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11. Necrosi e apoptosi - E

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Biologia Molecolare e Cellulare - D'Addario
26/03/14
11. Necrosi ed Apoptosi contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è
consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale
le cellule vivono in condizioni di OMEOSTASI (equilibrio) in cui svolgono una funzione specifica (DIFFERENZIAMENTO) che dipende da: condizioni dell’organismo (nutrienti, ormoni) rapporti cellula-­‐cellula, cellula-­‐ matrice; per potere “funzionare” una cellula ha bisogno di: -­‐ Energia -­‐ mantenere intatte le proprie strutture (membrane, organuli) -­‐ preservare il patrimonio genetico (DNA) Le cellule sono in grado di rispondere a STIMOLI FISIOLOGICI e a STIMOLI PATOLOGICI ADATTAMENTO • apertura e chiusura di canali e pompe ioniche VITALITA’ PRESERVATA • mobilizzazione di depositi metabolici (lipidi, glicogeno) • segregazione di materiali corpuscolati 1
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Adapted
cell
Normal
cell
Injury
Reversibly
injured cell
Danno Cellulare Lo stress è cosi acuto che la cellula non puo’ piu’ adattarsi Esposizione ad agenti che causano danno * Reversibile o irreversibile * Il risultato dipende da TIPO, DURATA E SEVERITA’ DEL DANNO Irreversibly
Injured cell
TIPO, STATO E ADATTABILITA’ delle cellule RISPOSTA CELLULARE AL DANNO A seconda della natura e della intensità del danno le cellule possono rispondere con l’aumento o con la riduzione del livello della loro attività. 2
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CAUSE di DANNO CELLULARE AGENTI FISICI traumi meccanici temperatura (ustioni, congelamenti) radiazioni AGENTI CHIMICI AGENTI INFETTIVI CARENZA di OSSIGENO (IPOSSIA) REAZIONI IMMUNOLOGICHE ipersensibilità autoimmunità ANOMALIE GENETICHE DISTURBI DELLA NUTRIZIONE carenze alimentari carenze vitaminiche obesità Cause di stimoli patologici Tipo esempi Genetico Difetti genetici, difetti cromosomici Nutrizionale Deficienze o eccessi di sostanze nutritive (ferro, vitamine) Immunologico Danni causati dal sistema immunitario (auto-­‐immunità) Endocrino Attività ormonale carente o eccessiva Agenti fisici Traumi meccanici, danno termico, radiazioni Agenti chimici Agenti chimici tossici (metalli pesanti, solventi, farmaci) Agenti infettivi Infezioni da virus, batteri, altri parassiti Anossia (ipossia) Secondaria ad alterazioni della funzione respiratoria/circolatoria 3
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Rappresentazione schematica della struttura cellulare normale e in condizioni di danno Le MODIFICAZIONI MORFOLOGICHE divengono evidenti solo dopo danno ai sistemi biochimici all’interno della cellula (mitocondri, plasmamembrana, REL) Danno reversibile
Le cellule rispondono ad un danno acuto RIGONFIANDOSI: rigonfiamento degli organuli, distacco dei ribosomi, distacco del bilayer fosfolipidico di membrana, citoplasma pallido Danno irreversibile
Alterazione della PERMEABILITA’ di MEMBRANA ROTTURA DEI LISOSOMI ed AUTOLISI Rigonfiamento e comparsa di corpi densi nei mirtocondri Cariolisi: nucleo si dissolve, perdita della basofilia Picnosi: riduzione delle dimensioni del nucleo e aumento basofilia Carioressi: nucleo risulta frammentato in particelle DANNO CELLULARE REVERSIBILE 1) Risposta cellulare ad uno stimolo lesivo dipende da natura, durata e intensità dello stimolo 2) Conseguenze di un danno cellulare dipendono dal tipo, stato e capacità adattative delle cellule. 3) Sistemi intracellulari che risultano + sensibili: -­‐ integrità membrana -­‐ respirazione aerobia -­‐ sintesi proteica -­‐ integrità del materiale genetico 4
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•  Atrofia: 26/03/14
Modalità di adattamento: •  Riduzione del volume di organo, senza apprezzabili variazioni del numero di cellule. - 
- 
- 
funzionalita’ cellulare ridotta al minimo per la sopravvivenza funzioni correlate al differenziamento sospese: ripristinate le condizioni normali le cellule atrofiche sono generalmente in grado di recuperare le loro funzioni specifiche ridotta richiesta funzionale (es. Muscolo in seguito ad una ingessatura)
Insufficiente apporto di ossigeno (ischemia parziale)
Insufficienti nutrienti (digiuno forzato)
•  Ipertrofia: •  Aumento del volume di organo, senza apprezzabili variazione del numero di cellule. processo fisiologico che risponde a necessita’ dell’organismo (seno in alllattamento)) •  Iperplasia: •  Aumento di numero e volume delle cellule. aumentata richiesta funzionale: aumento di eritrociti circolanti in alta montagna •  Metaplasia: La sostituzione di un tipo cellulare con un altro. sostituzione di un epitelio ghiandolare con uno squamoso (esposizione prolungata al fumo: metaplasia squamosa dell’epitelio bronchiale 5
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Meccanismo di azione del danno 4 sistemi intracellulari particolarmente vulnerabili: integrità delle membrane cellulari; respirazione aerobia sintesi proteica; integrità dell’apparato genetico le componenti biochimiche e strutturali della cellula sono strettamente correlate: danno in una sede porta ad un ampio spettro di effetti secondari: EX. blocco respirazione > ↓ATP > ingresso acqua etc; ü 
le alterazioni biochimiche precedono le modificazioni morfologiche del danno cellulare ü 
EX. morte del miocardio evidente al microscopio ottico solo dopo 10-­‐12 ore sebbene il danno irreversibile si verifichi dopo 20-­‐60 min Meccanismo di azione del danno Indipendentemente dall’agente scatenante le maggiori cause di morte sono: deplezione di ATP (prodotto dalla fosforilazione ossidativa e dalla glicolisi) e la diminuita sintesi di ATP sono conseguenze comuni del danno ischemico e tossico; ossigeno e radicali liberi derivati dall’ossigeno; questi si formano durante la riduzione dell’ossigeno molecolare ad acqua calcio intracellulare e perdita dell’omeostasi del calcio Difetti della permeabilità di membrana Danno mitocondriale 6
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radicali liberi derivati dall’ossigeno Specie chimiche estremamente instabili, altamente reattive, con un singolo elettrone spaiato in un orbitale esterno. Si formano durante ü 
ü 
ü 
Idrolisi dell’acqua da parte delle radiazioni ionizzanti; Reazioni di ossido/riduzione nella normale fisiologia della cellula; Metabolismo di chimici esogeni (farmaci, CCl4). I radicali liberi si possono formare a seguito di numerosi processi biologici: 1) Assorbimento di E radiante da parte dell’H2O (OH•, H•) 2) Metabolismo di sostanze chimiche esogene (CCl3•) 3) Reazioni redox durante la fosforilazione ossidativa (O2•, H2O2, OH•) 4) Reazione di Fenton (OH•) 5) Reazioni infiammatorie (O2•, H2O2, OH•, NO, ONOO-­‐) 7
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Meccanismo di danno dei radicali liberi ü 
perossidazione dei lipidi di membrana; ü 
modificazioni ossidative delle proteine; ü 
lesioni del DNA. 8
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perossidazione dei lipidi di membrana 1 Glucoproteina transmembrana 2 Proteine di superficie di membrana in presenza di O2, i radicali OH• attaccano i legami C=C degli acidi grassi insaturi dei lipidi di membrana; l’interazione genera perossidi che propagano la reazione ossidativa e il danno. 1 Scissione proteica 2 Ponti disolfuro 3 Crosslinking lipide-­‐proteina 4 Ossidazione amminoacidi 5 Malondialdeide rilasciata dagli acidi grassi ossidati 6 Crosslinking lipide-­‐lipide 7 Ossidazione degli acidi grassi calcio intracellulare e perdita dell’omeostasi del calcio intra < 0,1 mM; extra 1,3 mM mantenuto all’interno dei mitocondri e RE da ATPasi Interruzione di ATP o aumento non specifico della permeabiltà di membrana: é Ca intra attivazione numerosi enzimi (fosfolipasi; proteasi, ATPasi, endonucleasi) 9
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L’evento finale del danno cellulare è la MORTE CELLULARE La morte cellulare può avvenire secondo due diverse modalità: -­‐ morte accidentale à NECROSI (con rigonfiamento cellulare) -­‐ morte programmata à APOPTOSI (contrazione volume cellulare) 10
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cellula in necrosi RILASCIA I SUOI COSTITUENTI ALL ESTERNO cellula in apoptosi SI FRAMMENTA E I FRAMMENTI VENGONO RIMOSSI DA CELLULE MACROFAGICHE Necrosi
causata da danni alla cellula irreparabili, repentini 11
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morfologia della cellula in necrosi Le cellule necrotiche si presentano in un primo momento rigonfie e successivamente lisate. L’aspetto morfologico della necrosi è il risultato di due processi che agiscono insieme: ü 
ü 
La digestione enzimatica delle proteine: ü 
Autolisi (gli enzimi litici derivano dai lisosomi della stessa cellula) ü 
Eterolisi (gli enzimi litici derivano dai lisosomi dei leucociti sopraggiunti); La denaturazione delle proteine; Sono note diverse alterazioni cellulari post mortem di tipo litico, tra le quali quelle che interessano il nucleo sono: PICNOSI riduzione del volume nucleare CARIORESSI frammentazione del nucleo CARIOLISI
dissoluzione del nucleo 12
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morfologia del tessuto in necrosi Una volta che le singole cellule sono andate incontro alle alterazioni suddette, l’insieme delle cellule necrotiche può assumere diversi aspetti morfologici: ü 
ü 
Necrosi coagulativa ( il tessuto appare compatto, come cotto) ü 
Prevale la denaturazione delle proteine; ü 
Preservazione dei contorni cellulari per giorni; ü 
Caratteristica della morte ipossica (miocardio); Necrosi caseosa (il tessuto ha una consistenza soffice, che ricorda il formaggio) ü 
ü 
Tipica del tubercolo Necrosi colliquativa (il tessuto appare semifluido) ü 
Predomina la digestione enzimatica; ü 
Perdita dei contorni cellulari; ü 
Caratteristica del cervello. EVENTI PRINCIPALI nella NECROSI 13
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Eventi che si susseguono in una cellula che sta morendo per necrosi u  Arresto produzione di ATP nei mitocondri. u  Blocco pompe ioniche di membrana, che funzionano con l ATP u  ingresso sodio e acqua nella cellula. u  Rigonfiamento cellula e organuli interni. u  cellula avvia risposta allo shock termico (allo stress): aumento sintesi di chaperonine per contrastare la denaturazione delle proteine ubiquitine (legano proteine denaturate e le indirizzano alla distruzione). u  pH scende u  nella cellula entra il calcio. u  denaturazione proteica si fa massiccia. u  Il RE e gli altri organuli si rigonfiano u  cellula muore. Le cellule necrotiche e i loro resti scompaiono per l’intervento del processo infiammatorio, che segue sempre la morte per necrosi. 14
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Apoptosi Morte programmata, richiede: -­‐ energia, sintesi di RNA e di proteine -­‐ una ordinata sequenza di eventi -­‐ coinvolge cellule sia malate che sane -­‐ riguarda cellule sparse -­‐ non comporta una risposta infiammatoria PERCHE UNA CELLULA VA IN APOPTOSI per modellare l organismo durante l embriogenesi o, più in generale, per un appropriato sviluppo: -­‐ la formazione delle dita del feto richiede la rimozione del tessuto che le unisce -­‐ lo sfaldamento dell endometrio che dà inizio alle mestruazioni avviene per apoptosi. -­‐ la formazione di opportune connessioni fra i neuroni (sinapsi) richiede che le cellule in eccesso siano eliminate per apoptosi. per distruggere cellule che costituiscono un pericolo per l integrità dell organismo: cellule infettate da virus (l apoptos è uno dei metodi attraverso cui i linfociti T citotossici uccidono le cellule infettate) cellule del sistema immunitario auto-­‐responsive (→ difetti nel macchinario apoptotico si accompagnano alla comparsa di malattie autoimmunitarie) cellule con DNA danneggiato (→improprio sviluppo embrionale, trasformazione neoplastica). Le cellule rispondono ad un danno al DNA aumentando la produzione di p53, un potente induttore dell apoptosi. cellule tumorali (radiazioni e chemioterapici inducono apoptosi in alcuni tipi di tumore). 15
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Esempi di apoptosi ü 
Membrane interdigitali del feto; ü 
Sviluppo connessioni neuronali; ü 
Ricambio cellulare dei villi intestinali; ü 
ü 
Rimozione cellule ematopoietiche vecchie Delezione linfociti T autoreattivi nel timo EVENTI CARATTERISTICI DELL APOPTOSI 1. Il citoplasma inizia a contrarsi in seguito alla proteolisi di filamenti di actina. Perdita d acqua, insolubilizzazione proteine citoplasmatiche.. 2. La cromatina viene degradata in modo regolare (laddering) e così pure le proteine nucleari; il nucleo si condensa. 3. La cellula continua a contrarsi riducendosi ad una forma che permetta la facile eliminazione da parte dei macrofagi. Si verificano cambiamenti della membrana favorenti la fagocitosi 4. Formazione dei corpi apoptotici. 16
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Cambiamenti morfologici in una cellula in apoptosi L’apoptosi è diversa dalla necrosi A differenza dalla necrosi NON vi è: –  esaurimento dei meccanismi che producono energia nella cellula –  mancato funzionamento del normale controllo del volume cellulare –  rottura della membrana plasmatica –  reazione infiammatoria acuta indotta dalla morte cellulare Il processo: –  richiede energia –  coinvolge la sintesi proteica 17
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La cellula apoptotica si frammenta in Corpi apoptotici (Blebbing) Apoptosi = dal greco, caduta delle foglie da una pianta 18
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Caratteristiche dell'apoptosi Sono coinvolte molecole: -­‐ Recettori di membrana -­‐ Le caspasi, enzimi proteolitici aventi una cisteina nel sito attivo -­‐ Proteine liberate dai mitocondri, tra cui alcune endonucleasi -­‐ Proteine pro e antiapoptotiche Si distinguono: -­‐ una via estrinseca indotta da molecole extracellulari da una via intrinseca, indotta da eventi intracellulari -­‐ tre fasi: una di induzione, una di esecuzione e una di disgregazione L’apoptosi è coinvolta in processi fisiologici l 
organogenesi durante la vita embrionale l 
eliminazione delle cellule invecchiate l 
l 
morte cellulare che segue la rimozione degli stimoli ormonali eliminazione clonale dei linfociti che potrebbero altrimenti reagire con gli antigeni ‘self’ l 
atrofia dei tessuti ormono-­‐dipendenti l 
prevenzione dell’insorgenza di instabilità genomica 19
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L’apoptosi è coinvolta in processi patologici l 
l 
atrofia dei componenti secretori epiteliali nelle ghiandole esocrine dopo ostruzione prolungata del dotto eliminazione spontanea di una parte della popolazione cellulare in alcuni tumori l 
danno virale alle cellule l 
morte cellulare mediata da linfociti T citotossici l 
morte cellulare associata ad alcuni stimoli dannosi in basse dosi Fase di induzione -­‐ 
-­‐ 
Via estrinseca: , mediata da death receptors: interazione tra citochine pro-­‐apoptotiche (TNF-­‐α, TNF-­‐β, Fas-­‐L) espresse sulla superficie di alcune cellule e recettori sulla superficie della cellula bersaglio (TNF-­‐R, Fas) Via intrinseca: mancanza di fattori di crescita, danni cellulari al DNA o ai mitocondri Fase di esecuzione Propagazione della cascata delle caspasi e di altre proteine proapopoptotiche (Bid, Bad, p53) Rilascio dai mitocondri dell'APOPTOSOMA (citocromo c e Apaf 1), AIF, DNAsi Fase di degradazione Frammentazione del DNA da parte di endonucleasi attivate da caspasi e da ioni calcio a livello delle regioni tra due nucleosomi, in frammenti da 180-­‐200 pb 20
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Fase di induzione La via estrinseca si basa su un sistema classico di interazione recettore-­‐ligando che, una volta attivato, determina l’interazione di più pro-­‐caspasi con alcune proteine attivatrici. Questi recettori di morte appartengono ad una famiglia genica che comprende recettori simili al TNF-­‐R (Recettore per il Tumor Necrosis Factor) tra i quali il più studiato in termini di segnalazione apoptotica è il Fas. Il Fas è costituito da: •un dominio extracellulare interazione con ligando specifico •un dominio trans-­‐membrana •dominio di morte (DD) regione citoplasmatica presente sulla membrana plasmatica di tutte le cellule, mentre il suo ligando, FasL, è espresso solo da tipi cellulari specifici. Fase di induzione FasL induce l’aggregazione del recettore successivamente la proteina FADD si lega al dominio di morte del recettore mediando il reclutamento del proenzima Caspasi-­‐8 presso il recettore. L’avvicinamento di più Pro-­‐Caspasi-­‐8 stimola la dimerizzazione di due pro-­‐
enzimi con il conseguente cambio conformazionale richiesto per l’innesco dell’attività proteolitica. 21
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Fase di induzione La via intrinseca è sotto il diretto controllo del mitocondrio e viene innescata in seguito al rilascio di specifici componenti mitocondriali. La caspasi regolativa è la Caspasi-­‐9, che contiene un pro-­‐dominio regolativo denominato CARD (Caspase Activation and Recruitment Domine), il quale media le interazioni proteina-­‐proteina riconoscendo un altro dominio CARD presente su altre proteine. NELL AMBITO DEI PROCESSI DI CONTROLLO E INTEGRAZIONE DELL APOPTOSI UN PUNTO CRITICO
SI REALIZZA A LIVELLO DEI MITOCONDRI, A LIVELLO DEI QUALI NASCE IL SEGNALE DEFINITIVO CHE
INNESCA LA FASE DI ESECUZIONE.
La funzione mitocondriale può essere influenzata in due modi:
- Provocando una transizione di permeabilità mitocondriale (MPT): apertura di pori nella membrana interna
à riduzione potenziale di membrana à arresto fosforilazioni osidative à rigonfiamento.
- Provocando un aumento della permeabilità della membrana esterna e il rilascio del citocromo C nel citosol.
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Fase di esecuzione Regolazione dell’apoptosi l 
Anti-­‐apoptotici l 
Pro-­‐apoptotici - 
- 
Bcl-­‐2, Bcl-­‐XL IAPs - 
Bax, Bad, Bid P53 - 
HSP27, HSP72, HSP90 - 
HSP10, HSP60 - 
-­‐Le proteine pro-­‐apoptotiche si trovano nel citosol dove agiscono da sensori di danno cellulare. -­‐In seguito ad un danno, esse migrano alla superficie dei mitocondri dove si trovano le proteine anti-­‐apoptotiche. L interazione fra questi due gruppi di proteine porta alla perdita della normale funzione delle proteine ad attività anti-­‐apoptotica e alla formazione di pori sulla membrana mitocondriale, con rilascio di citocromo c e altre molecole pro-­‐apoptotiche dallo spazio intermembrana. Formazione dell APOPTOSOMA → APOPTOSI 23
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APOPTOSOMA E un complesso multiproteico formato dal citocromo C, da una proteina citosolica, Apaf-­‐1, dalla pro-­‐caspasi 9 e dall ATP. Le caspasi, oltre a degradare direttamente le proteine del citoscheletro, attivano una DNasi citoplasmatica che produce una caratteristica frammentazione del DNA: PROFILO A SCALETTA 24
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Line A Line B & C Linea D 26/03/14
DNA marker Tipica strisciata di una cellula trattata con un apoptotico. controllo Mock non trattato La via finale di tutti i tipi di apoptosi consiste nell attivazione di una cascata proteolitica. Le relative proteasi sono proteine altamente conservate e appartengono alla famiglia delle CASPASI (che comprende più di 10 membri). Cisteina Proteasi che tagliano proteine a livello di residui di acido aspartico -­‐ (da cui C-­‐ASP-­‐asi) i loro substrati sono altre caspasi: cascata che culmina con attivazione -­‐ caspasi effettrici: caspasi 3 e 6. -­‐ 
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Heat-­‐shock proteins 26
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differenze fra necrosi ed apoptosi 27
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