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15 anni di esperienza (Fabio Manoni)

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Il ruolo della
citofluorimetria nella
diagnostica urinaria
15 anni di esperienza
Fabio Manoni
I controllo
I controllo pre terapia
Risultato urinocoltura = Positiva
Specie batterica isolata: Enterococcus
faecius
III controllo dopo 48 ore dalla terapia
Risultato urinocoltura = Positiva
III controllo
II controllo
II controllo dopo 24 ore dalla terapia
Risultato urinocoltura = Positiva
Gli ultimi 15 anni hanno
profondamente modificato
l’approccio all’esame delle
urine in virtù delle nuove
tecnologie utilizzate nell’analisi
della frazione corpuscolata
Le nuove tecnologie hanno
determinato un notevole
miglioramento della qualità
analitica, dell’organizzazione
dei processi ed una
riconsiderazione in chiave
clinica dell’esame urine
NUOVE TECNOLOGIE,OPPORTUNITÀ DI:





Creare un nuovo esame che, focalizzando
gli stessi parametri valutati in microscopia,
ne permetta una migliore definizione
Esaminare urina nativa (eliminando le
variabili preanalitiche tipiche
dell’allestimento dei preparati per l’esame
microscopico)
Riduzione dei tempi di processo
(eliminando tempi dannosi alla
conservazione del campione)
Eliminare la soggettività della lettura al
microscopio
Misurare con migliore precisione ed
accuratezza i principali elementi
corpuscolati
Analizzatori automatizzati del
sedimento
analizzano l'urina
nativa
Centrifugazione
Concentrazione
Risospensione
(colorazione)
Allestimento
preparato
microscopico
FASE ANALITICA
New screening diagnostic techniques in urinalysis.
Delanghe J. CCA 2004
New technological evolutions have enabled new diagnostic approaches in
urinalysis. Urinary flow cytometry and automated microscopic
pattern recognition are two new techniques that are characterised
by a much better imprecision and a higher throughput as
compared to conventional microscopy of the urine sediment.
Although these new techniques are well suited for the routine clinical
laboratory for screening and diagnostic purposes, trained technicians are
still required to verify, and if necessary, to correct by visual microscopy.

Per i i già citati motivi (analisi su urina nativa, in tempo
reale, performances analitiche, standardizzazione) per
l’esame della frazione corpuscolata, in routine di media
ed alta intensità, è raccomandata l’analisi
automatizzata, con le diverse tecnologie oggi disponibili:
citofluorimetria, sistemi ad analisi d’immagine.
Chien TI 2007
FASE ANALITICA

L’esame microscopico come unico
sistema per l’esame della frazione
corpuscolata, è raccomandabile solo in
realtà con piccole routine e/o su casi
clinici selezionati; risulta a tutt’oggi il
gold standard per lo studio morfologico e
quale approfondimento della routine
automatizzata.
RIMeL / IJLaM 2010; 6
Esame delle urine, è tempo di cambiare
F. Manoni, S. Valverde, A. Caleffi, M. Alessio, G.
Gessoni, P. Cappelletti Gruppo di Studio SIMeL Esame
Urine
La situazione del Veneto




Alla fine del 2012 abbiamo inviato un
questionario a tutti i Laboratori
“Hospital Based” della Regione
Hanno risposto 37/38
27/28 Laboratori situati in Ospedali
Pubblici
10/10 Laboratori situati in Ospedali
Privati Convenzionati
11
Carico di Lavoro
12
Strategia Analitica
13
Tipologia Analizzatori
14
Imprecisione analitica
Valutata su 15 campioni di urina di pazienti
esterni ed interni, con concentrazioni diverse di
ciascun analita urinario in modo da coprire un
ampio range analitico
 Ciascun campione è stato aliquotato in cinque
provette, con sistema sottovuoto dal contenitore
di raccolta primario
 I 15 campioni sono stati analizzati in cinque serie
analitiche distinte, disponendo i campioni in
modo casuale in ciascuna serie analitica
 I risultati sono stati elaborati calcolando Media,
SD, C.V.%

16
Manoni et al. Minerva Medica 2009
Profilo imprecisione Eritrociti
303,0
3,22
314,6
2,00
469,9
1,88
574,4
1,23
609,8
1,01
779,4
1,56
1330,5
1,05
1354,6
0,79
10,00
5,00
0,00
1400
7,54
1300
147,9
15,00
1200
4,81
1100
70,7
20,00
1000
13,50
900
14,6
25,00
800
18,35
700
8,7
30,00
600
17,97
500
6,3
400
14,40
300
3,7
200
23,18
100
3,1
0
C.V. %
C.V.%
Media
RBC/µl
Media (RBC/uL)
17
Profilo imprecisione Leucociti
Media
WBC/µl
C.V. %
5,2
6,23
5,6
5,40
12,2
5,58
17,2
5,00
38,7
4,59
47,1
3,99
70,0
4,36
95,4
2,78
120,4
1,57
2.00
219,9
4,78
1.00
235,5
2,35
0.00
366,1
1,52
920,3
1,73
1081,0
3,68
1383,9
5,64
7.00
6.00
4.00
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
3.00
0
C.V.%
5.00
Media (WBC/uL)
18
P. imprecisione Cellule Epiteliali
Media
EC/µl
C.V. %
3,9
13,62
5,4
5,38
5,5
8,13
8,6
4,67
11,1
3,79
12.00
11,7
11,61
10.00
19,6
7,29
22,9
4,70
24,8
2,86
26,9
4,87
28,2
5,11
56,8
4,14
57
4,13
101,5
1,97
121,4
1,38
16.00
8.00
6.00
4.00
2.00
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0.00
0
C.V.%
14.00
Media (EC/uL)
19
P. imprecisione Cilindri
Media
CAST/µl
C.V. %
0,00
0,00
0,32
11,91
0,41
18,81
0,45
20,99
1,37
5,78
1,55
14,83
1,61
14,61
2,07
5,18
2,66
5,49
10.00
2,72
15,40
5.00
3,00
10,59
3,61
2,82
4,41
8,15
5,10
4,20
5,50
14,60
25.00
15.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0.00
C.V.%
20.00
Media (CAST/uL)
20
Profilo imprecisione Batteri
14.00
12.00
30,4
4,17
60,1
7,30
79,8
9,15
221,9
3,06
4.00
309,5
3,25
2.00
961,6
4,72
0.00
5329,0
2,56
5503,2
2,04
7720,3
3,31
8993,4
2,00
9364,6
7,77
12333,3
11,65
8.00
12000
11000
10000
9000
6.00
8000
C.V.%
10.00
7000
11,51
6000
25,9
5000
10,94
4000
23,1
3000
6,50
2000
10,3
1000
C.V. %
0
Media
BACT/µl
Media (BACT/uL)
21
Profilo
imprecisione Miceti
Media
LIEVITI
/µl
C.V. %
10,2
6,57
21,3
7,28
38,6
5,22
40,5
3,38
53,6
6,07
6.00
80,5
1,64
5.00
93,7
3,66
105,1
5,73
162,2
2,39
1.00
380,3
2,67
0.00
388,6
2,35
406,2
6,28
723,6
1,78
1188,9
1,89
1526,1
2,92
8.00
4.00
3.00
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
2.00
0
C.V.%
7.00
Media (BACT/uL)
22
23
Accuratezza vs
Metodo di Riferimento manuale



Valutazione di 215 campioni di pazienti
esterni ed interni
Conteggio a microscopio effettuato da due
operatori in camera Fuchs-Rosenthal con
Microscopio a Contrasto di Fase su urina
nativa non centrifugata, secondo metodo di
riferimento internazionale
Analisi svolte entro 2-4 ore dall’arrivo dei
campioni in laboratorio
24
Risultati: correlazione Emazie
Regressione lineare RBC
y = 0.95x -20.12
r2 = 0.96
Correlazione Pearson
p<0.0001
Valori su scala logaritmica
Ottima correlazione, statisticamente significativa,
rispetto al metodo di riferimento manuale
25
Correlazione Leucociti
Valori su scala logaritmica
Regressione lineare WBC
y = 1.01x + 31.9
r2 = 0.99
Correlazione Pearson
p<0.0001
Ottima correlazione, statisticamente significativa,
rispetto al metodo di riferimento manuale
26
Correlazione Cellule Epiteliali
Regressione lineare EC
y = 0.96x + 1.10
r2 = 0.92
Valori su scala logaritmica
Correlazione Pearson
p<0.0001
Ottima correlazione, statisticamente significativa,
rispetto al metodo di riferimento manuale
27
Risultati: correlazione Cilindri
Regressione lineare CAST
y = 0.92x + 0.56
r2 = 0.48
Valori su scala logaritmica
Correlazione Pearson
p<0.0001
28
Correlazione discreta, statisticamente significativa, rispetto al metodo di riferimento
manuale. Sovrastima dei conteggio UF-1000 rispetto al metodo manuale
29
Accuratezza Diagnostica
AUC
Curva
ROC
Cut-Off
UF-1000
(cells/uL)
SE
SP
VPN
VPP
IBC
RBC
0.96
10
97,1%
94,0%
96,9%
94,4%
95,6%
WBC
0.99
10
99,1%
92,8%
98,9%
93,9%
96,1%
EC
1.00
7
97,8%
96,4%
98,2%
95,8%
97,1%
CAST
0.92
1
88,9%
85,3%
98,1%
48,0%
85,8%
YEAST
0.92
>0
87,1%
93,1%
97,6%
69,2%
92,2%
30
Applicazioni “speciali” della
Citofluorimetria Urinaria
Possibilità di applicazioni particolari:
◦Valutazione della morfologia eritrocitaria
◦Screening Batteriuririe
◦Predittività della risposta al trattamenti
antibiotico
◦Differenziazione presuntiva delle infezioni
sostenute da germi Gram positivi e Gram
negativi
32
◦Conduttività
Conteggio Batteri Sysmex UF1000i nello screening delle
Infezioni Urinarie
Differenze statisticamente significative
tra campioni Negativi e Positivi (p<0.0001) e tra gruppi a diversa carica
UFC/mL (p<0.0001)
34
Manoni et Al. 2009 Microbiology and Inf dis.
Curve ROC Batteri UF-1000i
Positività Esame Colturale >=10^5 UFC/mL
AUC = 0.99
35
Applicazioni in Microbiologia
Manoni et al. RIMEL 2009, Manoni et al. CMI 2009,
Gessoni et al CCA 2010, Manoni et al. BC 2012,
36
CITOMETRIA URINARIA E
FOLLOW UP







Nel
2009
sono
state
considerate
3378
urinocolture in pazienti interni
I campioni positivi erano 1217 (36%)
In 135 casi (11% dei positivi e 4% del totale) vi
era ripetizione dell’esame con esito positivo
entro una settimana
Questi casi sono stati considerati indice del
fallimento della terapia
Abbiamo allestito uno studio caso controllo
arruolando un “responder” per ogni “non
responder”
I dati riportati di seguito si riferiscono a 79
coppie di pazienti
37
Responder
Non Responder
WBC
BACT
Risultati


In base ai dati ottenuti nel presente
studio possiamo suggerire che una
riduzione della batteriuria pari al 70% a
t24 suggerisca una buona risposta alla
terapia
Utilizzando il cut-off specificato abbiamo
ottenuto SE=0.96, SP=0.96, PPV=0.95,
Gessoni et al CCA 2010
NPV=0.96
39
Il principale ruolo del rene
nella produzione di urine
concentrate o diluite è
nella generazione e nel
mantenimento del soluto
midollare ipertonico
rispetto al plasma e la
definizione di un
meccanismo per il bilancio
osmotico tra la midollare
.
ed i dotti collettori
L’esordio di patologie croniche renali,
glomerulonefriti, sindrome nefrotica,
polidipsia e diabete insipido riducono
l’escrezione di urine fortemente
concentrate.
La diversa quantità di soluti modifica
le proprietà fisiche dell’urina:
•Pressione osmotica,
•Punto di ebollizione,
•Punto di congelamento
•Conduttività.
Conduttività
Conduttività
La conduttività appare legata alla osmolalità poiché
entrambe sono dipendenti dalla concentrazione di soluti ionici
nelle urine.
 La conducibilità elettrica o conducibilità specifica costituisce
una misura della capacità di un materiale di condurre una
corrente elettrica. Quando una differenza di potenziale
elettrico viene posto attraverso un conduttore, il suo flusso
mobile di cariche, dando origine ad una corrente elettrica.
 La conducibilità σ è definito come il rapporto tra la densità di
corrente per l'intensità del campo elettrico. Conducibilità è il
reciproco (inverso) di resistività elettrica e ha le unità SI
Siemens per metro (S • m-1) ovvero se la conduttanza
elettrica tra le facce opposte di un 1 metro cubo di materiale
è 1 Siemens quindi la conduttività elettrica del materiale è di
1 Siemens per metro.
45






Conduttività: reflette la proprietà di
una soluzione di condurre la corrente
elettrica current. It is a direct measure
for the dissolved ion concentration.
The electrical current is generated by
the stream of present electrons (in UFseries: stream of electrons from one
electrode to the other in diluted urine)
The unit of the conductivity C is the
reciprocal value of the specific electrical
resistance P:
C = Ω -1 · cm -1 with Ω -1 = S
(Siemens)
UF shows mS/cm
La densità relativa delle urine è il rapporto
tra la loro densità e quella dell’acqua e
dipende dal numero e dal peso delle
particelle di soluto nel campione:
Density = (Na).0,361+(K).0,355+(Cl).0,716+(Glucose).0,369+(Urea).0,238
L’osmolalità
Dipende esclusivamente dal numero delle
particelle di soluto:
mosmol.l=(Na).0.92+(K).0,93+(Cl).1,8+ (glucose).1,12+(Urea).0,973
35,0
y = 0,0239x + 3,0552
R2 = 0,8045
r = 0,8970
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
HEALTHYS
0,0
0
200
400
600
800
1000
1200
Osmolality calculated
measured
Conductivity measured
HEALTHYS Conductivity vs Osmolality (mS/cm)
Relative density
1400
1025 y = 0,0508x + 1001,8
R2 = 0,5783
1020
r = 0,7604
1015
1010
1005
1000
0
100
200
300
calculated
400
500
Electrolyte
HEALTHYS
HEALTHYS
Creatinine
y = 348,7x + 1141,3
2
R = 0,4600
10000
r = 0,6782
5000
0
5,0
10,0
15,0
20,0
Conductivity
25,0
15,0
20,0
Conductivity
Conductivity vs Creatinine
15000
0,0
700
600 y = 18,77x - 41,17
2
R = 0,8373
500
r = 9150
400
300
200
100
0
0,0
5,0
10,0
Conductivity vs Electrolyte
30,0
35,0
25,0
30,0
35,0
Electrolyte
HEALTHYS
700
600 y = 18,77x - 41,17
2
R = 0,8373
500
r = 9150
400
300
200
100
0
0,0
5,0
10,0
Conductivity vs Electrolyte
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
Conductivity
MGUS
400,0
300,0
conductivity vs electrolytes
40
y = 17,602x - 34,827
R2 = 0,8116
r = 0,9001
electrolytes
electrolyte
500,0
DIABETICS
Conductivity vs electrolyte
200,0
100,0
0,0
y = 0,0374x + 5,8274
R2 = 0,5198
r = 0,7209
20
30
10
0
0
5
10
15
Conductivity
20
25
30
0
100
200
300
conductivity
400
500
600
Conductivity correlation with other
Surrogates Markers of Urine Osmolality
and Renal Diuresis
Subjects
Normal
Diabetics
MGUS
N
Relative
Density
Sum Na K Cl
Creatinine
r = 0,7797
r = 0,9150
r = 0,6782
P < 0,001
P < 0,0002
P < 0,003
r = 0,5949
r = 0,7209
r = 0,5507
r = 0,096
P < 0,001
P < 0,001
P < 0,001
P > 0,05
r = 0,5533
r = 0,9001
r = 0,5106
r = 0,2253
P < 0,001
P < 0,0002
P < 0,001
P >0,05
Glucose
Protein
70
42
28
Conduttività




E’ influenzata dalla concentrazione urinaria di
soluti carichi elettricamente (ioni)
Non risente di altri soluti quali: glucosio,
proteine, mezzi di contrasto iodati, glicole.
Esprime quindi assai bene la capacità del rene
di concentrare le urine.
Differenze significative in base all’età ed al
sesso
53
CONDUCTIVITY ON ROUTINE URINALYSIS IN
OUTPATIENTS
subjects
number
mean value
Standard
deviation
PRU<0,2
25.738
17,6
5,9
PRU>0,2
3.327
18,8
6,1
DIABETIC
1.349
17,4
5,7
TOTAL
30.414
17,7
6,0
FEMALE
6.000
16,8
5,5
MALE
6.000
19,3
6,3
Conduttività

Confronto su 180
campioni dei valori di
Conduttività UF-1000i vs
UF-100

I risultati evidenziano piena
sovrapponibilità di valori

I risultati di Conduttività di UF1000i hanno quindi la stessa
utilità diagnostica di UF-100,
già documentata in studi
precedenti
Manoni et Al 2009 Minerva Urologica
CONCLUSIONI

Il nuovo esame delle urine quindi è in
grado di dare in mani esperte
performances analitiche di gran
lunga migliori rispetto a quello
possibile con metodi tradizionali,
soprattutto in routine medio alte,
quantifica in modo affidabile gli
elementi corpuscolati, processa il
campione in tempo reale,
selezionando opportunamente gli
approfondimenti sia morfologici che
microbiologici.
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