanno sempre il 5’ con solo un OH
C
8h
12h 15h
Proteina “ricombinante”
Biofarmaci o Farmaci proteici
In un primo tempo solo come farmaci che “replicano la funzione”.
La loro attività è uguale a quella naturale.
Le proprietà farmacologiche non sono “migliorate”
rispetto al prodotto naturale
PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI
DI PRIMA GENERAZIONE
Proteine identiche a quelle naturali
INSULINA
ERITOPOIETINA
G-CSF
FATTORI ANTIEMOFILICI
VACCINI RICOMBINANTI
DI SECONDA GENERAZIONE
Proteine che sono state manipolate (muteine)
VACCINI RICOMBINANTI
tPA
INSULINA
ANTICORPI
L’INSULINA
E’ UNA PROTEINA DI SECREZIONE
Sequenza (o peptide) segnale
Sequenza di inizio della traslocazione al RER
•
Peptide segnale
•
che verrà
prontamente
digerito dalla
peptide-segnalepeptidasi
Pre-proinsulin:
per la secrezione dal pancreas è presente anche
il peptide segnale all’ N-terminale
Il peptide segnale
Si perde dopo l’entrata
nel RER
Espressione
di
INSULINA UMANA
ricombinante
in batteri
Aggiunta di un peptide segnale
per facilitare la purificazione
(proteina nel “sopranatante”)
Purificazione del r-hGH
dal terreno di coltura
(dopo centrifugazione)
Ormone della crescita umano
hGH
PROTEINE DI SECREZIONE
IN BATTERI
Prima la
SINTESI
e poi la
SECREZIONE
Taglio del
peptide segnale
CREAZIONE DI PROTEINE
IBRIDE
CON L’ AGGIUNTA DI
SPECIFICI
DOMINI PROTEICI
“PROTEINE DI FUSIONE”
PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI
DI PRIMA GENERAZIONE
Proteine identiche a quelle naturali
INSULINA
ERITOPOIETINA
G-CSF
FATTORI ANTIEMOFILICI
VACCINI RICOMBINANTI
DI SECONDA GENERAZIONE
Proteine che sono state manipolate (muteine)
VACCINI RICOMBINANTI
tPA
INSULINA
ANTICORPI
Azione della Pol I
In vitro
si usa
il frammento di Klenow
MUTAGENESI
SITO-SPECIFICA
Oligonucleotide-diretta
MUTAGENESI
SITO-SPECIFICA
Oligonucleotide-diretta
DUPLICAZIONE
SEMI-CONSERVATIVA
Codice genetico
Ridondante (degenerato)
Codoni sinonomi
Non ambiguo
Universale (quasi !)
Letto in direzione 5’ – 3’
Produce polipeptide in direzione NH2 - COOH
Senza punteggiatura
Un mRNA ha un solo “frame” di lettura (determinato da AUG)
Mutagenesi oligonucleotide-diretta
INSULINA
INSULINA Lys-Pro: inversione in posizioni 28 e 29
oppure mutazione Pro/Asp
maggiore solubilità e minore formazione di polimeri.
Altre mutazioni per causare precipitazione a pH neutro dopo iniezione
per un rilascio graduale
Insulina per via orale
Mutagenesi oligonucleotide-diretta
ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO
VACCINO PER LA PERTOSSE
MUTAGENESI
SITO-SPECIFICA
Utilità nella
ricerca di base
Utilità a
fini applicativi
TNF - Tumor Necrosis Factor
• Induttore della via estrinseca della apoptosi (recettori di morte)
• Regolatore del sistema immunitario
• Citochina prodotta dai macrofagi, con un ruolo chiave nella
regolazione della risposta infiammatoria
– Elevati livelli ematici presenti in condizioni patologiche (artrite
reumatoide , spondilite anchilosante, inflammatory bowel disease /
Crohn’s disease)
– Farmaci che ne bloccano l’azione sono utili nel controllo di tali patologie
DOMINANTI NEGATIVI
TNF
TRIMERO DEL
RECETTORE
del TNF
TNF
TNF
Mutato
Dominante
negativo
Un trimero recettoriale
si forma e si attiva
interagento con
tre molecole di TNF
Vaccino ricombinante
per la pertosse
ADP-ribosilasi
Tossina attiva
Enzima inattivo
Proteina non tossica
Tossicità mediata da ADP-ribosilazione
di proteine G
ADP-ribosilazione
NAD +
CONCENTRAZIONE DI
ANTICORPI SPECIFICI
NEL SIERO
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