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6) EDCs

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Endocrinologia
“La scienza degli ormoni
non è un capitolo
metafisico, ma al contrario
uno dei più fisiologici e dei
più chimici della
medicina…..” (“La science
des hormones”, D. Rivoire,
1938)
Interferenti endocrini
“Un interferente endocrino è una sostanza
esogena o una miscela che altera le funzioni del
sistema endocrino e causa conseguentemente
effetti avversi sulla salute di un organismo
integro, o nella progenie o nelle
(sub)popolazioni” (OMS)
http://e.hormone.tulane.edu/learning/learning.html
http://www.epa.gov/scipoly/oscpendo/edspoverview/
primer.htm
Nell’adulto
i sistemi di omeostasi
possono compensare l’alterazione
e quindi non si manifestano effetti
L’esposizione durante la
“programmazione” del sistema
endocrino può indurre lesioni
permanenti
L’esposizione in fasi diverse dello
sviluppo può produrre effetti
diversi
I fenomeni di cross-talk endocrino
possono produrre effetti inattesi
Asse Ipotalamo-ipofisi-tiroide (HPT)
TRH
(+)
TSH
(+)
Ormoni tiroidei (T4 + T3)
(-)
Asse Ipotalamo-ipofisi-ghiandola surrenale (HPA)
CRH
(+)
ACTH
(+)
Cortisolo
(-)
Asse Ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG)
(+)
GnRH
(+)
GTH
(-)
Testosterone / Estradiolo
Pesticidi/PCBs
Inibitori della sintesi
Agonisti AhR
Antagonisti AR
Agonisti ER
ATTIVITA’ RIPRODUTTIVA
TRIBUTILSTAGNO
•Induce IMPOSEX in crostacei e molluschi.
IMPOSEX:
imposizione
di
caratteristiche
IMPOSEX
morfologiche riproduttive di un sesso sull’altro.
In genere sovrapposizione di caratteristiche
maschili sulle femminili.
Incapacità o ridotta possibilità di rilascio delle
uova dall’ovaio, soppressione dell’oogenesi (nei casi
più gravi) sviluppo di tubuli seminiferi nell’ovaia e
spermatogenesi.
Studi recenti in Mediterraneo hanno evidenziato la
presenza di imposex in Bolinus brandaris (Solè et
al., 1998) e in Heraplex trunculus (Martoja e
Bouquegneau, 1998; Axiak et al., 1995).
Chiavarini et al. (2003) hanno valutato l’imposex in
alcune popolazioni di Bolinus brandaris, Thais
haemastoma e Heraplex trunculus della Sicilia,
riscontrando un imposex diffuso, ad eccezione
della riserva marina di Ustica.
Stadio
Descrizione
0
Femmine senza segni maschili
1
Primi segni di imposex. In genere un pene incipiente localizzato
dietro il tentacolo oculare destro
2
Piccolo pene presente, con un dotto penieno sviluppato
3
Pene più grande che allo stadio 2, il dotto penieno continua
prossimalmente con una porzione di vasi deferenti. Si ha ancora
riproduzione
4
I vasi deferenti raggiungono l’apertura vaginale, la attraversano e
corrono nella porzione ventrale della ghiandola capsulare. Il pene ha
lunghezza comparabile a quella dei maschi. L’apertura vaginale è
immodificata e avviene ancora l’accoppiamento.
5
Vulva assente. Generalmente la ghiandola capsulare è spostata per
2/3 ventralmente, con il lume aperto nella cavità del mantello. Viene
impedito il rilascio della capsula delle uova, spesso sono presenti
capsule abortite
Riscontrano un’ottima correlazione tra TBT e
imposex (R2= 0.86) .
Lo stadio 3 è generalmente raggiunto per
concentrazioni superiori a 20-30 µg/kg e
concentrazioni superiori aggravano la situazione.
Concentrazioni vicine al limite di sensibilità (1 µg/kg)
sono sufficienti ad indurre imposex, anche se a stadi
iniziali.
La presenza di TBT NON era però strettamente
correlata al traffico navale.
•Nei maschi riduce l’inattivazione metabolica del
testosterone e ne aumenta la conversione in altri
androgeni (Rosin e Mason, 1996).
4-nonilfenolo
Sostanze di degradazione degli alchilfenoli
etossilati (surfattanti non ionici) ad azione
estrogenica nei pesci (Jobling e Sumpter, 1993).
Nella trota l’esposizione a 4-nonilfenolo induce
riduzione della crescita testicolare (Jobling et a.,
1996).
Induce
androgenizzazione
metabolica
per
riduzione
della
clearance
metabolica
del
testosterone e ad aumento dei suoi derivati
androgeni.
Induce la sintesi di vitellogenina (VTG), il
precursore delle proteine dell’uovo, e di proteine
delle zona radiata (Zrp).
Questi effetti probabilmente sono dovuti alla
interazione con il recettore ER, imitando l’E2.
L’induzione del ER è dose dipendente e alla sua
attivazione segue la sintesi di VTG e Zrp.
L’induzione del recettore era rapida, ma vi è un
tempo di latenza tra questo e la comparsa del picco
di trascritti.
Pare quindi esserci una prova dell’azione agonista
del NP nei confronti del recettore ER.
GnRH
GtH I
VTG
teca
androgeni
i
en
g
ro
t
s
e
granulosa
oocita
fosvitina
lipovitelline
Controllo negativo
Carrier vehicle
Trattamento 1
NP 10 mg/kg
•Prelievo di sangue al giorno 10 e 20 p.t.
•Valutazione della VTG con ELISA
Controllo positivo
E2 5 mg/kg
Trattamento 2
NP 25 mg/kg
Vitellogenin levels (µg/ml)
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
P.C.
25 mg/kg
400
200
10 mg/kg
0
N.C.
10 days
20 days
GRUPPO
VTG
(µg/ml)
10 days
VTG
(µg/ml)
25 days
CONTROLLO
NEGATIVO
0.0132
0.1757
10 mg/kg NP
0.0629
0.4629
25 mg/kg NP
0.1219
717.875
CONTROLLO
POSITIVO
1250
1833.888
• A 20 giorni post-trattamento non si osservano effetti
in termini di livelli di VTG nei pesci trattati con 10
mg/kg NP
•Nei gruppi trattati con E2 e 25 mg/kg NP si osserva
un aumento dei livelli di VTG a partire da 10 giorni
post-trattamento
Materiali e metodi
•115 esemplari di Caretta ricoverati presso il
C.R.T. di Lampedusa
•Sesso ed età difficilmente determinabili
Risultati
M.W
.
♀
♀
♀
♀
♀
♀
♂
♂
240KDa
151KDa
Conclusioni
• Buona cross-reattività dell’anticorpo anti-VTG di C.
mydas agasizii per la VTG di C. caretta
MA
• L’uso di anticorpo policlonale fornisce legami non
specifici (il gel è “sporco”)
• Possibile conservatività del core della proteina
Il monitoraggio eseguito con Caretta caretta dimostra
che l’ambiente marino in cui questi esemplari vivono non
mostra livelli di inquinanti tali da portare alla comparsa
di fenomeni chiari di ED, sebbene una certa attenzione
vada posta ai dati relativi ad alcuni soggetti, anche e
soprattutto in funzione della salvaguardia della specie.
Asse Ipotalamo-ipofisi-tiroide (HPT)
TRH
(+)
TSH
(+)
Ormoni tiroidei (T4 + T3)
(-)
Asse Ipotalamo-ipofisi-ghiandola surrenale (HPA)
CRH
(+)
ACTH
(+)
Cortisolo
(-)
Asse Ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG)
(+)
GnRH
(+)
GTH
(-)
Testosterone / Estradiolo
TIROIDE
Gli ormoni tiroidei sono fondamentali per la
regolazione di molte attività:
•Differenziazione e crescita;
•Riproduzione;
•Processi metabolici.
Gli effetti sono più evidenti nelle specie che
depongono uova, perché queste sono ricche di
lipidi, quindi si possono accumulare sostanze ad
azione di disendocrinia (PCBs, PHAHs).
Inibizione del trasporto e dell’utilizzo dello iodio
Composti che agiscono a questo livello riducono i
livelli di T4 (ne aumentano la frazione libera e
quindi la trasformazione in T3), con feed back
negativo sulla secrezione di TSH ed iperplasia e
ipertrofia tiroidee.
Inibizione del legame alle proteine plasmatiche
Sintesi di T3 e T4
Incidenza di tumori
Le lesioni benigne della tiroide sono indicatori di
esposizione a sostanze ad azione disendocrina.
PCBs
Nei pesci sono in grado di alterare l’indice
tiroideo, ma il meccanismo esatto NON E’
ANCORA STATO COMPRESO APPIENO.
Negli uccelli e nei mammiferi aumentano il
metabolismo e l’escrezione degli ormoni tiroidei e
diminuiscono i livelli di T4 circolante. Inducono
lesioni alle cellule follicolari FORSE legate alla
stimolazione ghiandolare da ridotti livelli di T4.
Diossine, furani e PCBs coplanari
Si legano al AhR e inducono il CYP1A. Riducono i
livelli di TT4 plasmatico ma non del FT4 e del TT3.
Modificano la durata della metamorfosi.
I furani e i PCB coplanari NON modificano i livelli
di T4 e T3, anche se in alcune specie si sono
osservate alterazioni
della capacità di
deiodurazione che FORSE compensa la lesione
tiroidea, che porterebbe a ipotiroidismo (da T3).
IPA (PAH)
Sono poco studiati, ma sembrano in grado di
aumentare i livelli di T3, attivare la IP e indurre
ipertrofia ghiandolare.
Insetticidi organoclorurati (OC)
In generale determinano sia per esposizione acuta
che cronica alterazioni tiroidee e della produzione
di ormoni tiroidei.
Il MIREX riduce nei salmonidi i livelli di T3 e T4 ed
altera l’istologia della ghiandola.
Il DDT riduce l’altezza delle cellule tiroidee, causa
una degenerazione dell’epitelio e una deplezione
del colloide.
Altri OC possono bloccare la sintesi di OT agendo
direttamente sulla tiroide o alterando la
produzione o il rilascio del TSH.
Insetticidi organofosforici (OP)
In linea generale riducono la sintesi del TSH e al
sua secrezione; inoltre riducono la conversione
extratiroidea del T4 in T3.
Le concentrazioni reperite a livello ambientale
sono in grado di indurre una riduzione dei livelli di
T4 e un incremento di quelli di T3.
Cianuri
I cianuri si sono dimostrati in grado di indurre (se
somministrati per via intraperitoneale) una
riduzione della captazione dello iodio, anche se non
alterano i livelli di T3 e T4.
In altri casi riducono i livelli di T4 (sia nei giovani
che negli adulti) e di T3(negli adulti).
Ammoniaca
L’esposizione di Channa punctatus riduce l’attività
IP dei reni, i livelli di T4 e l’attività IP tiroidea.
Si è anche osservata una diminuzione dell’attività
della glutatione perossidasi a livello tiroideo.
Metalli
Numerosi metalli, bloccando i gruppi tiolici degli
enzimi, possono alterare la trasformazione da T4 a
T3:Al, As, Cd, Pb, Hg.
Farmaci
Agiscono a vari livelli:
Mezzi
di
contrasto
iodati
(IOPROMIDE,
DIATRIZOATO)
•Deprimono i livelli di T3
•Deprimono la monodeiodurazione del T4
•Riducono al clearance plasmatica di T3 e T4
•Diminuiscono l’affinità di legame del recettore
nucleare T3 epatico
•Influenzano il trasporto dello iodio (anioni
complessi: perclorato, fluoroborato, ecc.)
•Modificano la iodurazione del T4 (tionamidi,
propiltiouracile, metimazolo, carbimazolo, derivati
dell’anilina, ecc.)
•Alterano la reazione di accoppiamento della DIT
(tionamidi, sulfonamidi)
•Variano il rilascio degli ormoni tiroidei (sali di
litio)
•Deiodurazione periferica (tiouracile, amiodarone)
•Escrezione
ed
inattivazione
tramite
la
competizione per i siti di legame alle proteine
plasmatiche o induzione di enzimi epatici
metabolizzanti (salicilati, clofibrato, metadone, 5fluorouracile, ecc.)
•Azione
degli
ormoni
(analoghi
ormonali,
amiodarone, fenitoina)
I RITARDANTI DI FIAMMA
Molecole utilizzate nelle vernici, nelle
plastiche, nelle schiume per imbottiture di
mobili, nei tessuti, negli apparecchi
televisivi, nei computer, in molti polimeri.
O
BrX
BrY
I PBDE, i loro metaboliti e i derivati
ambientali sono simili al T4 e ai PCBs
Cl
Br
Cl
H3C
Br
O
Br
O
Cl
O
Cl
Br
Cl
Br
Br
Cl
2,2',4,4',6-pentabromodiphenylether
(PBDE-100)
2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphenyl
(PCB-153)
Br
Br
2-(2',4'-dibromophenoxy)-4,6-dibromoanisol
(methoxy-PBDE)
Br
I
O
O
Br
O
I
Br
Br
Br
HO
HO
I
I
OH
Br
Br
Br
Br
Br
Br
H2N
Thyroxine (T4)
O
4-(2',4',6'-tribromophenoxy)-2,6-dibromophenol
(hydroxy-PBDE)
2,3,4,7,8-pentabromodibenzofuran
(PBDF)
Vengono aggiunti, MA NON LEGATI, ai polimeri, per cui nel
tempo fuoriescono dalle plastiche e passano nell’ambiente.
La disgregazione delle schiume poliuretaniche ad esempio
favorisce la dispersione dei PBDE con i frammenti di schiuma.
Pur essendo meno resistenti dei PCB (cui assomigliano
strutturalmente) alla degradazione ambientale, vi permangono
per lungo tempo (fino a diversi anni) andando incontro ad
accumulo ambientale.
I composti poco bromurati sono più reattivi e vanno
maggiormente incontro a biomagnificazione nel tessuto
adiposo dell’uomo, nei pesci e in altri animali, in particolare
nelle specie acquatiche.
Materiale
elettrico
3%
Trasporti
5%
Milioni di Kg/anno (2001)
Altro
10%
Materiali da
costruzione
31%
Elettronica
51%
PBDEs
America
Europa
Asia
DecaDeca-
24.5
7.6
25.9
OctaOcta-
1.5
0.85
1.5
PentaPenta-
7.1
0.15
0.15
Totale
33.02
8.3
24.6
Totale mondiale 67.3 M kg/anno
PBDE: utilizzati già dagli anni ’60
Composti utilizzati come additivi caratterizzati da un legame CBr termolabile.
Su questo di basa l’azione ignifuga: la scissione del legame C-Br
“sottrae” energia termica, rilasciando Br• che si legano ai C•,
riducendo le fiamme, il calore e la formazione di CO.
Negli animali da esperimento si è osservata induzione del
CYP1A1 e del CYP1A2, come testimoniato dall’aumento
dell’attività della EROD e di altri enzimi (benzfetamina Ndemetilasi, p-nitroanisol-demetilasi, arilidrocarbonidrossilasi, banzo(a)piren-idrossilasi), che permane fino a
30-60 giorni dopo il termine dell’esposizione.
Si è poi osservato una certa attività agonista nei confronti
del recettore arilico (AhR), che alcuni ipotizzano possa
essere legata alla presenza di impurezze dotate di questa
attività ed efficaci già a bassissime dosi (diossine?).
Per quanto riguarda le reazioni di fase II, si osserva
un’induzione della uridin-difosfato glucuroniltransferasi
(UDPGT).
BNF
12000
10000
Serie1
Serie2
6000
Serie3
4000
2000
Standard PBDE
0
1
10
100
60
1000
10000
50
40
30
ppm
nM
8000
20
AverageValues
10
0
1E-06 1E-05 1E-04 0,001 0,01
-10
-20
-30
0,1
1
10
C9
80
60
T1-13
40
180
20
Serie1
Serie2
Serie3
160
0
0,000001
-20
0,00001
0,0001
140
0,001
0,01
0,1
120
100
Serie1
Serie2
Serie3
-40
80
-60
60
40
20
0
0,000001
-20
0,00001
0,0001
0,001
0,01
0,1
T1-14
400
0,000E+00
0,000001
200
0
0,000001
0,00001
0,0001
0,001
0,01
-5,000E+02
0,1
0,00001
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
1
-200
-1,000E+03
-400
-600
-800
Serie1
Serie2
Serie3
-1,500E+03
Serie1
Serie2
Serie3
2000
-2,000E+03
-1000
1500
-1200
-2,500E+03
1000
-1400
-3,000E+03
500
-1600
Serie1
Serie2
Serie3
0
0,000001
-500
-1000
-1500
C9
0,00001
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
T2-20
I PBDE necessitano di metabolizzazione per attivarsi, ma
comunque non sembrano avere alcuna attività agonista nei
confronti del recettore arilico, almeno nel modello utilizzato.
I valori di pendente ottenuti sono infatti inferiori a quelli
ottenuti con concentrazioni di naftoflavone inferiori alla
EC10, equivalenti al limite di detection.
Considerazioni analoghe possono essere fatte per quanto
riguarda le prove di antagonismo: le differenze osservate
sono infatti troppo ridotte per poter essere considerate
significative.
L’attività antagonista “border line” POTREBBE essere dovuta
anche ad un’alterazione della molecola a seguito dei
procedimenti estrattivi. La molecola perderebbe quindi parte
della sua affinità per il recettore.
Necessario quindi effettuare prove con preattivazione della
molecola in vitro, per ridurre o verificare questa possibilità.
Problemi tossicologici legati ai
PBDEs
Interferenza
endocrina
– Effettti estrogenici e sulla tiroide
Developmental
effects
– Cervello e organi riproduttivi
Probabile
cancerogenesi
– Iniziato studi a lungo termine sui Penta
– Conversione ambientale a diossine/furani
Diossine/furani
bromurati ritrovati nell’uomo
Alterazione degli ormoni
tiroidei
Buona
evidenza nel ratto e nel topo
Alcune evidenze nell’uomo
Potenza relativa
penta-BDE > octa-BDE >>> deca-BDE
Effetto
additivo con co-esposizione a PCBs
Possibili meccanismi
–
–
Attività ormono-simile (legame alla transtiretina)
Induzione dell’enzima UDGPT (↑ escrezione T4)
T4
0,5
0,4
0,2
C
0,1
T1
0
T2
-0,1 0
-0,2
1
2
3
4
*
5
6
*
T3
-0,3
4
3,5
3
2,5
ng/dl
µg/dl
0,3
C
2
T1
1,5
T2
1
0,5
*
0
0
1
2
3
4
5
6
La riduzione del T4 nel gruppo trattato con le
concentrazioni più alte è stata osservata anche nel ratto
trattato con una miscela di penta BDE (Fowles et al.,
Toxicol., 86: 49-61, 1994)
Considerando anche l’importanza degli ormoni tiroidei per
lo sviluppo delle specie ittiche, risulta fondamentale
studiare più approfonditamente gli andamenti degli stessi,
considerando:
•Tempi più lunghi di esposizione;
•Un set più ampio di ormoni (non solo T3 e T4, ma anche
TSH, FT3 e FT4)
Effetto estrogenico
Esposizione
postnatale di ratti al
PBDE-99 altera l’espressione dei geni
regolati dagli estrogen (Lichtensteiger et
al., 2003)
– Prostata: recettore degli androgeni, degli
estrogeni ER-α and ER-β, insulin-like growth
factor (IGF-I)
– Cervello: recettore del progesterone, ER-α
estrogenica in vivo non
prevedibile dai test in vitro.
Attività
– PBDE-99 hanno bassa attività estrogenica nelle
cellule MCF-7.
Tossicità per lo sviluppo
Sistema nervoso
– Comportamento, capacità di apprendimento e
memoria alterata nel topo
– Perdita dell’udito nel ratto
– Effetti permanenti, i.e., misurati nell’adulto
– Effetti additivi con co-esposizione a PBDE e
PCB
Sistema riproduttivo maschile:
– Pubertà ritardata
– Aumento del peso della prostata ventrale e
della vescica seminale
Sistema riproduttivo femminile:
– Pubertà ritardata
– Alterazione della struttura cellulare ovarica
Minutes
**p<0.01
Viberg et al., 2002
Gli effetti, misurati nell’adulto, peggiorano con l’età.
Stesso schema visto con molti PCBs neurotossici.
Usati come ritardanti di fiamma in vari prodotti plastici.
Presenti anche in polistirene, poliuretano e tessuti.
Volatilizzazione e dilavamento
PBDE (ng/g lipid)
Time-trend: PBDEs in Blubber of
California Seals (She et al., 2002)
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
89
/
01
/
01
N=11
91
/
01
/
01
92
/
31
/
12
94
/
31
/
12
96
/
30
/
12
98
/
30
/
12
PBDEs in Columbia River Whitefish
From Genelle,
British Columbia
80
70
60
50
Sum PBDE (ng/g
fresh weight)
40
30
20
10
0
1992
1995
2000
Rayne et al. (2003) Environ Sci Technol 37(13):2847-54.
ng/g lipid
PBDEs nelle trote del lago Ontario (1978 1998)
1000
800
600
400
200
0
1978
1983
1988
Year
1993
1998
PBDEs nelle uova di gabbiano- Great Lakes
0.7
0.6
0.5
1.6
Snake Island
Lake Ontario
0.4
0.3
1.2
p<0.0001
t2=3.72 y
0.8
0.2
Gull Island
Lake Michigan
p<0.0001
t2=2.97 y
0.4
0.1
0
1980
1985
µg/g fresh wt.
1990
0.8
0.6
0.4
1995
0
2000 1980
1985
1990
Ch. Shelter Island
Lake Huron
1985
1990
2000
Graph from
M. Alaee
(2002)
p<0.0001
t2=4.95 y
0.2
0
1980
1995
1995
2000
PBDEs nel latte umano - Svezia
(Norén and Mieronyté, 1998)
PBDEs nel grasso del latte
PBDE in milk fat - Puget Sound mothers
175
156
ppb in M ilk Fat
150
117
125
126
100
75
50
25
13
13
13
1
2
3
50
56
5
6
26
0
4
Sample Number
(adapted from Northwest Environmental Watch, 2004)
7
8
9
PBDEs – normativa
internazionale
Europa
Vietati - Penta e octa-PBDE
Deca-PBDE usati nell’elettronica
(maggiormente i deca)
I deca saranno vietati dal 2006
In America l’EPA e i produttori
chimici sono giunti ad un accordo
per eliminare i Penta e gli OctaPBDE per la fine del 2004
I Deca-PBDE nei prodotti
elettronici (80% dell’uso
commerciale) – nessun accordo
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