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1.006 Scheda tecnica Quant BCL2-IgH

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Real-Time Quantitative PCR t(14;18) (Bcl2/IgH-MBR) per la diagnosi
ed il monitoraggio del linfoma a cellule follicolari
QUANT-BCL2/IgH™
Cat. n.1.006
Il linfoma a cellule follicolari (FLC) è il più comune tra i linfomi non-Hodgkin (NHL), essendo presente nel 25-30% di tutte le NHL dell’adulto. In
più del 80% dei casi di FCL, le cellule tumorali presentano la traslocazione t(14;18) che risulta dalla giustapposizione del gene Bcl2, localizzato sul
cromosoma 18, sulla regione di congiunzione (JH) dei geni delle catene pesanti delle immunoglobuline, sul cromosoma 14. Inoltre, la traslocazione
BCL2 è presente nel 30% dei linfomi a grandi cellule B diffuso.(DLBCL). Come conseguenza di questo riarrangiamento, il gene BCL2 subisce il
controllo della sequenza regolatoria eµ IgH delle IgH, con conseguente iperespressione della proteina anti apoptotica Bcl2 nelle cellule del linfoma. I
riarrangiamenti BCL2/IgH legati a specifichi breakpoints BCL2, nella maggior parte dei casi avvengono nella regione major breakpoint (MBR), che
comprende circa il 70% di tutti i breakpoints sul cromosoma 18. Questa regione è stata identificata in un segmento di 300 bp localizzato a monte della
regione 3’ non tradotta (3’ UTR) dell’esone 3 del gene BCL2. Il breakpoint sul cromosoma 14 può essere localizzato in qualsiasi regione consensus
del frammento JH del locus IgH.
La valutazione quantitativa delle cellule BCL2/IgH+ nei campioni di tessuto (sangue periferico, midollo osseo, linfonodi, biopsie o altri tessuti) da
pazienti con FCL e/o DLBCL, fornisce un utile strumento per: I) diagnosi molecolare II) monitoraggio della malattia minima residua (MRD) III)
precoce valutazione dell’efficacia terapeutica di un trattamento, inclusa chemioterapia, immunoterapia, chemio-immunoterapia, terapia ad alte dosi e
radioterapia, IV) monitoraggio della contaminazione da cellule tumorali nel midollo osseo o cellule staminali periferiche raccolte per terapia ad alte
dosi con liberazione emopoietica autologa. Molto recentemente, è stato dimostrato da un’analisi multivariata che i livelli assoluti di cellule
BCL2/IgH+ nel midollo osseo di pazienti con prima diagnosi di FCL, erano i migliori indicatori della risposta clinica e molecolare in seguito alla
terapia con CHOP e Rituximab. Da questo punto di vista, la quantizzazione assoluta delle cellule BCL2/IgH+ mediante Real-time PCR alla diagnosi
fornisce un importante nuovo strumento per prevedere la risposta al trattamento e l’evoluzione clinica a lungo termine in pazienti con FCL. Dato che i
livelli costitutivi di BCL2 nelle cellule tumorali di DLBCL hanno mostrato una correlazione con la prognosi e la resistenza alla chemioterapia, la
quantizzazione di cellule BCL2/IgH+ nei campioni di linfonodi può essere usata anche come indicatore prognostico nelle NHL t(14;18) aggressive a
cellule B. Infine, la valutazione quantitativa delle cellule BCL2/IgH+ può fornire un valore di cut-off in grado di discriminare le quantità di cloni
positivi t(14;18) trovati in pazienti con linfoma da quelli presenti in soggetti sani.
Il kit QUANT-BCL2/IgH permette la quantificazione delle cellule t(14;18)+ in campioni di tessuto (sangue periferico, linfonodi, biopsie di
altri tessuti) da pazienti con linfoma follicolare.
Principio del metodo: a) estrazione del DNA genomico; b)
amplificazione Real-time con probe con due marcatori; c) rivelazione
con un sistema Real Time PCR compatibile con la tecnologia
Taqman.
Applicabilità: su DNA estratto da sangue periferico, midollo osseo,
cellule di linfonodi o altri tessuti.
Numero di Test: 24 campioni da eseguire in duplicato (o 132
reazioni), curve standard e controlli.
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
L’uso di una curva standard di quantità note sia del gene endogeno di
riferimento (Albumina) che delle copie riarrangiate di BCL2/IgH
(DoHH2 DNA), consente il calcolo, in ciascun campione, del
rapporto tra le copie geniche specifiche BCL2/IgH e il DNA di
riferimento (Albumina). In basso sono mostrati i risultati relativi alle
curve di amplificazione BCL2/IgH e alle curve standard (diluizioni
Albumina e BCL2/IgH).
Amplification Plots
CD ROM 700 MB
Software per Residual Disease (MRD)
STANDARD DILUTIONS
St1-MBR 9x105 copies/2µl - Alb 9x104 copie/2µl
St2-MBR 9x104 copies/2µl - Alb 9x103 copie/2µl
St3-MBR 9x103 copies/2µl - Alb 9x102 copie/2µl
St4-MBR 9x102 copies/2µl - Alb 9x101 copie/2µl
St5-MBR 9x101 copies/2µl - Alb 9x100 copie/2µl
St6-MBR 9x100 copies/2µl
REAL-TIME PCR
10X Albumina (Primers/FAM-TAMRA probe)
10X BCL2/IgH (Primers/FAM-TAMRA probe)
Master Mix 2X
H2O DNase/RNase-free
Standard Curve
RT
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
+4°C
-20°C
Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato.
Materiali Richiesti: provette da 1,5 ml e da 15 ml in polipropilene;
portaprovette refrigerato; puntali sterili con barriera antiaerosol;
Provette da PCR con tappo ottico.
Reagenti richiesti non compresi nel kit: Per l'estrazione del DNA
si consiglia di utilizzare il seguente kit:
•
Kit Estrazione DNA - cat. n. 101
Strumenti richiesti: centrifuga con rotore ad angolo fisso per
provette da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con
adattatori per provette da 15 ml (1.500 x g); Set di pipette pre-PCR e
post-PCR (0.5 – 20 µl, 10 – 100 µl, 20 – 200 µl, 200 – 1000 µl);
Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con alimentatore;
Transilluminatore UV; Apparato fotografico. Strumento Real-time
PCR. Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere
sterili, DNase/RNase free e monouso.
STANDA RD DILUTIONS - rearrenged gene BCL2/IgH M BR
St.1 - St.6 (Eff. =97.7%): Y = -3.33 * LOG(X) + 40.15
STANDA RD DILUTIONS - Control gene Albu min
St.1 - St.5 (Eff. = 92.8%): Y = -3.05* LOG(X) + 35.42
I risultati sono espressi contemporaneamente come stima diretta delle
copie di BCL2/IgH-MBR, copie BCL2/IgH-MBR normalizzate con
l’albumina e numero assoluto di cellule BCL2/IgH-positive/105
cellule normali. I calcoli sono eseguiti automaticamente dal software
dedicato allegato.
BIBLIOGRAFIA
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Liu Y et al. PNAS (1994) 91: 8910-8914
Cleary ML et al. J.of Exp Med (1986) 164: 315-320
Aster JC et al. Am J Pathol (2002) 160: 759-763.
Tsimberidou AM et al. Leukemia & Lymphoma (2002) 43: 1589-1598
Galimberti S et al. Bone Marrow Transplant. (2003) 32:57-63.
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Gascoyne RD et al. Blood (1997) 90:244-51.
Mounier N et al. Blood (2003) 101:4279-84
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