TROMBOPLASTINA S

LABSHOP s.r.l.
TROMBOPLASTINA S
Tempo di Protrombina secondo Quick (PT)
CONFEZIONE: conservazione e stabilità
Per uso diagnostico in vitro
1001 – 10x4 mL
Conservare in frigo a +2/8°C. Stabile fino alla data di scadenza
riportata sulla confezione.
PRECAUZIONI/SIMBOLI DI PERICOLOSITA’
PRINCIPIO
Il PT viene utilizzato come strumento di screening e come test
quantitativo per i fattori di coagulazione della via estrinseca e
comune. Il Tempo di PT è prolungato nei pazienti affetti da patologie
congenite o acquisite che riducono l’attività dei fattori I (fibrinogeno),
II (protrombina), V, VII e X. Il PT viene inoltre largamente utilizzato
per monitorare la terapia anticoagulante per via orale.1,2 Gli
anticoagulanti assunti per via orale riducono l’attività della vitamina K
in base ai fattori di coagulazione (II, VII, IX, X, proteina C e proteina
S) con conseguente prolungamento del PT.
Il kit misura il Tempo di Protrombina cioè il tempo di coagulazione del
plasma dopo aver aggiunto il fattore tissutale (tromboplasina) e il
calcio.
La ricalcificazione del plasma, in presenza del fattore tissutale, attiva il
Fattore Xa. Quest’ultimo attiva, a sua volta, la protrombina in trombina
che converte il fibrinogeno in un coagulo di fibrina insolubile.
CAMPIONI
Plasma fresco in Citrato trisodico al 3,2 % (0.105 M).
Raccolta dei campioni e loro conservazione.
1.
Effettuare il prelievo evitando emolisi e contaminazioni e
miscelare immediatamente il sangue con l’anticoagulante.
( 9 volumi di sangue ed 1 volume di Citrato trisodico 3.2 %).
2.
Centrifugare a 1500 x g per 15 minuti.
3.
Testare entro 2 ore se i campioni si sono mantenuti a 22-24°C.
Se il test non viene completato entro le 24 ore, congelare il
plasma a -20°C per un massimo di 2 settimane oppure a -70°C
per un massimo di 6 mesi.
Per ulteriori dettagli circa la raccolta e la conservazione dei campioni
vedere il documento NCCLS3.
REATTIVI
Reattivo
Liofilo
Il preparato, secondo la normativa vigente, non è classificato come
pericoloso.
Maneggiare tuttavia il prodotto con cautela, secondo le norme di buona
pratica di laboratorio, evitando l’ingestione, il contatto con la pelle, gli
occhi, le mucose. Tutti i campioni devono essere trattati come
materiale potenzialmente infetto da HIV o Epatite.
PREPARAZIONE E STABILITA’ DEL REATTIVO
2.6 %
2%
1.34 %
0.7 %
0.7 %
0.13 %
0.05 %
0.013 %
Nessuna
100 %
0.5 ml
-
1+1
50 %
0.5 ml
0.5 ml
1+2
33 %
0.5 ml
1 ml
1+3
25 %
0.5 ml
1.5 ml
1+7
12.5 %
0.5 ml
3.5 ml
Di ogni diluizione determinare il tempo di coagulazione in doppio o
triplo.
Costruire una curva di taratura riportando le percentuali contro i
rispettivi tempi.
2. RATIO
Tempo di Protrombina (Campione in esame)
RATIO = ——————————————————
Tempo di Protrombina (Pool Plasmi normali)
Reattivo:
Liofilo
Ricostituire il contenuto di un flacone di Reattivo con 4 mL di acqua
distillata.
Miscelare delicatamente senza capovolgere e lasciar riposare per 15
minuti a temperatura ambiente.
Stabilità del reattivo ricostituito: 8 ore a 37°C o 7 giorni a 2-8°C.
(NON CONGELARE).
Portare il reattivo a temperatura ambiente prima dell’uso.
3. I.N.R. = RATIOISI
Per standardizzare il test, l’Organizzazione mondiale della Sanità
(OMS) consiglia di esprimere i risultati come INR ( International
Normalized Ratio)4.
L’INR viene calcolato partendo dal valore della RATIO secondo la
formula:
INR = RATIO ISI
PROCEDIMENTO
Ad esempio, con un ISI = 1 ed un valore RATIO = 3.2 , l’INR sarà:
Dispensare il campione in una provetta di plastica o in vetro siliconato
come riportato nello schema:
Campione
100 μL
Incubare circa 2 minuti a 37°C
Reattivo (preriscaldato a 37°C)
200 μL
All’aggiunta del reattivo far partire il cronometro e registrare il tempo
per la formazione del coagulo.
Eseguire la determinazione in doppio (la differenza tra i due tempi non
deve risultare superiore al 5%, in caso contrario effettuare un terzo
test)
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Tessuto cerebrale di coniglio
Glicina
Tricina
Solfato di sodio
Polietilenglicole
Calcio cloruro
Brij – 35
Sodio azide
Diluizione
Valore %
Plasma
NaCl 9 g/l
Il Tempo di Protrombina si può esprimere in tre modi:
•
Percentuale (Fattore di Quick)
•
Ratio
•
I.N.R. (International Normalized Ratio)
1. PERCENTUALE
Preparare 5 diluizioni scalari di un pool di plasmi normali come da
tabella:
INR = (3.2)1 = 3.2
L’ISI (International Sensitivity Index) rapporta la sensibilità della
Tromboplastina ai fattori della coagulazione.
I valori ISI vengono assegnati in rapporto ad un materiale di
riferimento primario.
I reagenti particolarmente sensibili hanno un valore ISI basso.
Conformemente alle raccomandazioni dell’ OMS, i valori INR
superiori a 5,5 espongono il paziente a rischio di complicanze
emorragiche.
I pazienti in terapia anticoagulante per via orale stabilizzata devono
mantenere un INR compreso tra 2 e 3,5 a seconda delle indicazioni
cliniche2.
Il valore ISI riportato sull’etichetta è specifico per ogni lotto di
Tromboplastina
VALORI DI RIFERIMENTO
In vari studi, eseguiti in più centri, il prodotto utilizzato su una
popolazione di pazienti normali ha fornito i seguenti risultati:
NUMERO
CAMPIONI
STRUMENTO
UTILIZZATO
PT MEDIO
Ottenuto
40
20
MLATM Electra 1000 CTM
MLATM Electra 900 CTM
13,2
13,7
RANGE
(± 2 DS)
11,4 – 15,0
12,4 – 15,0
LABSHOP s.r.l.
IL ACLTM300/3000
Amelung KC 10 TM
Pacific Hemostasis
Trombo Screen 400C
Pacific Hemostasis
Trombo Screen 200
61
20
38
10,5
12,7
8,9 – 12,1
9,3 – 14,2
13,5
12,2 – 14,8
13,5
12,0 – 15,1
Correlazione PT
r = 0,95
y = 1,01 x + 2,20
N=49
Correlazione INR
r = 0,95
y = 0,82 x + 0,10
Ciascun laboratorio deve stabilire il proprio intervallo di
riferimento.
INTERFERENZE:
Ossalato di sodio, EDTA ed Eparina quali anticoagulanti.
Sostanze quali contraccettivi orali, corticosteroidi, EDTA,
asparaginasi, clofibrato, eritromicina, etanolo, tetraciclina ed
anticoagulanti come eparina e warfarin5 possono allungare il PT.
Il PT può ridursi, viceversa, a causa di sostanze tra cui
antistaminici, butabarbitale, caffeina, contraccettivi orali,
fenobarbital e vitamina K5.
SMALTIMENTO RIFIUTI
CONTROLLO DI QUALITA’
60
Tutti i valori sopra dichiarati devono essere considerati solo come linea
guida.
Il prodotto deve essere smaltito secondo le locali normative in materia
di gestione di rifiuti.
PRESTAZIONI
PRECISIONE:
La precisione è stata accertata testando, con più strumenti, un plasma
normale ed uno patologico.
I CV (%), utilizzando 20 campioni, sono riassunti nella seguente
tabella:
CAMPIONE
Normale
Patologico
MLA Electra
1000 C
1.1 %
2.8 %
Tromboscreen
400 C
1.9 %
2.5 %
Tromboscreen
200
1.9 %
2.3 %
Amelung
KC 10
2.9%
1.1 %
SENSIBILITA’:
La verifica è stata effettuata diluendo un plasma normale combinato
con plasmi carenti in modo da ottenere una concentrazione finale
compresa tra il 10 e il 100 %.
% Fattore
100
50
40
30
20
10
TEMPO DI PROTROMBINA (sec.)
Fattore II
Fattore V
Fattore VII
11,6
11,6
11,8
11,6
13,2
12,6
11,7
13,9
12,8
12,3
14,9
13,5
12,8
15,9
13,9
14,1
18,3
15,2
E’ opportuno unitamente al campione eseguire anche un controllo
normale ed uno patologico ad ogni utilizzo del Kit.
LIMITI DEL METODO
CORRELAZIONE TRA METODI:
Il confronto tra questa Tromboplastina (y) ed altre due del commercio
(x), ha dato i seguenti risulati:
1.
2.
3.
4.
NOTE
8.
2.
3.
4.
Per mantenere la sospensione in condizioni ottimali durante
l’utilizzo, assicurarsi che sia in costante agitazione.
Perdita di vuoto nel flacone, valori errati, valori di controllo oltre
i limiti stabiliti oppure alterazioni del colore potrebbero essere
indice di deterioramento del prodotto.
Campioni torbidi, itterici, lipemici od emolisati potrebbero dare
luogo a risultati errati.
Utilizzare esclusivamente contenitori in vetro siliconato o in
plastica.
Il prodotto può essere utilizzato con qualsiasi metodo: manuale,
meccanico, foto-ottico, nefelometrico ecc.
Per un corretto utilizzo con la strumentazione è indispensabile
attenersi alle raccomandazioni della ditta produttrice dello
strumento.
BIBLIOGRAFIA
L’analisi biochimica della coagulazione comprende una serie di
reazioni influenzate da numerose condizioni preesistenti all’analisi
stessa e, pertanto, per ottenere risultati riproducibili è necessario un
costante controllo di tali variabili3 come ad esempio:
Il pH del plasma aumenta se esposto all’aria. Conservare quindi
il plasma sempre ben chiuso.
Il prodotto è stato studiato per funzionare a 37°C ± 0,5 °C.
Assicurarsi che tutti gli elementi riscaldanti, pertanto, si trovino
costantemente a tale temperatura.
Tutte le attrezzature devono essere perfettamente pulite e prive
anche di sole tracce di detergenti.
1.
Fattore X
11,7
12,8
13,3
14,1
14,8
17,0
8.
5.
6.
7.
Errichetti A. M., Holden A., Ansell J.: Management of Oral
Anticoagulant Therapy. Experience with an Anticoagulation
Clinic. Arch Inter Med 144, 1966-1968 (1984).
Hirsh J., Dalen J. E., Deykin D., Poller L.: Oral Anticoagulants:
Mechanism of Action, Clinical Effectiveness and Optimal
Therapeutic Range. Chest 102 (Suppl) 312s – 315s (1992).
NCCLS: Collection, Transport and Processing of Blood
Specimens for Coagulation Testing and General Performance of
Coagulation Assays; Approved Guideline. NCCLS document
H21-A3, NCCLS Wayne PA. (1998).
Palmer R.N., Grainick H. R.: Inhibition of the Cold Activation of
factor VII and the Protrombin Time. Am. J. Clin. Path 81, 618622 (1984).
Young D.S., Thomas D.W., Friedman R.B. et al: Effect of Drugs
on Clinical Laboratory Tests Clin. Chem. 18, 1041 (1972).
NCCLS: One – Stage Protrombin Time (PT) Test and Activated
Partial Thromboplastin time (APTT) test; Approved Guideline.
NCCLS document H 47 – A, NCCLS Wayne, PA. (1996).
Dalen J. E., Hirsh J.: American College of Chest Physicians and
the National Hearth, Lung, and Blood Institute National
Conference on Antithrombotic Therapy. Arch. Inter. Med. 146,
462 – 472 (1966).
Palaereti G., Coccheri S., Poggi M. et al: Oral Anticoagulant
Therapy Control; Evidence that the INR Expression Improves
the interlaboratory Comparability of Results. The Bologna Oral
Anticoagulant Control Exercise. Thromb Haemostasis 58:905910 (1987).
THROMBOPLASTIN S
Prothrombin Time according Quick (PT)
5.
Con il primo prodotto:
Correlazione PT
N=49
r = 0,98
y = 1,16 x + 1,3
Con il secondo prodotto:
Correlazione INR
r = 0,98
y = 0,98 x + 0,05
6.
7.
Il congelamento e lo scongelamento del plasma che contiene
cellule residue possono danneggiarne le membrane
compromettendo i risultati.
Reazioni infiammatorie acute possono ridurre il valore del PT a
causa della aumentata quantità di fibrinogeno.
Campioni di plasma con ematocrito non compreso tra 20 e 55%
potrebbero non rispondere correttamente al test; in tali casi è
necessario modificare la concentrazione del citrato cambiando il
rapporto tra sangue e anticoagulante.
For in vitro diagnostic use
1001 – 10x4 mL
PRINCIPLE
PT is used as a screening tool and as a quantitative test forcoagulation
factors in the extrinsic and common pathways. The test will be
prolonged in patients with acquired or congenital disorders that reduce
the activity of factors I (fibrinogen), II (Prothrombin), V, VII, and X.
The PT is also widely used to monitor oral anticoagulant therapy.1,2
LABSHOP s.r.l.
Oral anticoagulants reduce the activity of vitamin-k dependent clotting
factors (II,VII, IX, X, Protein C, and Protein S), and the PT is
prolonged as a result.
The kit measures the clotting time of plasma after adding a source of
tissue factor (thromboplastin) and calcium.
The recalcification of plasma in the presence of tissue factor generates
activated Factor Xa (F.Xa). F.Xa in turn activates Prothrombin to
thrombin, which converts fibrinogen to an insoluble fibrin clot.
SAMPLES
Fresh plasma in Trisodium Citrate 3,2 % (0.105 M).
Specimen collection and storage
1.
Draw blood and , avoiding hemolysis and contamination, mix
immediately blood with anticoagulant.
( 9 blood volumes and 1 trisodium citrate 3.2 % volume).
2.
Centrifuge at 1500 x g for 15 minutes.
3.
Test within 2 hours if samples are held at 22-24°C. If testing is
not completed within 24 hours, plasma should be frozen at -20°C
for up to two weeks or -70°C for up to 6 months.
For more details on specimen collection and storage, see NCCLS
Document3.
REAGENTS
Reagent
Lyophilized
Rabbit brain tissue
Glycine
Tricine
Sodium sulfate
Polyethilene glycol
Calcium chloride
Brij – 35
Sodium azide
2.6 %
2%
1.34 %
0.7 %
0.7 %
0.13 %
0.05 %
0.013 %
PACKAGE: Collection and storage
Store in refrigerator at +2/8°C. Stable until the expiration date reported
on the package.
Mix gently and stand for 15 minutes at room temperature. Do not
overturn the vial.
Stability of reconstituted reagent: 8 hours at 37°C or 7 days at 2-8°C.
(DO NOT FREEZE).
Bring reagent at room temperature before using.
For example, with an ISI = 1 and a RATIO value of 3.2 , the INR is
calculated as folows:
INR = (3.2)1 = 3.2
Test in duplicate (the difference between 2 values must be ≤ ±5%,
otherwise make a third test)
The ISI (International Sensitivity Index) is a measure of a
thromboplastin/instrument sensitivity to coagulation factors. ISI
values are assigned by comparison to a primary reference material.
High sensitivity reagents have low ISI values.
According to WHO recommendations, INR values above 5.5 place the
patient at unnecessary risk for bleeding complications.
It is generally advised that patients on stabilized oral anticoagulant
therapy should be maintained at an INR of 2.0 – 3.5, depending on the
clinical indication.2
The lot specific ISI value for Thromboplastin can be found on the kit
box label.
RESULTS
EXPECTED VALUES
PROCEDURE
Put tha sample in plastic or siliconized glass cuvette:
Sample
Incubate for about 2 minutes at 37°C
100 μL
Reagent (prewarm at 37°C)
Time clot formation.
200 μL
It’s possible to word Prothrombin Time in three ways:
•
Per cent (Quick Factor)
•
Ratio
•
I.N.R. (International Normalized Ratio)
1. PER CENT VALUE
The values are calculated through a calibration curve. The calibration
curve is obtained using 5 dilutions of a pool of normal plasmas as
follow:
Diluition
Value %
Plasma
NaCl 9 g/l
No one
100 %
0.5 ml
-
1+1
50 %
0.5 ml
0.5 ml
1+2
33 %
0.5 ml
1 ml
1+3
25 %
0.5 ml
1.5 ml
1+7
12.5 %
0.5 ml
3.5 ml
Of each dilution time clot formation in duplicate or in triplicate.
Make a calibration curve reporting percentages against respective
times.
In multi-center studies, when Thromboplastin was evaluated on a
normal population, the following results were obtained:
SAMPLES
NUMBER
40
20
61
20
38
60
INSTRUMENT
MLATM Electra 1000 CTM
MLATM Electra 900 CTM
IL ACLTM300/3000
Amelung KC 10 TM
Pacific Hemostasis
Trombo Screen 400C
Pacific Hemostasis
Trombo Screen 200
PT MEAN
secs
RANGE
(± 2 DS)
13,2
13,7
10,5
12,7
11,4 – 15,0
12,4 – 15,0
8,9 – 12,1
9,3 – 14,2
13,5
12,2 – 14,8
13,5
12,0 – 15,1
These values are intended as a guideline only.
Each laboratory should estabilish own Normal Reference Range.
WASTE DISPOSAL
The disposal of the product must be in accordance with local
regulation concerning waste disposal.
PERFORMANCE
2. RATIO
PRECAUTIONS / DANGER SYMBOLS
The preparation, according to current regulation, is classified as not
dangerous.
Anyway handle with care, avoid ingestion, avoid contact with eyes,
skin and mucous membranes. The samples must be handle as
potentially infected from HIV or Hepatitis.
PREPARATION AND REAGENT STABILITY
Reagent:
Lyophilized
Reconstitute the vial with 4 ml of distilled water.
Photrombin Time ( Sample)
RATIO = ——————————————————
Photrombin Time (Pool normal Plasmas)
3. I.N.R. = RATIOISI
To standardize testing, la Word Health Organization (WHO) has
recommended to word the results as INR ( International Normalized
Ratio)4.
L’INR is calculated using the RATIO value according to the
following mathematical relationship:
INR = RATIO ISI
PRECISION:
Thromboplastin Precision was assessed by testing a normal and
abnormal plasma on several different instruments. A summary of the
results follows.
Summary of within-run Precision Studies, % CV (N=20):
SAMPLE
Normal
Abnormal
MLA Electra
1000 C
1.1 %
2.8 %
Tromboscreen
400 C
1.9 %
2.5 %
Tromboscreen
200
1.9 %
2.3 %
Amelung
KC 10
2.9%
1.1 %
SENSITIVITY:
Factor sensitivity testing was performed by diluting pool normal
plasma with factor deficient plasmas such that the final factor
concentration ranged from 10 -100 %.
LABSHOP s.r.l.
% Factor
100
50
40
30
20
10
Factor II
11,6
11,6
11,7
12,3
12,8
14,1
PHROTROMBIN TIME (secs.)
Factor V
Factor VII
11,6
11,8
13,2
12,6
13,9
12,8
14,9
13,5
15,9
13,9
18,3
15,2
Factor X
11,7
12,8
13,3
14,1
14,8
17,0
CORRELATION:
Correlation studies were performed against two other sensitive
thromboplastin reagents by performing PT testing on normal and
abnormal samples.
With first product:
Correlation PT
N=49
r = 0,98
y = 1,16 x + 1,3
Correlation INR
r = 0,98
y = 0,98 x + 0,05
With second product:
Correlation PT
r = 0,95
y = 1,01 x + 2,20
N=49
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
BIBLIOGRAPHY
Correlation INR
r = 0,95
y = 0,82 x + 0,10
INTERFERENCES:
Sodium oxalate, EDTA, and heparin are not suitable
anticoagulants.
The PT may be prolonged by substances such as oral
contraceptives, corticosteroids, EDTA, asparaginase, clofibrate,
erythromycin, ethanol, tetracycline and anticoagulants such as
heparin and warfarin5 .
1.
2.
3.
4.
-
The PT may be shotened by substances includine antihistamines,
butabarbital, caffeine, oral contraceptives, phenobarbital and
vitamin K5.
QUALITY CONTROLS
Normal and abnormal plasmas should be tested in conjunction with
patient plasmas.
5.
6.
7.
LIMITATIONS
The biochemistry of coagulation involves a series of reactions that are
influenced by many pre-test conditions. These variables must be
controlled to obtain reproducible results3 :
pH will increase if plasma is open to air. Store sample stoppered.
The product was designed to work at 37°C ± 0,5 °C. Frequently
check the temperature of all heating elements.
All labware must be clean and and free of trace amounts of
detergents.
NOTES
1.
Lack of vacuum in vials, erratic results, quality control values
outside established ranges or product color variations could
indicate deterioration.
Turbid, icteric, lipemic or hemolyzed specimens may generate
erroneus results.
Use plastic or siliconized glass containers only.
Freezing and thawing plasma that contains residual cells will
generate damaged cell membranes that can affect results.
Acute infiammatory reactions can shorten PT results because of
elevated fibrinogen.
Plasma samples with hematocrits outside the range of 20-55 %
may be improperly anticoagulated and should be adjusted
appropriately.
The product is suitable for use with manual, mechanical, photooptical, nephelometric or other means of clot detection.
Follow manufacturer’s recommendations for proper use of
instrumentation.
To maintain adeguate suspension during use, maintain in
uniform agitation.
8.
Errichetti A. M., Holden A., Ansell J.: Management of Oral
Anticoagulant Therapy. Experience with an Anticoagulation
Clinic. Arch Inter Med 144, 1966-1968 (1984).
Hirsh J., Dalen J. E., Deykin D., Poller L.: Oral Anticoagulants:
Mechanism of Action, Clinical Effectiveness and Optimal
Therapeutic Range. Chest 102 (Suppl) 312s – 315s (1992).
NCCLS: Collection, Transport and Processing of Blood
Specimens for Coagulation Testing and General Performance of
Coagulation Assays; Approved Guideline. NCCLS document
H21-A3, NCCLS Wayne PA. (1998).
Palmer R.N., Grainick H. R.: Inhibition of the Cold Activation of
factor VII and the Protrombin Time. Am. J. Clin. Path 81, 618622 (1984).
Young D.S., Thomas D.W., Friedman R.B. et al: Effect of Drugs
on Clinical Laboratory Tests Clin. Chem. 18, 1041 (1972).
NCCLS: One – Stage Protrombin Time (PT) Test and Activated
Partial Thromboplastin time (APTT) test; Approved Guideline.
NCCLS document H 47 – A, NCCLS Wayne, PA. (1996).
Dalen J. E., Hirsh J.: American College of Chest Physicians and
the National Hearth, Lung, and Blood Institute National
Conference on Antithrombotic Therapy. Arch. Inter. Med. 146,
462 – 472 (1966).
Palaereti G., Coccheri S., Poggi M. et al: Oral Anticoagulant
Therapy Control; Evidence that the INR Expression Improves
the interlaboratory Comparability of Results. The Bologna Oral
Anticoagulant Control Exercise. Thromb Haemostasis 58:905910 (1987).

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