(PoRV) e influenza a (SIV) - Dipartimento di Scienze Mediche

STUDI GENOTIPICI E FILOGENETICI DI ROTAVIRUS A (PoRV) E
INFLUENZA A (SIV) VIRUS SUINI
Zaccaria Guendalina
CICLO XVII
Tutor: Prof. Fabio Ostanello e Dott. Gabriele Vaccari
Introduzione
Rotavirus A (RVA) e Influenza A virus (IAV) sono agenti virali ad ampio spettro d’ospite, capaci di infettare molte specie animali compresi il suino e l’uomo. Sono virus a
RNA a genoma segmentato che possono andare incontro a fenomeni di riassortimento tra la popolazione virale umana e quella animale con l’emergenza di ceppi
nuovi emergenti capaci di diffondere nell’uomo.
Il suino può avere un ruolo di serbatoio sia per quanto riguarda RVA che IAV.
Lo studio ha l’obiettivo di evidenziare link molecolari, tramite analisi genomica e filogenetica, fra virus circolanti negli animali e quelli descritti in letteratura nell’uomo.
E’ stato utilizzato il sequenziamento Sanger per il lavoro condotto sui Rotavirus, mentre per quanto riguarda lo studio su Influenza virus sono state settate le condizioni
di sequenziamento dell’intero genoma virale mediante l’applicazione di tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) con piattaforma Ion Torrent PGM.
Materiali e metodi
Materiali e metodi
L’RNA virale è stato estratto da campioni fecali suini risultati positivi per Rotavirus
mediante ELISA. Ogni segmento del genoma è stato retrotrascritto ed amplificato
con primers specifici mediante RT-PCR one step (QIAGEN OneStep RT-PCR Kit)
ed i prodotti di amplificazione visualizzati mediante corsa elettroforetica su gel di
agarosio.
Le reazioni di sequenziamento sono state eseguite con il BigDye® Terminator
v1.1 Cycle Sequencing Kit e le sequenze determinate con elettroforesi capillare
su ABI 3130.
Ad ognuno degli 11 segmenti del genoma di Rotavirus è stato assegnato un
genotipo utilizzando RotaC version 1.0 (http://rotac.regatools.be.), un programma
per la genotipizzazione di Rotavirus A disponibile su internet.
L’RNA estratto è stato prima retrotrascritto poi amplificato mediante una multiplex
PCR (PathAmpTM Flu A Reagents).
Il genoma virale è stato sequenziato mediante piattaforma Ion Torrent PGM, un
sequenziatore di nuova generazione.
Il materiale amplificato è stato frammentato fino ad ottenere frammenti di circa 200
bp di lunghezza. Ai campioni analizzati sono stati legati dei “barcode” (1-16), degli
oligonucleotidi con sequenza nota, che permettono il sequenziamento
contemporaneo di più campioni in una sola corsa.
La libreria così ottenuta è stata amplificata e sequenziata con lo Ion Torrent PGM.
Allineamento e analisi del coverage sono state effettuate con il Torrent Suite
Software.
Tabella 2: campioni analizzati con Ion
Torrent PGM. Dieci campioni sono stati
corsi sia con il chip 314 sia con il 316.
Risultati
Risultati
Abbiamo caratterizzato gli 11 segmenti dell’intero genoma di un ceppo (campione
2) isolato dal contenuto intestinale di un suinetto con diarrea (Tabella 1).
L’analisi genotipica ha evidenziato che tutti i segmenti genomici fatta eccezione di
NSP3 presentano un genotipo frequentemente riscontrato nella popolazione suina.
Al contrario, il genotipo assegnato al gene della proteina NSP3 è un genotipo raro
(T7), ad oggi assegnato a soli 7 isolati sia umani che animali.
La sequenza di un singolo isolato
H1N1pdm, ottenuta con il metodo NGS, è
stata comparata a quella ottenuta con
metodo Sanger: le sequenze mostrano
un’identità nucleotidica del 100%.
Abbiamo sequenziato con successo 36
isolati appartenenti a diversi sottotipi
(H1N1, H1N2 e H3N2), collezionati in Nord
Italia tra il 1998 e il 2012, correndo
contemporaneamente su un unico chip fino
a 16 campioni (Tab. 2).
I dati sono stati analizzati in funzione di una
sequenza di riferimento: per ogni campione
l’analisi del coverage mostra una profondità
di 20x per almeno il 99% della sequenza. In
figura 2 è portato ad esempio il grafico di
uno dei campioni analizzati che mostra la
profondità del coverage della sequenza
allineata ottenuta.
Tabella 1: Genotipi assegnati agli 11 segmenti genomici del campione 2.
RVA/Pig-wt/ITA/204BS/2010/G9P23
100
77
In ragione di questo
risultato, abbiamo
analizzato il segmento
genomico che codifica la
proteina NSP3 di altri 24
campioni, collezionati tra il
2009 e il 2010 da suinetti
con diarrea in diversi
allevamenti del Nord Italia.
In totale 16 dei 25 isolati
analizzati sono stati
assegnati al genotipo T7
mentre solo 6 al genotipo
T1, il genotipo della NSP3
più comunemente
riscontrato nella
popolazione suina. L’analisi
filogenetica ha evidenziato
che la maggior parte dei
campioni con genotipo T7
clasterizza insieme e
presenta una più stretta
vicinanza ad un ceppo
bovino, solo due campioni
clasterizzano insieme ad un
ceppo umano di probabile
derivazione suina (Fig.1).
RVA/Pig-wt/ITA/498BS/2010/GXP23
RVA/Pig-wt/ITA/622BS/2010/G9P6
NSP3
RVA/Pig-wt/ITA/492BS/2010/G5P23
RVA/Pig-wt/ITA/9BS/2009/G4P6
RVA/Pig-wt/ITA/5BS/2009/G5P13-P22
RVA/Pig-wt/ITA/10BS/2009/G9P23
100
RVA/Pig-wt/ITA/11BS/2009/G4P23
100
RVA/Pig-wt/ITA/12BS/2009/G4P23
RVA/Pig-wt/ITA/17BS/2009/G9P13-P22
T7
RVA/Pig-wt/ITA/519RE/2010/G5P23
RVA/Pig-wt/ITA/13BS/2009/G5PX
RVA/Pig-wt/ITA/2CR/2009/G9P23
100
RVA/Pig-wt/ITA/16BS/2009/GxPx
Bovine
Bovine-like
RVA/Cow-tc/GBR/UK/1973/G6P75
RVA/Human-xx/IND/mani-265/2007/G10P6
81
RVA/Hu/CHN/R479/2004/G4P6
Porcine-like
RVA/Hu/BEL/BE2001/2009/G9P6
RVA/Pig-wt/ITA/4BS/2009/G5P6
99
RVA/Pig-wt/ITA/524BS/2010/G9P23
89
RVA/Pig-wt/ITA/6BS/2009/GXP6
RVA/Pig-wt/ITA/19BS/2009/G4P6
88
100
99
RVA/Pig-wt/ITA/8RE/2009/G4P6
RVA/Pig-wt/ITA/14BS/2009/G9P6
RVA/Pig-wt/ITA/3BS/2009/G9P6
98
99
RVA/Pig-wt/ITA/7RE/2009/G9P13-P22
RVA/Pig-wt/IND/RU172/2002/G12P7
100
92
100
RVA/Human-wt/BEL/B4633/2003/G12P8
T1
Figura 2: Coverage del campione 10169. Il grafico
presenta in ascissa gli 8 segmenti genomici di Influenza A
virus, mentre in ordinata il numero (log10) di letture di ogni
singola base della sequenza allineata che è stata
evidenziata durante il sequenziamento. Questo è un indice
della validità e veridicità della chiamata della base. I
segmenti più corti hanno un coverage maggiore rispetto a
quelli lunghi.
RVA/Human-wt/BEL/B3458/2003/G9P8
RVA/Human-tc/USA/Wa/1974/G1P1A8
RVA/Human-xx/IND/mcs-13/2007/G9P6
RVA/Pig-tc/MEX/YM/1983/G11P97
RVA/Pig-tc/USA/Gottifried/1983/G4P6
RVA/Pig-tc/USA/OSU/1977/ G5P97
100
RVA/Pig-tc/VEN/A253/1988/G11P97
100
100
RVA/Pig-tc/VEN/A131/1988/G3P97
RVA/Human-tc/USA/DS-1/1976/G2P1B4
100
T2
RVA/Human-wt/RSA/GR10924/1999/G9P6
RVA/Pigeon-tc/JPN/PO-13/1983/G18P17
T4
PB2
PB1
PA
HA
NP
NA
M
NS
0.1
Figura 1: albero filogenetico del gene della
proteina NSP3. I campioni analizzati sono
evidenziati nella cornice rettangolare, in rosso
quelli appartenenti al genotipo T7 e in verde quelli
al genotipo T1.
I ceppi sono stati contrassegnati in base alla
specie da cui sono stati isolati:
suino
uomo
bovino
Conclusioni
Il sequenziamento dell’intero genoma è un importante strumento per comprendere
l’evoluzione e l’ecologia di agenti virali molto variabili come quelli presi in esame.
Mettendo a confronto i risultati ottenuti nei due lavori nel corso degli ultimi 6 mesi, sono
evidenti i vantaggi dell’utilizzo delle tecniche di NGS. Lo sviluppo di protocolli con metodo
NGS, che permettano il rapido sequenziamento di un gran numero di isolati virali, potrebbe
dimostrarsi fondamentale in situazioni critiche di epidemie. Tale metodologia necessita
tuttavia di una validazione tramite confronto con il sequenziamento Sanger che rimane il
metodo di riferimento.
Presentazioni orali:
•“Full-length genomic analysis of porcine Rotavirus strains isolated from pigs with diarrhoea in Northern Italy” presentato all’11th National Congress of the Italian Society for Virology ad
Orvieto.
Poster:
•“Next generation sequencing to study the molecular evolution and transmission dynamics of Influenza A virus in pigs” presentato al congresso Arbo-zoonet “Joint Conference on Emerging
and Re-emerging Epidemics Affecting Global Health” ad Orvieto.

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