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agroindustria isci 2002

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RIVISTA QUADRIMESTRALE
Anno 1
Numero 1
Istituto Sperimentale per le Colture Industriali - Bologna
Ministero delle Politiche Agricole e Forestali
Perché la Rivista “Agroindustria”?
Gli scenari in cui si colloca
Il settore agricolo fornisce la materia prima
per molte industrie trasformatrici; il comparto
(agroindustria) si presenta sempre più organizzato e integrato, con trend crescente di fatturato, di unità impegnate e di attività dell’indotto. Nel settore delle piante per usi alimentari (piante food), il consumo dei prodotti trasformati dall’industria (per esempio, gli
orticoli) tende ad aumentare e si presenta molto diversificato: oltre al prodotto fresco (I gamma), a quello conservato in scatola (II gamma) ed a quello surgelato (III gamma), sono
entrati nel mercato i prodotti della cosiddetta
IV gamma (ortaggi lavorati, tagliati e confezionati, pronti per l’uso) e della V e VI gamma (prodotti precotti e grillati). Inoltre, l’alimentazione si scopre essere il più potente fattore di mantenimento della salute e di prevenzione nella comparsa di alcune patologie tra
le più diffuse nella popolazione; attualmente,
si sta perciò assistendo ad un progressivo rafforzamento dell’attenzione da una qualità della
nutrizione ad una nutrizione finalizzata al miglioramento dello stato di salute; sicchè, i
paradigmi che hanno declinato il settore alimentare possono essere considerati, in ordine
temporale: quantità, qualità, nutrizione, prevenzione.
Intanto, i tradizionali metodi di produzione
agricola (caratterizzati da elevati apporti di
energia sussidiaria, specializzazione estrema
dei sistemi produttivi, riduzione della diversità genetica) hanno esasperato le caratteristiche proprie degli agroecosistemi, i cui effetti
si sono manifestati con eccedenze produttive
(concentrate nei Paesi sviluppati) e vivibilità
compromessa dell’ambiente. È emersa sempre più la necessità di gestire l’azienda secondo i criteri dell’agricoltura sostenibile, riducendo l’inquinamento, l’impiego di mezzi tecnici ottenuti da materie prime non rinnovabili
e promuovendo la valorizzazione delle risorse aziendali. In tale contesto, vanno assumendo importanza le colture a destinazione non
alimentare, rappresentate da diverse specie, le
più importanti delle quali (in base alle conoscenze disponibili, alle ricerche già svolte ed
all’interessamento
delle
industrie
trasformatrici) possono alimentare quattro
grandi filiere: Amido, Energia, Fibra e
Cellulosa, Oli industriali.
Com’è noto, una caratteristica che accomuna le colture industriali (alimentari e non) è
che il loro impiego risulta strutturato in filiere,
con il collegamento stretto fra le successive
fasi della catena: produzione in campo della
materia prima, raccolta e trasferimento del
prodotto all’industria di trasformazione, grande distribuzione organizzata dei prodotti derivati, distribuzione al dettaglio, consumo. Ciascun segmento della filiera presenta peculiarità proprie e sollecita interventi specifici di
ricerca e sperimentazione; le informazioni che
scaturiscono da questi interventi devono essere prontamente portate all’attenzione dei tecnici e degli operatori (utenti della ricerca) per
essere calate nella realtà operativa e promuovere l’avanzamento delle conoscenze nei specifici settori. Tale concetto, ovvio e di validità
generale, è particolarmente pertinente al settore agro-industriale, nel quale scelte sbagliate in un segmento della filiera possono avere
conseguenze negative sia a valle che a monte
della catena. La nuova rivista “Agroindutria”
si propone come strumento essenziale per
veicolare tali informazioni.
Il profilo scientifico
La rivista ospiterà lavori scientifici originali inerenti le tematiche (agronomiche, patologiche, genetiche e miglioramento genetico, fisiologiche, biologiche, biochimiche, tecnologiche, energetiche, economiche, ecc.) integrate nelle varie filiere. Tali informazioni saranno fruite da un pubblico di specialisti comprendente operatori del mondo della ricerca,
docenti e studenti universitari e delle scuole
superiori, tecnici agricoli. Esse saranno poi divulgate al mondo operativo ed al pubblico dei
non specialisti ad opera dei tecnici di base e
dei divulgatori locali che operano sul territorio. Perciò, lo spazio che la rivista si propone
di occupare si colloca a monte di quello occupato dalle riviste divulgative (L’Informatore
Agrario, Terra e Vita, Agrisole, Agrimese,
ecc.) e subito a valle di quello occupato dalle
riviste scientifiche internazionali. Senza sminuire l’importanza per un Ricercatore di pubblicare su riviste internazionali, alcuni risultati meritano di essere portati all’attenzione
diffusa delle realtà scientifiche e sperimentali
nazionali, più di quanto possa assicurare una
rivista internazionale.
La veste editoriale
La rivista ha cadenza quadrimestrale ed è
retta da un direttore responsabile, affiancato
da un comitato scientifico e da una segreteria
di redazione. L’editorial board include competenze che coprono le varie aree tematiche e
disciplinari delle principali filiere
agroindustriali. La direzione della rivista troverà nel comitato dei referee il supporto per
garantire l’alto profilo scientifico dei contenuti e la loro aderenza al target della rivista.
A sua volta, il comitato scientifico sarà
supportato, nell’espletamento della propria
attività, dalla segreteria di redazione; questa,
d’intesa con la direzione, invia i lavori ai
referee, recepisce le osservazioni che scaturiscono dal lavoro di revisione, le trasmette agli
autori, tiene i contatti con il pubblico e gli
abbonati.
La rivista, in lingua italiana, ospiterà solamente lavori scientifici e review su particolari
argomenti, queste ultime richieste dalla direzione a personalità autorevoli in questi settori. Gli articoli, organizzati nel modo tradizionale (testo, tabelle, grafici, figure), comprenderanno un riassunto in italiano ed uno in inglese; quest’ultimo, ampio, dovrà contenere
con chiarezza tutte le informazioni utili ai lettori di lingua inglese per la piena comprensione del lavoro.
Mentre esprimo gli auspici che la rivista
possa essere apprezzata e rappresentare un
punto di riferimento in virtù della sua indipendenza e della qualità scientifica e tecnica
delle informazioni diffuse, desidero ringraziare il MiPAF che ha condiviso e apprezzato tale
progetto, i colleghi dell’ISCI per la collaborazione che mi assicurano, nonché tutti gli
amici che con le loro critiche, suggerimenti o
proposte mi aiuteranno a migliorare il periodico ed a colmare le inevitabili lacune.
Editoriale
Why publish “Agroindustria”?
Background scenario
Agriculture supplies raw materials to many
processing industries; it is a growing business
currently upgrading and providing an increasing
number of jobs with a positive knock-on effect in
other sectors. Nowadays, large quantities of
vegetables are processed by industry: for fresh,
packaged and frozen foods, but also for pre-cut and
pre-cooked foods. Food is, moreover, an important
factor in health and the prevention of common
illnesses; food production has thus gone from
criteria based on quantity to quality, and from there
to the increasing importance of nutrition and the
prevention of diseases.
Traditional agriculture has been a high energy
user, a reducer of genetic diversity and an overproducer (in developed countries). All this has
placed the environment at risk. Sustainable growth
has become the buzz word of an entire generation
of farmers leading to the reduction of pollution and
use of non-renewable raw materials, but also to a
general rethink of the role of agriculture in the
modern world. Today agriculture produces not just
food, but starch, energy, fibre, cellulose and
industrial oils.
Production – whether in food or non-food
sectors – is based on a chain of suppliers,
processors and distributors reaching consumers.
Each link in the chain requires special attention
and research to improve efficiency. This is
particularly true in the agro-industrial sector where
mistakes can impact heavily on both sides of the
chain. “Agroindustria” is a journal dedicated to
providing information to all links in the chain.
Scientific content
The journal will publish original scientific
articles on subjects including agronomy, disease,
genetics, plant breeding, biology, bio-chemistry,
technology, energy, economics and others. This
information is intended for specialist readers:
researchers, University Professors, teachers and
technicians. Our aim is not to add to the magazines
addressed to the general public nor to copy leading
international scientific journals. Some research
requires a broad scientific audience, including
domestic rather than only international specialists.
Editorial content
The journal will come out three times a year and
is headed by a Director working with a scientific
committee and editors skilled in all fields of the
production chain. Referees will guarantee the high
level of scientific reporting and suitability for the
target readership. The editors will co-ordinate the
work of referees, the Scientific Committee and
authors, dealing with revisions and liasing with
subscribers and readers.
The Italian language journal will publish only
scientific works and reviews on particular
erquested topics. The lay-out will be conventional,
with text, tables, graphs and figures. Each article
will include an abstract in Italian and a longer one
in English generally summarising all the data.
It is our hope that the journal will make an
authoritative and independent contribution to the
development of agriculture in the coming years. I
would like to thank my colleagues at ISCI for all
their help, and friends for constructive criticism,
suggestions and proposals today and in the future.
Paolo Ranalli
Variabilità e mappatura di marcatori molecolari RAPD in Cannabis sativa L.
G. Mandolino, A. Carboni, M. Bagatta, P. Crucitti e P. Ranalli
Istituto Sperimentale per le Colture Industriali, Via di Corticella 133 - 40128 Bologna
RIASSUNTO
I marcatori molecolari sono stati impiegati con successo per l’analisi genetica e la caratterizzazione
della struttura genetica di varietà e popolazioni di canapa, utilizzando la tecnica RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA). Vengono presentati i risultati riguardanti l’analisi molecolare di sei
diverse varietà di Cannabis sativa, e l’analisi della progenie di un incrocio fra una pianta femminile
appartenente alla varietà Carmagnola e una pianta monoica appartenente ad una accessione proveniente
da banca di germoplasma. I risultati evidenziano che il livello di polimorfismo entro le varietà dipende
dal pedigree del materiale analizzato, essendo più elevato nelle varietà Carmagnola e Fibranova e via
via più limitato nelle varietà monoiche e da droga. È stato inoltre possibile raggruppare loci RAPD in
una mappa molecolare preliminare di Carmagnola e di una accessione monoica italiana. Infine,
vengono discusse le applicazioni delle tecniche impiegate all’analisi del fenotipo chimico di Cannabis
sativa L.
Parole chiave: Cannabis, RAPD, variabilità genetica, mappa molecolare, chemotipo.
ABSTRACT
Variability and molecular mapping of RAPD markers in Cannabis sativa L.
We used the RAPD technology to assess the degree and extent of genetic variation in six varieties of
Cannabis sativa L. of different genetic structure. The cvs. studied were a dioecious ecotype
(Carmagnola), a selection derived from it (C.S.), a cross-bred dioecious variety (Fibranova), a crossbred monoecious variety (Fibrimon), a full-sib dioecious drug strain (Northern Lights) and a female
inbred line (b92.73.2.13). Five decamer primers were used on DNAs from 10 single individuals of each
variety; 102 loci were scored upon analysis. Polymorphisms were found to be highest for cv Fibranova
(85.5%), which also showed the highest number of scored loci (83), the lowest average allele frequency
(0.42) and the highest levels of heterozygosity (0.26). Carmagnola and C.S. showed a slightly lower
polymorphisms (79.4 and 78.9%), accompanied by a lower loci number (68 and 71) and heterozygosity
(0.20) and by a higher average allele frequency (0.46-0.47). Northern Lights and Fibrimon showed
lower polymorphism (61.3 and 57.3%), a lower number of loci (62 and 61) and lower heterozygosity
(0.15), but a higher tendency to have fixed loci (av. allele frequency 0.64 and 0.67 respectively,
computed on all RAPD loci scored for each variety). The inbred line b92.73.2.13, being selfed twice
upon partial sex reversion, showed the narrowest variability, with only 45 loci scored, 31.1%
polymorphism, only a negligible heterozygosity (0.05) and a high number of fixed loci (av. allele
frequency 0.79).
The partition of variance evaluated by AMOVA showed that, considering cumulatively all the varieties,
48.8% of the variance was due to differences between varieties, and 51.2% to differences between the
individuals within varieties. These data confirm the high diversity found in Cannabis, and the existence
of a single, widely shared gene pool.
A 40-plants F1 progeny from a cross between a female Carmagnola plant and a monoecious accession
from Braunschweig’s germplasm bank was examined for segregation of RAPD markers. It was found
that 181 out of 674 total scorable loci (26.8%) segregate 1:1 in the F1, allowing the construction of a
preliminary map for Carmagnola (66 markers on 11 linkage groups) and for the monoecious accession
(43 markers distributed on 9 linkage groups).
The consequences and possibilities of exploiting the obtained data for the marker-assisted selection for
important traits, such as monoeciousness and chemotype, are also discussed.
Key words: Cannabis, RAPD, variability, molecular linkage map, chemotype.
INTRODUZIONE
Negli ultimi 15 anni, l’uso dei marcatori
molecolari per la caratterizzazione ed identificazione di genotipi vegetali o di specifici
caratteri ha facilitato enormemente lo studio dei genomi vegetali. In particolare, l’avvento di tecniche di analisi molecolare basate sulla PCR (Polymerase Chain Reaction;
Mullis, 1990) ha reso veloce e affidabile
Autore corrispondente: G. Mandolino - Istituto
Sperimentale Colture Industriali, Via di
Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia
Tel. (051) 6316832 - Fax (051) 374857
e-mail: [email protected]
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
l’impiego dei marcatori a DNA per il miglioramento genetico delle specie coltivate.
Il costo unitario dell’utilizzo di queste tecniche si è abbassato sufficientemente da consentire la loro applicazione anche dalle ditte
sementiere medio-piccole. Di conseguenza,
le informazioni sui polimorfismi genetici, le
mappe molecolari e i marcatori associati a
determinati caratteri agronomici sono cresciuti esponenzialmente e sono stati estesi a
specie vegetali poco studiate fino a pochi
anni fa. La canapa non costituisce un’eccezione, dal momento che a partire dal 1995
hanno cominciato a comparire sulle riviste
internazionali articoli riguardanti la
genomica della canapa.
Sono noti i motivi che hanno suscitato
l’interesse per l’introduzione della coltura
della canapa, e sono stati trattati in dettaglio
in altre sedi (Ranalli et al., 1999): necessità
di una coltura che tolleri un basso input di
fertilizzanti chimici e di pesticidi, potenziale alto valore aggiunto dei prodotti finali,
riscoperta delle fibre e dei prodotti naturali.
Allo stesso modo, sono ben note le difficoltà che si incontrano nelle varie fasi della utilizzazione della canapa, analizzate in dettaglio negli altri articoli di questo numero
monografico. Dal punto di vista della genetica e della sua applicazione al miglioramento genetico, l’avvento delle tecniche di biologia molecolare ha permesso di approfondire le conoscenze su questa pianta. In particolare, i marcatori molecolari consentono
di campionare i “loci” del genoma in studio,
visualizzandone la variabilità presente fra
diversi individui di una popolazione o varietà, fra diverse varietà e sottospecie, nonché di stimare parametri come il livello di
eterozigosi di una specie o varietà, la percentuale di loci con alleli fissati, cioè non
più segreganti, ed infine di riunire queste
informazioni, identificate da singoli
marcatori, in mappe di linkage che possono
comprendere caratteri di interesse per la selezione (quali il chemotipo, cioè il tipo o la
quantità di cannabinoidi), fornendo così uno
strumento utile per la selezione (Marker
Assisted Selection o MAS).
I marcatori molecolari sono stati utilizzati con successo nello studio di diverse specie che hanno caratteristiche di allogamia
simili alla canapa, quali Solanum tuberosum,
Medicago sativa, Lolium perenne, Camellia
sinensis e altre. In molti di questi studi sono
stati impiegati marcatori RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA; Williams et
al., 1990), molto semplici da visualizzare,
così che in tempi relativamente brevi possono essere individuati molti “loci” che però
restano anonimi per quanto riguarda la funzione del relativo DNA. Tuttavia, per i
marcatori RAPD occorre prestare particolare attenzione alla riproducibilità dei frammenti ottenuti mediante PCR.
Nel presente lavoro, verranno illustrati i
risultati ottenuti durante lo studio della struttura genetica di popolazioni e varietà di
Cannabis sativa L., da fibra o da droga, utilizzando marcatori RAPD; verrà presentata
una mappa molecolare preliminare derivante da un incrocio fra due piante di diversa
provenienza, e i risultati verranno discussi
con particolare riferimento alla genetica del
chemotipo ed alla possibilità di individuare
marcatori ad esso associati. I risultati ottenuti ampliano le conoscenze sui diversi
Agroindustria / Aprile 2002 3
Tabella 1 - Parametri statistici relativi ai loci identificati dall’analisi RAPD, e caratterizzanti le sei varietà di canapa. I dati relativi a tutte le varietà considerate
cumulativamente sono indicati nell’ultima riga.
Table 1 - Statistical parameters for the loci identified by RAPD analysis in six hemp varieties. The cumulative data are shown in the last row.
Varietà
Carmagnola
CS
Fibranova
Fibrimon
Northern Lights
b92.73.2.13
Tutte
Loci
Alleli
Numero
Fissati
Polimorfici
% di loci
polimorfici
Cv.
specifici
68
71
83
62
61
45
102
14
15
12
24
26
31
3
54
56
71
38
35
14
99
79.4%
78.9%
85.5%
61.3%
57.3%
31.1%
97.1%
3
5
materiali di interesse agroindustriale, fornendo una guida al selezionatore nell’individuare linee o popolazioni di possibile interesse
agronomico.
Figura 1 - Amplificazione da parte del primer
OPG04 di sei campioni “bulk” di DNA, ognuno
composto da quantità equimolari del DNA
genomico delle 10 piante di ogni varietà. Le
frecce indicano le bande di DNA cultivarspecifiche. Corsia 1, linea inbred b92.73.2.13;
corsia 2, Fibrimon; corsia 3, Fibranova; corsia 4,
Northern Lights; corsia 5, Carmagnola; corsia 6,
C.S. M, marcatori di peso molecolare (1 kb
ladder, Life Technologies).
Figure 1 - Amplification by primer OPG04
of six DNA bulks, each composed of
equimolar amounts of the DNAs of 10 plants
of each variety. Arrows indicate cultivar
specific bands. Lane 1, line b92.73.2.13;
lane 2, Fibrimon; lane 3, Fibranova; lane 4,
Northern Lights; lane 5, Carmagnola; lane
6, CS. M, molecular weight markers (1 kb
ladder, Life Technologies).
4 Agroindustria / Aprile 2002
MATERIALI E METODI
Il lavoro di caratterizzazione delle varietà
di Cannabis sativa L. è stato svolto su sei
cultivar e linee a diversa base genetica: le
cv italiane da fibra Carmagnola, C.S. e
Fibranova, di cui la prima è sostanzialmente
un ecotipo, la seconda una sua selezione e la
terza una cv cross-bred (Carmagnola x la
selezione di origine russa Bredemann Elite);
tutte e tre le cv sono dioiche. Quindi la cv
francese monoica Fibrimon, anch’essa crossbred ma a base genetica presumibilmente più
ristretta a causa del lavoro di selezione necessario per il mantenimento del carattere
monoico; la cv da droga Northern Lights,
dioica e presumibilmente selezionata intensivamente per livelli alti ed uniformi di
∆9-tetraidrocannabinolo (∆9-THC); infine,
una linea femminile inbred, la b92.73.2.13,
ottenuta mediante due cicli successivi di parziale reversione del sesso di piante femminili (Mohan Ram and Sett, 1982), e
autofecondazione. Il seme delle cv
Carmagnola, Fibranova e C.S. fa parte della
collezione di accessioni di canapa mantenuta dall’Istituto Sperimentale per le Colture
Industriali di Bologna; il seme della cv
Fibrimon (costituita presso la Fédération
Nationale des Producteurs de Chanvre) è stato gentilmente ceduto dal Prof. G. Venturi
(Dip.to di Agronomia, Università di Bologna); il seme della cv Northern Lights è stato ottenuto dalla Polizia di Stato; il tessuto
fogliare della linea b92.73.2.13 è stato gentilmente concesso dal dr. E. De Meijer - GW
Pharmaceuticals (G.B.).
Sono state valutate anche 40 singole piante
della progenie F1 ottenute dall’ibridazione
fra una pianta femminile di Carmagnola (collezione ISCI) ed una dell’accessione italiana monoica “Sud Italia”, ottenuta dalla banca di germoplasma del Institute of Plant
Genetics and Crop Plant Research - IPK
Gatersleben (D).
Porzioni di foglie di piante allevate in serra, sono state prelevate allo stadio di 4-6 foglie vere. Per ogni varietà dioica, sono state
scelte 5 piante femminili e 5 piante maschili; invece per la varietà monoica Fibrimon
sono state utilizzate 5 piante femminili,
4 monoiche e 1 maschile. Per la linea inbred
b92.73.2.13, sono state analizzate 10 piante
femminili. In tutti i casi, il sesso maschile è
Frequenza
media
dell’allele “1”
0.46
0.47
0.42
0.64
0.67
0.79
0.58
Eterozigosi media
0.20
0.20
0.26
0.15
0.15
0.05
0.29
stato determinato precocemente mediante
l’uso di un marcatore SCAR precedentemente sviluppato (Mandolino et al., 1999; vedi
anche Moliterni et al. nel presente numero
di Agroindustria), mentre per la varietà
monoica la distinzione fra piante femminili
e piante monoiche si è basata sull’osservazione diretta delle infiorescenze a maturità
della pianta. Il DNA genomico è stato preparato utilizzando il kit Nucleon Phytopure Amersham Pharmacia Biotech (G.B.). L’analisi RAPD è stata condotta su 30 ng di DNA
purificato, utilizzando primers decameri Operon Technologies, Alameda (U.S.A.).
Per l’analisi dei dieci individui appartenenti
alle sei varietà sono stati utilizzati 5 primers
Operon:
- OPA08 (5’GTGACGTAGG3’),
- OPA11 (5’CAATCGCCGT3’),
- OPB06 (5’TGCTCTGCCC3’),
- OPG04 (5’AGCGTGTCTG3’),
- OPH01 (5’GGTCGGAGAA3’).
La costruzione di una mappa molecolare
RAPD dell’incrocio Carmagnola x Sud Italia è stata invece condotta utilizzando
180 primers decameri della serie A-L della
ditta Operon Technologies. Le condizioni di
amplificazione in PCR e per la successiva
elettroforesi su gel per la separazione dei
frammenti di DNA amplificato, sono state
descritte da Faeti et al. (1996). Il profilo
elettroforetico ottenuto è stato convertito in
matrici di valori 1 e 0 (presenza o assenza,
rispettivamente, di una determinata banda di
DNA). Le righe delle matrici rappresentavano i loci RAPD e le colonne le piante analizzate. In ogni riga, lo zero corrispondeva
al genotipo omozigote per l’allele “assenza
di amplificazione” ed 1 corrispondeva al
genotipo omozigote od eterozigote per
l’allele “presenza di amplificazione”. L’allineamento delle bande di gel ottenuti da
diversi esperimenti è stato effettuato con il
software Molecular Analyst – Fingerprinting
Plus, versione 1.5 (BioRad, U.S.A.). L’elaborazione statistica delle matrici condotta
mediante il software TFPGA (Tools for
Population Genetic Analysis, versione 1.3;
Miller, 1999) ha consentito di calcolare per
le diverse cv vari parametri tra i quali: la
percentuale di polimorfismo molecolare, la
frequenza allelica media e l’eterozigosità ai
loci RAPD. In particolare, la stima
Tabella 2 - Composizione della varianza dovuta al dioicismo e alla varietà. Il data set per il calcolo del
contributo del sesso include solo le quattro varietà dioiche e 97 marcatori (parte superiore della tabella).
L’analisi AMOVA è stata anche condotta su tutte le 60 piante delle sei varietà (parte inferiore della
tabella), ignorando il contributo del sesso sulla varianza totale (102 markers). I parametri riportati
includono i gradi di libertà (df), le medie quadrate (MS), i componenti della varianza (VC), la
percentuale sulla variazione totale e il test di Bartlett’s (B).
Table 2 - Variance composition due to dioeciousness and to variety. The data set for the contribution of
sex included only the four dioecious varieties (97 markers, upper part). AMOVA analysis was also
performed on all 60 plants belonging to the 6 varieties (lower part), ignoring the contribution of sex to
the total variance (102 markers). Statistics include degrees of freedom (df), mean squares (MS),
variance components (VC), percent of the total variation and Bartlett’s test (B).
Fonte di variazione
df
MS
VC
% del totale B
Maschio-Femmina
1
25.15
0.51
3.3 *
0.06 ns
Individui-Sesso
38
14.94
14.94
96.7
Varietà
5
94.52
8.55
48.8***
6.73***
Individui/Varietà
54
8.97
8.97
51.1
***P<0.001; *P<0.05; ns= non significativo (test di significatività a 3000 permutazioni)
dell’eterozigosità è stata effettuata dal programma TFPGA mediante l’assunzione di
esistenza di equilibrio di Hardy-Weinberg,
in seguito alla quale è possibile calcolare la
frequenza dell’allele recessivo come radice
quadrata della frequenza del genotipo nullo
stesso (assenza di amplificazione, 0; Weir,
1996); la stima dell’eterozigosi “unbiased”
viene calcolata dal software come due volte
il prodotto di entrambe le frequenze alleliche
secondo l’algoritmo elaborato da Nei (1978).
La frequenza allelica è stata calcolata come
1-q, dove q è la frequenza dell’allele “assenza di amplificazione”, e il risultato ottenuto per la frequenza ad ogni locus è stato
mediato poi su tutti i loci presenti in ogni cv
per ottenere il parametro “frequenza allelica
media”. L’analisi di ripartizione della
varianza molecolare osservata è stata effettuata tramite il programma AMOVA-Prep
(Miller, 1998), che prepara i dati per il
software di analisi AMOVA, versione 1.55
(Excoffier et al., 1992). In una prima analisi, mirante ad esaminare il contributo del
sesso alla varianza osservata, solo le quattro
cv dioiche sono state analizzate (40 piante,
97 marcatori RAPD); successivamente,
l’analisi ha escluso il contributo del sesso e
quindi è stata estesa a tutte le sei cvv (60
piante, 102 loci RAPD).
Le matrici relative alle piante F1 dell’ibrido Carmagnola x Sud Italia (entrambe le
piante erano di chemotipo “puro cannabidiolo”, CBD) sono state inserite nel programma MapMaker (versione 3.0) per la
costruzione di una mappa molecolare per
ciascuno dei due parentali utilizzati.
RISULTATI
Variabilità genetica. I 5 primers utilizzati hanno identificato un totale di 102 loci
RAPD (Tab. 1) ed hanno consentito di assegnare a ciascuna delle 60 piante analizzate
un profilo RAPD unico. Il numero totale dei
loci identificati varia con l’ampiezza della
base genetica della cv considerata; è alta e
molto simile in Carmagnola e C.S. (68 e 71
loci RAPD rispettivamente), è ancora più
elevata in Fibranova (83), mentre cala progressivamente in Fibrimon e Northern Lights
(62 e 61) e ha il suo minimo nella linea inbred
b92.73.2.13 (45).I loci fissati (cioè non
polimorfici all’interno di una data cv) seguono un andamento inverso. Di conseguenza,
la varietà che presenta al suo interno il maggior numero di polimorfismi RAPD è
Fibranova (85.5% dei loci risultano
polimorfici), seguita da Carmagnola e C.S.
(79.4 e 78.9%), poi dalle cv Fibrimon e
Northern Lights (61.3 e 57.4%) ed infine
dalla linea inbred (31.1% di loci polimorfici).
Da notare nella tabella 1 che 3 loci sono risultati specifici per Northern Lights e 5 per
la linea b92.73.2.13 (entrambe varietà puro
∆9-THC), mentre non sono state identificate
bande RAPD esclusive di nessuna delle altre cv Tali bande fissate in una varietà e assenti nelle altre sono facilmente visibili quando si esaminano con la tecnica RAPD dei
“bulk” di DNA, ottenuti mescolando quantità uguali di DNA genomico di ciascuno dei
10 individui di ogni varietà (Fig. 1).
La frequenza dell’allele 1 (presenza di
banda) a ciascun locus è un altro parametro
di valutazione della variabilità nelle cv di
Tabella 3 - Valori di variazione fra le cultivar (espressi come percentuale della variazione totale) per
ognuna delle coppie di varietà studiate, calcolate mediante il software AMOVA.
Table 3 - Values of among-cultivar variation (expressed as percent of the total variation) for each pair
of the varieties studied, calculated by AMOVA analysis.
Carmagnola
CS
Fibranova
Fibrimon
N.Lights
b92.73.2.13
Carmagnola
12.8
19.5
40.7
51.5
65.2
CS
Fibranova
Fibrimon N.Lights
b92.73.2.13
18.0
42.5
46.5
61.2
34.5
41.1
57.9
58.3
76.8
-
76.3
canapa esaminate, e costituisce la base per
il calcolo, mediante opportuni algoritmi incorporati nel programma utilizzato,
dell’eterozigosità, quindi della percentuale
di eterozigosi mediata su tutti i loci per ciascuna varietà. Si nota dalla tabella 1 che la
frequenza allelica media è vicina a 0.5 nelle
cv italiane, mentre è via via più alta in
Fibrimon, Northern Lights e b92.73.2.13. Di
converso, l’eterozigosità stimata dal software
TFPGA è più alta in Fibranova, leggermente più bassa in Carmagnola e C.S., e via via
più bassa nelle altre varietà esaminate, fino
allo 0.05 della linea inbred due volte
autofecondata. Se si considerano tutti i loci
identificati dall’analisi RAPD (102) e la frequenza allelica in tutti gli individui esaminati cumulativamente, si ottiene il valore
medio dell’eterozigosità della canapa come
specie, che risulta essere 0.29.
I risultati dell’analisi di partizione della
varianza molecolare ottenuti tramite il
software AMOVA sono riassunti nella tabella
2. In una prima fase, è stata stimata tramite
la funzione “three-levels” la percentuale di
variazione dovuta al sesso entro le cv e agli
individui entro i sessi; tale analisi è stata
condotta soltanto sulle 40 piante delle quattro cv dioiche, e ha evidenziato la non
significatività del contributo del sesso alla
varianza (3.3%, test di Bartlett non significativo; tabella 2, parte superiore). Nella seconda analisi condotta, il contributo del sesso alla varianza è stato ignorato, e ci si è
concentrati sulla varianza dovuta alle varietà e agli individui (Tab. 2, parte inferiore);
da questa seconda analisi risulta che la percentuale di variazione entro le varietà (quindi
fra individui, indipendentemente dal loro
sesso) e fra le varietà è dello stesso ordine di
grandezza (51.2% contro 48.8%). I valori di
percentuale della variabilità fra le cv si
discostano però molto dal valore medio ottenuto considerando tutte e sei la varietà simultaneamente (48.8%) se si considerano
specifiche coppie di varietà; così, la variabilità fra le cvv. Carmagnola e C.S. è molto
più bassa, 12.8%, mentre è elevatissima,
76.3%, fra Northern Lights e b92.73.2.13,
nonostante si tratti di due varietà ad alto ∆9THC. I dati relativi alla variabilità fra varietà considerate a coppie sono riassunti nella
tabella 3.
Mappa di linkage. I parentali dell’ibrido
F1 “Carmagnola x Sud Italia” hanno mostrato
in seguito ad analisi 674 bande RAPD. Fra
queste, 269 (39.9%) erano polimorfiche fra
i due parentali, e 181 di esse segregavano
1:1 nella progenie F1 esaminata. Fra i 405
loci non polimorfici, 46 soltanto hanno segregato 3:1 in F1, il che conferma quindi lo
stato eterozigote di molti loci RAPD nei parentali. I loci che segregavano 3.1 non sono
stati utilizzati per la costruzione della mappa. Il test χ2 per la verifica dell’accordo dei
rapporti di segregazione osservati con quelli attesi è risultato significativo solo per 16
Agroindustria / Aprile 2002 5
Figura 2 - Mappa molecolare per marcatori RAPD in canapa (varietà Carmagnola). Questa mappa è
stata ottenuta a un valore di LOD = 3.0, massima distanza 30.0. I numeri in corrispondenza dei trattini
sono la sigla identificativa del marcatore RAPD, i numeri fra i trattini esprimono la distanza di mappa
in percentuale di ricombinazione.
Figure 2 - Molecular map of hemp (Carmagnola variety). This map was obtained at LOD = 3.0,
maximum distance 30.0. Numbers next to the hyphens are the RAPD marker code; numbers between
the hyphens indicate the percent of recombination between the markers.
dei 181 loci per i quali è stato ipotizzato il
rapporto di segregazione 1:1 (8.8%), e per
14 dei 46 loci che si presumeva segregassero secondo il rapporto 3:1 (30.4%). La mappa più avanzata ottenuta utilizzando il
software MapMaker è quella di Carmagnola,
nella quale finora sono entrati a far parte 66
marcatori distribuiti su 11 gruppi di linkage
(Fig. 2; Cannabis sativa possiede n=10 cromosomi); la mappa dell’accessione monoica
italiana comprende invece 43 marcatori distribuiti su 9 gruppi di linkage. Sono attualmente in corso le analisi delle progenie delle piante F2, con l’obiettivo di costruire una
mappa di linkage fra marcatori RAPD e loci
che controllano il carattere “chemotipo”. I
parentali scelti erano a chemotipo divergente e praticamente puro (CBD o THC), mentre tutte le piante F1 analizzate sono risultate
a chemotipo misto (CBD + THC). Pertanto,
si dovrà esaminare la progenie F2 per osservare segregazione del chemotipo e associare quest’ultimo a qualche marcatore RAPD.
DISCUSSIONE
I risultati presentati confermano ed estendono precedenti osservazioni (Faeti et al.,
1996) sull’elevato grado di variabilità,
misurabile come polimorfismo molecolare
dei marcatori RAPD, nella specie Cannabis
sativa L. In effetti, tutte le piante esaminate
sono risultate avere un diverso profilo
RAPD, e quindi tutte distinguibili fra loro,
per le bande ottenute dalla combinazione di
6 Agroindustria / Aprile 2002
uno o più primers. Questo livello così elevato di polimorfismo non sorprende dato che
la canapa è un’allogama obbligata, ed è
comparabile con altre specie allogame esaminate, quali la patata, dove è stato stimato
un polimorfismo del 95% mediante
marcatori RAPD (Gebhardt et al., 1989;
Forapani et al., 1999), Lolium perenne, dove
l’analisi RAPD ha rilevato che la diversità
entro le cv era superiore a quella fra le cv
(Sweeney e Danneberger, 1994) o Medicago
sativa, in cui in alcuni studi il livello di
polimorfismo molecolare RAPD è stato stimato intorno al 95% (Barcaccia et al., 1994).
Anche i dati relativi al numero di loci sono
compatibili con quanto noto sulla struttura
genetica delle sei varietà esaminate.
Carmagnola e C.S. sono da considerarsi
ecotipi, anche se era da attendersi una base
genetica più ristretta per C.S., che è una selezione da Carmagnola. Fibranova, invece,
è un incrocio fra l’ecotipo Carmagnola e una
linea di origine russa, la Bredemann Elite, e
questa origine da “cross-bred” si riflette in
un maggior polimorfismo ed una eterozigosi
più elevata. Le due cv Fibrimon e Northern
Lights, pur essendo di origine e caratteristiche molto diverse (una monoica e contenente
quasi esclusivamente CBD, l’altra dioica e
puro ∆9-THC), condividono una base genetica molto più ristretta rispetto alle cv italiane, a causa del lavoro di selezione stretta che
occorre effettuare per impedire la perdita dei
caratteri che le contraddistinguono, il
monoicismo e l’elevato tenore di ∆9-THC,
rispettivamente. Da questo derivano i livelli
più bassi di polimorfismo, di eterozigosi, di
frequenza allelica media, fino ad un più basso
numero di bande individuabili: il lavoro di
scelta e selezione che sta dietro queste cv
provoca la perdita netta di un buon numero
di alleli per la presenza di bande. Quest’ultimo fenomeno è ancora più marcato nella
linea inbred b92.73.2.13, ottenuta attraverso due cicli di reversione del sesso ed
autofecondazione. Qui i polimorfismi sono
comparativamente molto ridotti rispetto alle
cv italiane (31% contro circa 80%), c’è un
numero più limitato di alleli per la presenza
di bande, e la frequenza allelica media si
avvicina ad 1, come atteso nel caso di “quasi fissazione” a molti loci, e l’eterozigosi è
estremamente bassa (Forapani et al., 2001).
Sono stati individuati 3 marcatori RAPD
presenti solo nella cv da droga Northern
Lights e 5 nella linea inbred b92.73.2.13,
entrambe puro THC; questi marcatori risultano pertanto particolarmente interessanti. Le
analisi statistiche effettuate sono state condotte su 10 piante di ogni cv, ma sono state
analizzati un numero elevato di loci (102),
il che conferisce validità generale alle conclusioni tratte (Nei, 1978).
Anche l’analisi di partizione della varianza
osservata riflette in modo fedele la struttura
delle cv analizzate. Comparando coppie di
varietà, si nota che la variabilità fra le varietà diventa progressivamente più importante
rispetto alla variabilità entro le varietà con
l’aumentare del grado di selezione necessario a mantenere le caratteristiche delle cv
confrontate. Così, comparando la linea
inbred b92.73.2.13 e la cv da droga Northern
Lights, il 76.3% della variabilità totale delle
due cv è dovuta alla differenza tra cv, mentre nel confronto tra cv Carmagnola e C.S.,
solo il 12.8% della variabilità è dovuta alle
differenze fra varietà, il resto essendo dovuto a differenze puramente individuali entro
varietà. Considerando tutte le varietà analizzate, si ottiene che circa metà della variazione è dovuta alle differenze tra varietà
(48.8%) e l’altra metà a differenze individuali (51.2%).Non è stato possibile discriminare mediante parametri statistici la cv
Carmagnola dalla sua selezione C.S., e anche la percentuale di variabilità fra queste
due cv (12.8%, tabella 3) è risultata dello
stesso ordine di grandezza della variabilità
di due diversi lotti di seme della cv
Carmagnola, e quindi non significativa (dati
non mostrati). L’elevata percentuale di
varianza dovuta a differenze individuali più
che a segregazione fra le varietà e gli ecotipi
è in accordo con l’ipotesi dell’esistenza di
un’unica specie in Cannabis (Cannabis
sativa), e con l’esistenza di un unico pool
genico per tutta la specie, sottolineata da vari
autori, e indipendente da caratteristiche
macroscopiche come il monoicismo e il tipo
di cannabinoide (de Meijer, 1995; 1999).
Tale limitata separazione varietale si può
presumibilmente giustificare con l’allogamia
obbligata della specie, e con l’altissima capacità di dispersione del polline di canapa,
che porta a livellare e disperdere la variabilità, soprattutto in assenza di uno stringente
lavoro di selezione, che è almeno in molti
casi venuto a mancare in tutto il lungo periodo di abbandono della coltura.
L’elevato grado di eterozigosi rilevato
mediante analisi RAPD delle varietà ha suggerito che è possibile costruire una mappa
molecolare della canapa in F1. La progenie
esaminata ha confermato che il numero di
marcatori che segregano 1:1 in F1 è sufficientemente elevato per costruire una mappa, anche se è possibile che per ottenere
mappe più dense occorra applicare strategie
che forniscano un numero più elevato di
marcatori multi-locus (es. AFLP; Vos et al.,
1995), oppure a utilizzare progenie F2. Attualmente è in corso l’analisi RAPD e AFLP
di progenie F2 di canapa nelle quali viene
osservata anche la segregazione del
chemotipo, poiché i parentali erano divergenti per questo carattere. Una mappa preliminare di canapa è stata comunque ottenuta, e le informazioni relative al numero di
marcatori segreganti 1:1, non segreganti, o
segreganti 3:1 sono di grande utilità per la
costruzione di future “mapping populations”.
Va anche sottolineato che i dati ottenuti
mostrano che solo una minoranza dei
marcatori segreganti ha mostrato una distribuzione nella progenie che si è discostata
dall’atteso (test χ2 significativo), indice questo di una quantità trascurabile di segregazioni distorte ottenute, nonostante il numero di individui esaminati nella F1 (40) non
sia elevatissimo.
I risultati ottenuti nel corso delle
sperimentazioni descritte fanno ben sperare
nella possibilità, scegliendo gli opportuni
incroci e tipo di progenie, di individuare
marcatori molecolari associabili al carattere
“chemotipo”, e quindi, in un futuro non lontano, di poter effettuare la selezione per (o
contro) un determinato chemotipo con
l’ausilio delle tecniche di biologia
molecolare, che permetterebbe la determinazione precoce del carattere e quindi renderebbe più veloce ed affidabile il miglioramento genetico per quel carattere.
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Agroindustria / Aprile 2002 7
Identificazione di marcatori molecolari associati al sesso e loro applicazione al
breeding ed allo studio del differenziamento sessuale di Cannabis sativa L.
V.M.Cristiana Moliterni, Giuseppe Mandolino, Luigi Cattivelli1, Paolo Ranalli.
Istituto Sperimentale per le Colture Industriali, Via di Corticella, 133 (BO)
1
Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura, Strada S. Protaso, 302 - Fiorenzuola d’Arda (PC)
RIASSUNTO
La Cannabis sativa è una specie dioica con dimorfismo sessuale che si manifesta in una fase molto
tardiva dello sviluppo, poco prima della produzione dei fiori. Di qui la necessità di un sistema
rapido di discriminazione dei due sessi, funzionale alla realizzazione dei programmi di breeding.
L’analisi RAPD del genoma di individui di sesso maschile e femminile ha permesso di individuare
alcuni frammenti di DNA maschio-specifici. Da uno di questi, il MADC2, è stato ottenuto un
marcatore SCAR che consente una discriminazione rapida e sicura dei due sessi. Tale marcatore è
stato inoltre un supporto utile allo studio del differenziamento sessuale di Cannabis sativa.
Parole chiave: Cannabis sativa, dioicismo, differenziamento sessuale, RAPD, SCAR, marcatori
del sesso, C-DNA AFLP.
ABSTRACT
Sex-linked molecular markers as tools for breeding and studies on sexual differentiation of
Cannabis sativa L.
Cannabis sativa L. is a naturally dioecious species with heterogametic males (2n = 18+XY) and
homogametic females (2n = 18+XX). It is characterized by unisexual flowers and shows sexual
dimorphism. Despite the presence of sexual chromosomes, the sex of Cannabis sometimes shows
some flexibility. Anomalies may in fact occur in floral development, such as the presence of the
reproductive structure of the opposite sex or the development of bisexual inflorescence (monoecious
phenotype). Sexual dimorphism generally occurs late in plant development, often leading to labourintensive steps during breeding programs. The development of a method for rapid sex determination
in Cannabis sativa would therefore be advisable. By means of the RAPD technique, applied to
male and female genomes, a marker of 400bp was identified to be male specific. It was named
MADC2 (Male Associated DNA of Cannabis) according to Sakamoto et al. (1995). Despite its
sex-specific association, the sequences corresponding to MADC2 were present in both staminate
and carpellate plants, as revealed by Southern hybridization with the cloned RAPD band. MADC2
was sequenced and specific primers were constructed corresponding to its 1-20 and 373-391 positions.
These primers generated a male-specific SCAR marker, 391bp long, and two fragments about 560
and 870bp long in the female and monoecious genotypes. A rapid method based on a PCR
amplification directly from plant tissue was also developed from the original protocol by Klimyuk
et al. (1993). This procedure, with the male-specific SCAR marker, gives a suitable method for a
precise, early and rapid identification of males during breeding programs.
The molecular mechanism of Cannabis sativa sexual differentiation was also investigated. By
means of optical microscopy, the earliest step in apex sexual differentiation was identified as the
leaves of the fourth node emerge. Most of the samples observed at this stage have indeed developed
some lateral meristem buds. In order to identify the genes involved in this earliest stage of sexual
differentiation an analysis of gene expression was carried out by means of the cDNA AFLP technique.
Several differentially expressed AFLP fragments were recovered and their sex specificity checked
by Reverse Northern and Northern analysis, but only subcloning and sequencing will make it
possible to track back to the genes having a differential expression at this stage. The rapid method
of sex determination was of great importance for sex discrimination at the fourth node, because of
the complete absence of sexual dimorphism between plants at this stage.
Key words: Cannabis sativa, dioecy, sexual differentiation, RAPD, SCAR, sex linked molecular
markers, cDNA AFLP.
INTRODUZIONE
La Cannabis sativa è una pianta erbacea
annuale appartenente alla famiglia delle
Cannabaceae e all’ordine delle Hurticales.
Autore corrispondente: V.M.Cristiana Moliterni
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di
Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia
Tel. (051) 6316811 - Fax (051) 374857.
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
8 Agroindustria / Aprile 2002
È una specie naturalmente dioica, con individui di sesso maschile e femminile, dotati
di fiori unisessuali e caratterizzati da un
dimorfismo sessuale che, oltre alla
morfologia del fiore, si estende anche
all’habitus della pianta. Infatti i maschi sono
generalmente più alti ed esili delle femmine
ed hanno un ciclo vitale più breve. I fiori
unisessuali sono portati in infiorescenze dapprima terminali e successivamente laterali
(Fig. 1). Negli individui di sesso maschile i
fiori sono organizzati in numero variabile in
panicoli pendenti ed a volte ramificati, generalmente privi di foglie. I fiori del panicolo
possono essere singoli o raggruppati ed in
questo caso ogni fiore è sostenuto da un sottile peduncolo. Ogni fiore maschile è costituito da un perianzio formato da cinque
sepali che racchiude l’androceo composto da
cinque stami sostenuti da sottili filamenti.
Le antere portate all’estremità degli stami, a
maturità deiscono longitudinalmente liberando il polline che può essere così trasportato
dal vento (Mohan Rham & Nath, 1964). I
fiori femminili sono invece organizzati in
racemi che si sviluppano in posizione terminale od all’ascella di foglie o ramificazioni laterali. Nell’infiorescenza, all’ascella
di una piccola foglia verde si sviluppano due
fiori ciascuno sotteso ad una piccola stipola.
Il fiore femminile ha una struttura molto
semplice essendo costituito da una brattea
verde che avvolge completamente il
perianzio, appena abbozzato, e l’ovario. Lo
stilo si differenzia nella porzione distale in
uno stimma bifido. La brattea fiorale è particolarmente ricca di peli silicei e tricomi
ghiandolari che secernono sostanze aromatiche e resinose (Mohan Rham & Nath,
1964).
Il corredo cromosomico di Cannabis
sativa è composto da 9 coppie di autosomi
ed una coppia di cromosomi sessuali. Il sesso maschile è definito dalla presenza della
coppia eteromorfa XY mentre quello femminile è definito dalla coppia XX, similmente a quanto si verifica in altre specie dioiche
come per esempio la Silene latifolia. Il cromosoma Y in Cannabis è subtelocentrico ed
è caratterizzato dall’avere un satellite all’estremità del braccio corto ed un braccio
lungo particolarmente sviluppato, tanto che
si ritiene che la differenza nelle dimensioni
dei genomi maschile e femminile (rispettivamente 1683 Mbp e 1636 Mbp), sia quasi
completamente attribuibile al cromosoma Y
(Sakamoto et al., 1998). Il cromosoma X
invece è submetacentrico e porta un satellite all’estremità del braccio corto. Come si
verifica frequentemente nei cromosomi sessuali vegetali, anche il cromosoma Y di
Cannabis è fortemente eterocromatico e ricco di sequenze ripetute che sono causa della
sua forte condensazione in metafase
(Sakamoto et al., 1998). Una buona parte
del DNA ripetuto è costituito da sequenze
del tipo LINE (Long Interspersed Elements)
che rappresentano vestigia di elementi
trasponibili al livello dei quali è possibile
rilevare un basso livello di trascrizione per
Tabella 1 - Frammenti RAPD maschio specifici.
Table 1 - Male specific RAPD markers.
Primer
Sequenza
Dimensioni
della banda
RAPD
OPA08
5’-GTGACGTAGG-3’
400 bp
OPA12
5’-TCGGCGATAG-3’
700 bp
OPC04
5’-CCGCATCTAC-3’
1600 bp
OPC08
5’-TGGACCGGTG-3’
2700 bp
OPC10
5’-TGTCTGGGTG-3’
700 bp
OPC14
5’-TGCGTGCTTG-3’
1400 bp
OPD05
5’-TGAGCGGACA-3’
900 bp
OPE02
5’-GGTGCGGGAA-3’
1000 bp
OPE14
5’-TGCGGCTGAG-3’
400 bp
OPI01
5’-ACCTGGACAC-3’
1600 bp
OPJ16
5’-CTGCTTAGGG-3’
1400 bp
la presenza di ORF ancora attive, relative
ad enzimi connessi al meccanismo stesso
della trasposizione. Le LINEs di Cannabis
sativa (LINE-CS) sono rappresentate anche
negli autosomi e nel cromosoma X ma, molto
particolare è la loro specifica concentrazione all’estremità del cromosoma Y. Ciò fa
pensare che esse possano avere un ruolo nel
mantenimento della struttura dell’Y e che
possano contribuire alla differenziazione
morfologica e strutturale dei cromosomi sessuali creando delle regioni eteromorfiche al
livello delle quali risulta repressa la
ricombinazione (Sakamoto et al., 2000).
Nonostante siano presenti i cromosomi
sessuali, il sesso nella canapa è un carattere
che manifesta una certa flessibilità. Infatti
occasionalmente è possibile rilevare delle
anomalie nello sviluppo fiorale che si manifestano con la comparsa degli organi ripro-
duttivi del sesso opposto o con lo sviluppo
di infiorescenze miste (recanti sia fiori maschili che femminili) che caratterizzano il
fenotipo monoico. Un altro aspetto controverso della determinazione del sesso in
Cannabis è dato dalla possibilità di ottenere
per alcuni genotipi, la sua parziale o completa reversione. È noto infatti che il trattamento con sostanze mascolinizzanti o
femminilizzanti, seguito dall’esposizione ad
un fotoperiodo efficace per l’induzione alla
fioritura, è in grado di determinare la comparsa degli organi riproduttivi del sesso opposto anche in individui che sono già in uno
stadio avanzato del proprio differenziamento
sessuale. Hanno un effetto mascolinizzante
quelle sostanze che inibiscono la biosintesi
o l’attività dell’etilene quali l’aminoetossivinilglicina, Ag(S2O3)23- e AgNO3, mentre
hanno un effetto femminilizzante i precur-
Figura 1 - Infiorescenza maschile (sinistra), infiorescenza femminile (destra).
Figure 1 - Male inflorescence (left), female inflorescence (right).
sori o gli attivatori della biosintesi di questo
ormone vegetale come l’etephon (Mohan
Ram and Sett, 1982a; Mohan Ram and Sett,
1982b). La possibilità di reversione è sicuramente un carattere a base genetica poiché
esistono dei genotipi suscettibili e dei
genotipi refrattari al trattamento di reversione.
In pieno campo il ciclo vitale della canapa ha una durata di 5-6 mesi ed il
raggiungimento della maturità sessuale si
verifica dopo 3-4 mesi con la comparsa dei
fiori unisessuali. Il dimorfismo sessuale si
manifesta solo in uno stadio molto avanzato
dello sviluppo quando, poco prima della produzione dei fiori, negli individui di sesso
maschile si verifica un particolare allungamento degli ultimi internodi, fenomeno che
rende i maschi più alti ed esili delle femmine.
La possibilità di distinzione precoce del
sesso costituisce un problema basilare in ogni
programma di miglioramento genetico della canapa, essendo questa una specie tipicamente allogama. Per esempio, il metodo
Bredeman di selezione per la qualità della
fibra prevede un’analisi precoce qualitativa
e quantitativa della fibra negli individui di
sesso maschile, cui segue l’eliminazione e
quindi l’esclusione dalla possibilità di
impollinazione di quelli che non soddisfano
i parametri stabiliti (Bredeman, 1938).
L’obiettivo principale di questo lavoro è
stato quindi la ricerca di un sistema che permettesse una discriminazione precoce ed affidabile dei due sessi e che potesse costituire un supporto utile ai programmi di miglioramento genetico di Cannabis sativa.
L’altro aspetto investigato ha riguardato
più direttamente il meccanismo di determinazione del sesso. Sebbene sia conosciuta
la relazione tra cromosomi eteromorfici e
sesso in Cannabis, nulla è ancora noto sui
meccanismi molecolari che sottendono a
questo processo.
Il lavoro di ricerca si è quindi sviluppato
da un lato verso l’analisi dei genomi di individui di sesso maschile e femminile, mediante la tecnica RAPD (Williams et al., 1990),
al fine di identificare sequenze di DNA sesso-specifiche; e dall’altro verso la comprensione dei meccanismi molecolari del
differenziamento sessuale in Cannabis. A
tale scopo è stata condotta un’analisi dell’espressione genica differenziale, utilizzando la tecnica cDNA AFLP.
MATERIALI E METODI
Analisi dei genomi mediante la tecnica
RAPD (Random Amplyfied Polymorphic
DNA). Semi appartenenti a 13 varietà ed
accessioni di Cannabis sativa, di diversa
origine (Faeti et al., 1996), sono stati fatti
germinare in serra e le plantule sviluppatesi
sono state trasferite in pieno campo fino al
raggiungimento della maturità sessuale, al
fine di identificare con certezza il sesso di
Agroindustria / Aprile 2002 9
Tabella 2 - Sequenza del frammento MADC2. Le regioni sottolineate corrispondono ai primers per l’ottenimento del marcatore SCAR di 391bp, maschio
specifico.
Table 2 - MADC2 sequence. Underlined regions correspond to the male specific SCAR marker primers.
GTGACGTAGG
TAGAGTTGAA
TAACTAAGCA
TGGACCTAAC
GATTTCCAAA
AGCGTGCGAT
TTCTTCTTTC
TGCAATTACA
TTCTACTATG
GAGTGCTAGG
GGCAGTTAAT
TGAGATTAAA
TGCCAGGTTC
GATCAAAAGA
TCTTTGAACT
GCATATCCAT
ATATTCTCCA
CCCCTATCAA
TTCGCAAGAT
CTATAAAGTT
TTACCCAATT
AGTTTTGAGC
TAATGCAGGC
TATTCCTGAA
ACTTTTGAAA
CGTTTCAGTG
GTCCGCAAAG
AAAGAACGTT
TGGTCATCTT
TCCTTCAAGG
CAAGACTTGC
GTACAGGTAA
TTCACCTAAG
ACGATATTTT
TCAGTGGACC
GTCTCTGGTT
AACTTATTGA
GTCTCTCATA
GCCTACGTCA
C
ciascun individuo. Gli incroci e l’analisi delle
progenie segreganti sono stati invece condotti in serra, in condizioni controllate, su
un totale di circa 200 individui. Da ciascuna
pianta sono state prelevate alcune foglie giovani ed utilizzate per l’estrazione del DNA.
Il DNA genomico è stato estratto secondo il
metodo indicato da Taylor e Powell con alcune modifiche minori (Faeti et al., 1996).
Per l’analisi RAPD sono stati utilizzati 179
primers decameri appartenenti alle serie A,
B, C, D, E, G, H, I, J, disegnati dalla Operon
Technologies, USA. Le amplificazioni
RAPD ed i profili elettroforetici sono stati
ottenuti secondo il protocollo riportato in
Faeti et al. (1996).
Clonaggio e sequenziamento dei frammenti RAPD. I frammenti RAPD associati
putativamente al sesso maschile sono stati
eluiti dal gel, clonati e sequenziati secondo
la procedura descritta precedentemente
(Mandolino et al., 1999).
Southern Hybridization. La verifica della sesso-specificità di ciascun frammento è
stata effettuata mediante ibridazione di filtri
Southern prodotti secondo la procedura già
riportata da Mandolino et al. (1999).
Produzione di marcatori SCAR. Sulla
base della sequenza nucleotidica dei frammenti RAPD, sono stati costruiti dei primers
interni alla sequenza per l’ottenimento di
marcatori SCAR. Per la produzione dei
marcatori SCAR è stato seguito il protocollo dell’analisi RAPD (Faeti et al., 1996) a
cui sono state apportate alcune modifiche
riguardo la temperatura di annealing (60°C)
e la concentrazione di MgCl2 nella mix di
amplificazione (1.5 mM). La verifica dell’associazione del marcatore SCAR al
fenotipo è stata effettuata mediante l’analisi
di progenie segreganti.
Analisi dell’espressione genica mediante la tecnica cDNA AFLP (Amplyfied
Fragment Length Polymophism).
Materiale vegetale. Semi di canapa della
cultivar Fibranova sono stati fatti germinare
e mantenuti in serra con un fotoperiodo di
11 ore e ad una temperatura media di 27°C.
Figura 2 - Analisi SCAR realizzata con i due primers maschio-specifici, su DNA genomico
rispettivamente di maschi e femmine appartenenti a cultivar diverse: Carmagnola (1-2),
Fibranova (3-4), Uniko (5-6), Kompolti ibrido TC (7-8), Accessione 2 (9-10), cv. Bialobrzeskie,
monoica, quattro individui (11-14).
Figure 2 - SCAR analysis with the male-specific primers on genomic DNA from one male and one
female of different cultivar: Carmagnola (1-2), Fibranova (3-4), Uniko (5-6), Kompolty Hybrid
TC (7-8), Accession 2 (9-10) and four different monoecious plants of cv. Bialobrzeskie (11-14).
10 Agroindustria / Aprile 2002
Molto precocemente è stata realizzata una
determinazione rapida del sesso secondo il
protocollo di Klimyuk et al. (1993), con alcune modifiche apportate per Cannabis
sativa (vedi Risultati).
Analisi microscopica della struttura degli apici. Apici maschili e femminili sono
stati prelevati in vari momenti del
differenziamento sessuale e fissati in
glutaraldeide 3% per 24 ore. Successivamente sono stati inclusi in resina ed analizzati al
microscopio ottico in sezioni semifini, colorate con Blu di Toluidina.
Estrazione del m-RNA. Apici prelevati
al 2° nodo ed apici maschili e femminili prelevati al 4° nodo sono stati polverizzati in
un mortaio con azoto liquido e trasferiti nel
buffer di estrazione (Buffer 1: 50 mM TrisHCl, pH 9.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA,
2% SDS) scaldato a 37°C (5ml del buffer
per 1 g di peso fresco). L’omogenato è stato
trasferito in tubi di polipropilene sterili e
sottoposto due volte ad estrazione con un
egual volume della miscela fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1), e una volta, con un egual volume della miscela cloroformio/alcool isoamilico (24:1). Al sovranatante ottenuto dall’ultima estrazione è stata
aggiunta Oligo-dT cellulosa (Boehringer
Mannheim) in quantità pari a 150 mg ml-1
ed NaCl fino ad una concentrazione finale
pari a 0.4 M. I campioni sono stati posti in
agitazione orizzontale (30-50 rpm) per 30' e
quindi centrifugati a bassa velocità per ottenere una completa separazione della
cellulosa dal sovranatante. La cellulosa è
stata sottoposta a due lavaggi con 10ml di
Buffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 400 mM
NaCl, 0.2% SDS) ed a due lavaggi con 10 ml
di Buffer 3 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5,
100 mM NaCl). Ciascun lavaggio è stato seguito da una breve centrifugata a 800xg per
20 minuti. Dopo l’ultimo lavaggio la
cellulosa è stata trasferita in colonnine per
cromatografia del volume di 10 ml e sottoposta a quattro lavaggi successivi con 10 ml
di Buffer 3 per eliminare tutti gli acidi nucleici
che non si erano legati per affinità all’OligodT cellulosa. L’RNA messaggero è stato eluito
Tabella 3 - Protocollo per la determinazione rapida del sesso in Cannabis sativa (da Klimyuk et
al.,1993 modificato).
Table 3 - Procedure for rapid PCR based sex determination. P21 and α 1 primers correspond to the
1-20 and 373-391 position of the MADC2 sequence respectively.
Protocollo per la determinazione rapida del sesso in Cannabis sativa
(da Klimyuk et al.(1993 ), modificato)
1. Prelevare dalla porzione distale di una giovane foglia un frammento lungo 4-5mm e largo 2-3mm ed
introdurlo in una provetta da 1.5ml sterile
2. Aggiungere 40µl di NaOH 0.25M ed effettuare una rapida centrifugata
3. Incubare a 100°C per 35 secondi. netti
4. Aggiungere 40µl di HCl 0.25M e 20µl di Tris-HCl 0.5M, pH 8, 0.25% Triton X-100
5. Centrifugare brevemente ed incubare a 100°C per 2 minuti
6. Prelevare ciascun frammento e trasferirlo sul fondo di una provetta da PCR
7. Aggiungere ad ogni frammento 25µl della MIX di amplificazione
MIX
H 2O
18.3µl
Buffer 10X
2.5µl
0.75µl
MgCl2 50mM
α1 primer (100ng/µl)
1µl
P21 primer (100ng/µl)
1µl
dNTP mix (2.5mM each)
1.25µl
Taq DNA Polymerase (5U/l) 0.2µl
Realizzare un'amplificazione per SCAR (vedi Materiali e Metodi)
N.B. I primers P21 e α1 corrispondono alle sequenze 1-20 e 373-391 del MADC2
in quattro frazioni ottenute applicando sulla
colonnina, per ogni frazione, un volume di
400 µl di Buffer 4 (10 mM Tris-HCl,
pH 7.5), scaldato a 65°C. L’RNA messaggero di ciascuna frazione è stato precipitato
con 2.5 volumi di etanolo assoluto a -20°C
O/N. Le frazioni precipitate sono state
recuperate e quantificate spettrofotometricamente. Tutta la procedura del-
1Kb
l’estrazione è stata condotta utilizzando vetreria e supporti monouso sterili, nonché
soluzioni prodotte con acqua distillata e
DEPC, e successivamente autoclavate.
Sintesi del cDNA. Il cDNA è stato sintetizzato a partire da 1µg di mRNA. La sintesi
del primo filamento è stata realizzata utilizzando l’enzima Superscript™ II (Life
Technologies), secondo il protocollo sugge-
M M M F F F M M F F F F M F M F F M
1Kb
Figura 3 - Visualizzazione degli amplificati ottenuti con il metodo rapido di determinazione del sesso.
La freccia indica la banda relativa al marcatore SCAR maschio-specifico di 391bp.
Figure 3 - Amplificate profiles obtained with the rapid methods for sex determination. The arrow
indicates the male-specific SCAR marker of 391bp.
rito dalla ditta. I’RNA ibrido ha fornito lo
stampo per la sintesi del secondo filamento,
catalizzata dall’enzima DNA Polymerase I
(Life Technologies), in presenza di
RNAaseH (Life Technologies). Anche per
la sintesi del doppio filamento è stato seguito il protocollo suggerito dalla ditta produttrice dell’enzima.
cDNA AFLP. L’analisi cDNA AFLP è stata condotta secondo il protocollo messo a
punto da Bachem et al. (1996) utilizzando
enzimi di restrizione diversi ed in particolare BstY1 come “rare cutter” ed Mse1 come
“frequent cutter”. Le amplificazioni selettive
sono state ottenute combinando i due primers
BstY +C/+T con 30 primers Mse+3. Gli
amplificati sono stati separati su gel di sequenza (poliacrilammide 6% in TBE 0.5X,
urea 8 M) realizzato nell’apparato SequiGen GT (Bio Rad). I profili AFLP sono stati
rilevati mediante autoradiografia.
Analisi Reverse Northern. I frammenti
AFLP putativamente differenziali sono stati
ritagliati dal gel di sequenza ed eluiti in 50 µl
di TE 1X per riscaldamento a 65°C per 15'.
Ogni frammento è stato nuovamente amplificato con la combinazione di primers che
lo aveva generato, e separato in doppio su
gel di agarosio al 1.5%. I frammenti sono
stati successivamente trasferiti su filtro di
nitrocellulosa (Southern Blotting) in modo
tale da avere per ciascuna serie di frammenti, due filtri identici. I filtri sono stati ibridati
separatamente con mRNA relativo al 4° nodo
maschile e femminile, che era stato precedentemente marcato radioattivamente con
α32P-dNTP (Sambrook et al., 1989). Per la
marcatura interna del mRNA è stato è stato
utilizzato come primer l’Oligo-dT (12-18)
(Boehringer Mannheim) ed è stato seguito
il protocollo suggerito da Sambrook et al.
(1989). I pattern di ibridazione sono stati rilevati mediante autoradiografia.
Analisi Northern. L’analisi Northern è stata condotta utilizzando 900ng/lane di mRNA
relativo al 4° nodo maschile e femminile secondo la procedura riportata in Sambrook, et
al. (1989). Le sonde utilizzate sono state marcate radioattivamente (γ32P-dNTP) con il metodo della marcatura terminale (Sambrook et
al., 1989).
RISULTATI E DISCUSSIONE
L’analisi RAPD ha permesso di individuare numerosi marcatori polimorfici, rivelando l’elevato grado di polimorfismo esistente tra le varietà e le accessioni di canapa analizzate. Sorprendente è il livello dei
marcatori polimorfici (circa 80%) riscontrato
tra la varietà Carmagnola e la cultivar
Fibranova (entrambe italiane), che invece
risultano relativamente poco distanti
geneticamente (Allavena, 1961); ciò è tuttavia comprensibile se consideriamo che la
canapa è una specie dioica ed allogama obbligata. Dei 179 primers decameri testati, 11
hanno prodotto dei marcatori associati al
Agroindustria / Aprile 2002 11
Figura 4 - Sezione longitudinale dell’apice al quarto nodo.
Figure 4 - Longitudinal section of the apex at the fourth node.
fenotipo maschile di dimensioni comprese
tra 400 e 2700bp (Tab. 1). Uno di questi
marcatori, quello generato dal primer
OPA08, è stato clonato e sequenziato
(Mandolino et al., 1998). Il frammento è stato chiamato MADC2 in accordo con la
nomenclatura proposta da Sakamoto et al.
(1995) ed ha una lunghezza di circa 400bp.
Ha un contenuto di G+C del 40.3% e risulta
privo di ORF al suo interno. Dalla ricerca
nelle banche dati di GenBank, EMBL, DDBJ
e PDB è emerso che questo frammento ha
un basso livello di omologia con altre sequenze di DNA ripetitivo riscontrate in altre
specie vegetali quali orzo, frumento, cocco,
pino, ed Arabidopsis, inoltre non risulta avere omologie con il frammento MADC1 identificato da Sakamoto et al. (1995), nonostante la forte similitudine nel contenuto di G+C
(39.9% in MADC1 e 40.3% in MADC2).
La maschio-specificità del MADC2 è stata
testata mediante una ibridazione Southern
che ha rivelato tuttavia la presenza del frammento sia nel genoma maschile che femmi-
nile (Mandolino et al., 1999).
Sulla base della sequenza MADC2
(Tab. 2) sono stati costruiti due primers, rispettivamente corrispondenti alle posizioni
1-20 (5'-GTGACGTAGGTAGAGTTGAA-3')
e373-391(5'-GTGACGTAGGCTATGAGAGA-3')
del frammento. Questi primers hanno permesso di amplificare una regione di 391bp
nel genoma maschile e due regioni, di circa
560bp e 870bp, nel genoma degli individui
di sesso femminile e monoici. La capacità
del marcatore SCAR di 391bp di individuare il fenotipo maschile è stata inizialmente
verificata su 41 individui di sesso maschile,
femminile e monoico, appartenenti a 20 varietà ed accessioni diverse di canapa
(Mandolino et al., 1998). In tutti i maschi
analizzati è stata prodotta un unica banda di
391bp mentre nelle femmine e nei monoici
sono state prodotte le due bande di peso
molecolare maggiore (Fig 2). L’analisi di tre
progenie segreganti per il sesso ha permesso di confermare l’associazione del
marcatore di 391bp al sesso maschile in
Figura 5 - Sezione longitudinale dell’apice al secondo nodo.
Figure 5 - Longitudinal section of the apex at the second node.
12 Agroindustria / Aprile 2002
quanto in nessun caso è stato possibile riscontrare ricombinazione per il marcatore.
Questo permette di dire che il frammento di
391bp costituisce un marcatore molecolare
affidabile per l’identificazione del sesso maschile. La produzione dei due frammenti di
560bp ed 870bp negli individui di sesso femminile e nei monoici da parte dei primers
SCAR, nonché il risultato dell’analisi
Southern, confermerebbe la presenza di sequenze simili nel genoma maschile e femminile. Evidentemente, però tali sequenze
risultano organizzate in maniera diversa nei
due sessi. È ormai ampiamente accettata la
teoria secondo cui i cromosomi sessuali X e
Y si sarebbero originati da una coppia di cromosomi omologhi attraverso l’instaurazione
di un meccanismo di repressione della
ricombinazione, che avrebbe portato i due
cromosomi a differenziarsi anche
morfologicamente (Charlesworth, 1991).
D’altro canto l’assenza di ricombinazione
avrebbe favorito l’accumulo di sequenze ripetute di cui i cromosomi sessuali vegetali
sono particolarmente ricchi (Charlesworth,
1991). L’assenza di ricombinazione per il
marcatore di 391bp fa pensare che esso si
trovi sul cromosoma Y, e benché non esista
una dimostrazione diretta di ciò, questa ipotesi potrebbe essere comunque avvalorata
dall’omologia esistente tra la sequenza del
frammento SCAR e le sequenze riscontrate in regioni di DNA ripetitivo di altri organismi vegetali. Sulla base di questi dati
possiamo dire che i nostri primers SCAR
sono in grado di amplificare frammenti di
DNA ripetuto presenti probabilmente nella
regione di “non ricombinazione” dei due
cromosomi sessuali e che per questo motivo, nel tempo, hanno acquisito una diversa
organizzazione. La probabile localizzazione dei due frammenti di 560bp ed 870bp
sul cromosoma X potrebbe essere dimostrata dalla possibilità di ottenere la loro amplificazione anche negli individui di sesso
maschile, in opportune condizioni (minore
stringenza).
Accertata l’associazione tra il marcatore
di 391bp ed il sesso maschile, si è cercato di
produrre un sistema che permettesse una
determinazione rapida ed affidabile del sesso, basato sulla presenza-assenza di questo
marcatore. Sulla base di un protocollo modellato su Arabidopsis da Klimyuk et al.
(1993), apportando le dovute modifiche per
Cannabis, è stato messo a punto un sistema
rapido di screening del sesso che consiste
nella realizzazione di una amplificazione
PCR direttamente su tessuto vegetale opportunamente trattato (Tab. 3, Fig. 3). La possibilità di determinazione del sesso nella canapa mediante lo SCAR rapido non solo
costituisce uno strumento utile al miglioramento genetico ma ha avuto un ruolo fondamentale anche nel lavoro di ricerca finalizzato all’identificazione dei geni coinvolti nel
differenziamento sessuale di Cannabis
differenziamento in senso maschile o
femminile dell’apice. L’individuazione di
questi geni, ed eventualmente il controllo degli stessi, è uno degli obiettivi che ci si propone di conseguire nell’immediato futuro.
M
BIBLIOGRAFIA
F
Figura 6 - Analisi Reverse Northern: filtri identici contenenti i frammenti differenziali AFLP sono stati
ibridati separatamente con mRNA marcato relativo al quarto nodo maschile e femminile. Gran parte dei
frammenti sono risultati egualmente rappresentati in maschio e femmina al quarto nodo. Ogni banda
corrisponde ad un singolo frammento AFLP.
Figure 6 - Reverse Northern analysis: the same differential AFLP fragments, blotted on two
membranes were separately hybridized with labeled mRNA from the male and female fourth node. The
majority of them were equally represented in the male and female mRNA from the fourth node. Each
lane corresponds to one AFLP fragment.
sativa.
Nelle nostre condizioni di crescita in serra (vedi Materiali e Metodi) il ciclo vitale
della canapa si conclude in 3-4 mesi ed il
raggiungimento della maturità sessuale, definito dalla comparsa dei fiori unisessuali,
si realizza dopo 50-60 giorni dall’emergenza della plantula dal terreno, momento in cui
la pianta ha quasi raggiunto le sue dimensioni definitive (3-4 metri). Dati in letteratura ed esperienze dirette hanno tuttavia rivelato che in alcune condizioni è possibile
ottenere il completo differenziamento dei
fiori unisessuali anche in stadi molto precoci dello sviluppo. È stato necessario quindi,
effettuare un’analisi microscopica degli apici
di Cannabis sativa, prelevati in momenti diversi dello sviluppo, al fine di individuare
quale fosse lo stadio più precoce del
differenziamento sessuale. Dall’analisi microscopica è emerso che il primo stadio in
cui è possibile rilevare dei cambiamenti nella
morfologia dell’apice corrisponde alla fase
di emergenza delle foglioline del quarto
nodo. In questo stadio la plantula ha delle
dimensioni di 10-15cm che sono decisamente inferiori a quelle dell’adulto e non manifesta alcun dimorfismo sessuale. In tutti i
campioni osservati al microscopio in questo
stadio è stato possibile rilevare la presenza
degli abbozzi dei meristemi laterali, all’ascella delle foglie del quarto nodo (Fig.4).
Questi abbozzi, con ogni probabilità, saranno in grado di differenziarsi nei meristemi
infiorescenziali all’estremità dei quali saranno portati i fiori unisessuali. L’analisi microscopica ha permesso di identificare lo stadio più precoce del differenziamento dell’apice di Cannabis sativa nella fase di emergenza delle foglioline del quarto nodo. In
apici maschili e femminili prelevati in questo stadio è stata quindi effettuata un’analisi
dell’espressione genica differenziale. Gli
apici prelevati all’emergenza delle foglioline del 2° nodo hanno costituito il “controllo” nell’analisi, in quanto in tutti i campioni
osservati in questo stadio non è mai stato
possibile rilevare la presenza degli abbozzi
dei meristemi laterali, all’ascella delle fo-
glie apicali (Fig.5). Mediante il sistema rapido di determinazione del sesso è stato possibile discriminare precocemente (all’emergenza del primo palco di foglie) gli individui di sesso maschile da quelli di sesso femminile e prelevare con certezza gli apici,
separatamente. Nei campioni prelevati al
2°nodo ed al 4°nodo (maschile e femminile) abbiamo condotto l’analisi dell’espressione differenziale mediante la tecnica del
c-DNA AFLP. Con lo screening dei profili
AFLP è stato possibile individuare numerose centinaia di frammenti differenziali, che
risultavano quindi essere presenti nel mRNA
del 4°nodo di uno dei due sessi, ed assenti
nell’altro e nel controllo. Questi frammenti
putativamente differenziali sono stati sottoposti ad un primo livello di controllo costituito dall’analisi Reverse Northern (Fig.6).
Dal Reverse Northern è emerso che gran
parte dei frammenti AFLP in realtà erano
egualmente rappresentati nel pool di geni
espressi al quarto nodo sia nei maschi che
nelle femmine. Tuttavia alcuni di questi
frammenti, circa venti, hanno confermato la
loro espressione differenziale che è stata sottoposta ad un ulteriore livello di controllo,
costituito dall’analisi Northern. Soltanto sei
dei frammenti hanno confermato la loro
espressione differenziale con l’ibridazione
Northern, risultando tutti maggiormente rappresentati nel mRNA relativo al quarto nodo
femminile rispetto al maschile.
Il clonaggio ed il sequenziamento dei
frammenti differenziali darà la possibilità di
risalire ai geni maschili e femminili
differenzialmente espressi in questo stadio
precoce dello sviluppo di Cannabis sativa
CONCLUSIONI
La capacità del marcatore SCAR di 391bp
di produrre una discriminazione precoce e
rapida dei due sessi ha avuto un ruolo determinante nel lavoro di ricerca sul
differenziamento sessuale della canapa. Esso
infatti ha reso possibile l’investigazione degli stadi più precoci di questo processo in
cui molto probabilmente già cominciano ad
esprimersi quei geni responsabili del
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Agroindustria / Aprile 2002 13
Attività di miglioramento genetico per la costituzione di nuove varietà di canapa
dioiche
M. Di Candilo, P. Ranalli, M. Diozzi, G. Grassi
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia.
RIASSUNTO
È stato avviato un programma di miglioramento genetico della canapa tessile, per la costituzione di
nuove cultivar dioiche. La selezione sfrutta la variabilità disponibile e quella indotta mediante
mutagenesi e si basa su procedure di selezione classiche delle piante allogame, finalizzate alla
costituzione di popolazioni a fecondazione libera. L’attività di cui si riferisce è stata avviata nel
1998 realizzando 11 combinazioni d’incrocio fra le cultivar e/o accessioni: Carmagnola, Fibranova,
Kompolti, Superfibra, Eletta Campana, Red Petiole, Carmagnola Gigante, Ungherese e Bolognese.
A partire dalla seconda generazione le popolazioni sono state sottoposte a selezione per le caratteristiche delle piante, quali: altezza, diametro dello stelo, portamento della canopy, resistenza ai
patogeni e all’allettamento, nonché bassi livelli di tetraidrocannabinolo (THC). Le popolazioni in
più avanzata fase di selezione vengono poi sottoposte a prove di confronto in parcelle replicate per
le valutazioni produttive e qualitative.
Il lavoro finora svolto ha portato alla costituzione di 11 nuove popolazioni, giunte a diverso stadio
di selezione. La risposta alla selezione è stata buona soprattutto per i caratteri contenuto di THC
della pianta e produzione di biomassa. I caratteri maggiormente correlati con la produzione di fibra
sono risultati la biomassa (r = 0.687**), la sostanza secca (r = 0.359*), la percentuale di corteccia
dello stelo (r = 0.345*) e la percentuale di fibra dello stelo (r = 0.638**). Fra le progenie in più
avanzata fase di selezione, quelle discendenti dagli incroci “Kompolti x Fibranova” e “Carmagnola
x Kompolti” hanno mostrato ottime performance, sia in termini di adattabilità all’ambiente padano,
sia sotto il profilo produttivo (resa in biomassa, sostanza secca e fibra).
Parole chiave: canapa, breeding, fibra tessile, cultivar dioiche.
ABSTRACT
Genetic improvement for the development of new dioecious hemp varieties
At the ISCI (Research Institute for Industrial Crops), a work program for the development of new
dioecious fibre hemp varieties is being carried out. The genetic resources utilised in the crossing
program included germoplasm collected and stored at our Institute and accessions developed from
mutagenis experiments. The selection work exploited the available variability and was based on
the classic strategies adopted for allogamous species. The selection unit is therefore the population,
evaluated on the basis of the main biometrics parameters (genetic variance and its components,
hereditability, etc.). The work started in 1998 and involved 11 cross combinations between the
following cultivars or accessions: Carmagnola, Kompolti, Superfibra, Eletta Campana, Red Petiole,
Carmagnola Gigante, Ungherese and Bolognese. The F1s obtained were in some instances
backcrossed to the parental, providing valuable traits to be introduced in the new population. From
the F2 generation, the plants were subjected to selection for the following traits: height, stem diameter,
canopy bearing, pathogen and lodging resistance, low tetrahydrocannabinol (THC) content.
On the basis of these evaluations, all plants considered of no interest were discarded before flowering,
thus avoiding the spread of the pollen and their contribution to the crosses. The selected populations
were again evaluated in field trials, in replicate plots, for the production and qualitative assessments.
The work performed led to the constitution of 11 new populations integrating different levels of
selection advances and production characteristics: different earliness, extremely low THC, adequate
vegetative vigour, good performance for biomass and fibre production. A relevant response to the
selection was obtained especially for THC level and biomass production. The traits found to be
most correlated with fibre production were biomass (r = 0.687**), dry matter (r = 0.359*), percentage
of cortex in the stem (r = 0.345*) and fibre percentage in the stem (r = 0.638**).
Among the most selected offsprings, good performances were observed for “Kompolti x Fibranova”
and “Carmagnola x Kompolti” crosses, both for adaptability to the environment and for production
(biomass, dry matter and fibre yield).
Key words: hemp, breeding, textile fibre, dioecious cultivars.
Autore corrispondente: Di Candilo M.
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di
Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia
Tel. (051) 6316833 - Fax (051) 374857.
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
14 Agroindustria / Aprile 2002
INTRODUZIONE
In questi ultimi anni, in Italia, vi è un crescente interesse per la reintroduzione della
coltura della canapa tessile, per motivi di
ordine agricolo, industriale ed ambientale.
Il mondo agricolo vede nella canapa una
alternativa colturale alle grandi colture
cerealicole sempre più eccedentarie e meno
remunerative. Inoltre, gli imprenditori agricoli sanno che la canapa si inserisce bene
negli ordinamenti colturali, richiede modesti input energetici e migliora la fertilità del
terreno.
Il mondo industriale, a sua volta, è molto
interessato al prodotto di tale coltura a causa della crescente richiesta di fibre naturali,
sia per il settore dell’abbigliamento, sia per
il settore dell’arredamento e della biancheria per la casa, entrambi ad alto valore commerciale.
Gli indumenti di canapa si contraddistinguono per senso di fresco, naturalezza, traspirabilità, resistenza ai raggi UV e durata
nel tempo.
Analogamente, nell’arredamento la canapa offre grandi vantaggi, quali: resistenza alla
luce solare ed artificiale (importantissima per
i tessili impiegati nel rivestimento mobili,
pareti e pavimenti), buona resistenza all’abrasione e manutenzione più semplice rispetto ad altre fibre.
Sotto il profilo ecologico la canapa è sicuramente una delle colture più rispettose
dell’ambiente. Infatti, richiede modesti apporti di fertilizzanti, soffoca naturalmente le
erbe infestanti, perciò non necessita di
diserbo chimico, non richiede trattamenti
fitosanitari, trattandosi di una pianta molto
rustica, richiede modesti apporti irrigui, limitatamente al Sud Italia (Di Bari et al.,
2001), e risana i terreni contaminati da metalli pesanti (Baraniecki et al., 1995; Citterio,
2001).
La reintroduzione della coltura impone
però un ammodernamento della filiera produttiva in termini di meccanizzazione della
raccolta e industrializzazione delle fasi di
macerazione e prima lavorazione della fibra;
inoltre, è pure necessario acquisire una gamma varietale sufficientemente ampia e differenziata, idonea ai nostri ambienti.
Riguardo a quest’ultimo punto, va considerato che le varietà italiane iscritte al Registro varietale sono solo quattro, di cui tre
molto datate (Carmagnola, CS e Fibranova)
ed una di recente costituzione (Red Petiole),
che si contraddistingue dalle precedenti per
un marcatore morfologico (colorazione
antocianica dei piccioli fogliari) associato a
bassissimo contenuto di THC (Ranalli et al.,
1996; Di Candilo et al., 1999 e 2000). A ciò
va aggiunto che le varietà selezionate nel
Centro-Nord Europa mal si adattano alle
nostre latitudini per il diverso fotoperiodo
(Crescini, 1951): spesso vanno rapidamente in prefioritura, con forte riduzione della
Tabella 1 - Caratteri biometrici e contenuto di THC delle piante
Table 1 - Biometric characteristics and THC content of the plants
Popolazioni
Piante m
(n.)
P-1
P-2
P-3
P-4
P-5
P-6
P-7
Carmagnola
Fibranova
Kompolti
70.1 a
73.0 a
72.9 a
68.5 a
72.2 a
71.0 a
69.8 a
70.3 a
69.4 a
71.5 a
Diametro
mediano
stelo
(mm)
Altezza
pianta
(cm)
-2
THC
(% s.s.)
0.033 bc
0.030 bc
0.020c
0.020 c
0.017 c
0.017 c
0.017 c
0.047 b
0.030 bc
0.077 a
7.3 ac
7.6 ab
7.2 ac
7.9 a
7.1 ac
7.8 ab
7.9 a
7.0 bc
6.7 c
7.6 ab
254.8 ab
255.5 ab
255.3 ab
274.1 ab
245.6 bc
280.2 a
267.6 ab
280.5 a
270.2 ab
223.7 c
Medie
70.9
260.7
7.4
I valori della medesima colonna contrassegnati da lettere diverse differiscono
statisticamente per P≤0.05 (test di Duncan).
produzione e decadimento qualitativo della
fibra (Di Candilo et al., 2000b).
Va ancora considerato che le varietà
coltivabili non devono presentare livelli di
THC nella pianta superiori allo 0.2% della
sostanza secca, pena il sequestro e la distruzione della coltivazione da parte delle forze
dell’ordine, nonché l’esclusione della varietà
dall’elenco di quelle ammesse alla coltivazione dalla normativa europea.
Sulla base di tali premesse, nell’ambito
del Progetto “Canapa per fibra tessile: dalla
produzione alla utilizzazione”, finanziato dal
Ministero delle Politiche Agricole e
Forestali, è stata avviata una attività di mi-
0.031
glioramento genetico, finalizzata alla costituzione di nuove cultivar dioiche.
In questa sede si riferisce sul lavoro già
svolto e sui primi risultati acquisiti.
MATERIALI E METODI
La selezione di nuove cultivar attinge da
germoplasma in collezione all’ISCI, sfrutta
la variabilità disponibile e quella indotta
mediante mutagenesi e si basa su procedure
di selezione classiche delle piante allogame,
finalizzate alla costituzione di popolazioni
a fecondazione libera. L’unità di selezione è
quindi la popolazione, la quale è valutata rispetto ai principali parametri impiegati in
genetica di popolazione (varianza genetica
e sue componenti, ereditabilità dei caratteri
sottoposti a selezione, azioni geniche implicate nella espressione dei principali caratteri, ecc.).
L’attività di miglioramento, di cui si riferisce, è stata avviata nel 1998, eseguendo le
prime combinazioni d’incrocio. Le
discendenze F1, derivate dagli incroci, in
taluni casi sono state reincrociate con il parentale da cui si voleva il maggiore apporto
di caratteri nella nuova popolazione.
Più in particolare, sono stati realizzati incroci fra i seguenti parentali: Bolognese,
Carmagnola, Carmagnola Gigante, Eletta
Campana, Fibranova, Kompolti, Superfibra,
Red Petiole e Ungherese.
Sia gli incroci che gli allevamenti sono
stati realizzati in isolamento spaziale, per
evitare inquinamenti da polline estraneo.
A partire dalla seconda generazione le
popolazioni sono state sottoposte a selezione per le caratteristiche delle piante, quali:
energia germinativa, vigore vegetativo, altezza, diametro dello stelo, portamento della canopy, resistenza ai patogeni e all’allettamento, nonché per bassi livelli di THC.
Sulla base di tali valutazioni, prima della fioritura sono state eliminate dal campo di allevamento tutte le piante di scarso valore, in
modo da escluderle dall’interincrocio.
Il rilevamento del THC è stato effettuato
in laboratorio inizialmente con metodo
immunoenzimatico (Grassi et al., 1997),
poiché molto più veloce del metodo ufficiale gas-cromatografico e, perciò, più adatto
alle esigenze di dover saggiare in breve
% 1.8
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0
Prima della selezione
Dopo la selezione
THC
CBD
Totale
Cannabinoidi
0.86-0.90
0.81-0.85
0.76-0.80
0.71-0.75
0.61-0.70
0.56-0.60
0.51-0.55
0.46-0.50
0.41-0.45
0.36-0.40
0.31-0.35
0.26-0.30
0.21-0.25
0.16-0.20
0.11-0.15
0.06-0.10
100
80
60
40
20
0
0.00-0.05
Piante (%)
Figura 1 - Percentuali di cannabinoidi nelle popolazioni prima e dopo la selezione.
Figure 1 - Cannabinoid percent in the populations before and after selection.
Classi THC (%)
Figura 2 - Distribuzione del THC in classi di frequenza nella popolazione prima della selezione.
Figure 2 - THC frequency distribution in the population before selection.
Agroindustria / Aprile 2002 15
Tabella 2 - Produzioni di biomassa e percentuali di sostanza secca.
Table 2 - Biomass productions and dry matter ratios.
Biomassa
Popolazioni
Steli
-1
(t ha )
P-1
P-2
P-3
P-4
P-5
P-6
P-7
Carmagnola
Fibranova
Kompolti
24.7
33.8
26.9
23.0
30.6
34.7
28.9
32.2
30.9
32.6
Medie
29.8
Foglie
-1
(t ha )
9.1
11.8
8.7
10.0
12.3
13.4
12.7
9.7
9.3
11.0
de
ab
ce
e
ac
a
bd
ab
ac
ab
10.8
Totale
-1
(t ha )
34.6
47.7
36.6
33.6
44.1
49.2
42.4
43.0
40.9
44.1
b
ab
b
b
b
b
b
b
b
b
1.0
de
ab
ce
e
ab
a
ac
ac
bd
ab
41.6
35.8
41.5
36.9
36.6
7.6
37.7
35.5
42.3
38.5
29.9
30.9
29.3
30.1
29.8
32.5
30.1
29.7
31.7
30.2
31.0
bc
ab
ab
ab
ab
ab
bc
a
ab
c
37.2
19.8
20.6
20.1
18.2
20.8
21.0
21.7
20.6
20.2
21.5
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
30.5
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
20.4
contrassegnati da lettere diverse differiscono per P≤0.05 (test di
rapporto foglie/biomassa, percentuali di
sostanza secca negli steli, nelle foglie e
nelle infiorescenze. Quindi sono stati calcolati i parametri: produzione di steli
freschi defogliati, produzione di foglie
fresche, produzione di sostanza secca
totale e delle sue componenti. Inoltre, è
stata rilevata la produzione di fibra, previa
macerazione microbiologica delle bacchette in vasca, stigliatura e gramolatura
dello stigliato.
Adottando le metodologie esposte, nel
2001 è stata proseguita l’attività di selezione in isolamento spaziale delle progenie non
ancora stabilizzate. Inoltre, è stata effettuata
una prova di confronto fra 7 progenie, in più
avanzato stato di approntamento, e tre testimoni, rappresentati da due varietà italiane
(Carmagnola e Fibranova) ed una ungherese (Kompolti).
Quest’ultimo esperimento è stato effettuato ad Anzola dell’Emilia (BO), in terreno
tendenzialmente argilloso, rappresentativo
della Valle Padana.
lazioni dioiche, giunte a diverso stadio di
selezione. Si tratta di una gamma di materiali caratterizzati da: diversa durata del ciclo biologico, assenza o scarsissima presenza di THC nelle piante, buon vigore
vegetativo e buone potenzialità produttive
in biomassa e in fibra.
La risposta alla selezione è stata buona
soprattutto per la riduzione dei cannabinoidi,
in generale, e del THC in particolare. Osservando la figura 1 si può rilevare che nella
popolazione di partenza il contenuto medio
totale di cannabinoidi nelle piante (rappresentati quasi interamente da CBD e THC)
era dell’1.60%, di cui 1.46% di CBD e 0.15%
di THC. Dopo tre cicli di selezione il contenuto totale è sceso a 0.28%, di cui 0.26% di
CBD e 0.02% di THC.
Con riferimento al THC in particolare, in
figura 2 si può osservare che nella popolazione di partenza, il 18% delle piante presentava livelli di THC che superavano la
soglia, fino a raggiungere lo 0.9% della sostanza secca. Dopo la selezione (Fig. 3), il
93% delle piante è afferito alla classe più
bassa di THC (0.00-0.05%), il 5% è afferito
alla classe subito sopra (0.06-0.10% di THC)
e il restante 2% delle piante è risultato in-
RISULTATI
Attività di selezione. Il lavoro svolto ha
portato alla costituzione di 11 nuove popo-
Classi THC (%)
Figura 3 - Distribuzione del THC in classi di frequenza nella popolazione dopo la selezione.
Figure 3 - THC class frequency distribution in the population after selection.
16 Agroindustria / Aprile 2002
0.86-0.90
0.81-0.85
0.76-0.80
0.71-0.75
0.66-0.70
0.61-0.65
0.56-0.60
0.51-0.55
0.46-0.50
0.41-0.45
0.36-0.40
0.31-0.35
0.26-0.30
0.21-0.25
0.16-0.20
0.11-0.15
0.06-0.10
100
80
60
40
20
0
0.00-0.05
Piante (%)
0.8
2.1
1.0
0.6
1.2
1.2
0.8
1.1
0.7
0.5
d
ac
d
cd
ab
a
ab
cd
d
bd
I valori della medesima colonna
Duncan)
tempo un elevatissimo numero di piante; successivamente, quando il numero di individui da saggiare si è ridotto, è stato adottato
il metodo gas-cromatografico.
Su singole piante è stata rilevata la percentuale di fibra, sottoponendo tasselli di
steli a macerazione in vasca, con addizione
di ceppi batterici ad elevata azione
pectinolitica (Di Candilo et al. 1999a e
2000a).
Le popolazioni in più avanzata fase di selezione sono state sottoposte a prove di confronto in parcelle replicate per le valutazioni produttive e qualitative. Il protocollo sperimentale di queste prove si è basato sui seguenti criteri operativi:
- schema sperimentale a blocco randomizzato,
con quattro ripetizioni e parcelle da 20 m2;
- semina a macchina nel periodo fine marzo-inizio aprile;
- densità d’investimento di 110-120 piante m-2,
disposte su file distanti 20 cm l’una dall’altra;
- raccolta in corrispondenza della piena fioritura;
- rilievi per parcella alla raccolta: contenuto
di THC, piante m-2, altezza pianta, diametro basale e apicale dello stelo, produzione
di biomassa, rapporto steli/biomassa,
Infiorescenze
-1
(t ha )
Sostanza secca nelle componenti
della biomassa
InfioreStelo
Foglie
scenze
(%)
(%)
(%)
Tabella 3 - Produzioni di sostanza secca e rapporto fra stelo e sue componenti.
Table 3 - Dry matter productions and ratio between the stem and its components.
Popolazioni
P-1
P-2
P-3
P-4
P-5
P-6
P-7
Carmagnola
Fibranova
Kompolti
Stelo
-1
(t ha )
8.8 d
13.9 a
9.9 cd
8.4 d
11.4 bc
13.0 ab
10.2 cd
13.6 a
11.9 ac
9.8 cd
Sostanza secca
Foglie
Infiorescenze
-1
-1
(t ha )
(t ha )
2.8
3.5
2.6
3.0
4.0
4.0
3.8
3.1
2.8
3.4
c
ac
c
bc
a
a
ab
ac
c
ac
0.2 b
0.4 a
0.2 b
0.2
0.2
0.2
0.1
0.1
b
b
b
b
b
o
o
Totale
-1
(t ha )
11.8
17.8
12.7
11.5
15.6
17.2
14.2
16.9
14.8
13.3
e
a
de
e
ac
a
cd
ab
bd
de
Corteccia/
stelo
(%)
33.5
35.1
34.2
35.7
35.1
35.2
35.8
31.8
33.7
37.0
bc
ab
ac
ab
ab
ab
ab
c
bc
a
Canapulo/
stelo
(%)
66.5
64.9
65.8
64.3
64.9
64.8
64.2
68.2
66.3
63.0
ab
bc
ac
bc
bc
bc
bc
a
ab
c
Medie
11.1
3.3
0.2
14.6
34.7
65.3
I valori della medesima colonna contrassegnati da lettere diverse differiscono statisticamente
per P≤0.05 (test di Duncan).
genotipi a confronto. Ciò indica sicuramente
cluso nella terza classe (0.11-0.15%). In
pena sopra la prima coppia di foglie basali.
che le condizioni ambientali (temperature,
sostanza, il criterio di eliminare da ciascuna
In tabella 1 sono riportate le caratteristiumidità, piovosità, ecc.) del 2001 sono state
popolazione, poco prima della fioritura, le
che biometriche e i contenuti di THC delle
poco favorevoli alla sintesi del THC da parpiante a più elevati livelli di principio stupepopolazioni confrontate.
te delle piante, tuttavia osservando i dati si
facente e con minore vigoria ed altezza, si è
La capacità di ricaccio delle piante è stata
può rilevare che almeno cinque nuove poconfermato molto efficace per l’ottenimento
elevata, tuttavia l’investimento raggiunto è
polazioni hanno fatto riscontrare valori prosdi nuovi genotipi a scarsissimo contenuto di
stato inferiore a quello precedente l’evento
simi allo zero, significativamente inferiori a
THC e ad elevata resa in biomassa.
meteorico. Alla raccolta, la fittezza media
quelli di Kompolti e Carmagnola. Sulla base
I caratteri maggiormente correlati con la
rilevata è stata di 71 piante m-2, con variabidi tali evidenze, che peraltro confermano i
produzione di fibra sono risultati la biomassa
lità molto contenuta fra le tesi.
riscontri dell’anno precedente, si può ragio(r = 0.687**), la produzione di steli secchi
L’altezza media delle piante è stata un po’
nevolmente ritenere che, anche in condizio(r = 0.359*), la percentuale di corteccia nelinferiore a quella riscontrata negli anni preni pedo-climatiche estremamente favorevolo stelo (r = 0.345*) e la percentuale di fibra
cedenti (261 cm), verosimilmente anche per
li alla sintesi del THC, in buona parte delle
nello stelo (r = 0.638**).
effetto della cimatura (Di Candilo et al.,
nuove popolazioni il contenuto di sostanza
Valutazione di progenie in avanzata fase
2002). Tuttavia, talune progenie hanno suallucinogena in discorso dovrebbe rimanere
di approntamento. La prova ha avuto un
perato sensibilmente il testimone Kompolti.
abbondantemente al di sotto della soglia soottimo avvio, grazie alla pronta ed uniforme
I diametri degli steli sono risultati contepra riportata.
emergenza delle plantule. Purtroppo in data
nuti, seppure in presenza di investimenti inLa produzione media di biomassa fresca
18 maggio, quando le piante avevano ragferiori a quello ottimale. Ciò, in quanto le
ha raggiunto 41.6 t ha-1, alla quale hanno
giunto l’altezza di 80 cm circa, sono state
piante che hanno ributtato hanno emesso due
contribuito gli steli per il 71.6%, le foglie
colpite da una pesante grandinata che ha progetti ciascuna, raddoppiando così il numero
per il 26% e le infiorescenze per il 2.4%
vocato la rottura di un gran numero di steli.
degli steli rispetto al numero delle piante.
(Tab. 2).
Conseguentemente, si è preferito effettuare
I livelli di THC sono risultati sensibilmenLe rese più elevate in biomassa sono state
una cimatura generale a 8-10 cm da terra, apte inferiori alla soglia dello 0.2% per tutti i
ottenute dalle progenie P-6, P-2, P-5 e P-7,
nonché dai testimoni Kompolti e
Tabella 4 - Produzioni di fibra delle popolazioni a confronto.
Carmagnola, con valori compresi fra 49.2 e
Table 4 - Fibre productions of cultivars compared
42.4 t ha-1, nell’ordine, non significativamenFibra
Fibra
Fibra
te diversi fra loro. Gli stessi genotipi, ad eccorta
totale
Popolazioni
lunga
cezione di P-7, si sono evidenziati anche per
-1
-1
-1
(t ha )
(t ha )
(t ha )
la produzione di steli freschi defogliati, oscillata fra 30.6 t ha-1 (progenie P-5) e 34.7 t ha-1
(progenie P-6).
1.56 d
0.36 cd
1.20 de
P-1
Interessante rilevare che le progenie so2.34 ab
0.62 bc
1.72 ab
P-2
pra citate, oltre che per la resa in steli, si
1.46 d
0.35 d
1.11 e
P-3
sono evidenziate anche per la produzione di
1.74 cd
0.41 bd
1.33 ce
P-4
foglie (11.8-13.4 t ha-1) a conferma della loro
1.91 bd
0.51 bd
1.40 be
P-5
buona vigoria (Tab 2).
2.13 bc
0.51 bd
1.62 ac
P-6
Le percentuali medie di sostanza secca
2.03 bc
0.50 bd
1.53 ac
P-7
nelle
componenti della parte aerea della pian1.76 cd
0.64 d
1.42 be
Carmagnola
ta al momento della raccolta erano 37.2, 30.5
2.19 bc
0.67 b
1.52 ad
Fibranova
e 20.4%, rispettivamente nello stelo, foglie
2.71 a
0.95 a
1.76 a
Kompolti
e fiori. Fra i genotipi a confronto,
Carmagnola ha fatto rilevare la percentuale
Medie
1.46
0.52
1.98
di sostanza secca dello stelo tendenzialmente
valori della medesima colonna contrassegnati da lettere
più elevata (42.3), mentre Kompolti ha
diverse differiscono statisticamente per P =0.05 (test di Duncan)
Agroindustria / Aprile 2002 17
evidenziato il valore significativamente più
basso (29.9%). Cinque delle nuove progenie
hanno mostrato valori variabili da 36.6 a
41.5%, non significativamente diversi da
quello di Carmagnola (Tab. 2).
La produzione media complessiva in sostanza secca è stata di 14.6 t ha-1, di cui il
76% dovuto agli steli, il 22.6% alle foglie e
l’1.4% alle infiorescenze. Anche per questo
parametro si sono evidenziate le progenie P2 e P-6, le cui rese (17.8 e 17.2 t ha-1) non si
sono differenziate significativamente da
quelle fornite da Carmagnola e dalla progenie P-5 (Tab. 3).
Il contributo di sostanza secca dovuto agli
steli ha raggiunto i valori massimi nelle progenie P-2 e P-6 (13.9 e 13.0 t ha-1, rispettivamente), nonché nei testimoni Carmagnola
e Fibranova (13.6 e 11.9 t ha-1) (Tab.3).
L’incidenza dello strato corticale sullo stelo, correlata con la resa in fibra, è stata del
34.7%. Fra le cultivar, Kompolti ha mostrato il valore più elevato in assoluto (37%),
significativamente superiore a quelli degli
altri due testimoni; per le nuove popolazioni, eccetto una, sono stati rilevati valori compresi fra 34.2 e 35.8% non statisticamente
diversi da quello di Kompolti.
Il rapporto canapulo/stelo in media è stato del 65.3%: le tesi con i maggiori valori di
questo carattere sono state Carmagnola, P-1
e Fibranova (Tab. 3).
La produzione di fibra (Tab. 4) in media è
stata di 1.98 t ha-1, di cui 1.46 t ha-1 di fibra
lunga (mannelle lunghe quanto gli steli) e
0.52 t ha-1 di fibra corta (stoppa). Produzioni superiori alla media di campo sono state
fornite soprattutto da Kompolti e dalla progenie P-2 (2.71 e 2.34 t ha-1, rispettivamente); inoltre, rese superiori alle 2 t ha-1 sono
state ottenute da Fibranova e dalla progenie P-6.
Nei primi cinque posti della graduatoria
produttiva per fibra lunga troviamo
Kompolti, le progenie P-2, P-6 e P-7 e
Fibranova, con valori compresi fra 1.76 e
1.52 t ha-1, nell’ordine.
Per la fibra corta, la produzione significativamente più elevata è stata rilevata in
18 Agroindustria / Aprile 2002
Kompolti.
CONCLUSIONI
Anche se le nuove popolazioni selezionate necessitano di ulteriore affinamento e valutazione in altre situazioni pedo-climatiche,
sembra si possa ritenere che l’attività di
breeding finora svolta abbia avuto buon esito. Di fatto, le progenie P-2 e P-6, ottenute
per selezione delle popolazioni derivanti,
rispettivamente, dagli incroci “Kompolti x
Fibranova” e “Carmagnola x Kompolti”,
hanno mostrato ottime performance, sia in
termini di adattabilità all’ambiente padano
(da tali popolazioni non è mai stata rilevata
sensibilità alla pre-fioritura), sia sotto il profilo produttivo (resa in biomassa, sostanza
secca e fibra).
Inoltre, tali progenie hanno evidenziato
ottima energia germinativa, buon vigore e
notevole rusticità. Il loro ciclo biologico può
essere considerato tardivo: in condizioni
normali giungono alla piena fioritura intorno a metà agosto.
Altre due popolazioni interessanti sembrano essere le progenie P-5 e P-7, selezionate
dalle discendenze degli incroci “Carmagnola
x Fibranova” e “Carmagnola x Eletta Campana”, abbastanza competitive per produzione di fibra.
Vi sono poi popolazioni derivate da incroci con l’accessione “Bolognese”, non
ancora sottoposte a prove di valutazione in
parcelle replicate, che hanno manifestato
spiccata precocità di maturazione.
In definitiva, si ritiene che da tali materiali dovrebbero derivare 2-3 nuove cultivar
che, unitamente alle varietà italiane già iscritte al Registro, potrebbero costituire una
gamma di varietà dioiche sufficientemente
ampia e differenziata per ciclo di
maturazione, tale da soddisfare le esigenze
dei vari contesti colturali.
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M. Di Candilo, D. Liberalato1, A. Del Gatto, D. Laureti, V. Di Bari2, R. Colucci2, P. Tedeschi3, L. Postiglione3,
M. Poli4, M. Diozzi, G. Grassi, P. Ranalli
Istituto Sperimentale per le Colture Industriali, Bologna.
1
Zignago Tessile S.p.A., Fossalta di Portogruaro, Venezia
2
Istituto Sperimentale Agronomico, Bari.
3
Dipartimento di Ingegneria Agraria e Agronomia del Territorio, Università di Portici (NA)
4
Azienda Sperimentale “M.Marani”, Ravenna
RIASSUNTO
Vengono riferiti i risultati di prove di confronto varietale svolte in diverse località nel biennio 20002001. Complessivamente sono state valutate 7 varietà dioiche, 2 monoiche e 8 ibridi sperimentali
dioici. Le prove sono state svolte ad Anzola dell’Emilia (Bologna), Ravenna, Osimo (Ancona),
Rutigliano (Bari) e Vitulazio (Caserta). Sono stati effettuati rilievi inerenti le caratteristiche
biometriche e produttive delle piante, nonchè i contenuti di ∆9 tetraidrocannabinolo (THC) delle
stesse piante e le caratteristiche qualitative della fibra per uso tessile. I risultati ottenuti hanno
evidenziato come più meritevoli le cultivar italiane Carmagnola, C.S. e Fibranova per adattabilità
ambientale, stabilità produttiva e livelli di produzione. Inoltre, buone performance sono state
evidenziate da taluni ibridi sperimentali che hanno unito alle buone caratteristiche agronomiche
una buona qualità della fibra (resa in pettinato e finezza).
Parole chiave: canapa, cultivar, produttività, fibra tessile, qualità.
ABSTRACT
Morphological, production and qualitative behaviour of hemp cultivars (Cannabis sativa L.)
in several Italian locations
Results of comparative trials between several hemp varieties carried out in various Italian localities
in the 2000-2001 period are presented. The evaluation included nine varieties (7 dioecius and 2
monoecius) and eight experimental dioecius hybrids. The locations experimented were Anzola
dell’Emilia (Bologna), Ravenna, Osimo (Ancona), Rutigliano (Bari) and Vitulazio (Caserta).
Evaluation concerned plant biometric characteristics (plant density, height, stem diameter), THC
content (determined by EC official methodology), biomass production, stem dry matter percentage,
bark/stem ratio and dry matter production. In addition, stems of only one locality were water retted
and scutched. The textile quality of the fibre was evaluated by organoleptic assessment, hackling
yield and fineness. The performance of hemp cultivars showed the possibility of obtaining the
same productivity both in Northern Italy, under dry weather conditions, and Southern Italy, under
growing conditions supported by heavy irrigation. In Central Italy, the yields were extremely low
although the rainfall was not notably lower than in the Emilia-Romagna localities. In particular, the
rainfall distribution in Osimo was, as usual, more uneven than Northern areas, with an extremely
dry July. Consequently, in this locality, and very likely in all Central Italy, it is necessary to apply
irrigation during the last growing period of the cultivation. As far as cultivars are concerned,
Carmagnola, CS and Fibranova showed the greatest stability and good fibre yield. Kompolti, a
Polish dioecius variety, demonstrated a high bark/stem ratio in all localities and a good fibre yield;
unfortunately, the fibre quality was poor. Fedora and Futura, French monoecius varieties, had a
lower performance than dioecius cultivars due to their high flowering sensitivity. The experimental
hybrids Hy2, Hy3 and Hy4, respectively coming from “Carmagnola x Kompolti”, “Carmagnola x
Fibranova” and “Carmagnola x Carmagnola Gigante”, demonstrated a positive performance, the
first two exhibiting good dry matter production and the third a valuable fibre quality and hackling
yield.
Key words: hemp, cultivars, production, textile fibre, quality.
INTRODUZIONE
In Italia, da 4-5 anni, si sta cercando di
reintrodurre la coltivazione della canapa da
Autore corrispondente: Di Candilo M.
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di
Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia
Tel. (051) 6316833 - Fax (051) 374857
E-mail: [email protected]
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
fibra sulla spinta di esigenze agronomiche
(necessità di individuare alternative produttive alle grandi colture, sempre più
eccedentarie), industriali (necessità di
reperire in loco la materia prima, sempre più
richiesta a livello mondiale) ed ambientali
(esigenza di introdurre colture richiedenti
bassi input energetici, ecocompatibili).
Sotto quest’ultimo aspetto la coltura della
canapa è sicuramente una delle più interessanti, in quanto non richiede interventi chi-
mici di difesa e di diserbo; inoltre, almeno
nel Nord Italia non richiede neppure l’irrigazione. Ciò, grazie alle sue spiccate caratteristiche di rusticità, al suo accelerato ritmo di crescita ed azione soffocante sulle
malerbe, nonché al suo apparato radicale
molto sviluppato e profondo.
Di fatto però, nonostante il grande interesse per la coltura e le buone performance
produttive della pianta, la superficie complessiva investita a canapa dal 1999 rimane
estremamente ridotta (poco più di 150 ettari), soprattutto per la mancanza di centri industriali in grado di effettuare la prima lavorazione del prodotto raccolto. In altre parole, la coltura non decolla, poiché la filiera
produttiva è incompleta.
La reintroduzione della canapa impone un
aggiornamento dell’agrotecnica (Di Candilo
et al., 2000a), la valutazione delle cultivar
disponibili per una oculata scelta varietale,
la meccanizzazione della raccolta secondo
le esigenze imposte dalle successive operazioni di processing, lo studio e la messa a
punto del processo di macerazione da adottare nei centri industriali di prima lavorazione del prodotto (Di Candilo et al., 2000b;
Mastromei et al., 2001).
Con tali finalità, il Ministero delle Politiche Agricole e Forestali ha promosso e finanziato il Progetto di ricerca “Canapa per
fibra tessile : dalla produzione alla utilizzazione”, giunto al secondo anno di attività.
Con riguardo alle cultivar, in vista del
rilancio della coltura, si ritiene doveroso riprendere la valutazione del germoplasma
disponibile, anche perché il panorama
varietale attuale, salvo poche eccezioni, è
cambiato rispetto al passato: accanto alle
varietà italiane sono disponibili numerose
cultivar straniere; queste ultime non sempre
si adattano alle condizioni ambientali del
nostro Paese, evidenziando spesso spiccata
sensibilità alla pre-fioritura, con forte
penalizzazione della produzione. Inoltre,
taluni materiali, provenienti dai Paesi dell’Est, nelle nostre condizioni colturali possono raggiungere livelli di THC superiori
alla soglia massima (0.2% della s.s.), creando notevoli difficoltà di ordine legale ed economico agli agricoltori, oltre a disaffezionarli
alla coltura. Ecco quindi che una appropriata
Agroindustria / Aprile 2002 19
Tabella 1 - Principali notizie riguardanti la conduzione delle prove.
Table 1 - Principal data on trial management.
Anno 2000
Anno 2001
Anzola
Emilia
Ravenna
Campocavallo
S.Biagio
Rutigliano
Anzola
Emilia
Ravenna
Vitulazio
Tipo di terreno
Argilloso
Limoso
MedioImpasto
Limoargilloso
Terra rossa
Argilloso
Limoso
Sabbiolimoso
Precessione colt.
F. tenero
Mais
F. duro
F. duro
F. duro
F. tenero
Mais
F. duro
100 Kg/ha
P2O5
100 Kg/ha
P2O5
100 Kg/ha
K2O
100 Kg/ha
P2O5
100 Kg/ha
P2O5
100 Kg/ha
P2O5
50 Kg/ha
K2O
100 Kg/ha
P2O5
10 Kg/ha
P2O5
100 Kg/ha
K2O
142 Kg/ha
P2O5
200 Kg/ha
K2O
Operazioni
colturali
Concimazione
- pre-semina
- copertura
100 Kg/ha N 150 Kg/ha N 150 Kg/ha N 150 Kg/ha N 150 Kg/ha N 100 Kg/ha N 150 Kg/ha N 100 Kg/ha N
21/3, (mecc.) 23/3, (mecc.) 31/3, (mecc.) 13/4, (mecc.) 31/3, (mecc.) 26/3, (mecc.) 23/3, (mecc.) 31/3, (mecc.)
Semina
Regime irriguo
Asciutto
Asciutto
Asciutto
Asciutto
Irriguo
Volume irriguo
N. interventi
--
--
--
--
Data di raccolta
6/7-7/8
15/6-4/8
21/6-31/7
22/6-3/8
sperimentazione varietale assume grande
importanza per la scelta delle cultivar più
idonee alle nostre possibili aree canapicole.
Inoltre, tale studio ha notevole valenza anche per i breeders impegnati nella costituzione varietale, che possono scegliere oculatamente i parentali per la realizzazione di
nuove combinazioni d’incrocio.
In questa sede si riferisce su un biennio di
sperimentazione condotta in diverse località della Penisola, con varietà iscritte al Registro e con materiali sperimentali.
Asciutto
Irriguo
4355 m /ha
12 interventi
--
--
3200 m /ha
5 interventi
12/6-4/8
24/7-7/8
15/6-4/8
24/7-2/8
3
già provati l’anno precedente).
Nel 2000 la prova è stata effettuata ad
Anzola dell’Emilia (BO), Ravenna, San
Biagio di Osimo (AN), Campocavallo di
Osimo (AN) e Rutigliano (BA); nel 2001 si
è operato ad Anzola dell’Emilia, Ravenna e
Vitulazio (CE).
In tutte le località e per entrambi gli anni
è stata adottata la medesima metodologia
sperimentale, basata sui seguenti criteri operativi:
- schema sperimentale: blocco randomizzato con 4 ripetizioni;
- parcella: 20 m2, comprendente 22 file di
piante;
- concimazione commisurata alla fertilità
del terreno;
- semina: prima metà di marzo, su fila pressoché continua, con distanza di 20 cm fra
le file;
- diradamento: alla differenziazione della
3
quarta foglia vera, adottando una distanza di 5 cm sulla fila;
- conduzione della coltura: in asciutto nelle località del Centro-Nord, in irriguo in
quelle del Sud.
In tabella 1 è riportata la scheda agronomica dei singoli campi, nella quale figurano
gli interventi colturali, le dosi dei mezzi tecnici impiegati e le date di raccolta.
Rilievi per parcella nel corso del ciclo
colturale:
- data emergenza: quando circa 2/3 delle
piante attese presentavano le due foglie
cotiledonari dispiegate;
- data fioritura;
- manifestazioni parassitarie: data di comparsa e gravità degli attacchi.
Rilievi alla raccolta (alla piena fioritura
delle piante):
- Su apposita area di saggio/parcella (1 m2):
numero di piante presenti; peso della
Anzola Emilia
20
15
10
5
0
Ravenna
Campocavallo
Figura 1 - Effetti combinati delle cultivar e degli ambienti sulla produzione di sostanza secca, anno 2000.
Figure 1 - Effects of the “cultivars x localities” interaction on dry matter production, year 2000.
20 Agroindustria / Aprile 2002
Futura
Hy4
Hy2
Carmagnola
Hy
Red Petiole
Fibranova
S.Biagio
Carmagnola
Steli (t ha-1 s.s.)
MATERIALI E METODI
Parte agronomica. Le prove sono state
svolte nel biennio 2000-2001. Nel primo anno sono stati confrontati 14 materiali, di cui
6 varietà dioiche, 2 monoiche e 6 ibridi sperimentali; nel secondo anno le tesi a confronto
erano 13, di cui 5 varietà dioiche (4 già provate
nel primo anno) e 8 ibridi sperimentali (di cui 6
Asciutto
Rutigliano
Tabella 2 - Effetti medi degli ambienti sulle caratteristiche biometriche e produttive delle cultivar, anno 2000
Table 2 - Average effects of the localities on biometric and production characteristics of the cultivars, year 2000.
Caratteri
-2
Piante m
Altezza pianta
Diametro basale stelo
Biomassa
Steli freschi
Sostanza secca steli
Steli secchi
Corteccia/stelo
THC
(n.)
(cm)
(mm)
-1
(t ha )
-1
(t ha )
(%)
-1
(t ha )
(%)
(%)
Anzola
Emilia
117.6 a
238.2 a
8.2 b
42.6 a
32.2 a
37.8 c
12.5 a
32.7 b
0.15 ab
biomassa; peso degli steli defogliati e
cimati (la cimatura è stata effettuata asportando la parte apicale della pianta non
fibrosa); peso delle foglie e “cime”.
- Su campioni di 20 piante di ciascuna area
di saggio: altezza delle piante e diametro
basale degli steli.
- Su campioni di 5 piante per ciascuna area
di saggio: percentuale di sostanza secca
(lasciando i campioni in stufa a 65 °C per
36 ore; rapporto ponderale corteccia/stelo (sul “fresco” e sul secco): cinque steli
sono stati tagliati in tre parti uguali, per
operare sul terzo mediano la separazione
della corteccia dal canapulo.
- Sull’intera parcella: peso della biomassa
prodotta.
Limitatamente alle prove di Anzola
Emilia, è stata effettuata anche la
macerazione in acqua delle bacchette di ciascuna cultivar, impiegando appositi vasconi
di cemento affondati nel terreno.
Inoltre, nel corso dei cicli colturali in tutte le località sono stati rilevati gli andamenti
dei principali parametri climatici (temperature e precipitazioni) e raffrontati con le
medie storiche.
Parte industriale. Le caratteristiche
qualitative della fibra stigliata e gramolata
ottenuta ad Anzola Emilia sono state valutate presso lo stabilimento della Zignago Tessile. In particolare, campioni delle varie
Ravenna
93.7 b
240.4 a
8.8 a
42.2 a
33.4 a
38.5 c
13.0 a
28.6 c
0.17 a
Campocavallo
86.5 b
195.9 b
8.0 b
21.8 c
16.2 c
43.7 a
7.2 b
26.0 d
0.14 b
cultivar sono stati classificati secondo la griglia di classificazione CIPALIN utilizzata per
il lino e comprende i seguenti parametri
qualitativi: colore, macerazione, finezza, resistenza, lunghezza, omogeneità, stigliatura,
proprietà, aspetto, densità e “mano”. I parametri, seppur con nomi diversi, sono gli stessi che storicamente sono stati usati per la
determinazione qualitativa della fibra di canapa. La gradazione dei valori di queste variabili va da 1 a 5 (classifica a ranghi). Il
materiale è stato quindi condizionato in sala
pettinatura per 48 ore, a temperatura ed umidità controllate. Prima della lavorazione il
materiale è stato cimato e tagliato in spezzoni
di lunghezza variabile tra gli 80 e i 110 cm,
per adeguarlo alle specifiche tecniche della
macchina, quindi pesato misurando inoltre
la percentuale d’umidità mediante igrometro
ad aghi EKV/M. La pettinatura è stata eseguita su pettinatrice Liebb. La resa è stata
calcolata come percentuale tra materiale in
uscita (mannelle pettinate) e materiale entrante (filaccia stigliata e gramolata). Per la
misurazione della finezza il pettinato è stato
condizionato in ambiente controllato (20 °C;
UR=65%) per 48 ore. Da ogni lotto è stato
prelevato un campione di circa 20 g; ogni
campione è stato tagliato omogeneamente
alla lunghezza di circa 20 mm e miscelato
attraverso Fibre Blender, presso IAF di
Reutlingen in Germania. Dal tampone di fibre
San Biagio
50.7 c
188.0 b
8.2 b
17.0 d
12.4 d
43.9 a
5.5 c
26.0 d
0.16 ab
Rutigliano
Medie
116.1 a
194.0 b
6.8 c
39.3 b
29.3 b
41.5 b
12.3 a
49.6 a
0.11 c
92.9
211.3
8.0
32.6
24.7
41.1
10.1
32.6
0.15
così ottenuto sono stati prelevati 5 campioni
di 1.2 g (± 1 mg) ciascuno (Norme française
G 07 074) la cui misura, mediante airflow
WIRA, è stata ripetuta tre volte per un totale
di 15 misurazioni per campione. La
calibrazione dello strumento è stata effettuata
utilizzando campioni standard di lino di finezza nota (unità di misura I.F.S.= indice di
finezza standard), forniti dall’Istituto Tessile Francese.
Analisi dei dati. L’analisi statistica dei
dati è stata effettuata per anno, dato che non
tutti i materiali genetici e non tutte le località sono stati considerati per entrambi gli anni.
Il confronto fra le medie è stata effettuata
mediante il test di Duncan, nel caso degli
effetti principali, e con il calcolo delle differenze minime significative (DMS), nel caso
delle interazione.
Andamento meteo. Nel primo anno, durante il periodo interessato dalle prove (marzo-agosto) la piovosità è stata di 277 mm ad
Anzola Emilia, 192 mm a Ravenna, 244 mm
ad Osimo e 71 mm a Rutigliano.
La distribuzione delle precipitazioni nel
tempo è stata abbastanza regolare nella località emiliana, un po’ meno a Ravenna, con
scarsità in maggio e giugno. Ad Osimo, invece, la piovosità è stata scarsa dall’inizio
di luglio fino al termine del ciclo colturale.
A Rutigliano le precipitazioni sono state
pressoché assenti dall’inizio della seconda
0.7
THC (% s.s.)
0.6
Anzola Emilia
0.5
Ravenna
0.4
Campocavallo
0.3
S.Biagio
0.2
Rutigliano
0.1
Futura
HY4
HY2
Carmagnola
HY
Red Petiole
Fibranova
Carmagnola
0
Figura 2 - Effetti combinati delle cultivar e degli ambienti sul contenuto di THC delle piante, anno 2000.
Figure 2 - Effects of the “cultivars x localities” interaction on THC levels, year 2000.
Agroindustria / Aprile 2002 21
Tabella 3 - Caratteristiche biometriche e produttive delle cultivar (medie di 5 località), anno 2000.
Table 3 - Biometric and production characteristics of the cultivars (averages for 5 localities), year 2000.
Cultivar
Carmagnola
C.S.
Fibranova
Carmagnola G.
Red Petiole
Eletta Campana
Carmagnola HY
HY1
HY2
HY3
HY4
HY5
Futura
Fedora
Medie
Piante
-2
m
(n.)
Altezza
pianta
(cm)
Diametro
basale
stelo
(mm)
Biomassa
-1
(t ha )
85.4 cd
92.2 bd
87.0 cd
95.3 bc
71.7 e
93.1 bd
81.4 de
93.3 bd
83.0 ce
103.1 ab
109.5 a
104.5 ab
89.0 cd
112.5 a
241.7 a
239.8 a
231.2 ab
191.4 d
230.3 ab
223.4 b
241.1 a
206.3 c
241.5 a
233.2 ab
231.0 ab
208.1 c
139.7 e
99.1 f
8.7 bc
9.2 a
8.4 cd
7.3 f
9.0 ab
7.9 e
9.2 a
7.8 e
8.7 bc
8.6 bc
8.1 de
7.2 f
6.6 g
5.4 h
36.7 a
34.2 bd
35.2 ac
31.4 e
33.3 ce
35.7 ab
35.5 ab
32.6 de
36.9 a
36.4 ab
35.6 ab
37.0 a
20.5 f
15.4 g
41.9 ab
43.4 ab
43.4 ab
40.6 bc
42.7 ab
42.8 ab
43.3 ab
43.0 ab
44.1 a
40.5 bc
40.9 bc
38.9 c
33.6 d
36.0 d
211.3
8.0
32.6
41.1
92.9
decade di aprile fino alla raccolta.
Le temperature minime nelle località del
nord sono state costantemente inferiori a
quelle riscontrate nel Centro-Sud di 1-2 °C.
I valori massimi, invece, nelle diverse località si sono differenziati sensibilmente solo
nel periodo inizio luglio-inizio agosto, con
livelli di 3-4 °C in più nella località del Sud.
Nel 2001 la piovosità nel periodo sopra
indicato è stata di 302 mm ad Anzola Emilia,
310 mm a Ravenna e 153 mm a Vitulazio.
Anche in questa annata la distribuzione
delle piogge è stata più omogenea nella località emiliana; a Ravenna, invece, si sono
avute precipitazioni abbondanti in aprile e
carenti dalla seconda decade di giugno fino
Sostanza secca
stelo
-1
(%)
(t ha )
Corteccia/
stelo
(%)
Fibra*
(filaccia)
-1
(t ha )
THC
(% s.s.)
12.0 ab
11.3 bc
11.7 ac
9.3 d
11.0 c
11.4 bc
11.5 bc
9.9 d
12.5 a
11.6 ac
11.0 c
11.1 bc
4.3 e
2.7 f
30.8 de
29.8 df
30.6 de
31.2 de
30.2 de
28.9 ef
34.9 c
38.4 b
31.9 d
29.8 df
27.6 f
41.1 a
34.1 c
37.2 b
2.21 c
2.28 c
2.24 c
0.96 e
1.94 cd
2.07 c
2.69 ab
1.64 d
2.99 a
2.33 bc
1.94 cd
2.05 cd
0.76 e
0.25 f
0.08 ef
0.09 de
0.11 de
0.11 de
0.05 f
0.43 a
0.17 c
0.26 b
0.20 c
0.08 ef
0.05 f
0.17 c
0.12 d
0.11 de
10.1
32.6
1.88
0.14
alla raccolta. A Vitulazio si è avuta una
piovosità analoga alle località del nord solo
in marzo e aprile, successivamente l’andamento stagionale è stato molto siccitoso.
Le temperature nelle diverse località si
sono differenziate solo per i valori minimi
che per tutto il periodo delle prove sono state di 2-3 °C più alte al sud.
RISULTATI
Anno 2000
Aspetti agronomici
a) Effetti ambientali
L’ambiente di coltivazione ha influito significativamente sulle caratteristiche biometriche e produttive delle piante (Tab. 2).
Di fatto, la produzione di biomassa verde è
variata fortemente passando da poco più di
42 t ha -1 , ottenute ad Anzola Emilia e
Ravenna, a 21.8 e 17.0 t ha-1 realizzate nelle
due prove di Osimo. I forti cali di produzione in quest’ultima località sono risultati associati a densità di investimento
marcatamente inferiori a quelle degli altri
ambienti, oltre che a minore altezza delle
piante.
Al contrario, nel marchigiano sono risultate significativamente più elevate le percentuali di sostanza secca dello stelo, sia rispetto a quella rilevata nel barese, sia, soprattutto, nei confronti di quelle riscontrate in
Emilia-Romagna. Tuttavia, la produzione
5
Punteggio Cipalin
4
3
2000
2
1
Figura 3 - Classificazione organolettica della fibra.
Figure 3 - Fibre organoleptic classification.
22 Agroindustria / Aprile 2002
Fedora
Futura
HY7
HY6
HY5
HY4
HY3
HY2
HY1
Carmagnola HY
Eletta Campana
Red Petiole
Kompolti
Carmagnola Gigante
Fibranova
C.S.
Carmagnola
0
2001
Tabella 4 - Effetti medi degli ambienti sulle caratteristiche biometriche e produttive delle cultivar, anno 2001.
Table 4 - Average effects of the localities on biometric and production characteristics of the cultivars, year 2001.
Caratteri
Anzola E.
Ravenna
Vitulazio
Medie
-2
Piante m
(n.)
73.4 a
56.0 c
127.9 a
85.8
Altezza pianta
(cm)
258.8 b
317.8 a
312.3 a
296.3
Diametro basale stelo
(mm)
10.6 b
14.2 a
10.7 b
11.8
-1
Biomassa
(t ha )
42.9 c
46.8 b
50.3 a
46.7
-1
Steli freschi
31.4 b
40.2 a
40.9 a
37.5
(t ha )
Sostanza secca steli
(%)
37.4 b
40.7 a
39.1 a
39.1
-1
Steli secchi
(t ha )
11.8 b
16.4 a
16.4 a
14.9
Corteccia/stelo
(%)
33.7 a
30.7 b
26.8 c
30.4
THC
(% s.s.)
0.07 c
0.09 b
0.10 a
0.09
I valori delle singole righe contrassegnati da lettere diverse differiscono significativamente per P≤0.05
(test di Duncan)
tendenzialmente più elevata di sostanza secAltre differenze produttive molto marcaconsentita (0.2% della sostanza secca). Tutca, dovuta agli steli defogliati e cimati, è stata
te hanno riguardato il rapporto corteccia/stetavia, sono state riscontrate differenze signiottenuta a Ravenna (13 t ha-1). Rese non silo che nel barese ha raggiunto il valore masficative fra gli ambienti, con il valore più
gnificativamente diverse sono state raggiunte
simo di 49.6%, mentre ad Osimo sono stati
basso rilevato a Rutigliano (0.11%) e quello
ad Anzola Emilia e a Rutigliano; ad Osimo,
ottenuti quelli significativamente più bassi.
più alto ottenuto a Ravenna (0.17%).
invece, si è avuto, in media, un dimezzamenIn questo caso le differenze sono da imputab) Effetti delle cultivar
to della produzione.
re alla diversa fittezza delle piante che ha
Le cultivar a confronto si sono differenLa marcata riduzione della resa verificainfluito, a sua volta, sul diametro degli steli.
ziate significativamente per tutti i caratteri
tasi nel marchigiano, sebbene la piovosità
È noto infatti che l’investimento è un fattore
considerati (Tab. 3).
complessiva sia stata superiore a quella di
agronomico in grado di influire in modo siCirca la densità di investimento, è emerso
Ravenna e leggermente inferiore a quella di
gnificativo e consistente sia sulle caratteriche la varietà Fedora e gli ibridi HY-4, HY-5
Anzola Emilia, è stata indotta verosimilmenstiche biometriche che produttive delle piane HY-3 hanno mostrato le maggiori fittezze
te dalla più disomogenea distribuzione delte. Gli investimenti più alti favoriscono lo
(otre 100 piante m-2), mentre Red Petiole ha
le piogge rispetto alle località del nord. Di
sviluppo di steli di diametro inferiore, conevidenziato il valore più basso (72 piante m2
fatto, ad Osimo nell’ultima fase del ciclo
seguentemente la superficie corticale (m-2)
).
colturale (luglio-inizio agosto) sono caduti
risulta superiore (Van Der Werf et al., 1994;
Per l’altezza delle piante si sono distinte
solo 27 mm di pioggia, ovvero 47 mm in
Di Candilo et al., 1996). Fra l’altro, la propositivamente Carmagnola, HY-2, Carmameno rispetto ad Anzola Emilia e 60 mm in
duzione di steli sottili influisce positivamente
gnola HY e C.S. che hanno raggiunto almemeno rispetto a Ravenna. In sostanza, tale
sulla qualità della fibra, grazie alla presenza
no i 240 cm; valori non significativamente
evidenza conferma precedenti risultati, cirdi una maggiore percentuale di fibre primadiversi sono stati ottenuti per HY-3, HY-4 e
ca la necessità di supportare la coltivazione
rie, qualitativamente migliori rispetto alle
Red Petiole. Le cultivar più basse in assolucon l’irrigazione anche nel centro Italia (Del
fibre secondarie, più abbondanti negli steli
to sono state le monoiche Fedora e Futura,
Gatto et al., 1999; Di Candilo et al., 2001),
grossi (Dempsey, 1975).
rispettivamente con 99 e 140 cm. Al riguaroltre che nel Sud del Paese (Di Bari et al.,
I livelli di THC nelle piante in tutte le lodo, va sottolineato che tali genotipi dopo
2001).
calità sono rimasti sotto la soglia massima
appena 50-60 giorni dalla semina, hanno fio-
60
resa %
50
40
30
20
10
Fedora
Futura
HY7
HY6
HY5
HY4
HY3
HY2
HY1
Carmagnola HY
Eletta Campana
Red Petiole
Kompolti
Carmagnola Gigante
Fibranova
C.S.
Carmagnola
0
2000
2001
Figura 4 - Resa di pettinatura delle cultivar.
Figure 4 - Hackling yield of the cultivars.
Agroindustria / Aprile 2002 23
Tabella 5 - Caratteristiche biometriche e produttive delle cultivar (medie di 3 località), anno 2001.
Table 5 - Biometric and production characteristics of the cultivars (averages for 3 localities), year 2001.
Cultivar
Carmagnola
C.S.
Fibranova
Red Petiole
Kompolti
Carmagnola HY
HY1
HY2
HY3
HY4
HY5
HY6
HY7
Piante
-2
m
(n.)
Altezza
pianta
(cm)
Diametro
basale
stelo
(mm)
Biomassa
-1
(t ha )
98.1 a
93.1 ab
93.4 ab
78.5 ce
82.5 bd
77.7 ce
72.1 de
84.8 ad
93.2 ab
94.2 ab
90.9 ac
68.3 e
88.3 ac
312.2 ab
308.4 ab
304.3 ab
288.0 cd
269.5 e
296.5 bd
254.5 f
311.6 ab
307.4 ab
301.8 ac
283.1 de
301.0 ac
313.8 a
12.0 ac
12.0 ac
11.8 bd
12.1 ac
11.1 de
12.6 a
10.9 e
12.5 ab
11.5 ce
11.8 bd
11.5 ce
12.3 ab
11.9 ac
49.3 ab
46.2 bd
46.2 bd
44.0 d
51.7 a
45.5 bd
45.8 bd
49.4 ab
48.4 ac
45.1 cd
46.3 bd
43.8 d
44.8 cd
Sostanza secca
stelo
-1
(%)
(t ha )
40.5 ad
42.3 a
40.9 ab
39.3 be
34.5 f
38.2 e
35.0 f
40.0 be
40.6 ac
38.6 ce
38.3 de
40.1 be
39.8 be
16.7 a
16.6 ab
15.9 ac
13.7 ef
12.8 fg
13.8 ef
12.4 g
16.3 ab
16.3 ab
14.5 de
13.7 ef
15.0 cd
15.5 bd
Corteccia/
Stelo
(%)
Fibra*
(filaccia)
-1
(t ha )
THC
(% s.s.)
28.2 de
28.8 de
29.9 cd
27.6 e
41.2 a
29.7 cd
29.2 ce
31.0 c
28.2 de
27.3 e
30.0 cd
33.3 b
31.0 c
1.46 e
1.42 ef
2.01 bc
1.54 de
2.22 ab
1.57 de
1.05 g
2.35 a
1.82 cd
1.17 fg
1.63 de
1.51 e
1.65 de
0.06 e
0.06 e
0.05 e
0.05 e
0.10 cd
0.12 bc
0.14 ab
0.15 a
0.09 d
0.04 e
0.10 cd
0.10 cd
0.09 d
Medie
85.8
296.3
11.8
46.6
39.1
14.9
40.4
1.65
0.09
I valori delle singole colonne contrassegnati da lettere diverse differiscono significativamente per P≤0.05 (test di
Duncan). * I dati relativi alla produzione di fibra si riferiscono alla sola località di Anzola Emilia.
rito, bloccando così la loro crescita. Per la
stessa ragione anche i diametri degli steli di
queste due varietà sono risultati rilevantemente inferiori a quelli delle altre cultivar.
La produzione di biomassa fresca ha raggiunto i valori tendenzialmente più elevati
(oltre le 36 t ha-1) con le cultivar HY-5, HY-2
e Carmagnola; rese non significativamente
diverse sono state ottenute da HY-3, HY-4,
Eletta Campana, Carmagnola HY e Fibranova, mentre Fedora e Futura, a causa del
loro ridottissimo sviluppo, hanno fornito le
produzioni statisticamente più basse (15.4 e
20.5 t ha-1, rispettivamente).
La percentuale di sostanza secca dello stelo in almeno 8 cultivar ha superato il 40%.
Futura e Fedora sono risultate poco interes-
santi anche sotto tale aspetto.
Le produzioni di sostanza secca nei casi
più meritevoli (HY-2, Carmagnola,
Fibranova e HY-3) si sono collocate sulle
12 t ha-1. In tutti gli altri casi, ad eccezione
di Futura, Fedora e Carmagnola Gigante, si
sono avute rese comprese fra 10 e 11 t ha-1.
Il rapporto corteccia/stelo è risultato molto favorevole per Fedora, HY-1 e, soprattutto, HY-5 (37-41%), mentre per HY4, HY3,
Eletta Campana e C.S. si sono avuti i valori
più bassi, inferiori al 30%.
Per la produzione di fibra, stigliata e
gramolata (filaccia), si sono particolarmente distinti HY2 e Carmagnola HY (2.99 e
2.69 t ha-1, rispettivamente). Subito dopo si
è collocato HY-3 (2.33 t ha-1) e poi, man
mano, tutte le altre cultivar, fino a Futura e
Fedora in fondo alla graduatoria.
Il contenuto di THC delle piante, in media, è stato basso (0.14% della s.s.); tuttavia, l’ibrido HY-1 e, soprattutto, la cultivar
Eletta Campana hanno superato la soglia
ammessa con valori di 0.26 e 0.43%, rispettivamente. I livelli più rassicuranti del
cannabinoide sono stati rilevati per Red
Petiole e HY-4, che non hanno superato lo
0.05%. A questo riguardo però, va
evidenziato che c’è stata interazione fra
cultivar e ambienti, come si vedrà di seguito.
c) Interazione “cultivar x ambienti”
L’interazione fra cultivar e ambienti ha
interessato diversi caratteri, tuttavia per ra-
100
90
80
I.F.S.
70
60
2000
50
40
30
20
10
Figura 5 - Finezza della fibra pettinata.
Figure 5 - Hackled fibre fineness.
24 Agroindustria / Aprile 2002
Fedora
Futura
HY7
HY6
HY5
HY4
HY3
HY2
HY1
Carmagnola HY
Eletta Campana
Red Petiole
Kompolti
Carmagnola Gigante
Fibranova
C.S.
Carmagnola
0
2001
Anzola Emilia
Ravenna
HY7
HY6
HY5
HY4
HY3
HY2
HY1
Carmagnola HY
Kompolti
Red Petiole
Fibranova
C.S.
Vitulazio
Carmagnola
Steli (t ha-1 s.s.)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Figura 6 - Effetti combinati delle cultivar e degli ambienti sulla produzione di sostanza secca, anno 2001.
Figure 6 - Effects of the “cultivars x localities” interaction on dry matter production, year 2001.
gioni di spazio vengono qui presentate solo
quelle più importanti, relative alla produzione
di sostanza secca (Fig. 1) e al contenuto di
THC delle piante (Fig. 2).
La produzione di sostanza secca delle
cultivar ha risentito significativamente dell’ambiente di coltivazione, così ad Anzola
Emilia i tipi più produttivi sono stati HY-2,
Red petiole, Carmagnola, HY-3 e Fibranova;
a Ravenna si sono particolarmente
evidenziate HY-3, HY-4 e HY-2, ad Osimo
sono risultate più meritevoli Carmagnola
HY, HY-1 e HY-3 nella prova di S. Biagio e
Fibranova e HY-2 nella prova di
Campocavallo; a Rutigliano, infine, si sono
evidenziate HY-5 e HY-1.
Riguardo al THC, Eletta Campana ha superato la soglia in tutte le località, con differenze notevoli in Emilia-Romagna e a
Osimo-S. Biagio e meno marcate negli altri
due ambienti. Analogamente, HY-1 ha superato detta soglia in tutte le località, eccetto Rutigliano. Inoltre, per lo stesso motivo
si sono distinti negativamente Carmagnola
Gigante ad Anzola Emilia, nonché HY-1 e
Carmagnola HY ad Osimo. Al contrario, Red
Petiole e HY-4 in tutte le località hanno
mostrato i contenuti più bassi (0.04-0.05%).
Aspetti qualitativi
a) Classificazione organolettica
La media dei valori dei parametri
organolettici è risultata pari a 2.61. Il punteggio nettamente più elevato (4.6) è stato
ottenuto dall’ibrido HY-4 seguito dalla Red
Petiole (3.7) e con valori medi prossimi a 3
da Carmagnola Gigante, Carmagnola HY,
Eletta Campana, HY-1 e HY-2. Al contrario, le varietà monoiche Fututra e Fedora
hanno conseguito i punteggi più bassi
(Fig. 3).
b) Pettinatura
La resa media è risultata piuttosto bassa,
pari al 26.2%. I valori più interessanti, prossimi al 35%, sono stati rilevati per le cultivar
Kompolti, Carmagnola HY e HY-1. Carmagnola Gigante, invece, è stata la peggiore
sotto tale profilo (Fig. 4).
c) Finezza
L’indice di finezza standard in media è risultato di 67.5. La varietà Carmagnola Gigante, contrariamente a quanto fatto rilevare per la pettinatura, spicca positivamente
con il valore di 42.1 seguita dagli ibridi HY-4
e HY-5 con rispettivamente 55 e 59.8. Le
fibre più grossolane sono state evidenziate
da Carmagnola, C.S., Fibranova, Red Petiole
e HY-2 (Fig. 5).
Anno 2001
Prima di illustrare i risultati ottenuti va
evidenziato che in questo secondo anno la
coltura impiantata ad Anzola Emilia, in data
8 maggio, quando le piante avevano già raggiunto l’altezza di 1 m circa, è stata fortemente danneggiata da una grandinata. Successivamente, le piante spezzate hanno ributtato, emettendo ciascuna due getti. A fine
ciclo, nell’ambito di ciascuna parcella le
piante apparivano abbastanza uniformi; purtroppo, come si vedrà dai dati rilevati, l’altezza media delle piante è risultata sensibilmente inferiore a quella dell’anno precedente, con conseguenze negative sulla produzione.
Parte agronomica
a) Effetti ambientali
Analogamente a quanto riscontrato nel
2000, anche nel secondo anno di prova l’ambiente di coltivazione ha provocato effetti
significativi su quasi tutti i caratteri considerati (Tab. 4).
La produzione di biomassa, contrariamente a quanto osservato nel primo anno, è risultata significativamente più elevata nel sud Ita-
lia, grazie alla maggiore densità di investimento e all’irrigazione, più che compensativa
della minore piovosità rispetto alle località del
Nord. Ad Anzola Emilia, per la ragione sopra
evidenziata, è stata ottenuta la resa significativamente più bassa, associata ad una minore
altezza delle piante (-17.9%, in media).
Passando alla sostanza secca degli steli,
sia in percento che in assoluto, contrariamente a quanto emerso per la biomassa, non ci
sono state differenze di rilievo fra la prova
di Ravenna e quella di Vitulazio. Evidentemente, la coltura condotta nel casertano, al
momento della raccolta, presentava una
maggiore fogliosità rispetto a quella svolta
in Romagna, e ciò è spiegato, verosimilmente, dalle numerosi irrigazioni effettuate a
Vitulazio fino a poco prima della raccolta
(Tab. 1).
Il rapporto corteccia/stelo è risultato significativamente più elevato ad Anzola
Emilia (33.7%), per effetto del ricaccio delle piante. Infatti, come già accennato, le piante spezzate dalla grandine hanno ributtato
due getti ciascuna, che grazie ai loro diametri ridotti rispetto allo stelo unico, hanno fornito una maggiore superficie corticale.
Il contenuto medio di THC delle piante,
contrariamente a quanto riscontrato nel 2000,
è stato significativamente più alto al Sud,
anche se notevolmente inferiore alla soglia
ammessa. Ad Anzola Emilia è stato riscontrato il valore più basso (0.07%).
b) Effetti delle cultivar
Anche nel 2001 sono state riscontrate differenze significative fra le cultivar per tutti i
parametri considerati (Tab. 5).
Le densità di investimento più elevate
sono state rilevate per Carmagnola, HY-4,
Fibranova, HY-3, C.S. e HY-5, i cui valori
(98.1-90.9 piante m-2) non si sono differenziati statisticamente. La fittezza più bassa,
Agroindustria / Aprile 2002 25
invece, è stata riscontrata per HY-6
(68.3 piante m-2).
Per l’altezza delle piante si sono evidenziate 8 tesi, con valori superiori a 300 cm, di
queste 3 sono rappresentate da Carmagnola,
C.S. e Fibranova, mentre le altre 5 sono costituite da ibridi sperimentali. Kompolti e
HY-1 hanno mostrato le piante significativamente più basse (269.5 e 254.5 cm, rispettivamente).
I diametri basali degli steli sono risultati piuttosto elevati, con valori compresi fra 10.9 mm
di HY-1 e 12.6 mm di Carmagnola HY.
Per la produzione di biomassa fresca si
sono particolarmente distinti Kompolti,
HY-2, Carmagnola e HY-3, con rese variabili da 51.7 a 48.4 t ha-1, non significativamente diverse fra loro.
Le percentuali di sostanza secca degli steli
sono risultate più elevate in C.S., Fibranova,
Carmagnola e HY-3 (>40%) e significativamente più basse in Kompolti e HY-1.
Conseguentemente a quanto appena sopra
evidenziato e alle altezze raggiunte dalle
piante, le cultivar che hanno prodotto più
sostanza secca sono state Carmagnola, C.S.,
HY-2, HY-3 e Fibranova, le cui rese hanno
oscillato da 16.7 a 15.9 t ha-1, nell’ordine),
mentre Kompolti e HY-1 si sono mostrate le
meno produttive.
Al contrario, Kompolti si è evidenziata per
il migliore rapporto corteccia/stelo (41.2%),
le altre cultivar, invece, hanno fatto rilevare
valori notevolmente più bassi.
Per la produzione di fibra l’ibrido HY-2 si
è confermato come più interessante
(2.35 t ha-1). Inoltre, ottime rese sono state
raggiunte da Kompolti e Fibranova (2.012.22 t ha-1), le altre cultivar si sono attestate
su valori compresi fra 1.82 t ha-1 di HY-3 e
1.01 t ha-1 di HY-1.
Infine, per il THC i valori medi di tutte le
cultivar sono risultati inferiori alla soglia; i
livelli più bassi sono stati rilevati per Red
Petiole, Fibranova (0.05%), Carmagnola e
C.S. (0.06%), mentre quelli significativamente più alti sono stati ottenuti da HY-1 e
HY-2 (0.14 e 0.15%).
c) Interazione “Cultivar x ambienti”
Anche nel 2001 il comportamento
biometrico-produttivo delle cultivar è variato
in funzione dell’ambiente di coltivazione. Di
fatto, gli effetti combinati hanno interessato
soprattutto l’altezza delle piante, la produzione di sostanza secca (Fig. 6), il rapporto
corteccia/stelo ed il contenuto di THC delle
piante (Fig. 7).
Più in particolare, ad Anzola Emilia si sono
distinte per vigorosità Carmagnola, HY-4,
Fibranova e HY-7. Le prime tre di esse,
unitamente a C.S. e HY-3, sono risultate le
più produttive in sostanza secca (13.4-14.3 t
ha-1), mentre Kompolti, HY-6 e HY-7 si sono
evidenziate per i più elevati rapporti “corteccia/stelo” (39.7-36.4%).
Riguardo al THC, Red Petiole e
Fibranova, ancor più delle altre cultivar, hanno mostrato livelli estremamente ridotti
(0.03% della s.s.).
A Ravenna le cultivar più sviluppate sono
state HY-6 e HY-7 che hanno superato i
340 cm di altezza. Peraltro, HY-7 è stata la
maggiore produttrice di sostanza secca, assieme a C.S., Hy2, Carmagnola e HY-3 (circa 18 t ha-1).
Per il rapporto corteccia/stelo anche in
questa seconda località spicca Kompolti con
un valore del 42%; livelli interessanti, anche se sensibilmente inferiori a quello di
Kompolti, sono stati ottenuti da HY-6 e HY-5.
I contenuti di THC più bassi (0.02-0.06%)
sono stati ottenuti da HY-4, Carmagnola e
C.S.
A Vitulazio le cultivar più sviluppate sono
state HY-2, Carmagnola, C.S. e Fibranova.
Fra queste, Carmagnola, in exaequo con
HY-7, è stata anche la maggiore produttrice
di sostanza secca (18.3 t ha-1). Inoltre, rese
importanti sono state fornite da Fibranova,
C.S., Carmagnola HY, HY-2 e HY-3.
Per il rapporto corteccia/stelo anche a
Vitulazio il valore più elevato, in assoluto,
è stato ottenuto da Kompolti (41.8%).
Riguardo al THC le cultivar più interessanti sono state Red Petiole e Fibranova
(0.04%).
Caratteristiche qualitative
a) Classificazione organolettica
La media dei valori dei parametri
organolettici è risultata pari a 2.52, non significativamente diversa da quella del 2000.
I punteggi più elevati sono stati ottenuti da
HY-5 e C.S., entrambi con valore medio di
3.6; subito dopo si sono collocati HY-3 (3.3),
Carmagnola (3.2) e HY-6 (3.0) (Fig. 3).
b) Pettinatura
Anche per il 2001 la resa media è risultata piuttosto bassa (30.2%) e non significativamente diversa da quella del 2000. L’ibrido HY-4 ha raggiunto una resa del 50% circa, di gran lunga superiore alle altre cultivar.
L’ibrido HY-1 ha confermato i valori raggiunti
nel 2000 (38%), eguagliato dalla Fibranova.
Leggermente inferiori sono risultati C.S. e
HY-7, mentre l’ibrido HY-3 si è collocato in
fondo alla graduatoria di merito (Fig. 4).
c) Finezza
L’indice di finezza standard in media è risultato di 58.6, significativamente migliore
di quello rilevato per il 2000. Contrariamente
a quanto osservato per il primo anno i migliori valori di finezza sono stati osservati
rispettivamente per HY-2, HY-3, Fibranova
e HY-4; peraltro, quest’ultimo ha confermato i dati dell’annata precedente. Nettamente
peggiore sotto tale profilo la varietà Kompolti
0.18
0.16
THC (% s.s.)
0.14
0.12
Anzola Emilia
0.1
0.08
Ravenna
0.06
Vitulazio
0.04
0.02
Figura 7 - Effetti combinati delle cultivar e degli ambienti sul contenuto di THC delle piante, anno 2001.
Figure 7 - Effects of the “cultivars x localities” interaction on THC levels of the plants, year 2001.
26 Agroindustria / Aprile 2002
HY7
HY6
HY5
HY4
HY3
HY2
HY1
Carmagnola HY
Kompolti
Red Petiole
Fibranova
C.S.
Carmagnola
0
(Fig. 5).
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Riguardo agli ambienti, le prove svolte
hanno evidenziato che nel Sud Italia è possibile raggiungere produzioni analoghe a
quelle ottenibili in asciutto nel nord del Paese a condizione di sostenere pesantemente
la coltura con l’irrigazione. Nel centro della
Penisola, sebbene la piovosità non sia stata
sensibilmente inferiore a quelle delle località emiliano-romagnole, le produzioni sono
risultate estremamente più basse. In realtà
ad Osimo la distribuzione delle precipitazioni è risultata, come di consueto, più
disomogenea rispetto al nord, con forte deficit in luglio. Conseguentemente, anche in
tale località e, verosimilmente in tutto il centro Italia, è necessario ricorrere all’irrigazione nell’ultima fase di crescita della coltura.
Per quanto attiene alle cultivar,
Carmagnola, C.S. e Fibranova sono risultate quelle a comportamento più stabile e fra
le più produttive.
La varietà dioica polacca Kompolti ha
evidenziato in tutte le località un elevato rapporto corteccia/stelo, indice di un’ottima resa
in fibra. Purtroppo, le caratteristiche
qualitative di quest’ultima sono risultate scadenti, in accordo con quanto rilevato in precedenti esperienze (Liberalato, 2000).
Le varietà monoiche Futura e Fedora sono
risultate nettamente inferiori alle dioiche a
causa della loro spiccata sensibilità alla prefioritura. D’altra parte, già negli anni ’60 i
ricercatori italiani avevano riscontrato per le
monoiche di allora grande instabilità di comportamento e minore produttività rispetto alle
dioiche italiane (Venturi, 1967 e 1969;
Amaducci, 1969). Anche a livello qualitativo
della fibra le monoiche sperimentate non
hanno brillato, evidenziando modestissime
rese e scarsa finezza.
Gli ibridi sperimentali non hanno
evidenziato fenomeni di eterosi nel senso
classico (lussureggiamento vegetativo),
presumibilmente sia per il livello di
eterozigosi dei parentali utilizzati (Forapani
et al., 2001), sia per la vicinanza genetica
delle popolazioni incrociate. Tuttavia alcuni di essi sembrano abbastanza interessanti
per le capacità produttive o per la qualità
della fibra. Ci si riferisce in particolare a HY2 e HY-3, derivanti rispettivamente dall’incrocio “Carmagnola x Kompolti” e
“Carmagnola x Fibranova”, e HY-4 ottenuto dall’incrocio “Carmagnola x Carmagnola
Gigante”, distintisi molto positivamente per
le caratteristiche qualitative della fibra e per
la resa alla pettinatura. Probabilmente, conviene indagare ulteriormente tale indirizzo
perché potrebbe rappresentare il mezzo per
combinare in varia misura le caratteristiche
possedute dalle cultivar parentali (Venturi,
1970).
Sotto il profilo più strettamente qualitativo
va sottolineato che la classificazione
organolettica è risultata applicabile solo in
parte, dato che per alcuni parametri non vi è
stata variabilità, mentre per qualche altro la
valutazione è risultata difficile. Rientrano nel
primo caso la qualità della stigliatura, risultata insufficiente per la quasi totalità dei campioni, così come la “proprietà” (leggasi pulizia), per la frequente presenza di residui di
canapulo, il colore e la lunghezza della
filaccia, sempre superiore a 2 metri. Quest’ultimo parametro apparentemente poco
importante rende il prodotto industrialmente poco competitivo per il costo del lavoro
legato al taglio della fibra per poter essere
pettinata. Nel secondo caso rientra invece il
grado di macerazione, generalmente disomogeneo, con notevole differenza fra parte basale e parte apicale dello stelo. Tuttavia, dal
giudizio medio delle due annate risulta che
l’ibrido HY-4, assieme a Red Petiole,
Carmagnola e C.S. si sono distinti positivamente sotto il profilo qualitativo.
Riguardo alla pettinatura, premesso che i
dati ottenuti sono puramente indicativi in
ragione delle ridotte dimensioni dei singoli
campioni, si sottolinea una generale bassa
percentuale di resa, le cui cause sono probabilmente molteplici (fibre aggrovigliate, grado di macerazione, presenza di resti di
canapulo), ma che devono essere risolte per
ottenere rese competitive.
Il parametro finezza è variato sensibilmente fra le due annate, con risultati talvolta contrastanti per alcune cultivar. In media, le fibre della serie di ibridi HY1÷HY5 sono risultate significativamente più fini rispetto a
quelle delle altre cultivar. L’ibrido HY-4 è
risultato quello più interessante e per il quale si può prevedere di ottenere un filato di
titolo metrico pari almeno a 26.
Relativamente ai contenuti di THC delle
piante, anche se non sono mancati taluni tipi
che hanno superato la soglia dello 0.2%, la
maggioranza dei materiali sperimentati sembra offrire buone garanzie. Ciò è particolarmente valido per i materiali di recente costituzione come Red Petiole o per le cultivar
Carmagnola, C.S. e Fibranova sottoposte a
riselezione per bassi livelli di THC.
Circa le possibili indicazioni per il breeder,
si ritiene che qualsiasi programma di miglioramento genetico della canapa tessile non
possa prescindere dal coinvolgimento delle
varietà storiche italiane, visto che anche in
tale sperimentazione si sono collocate mediamente ai vertici delle graduatorie produttive, evidenziando, fra l’altro, grande stabilità di comportamento e adattabilità ambientale. D’altra parte, la stessa sperimentazione
ha messo in risalto taluni materiali come, per
esempio, Carmagnola Gigante e l’ibrido
HY-4 per l’elevata finezza della fibra, che è
sicuramente il carattere qualitativo più importante per ottenere filato ad alto titolo, idoneo per tessuti da abbigliamento.
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Agroindustria / Aprile 2002 27
Influenza dell’epoca di semina e di raccolta sulle caratteristiche biometriche
produttive della canapa da seme (Cannabis sativa L.)
Mario Di Candilo, Michele Diozzi e Paolo Ranalli
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia.
RIASSUNTO
Allo scopo di individuare le soluzioni colturali più idonee per la meccanizzazione della raccolta del
seme di canapa è stata svolta una prova di confronto fra due epoche di semina (30 aprile e 30
maggio), in combinazione con due cultivar dioiche (Carmagnola e Fibranova) e con cinque epoche
di raccolta. L’esperimento è stato effettuato ad Anzola dell’Emilia (Bologna), con schema sperimentale a split-plot. Per ciascuna raccolta sono stati rilevati i caratteri: densità d’investimento,
altezza della pianta, diametro mediano dello stelo, produzione di seme, produzione di steli, peso
1000 semi e germinabilità del seme. I risultati ottenuti hanno messo in evidenza effetti significativi
indotti dalle variabili singolarmente ed in interazione fra loro. Carmagnola, rispetto all’altra cultivar,
ha mostrato maggiore densità d’investimento, maggiore altezza della pianta e maggiore produzione di sostanza secca. Fra le due epoche di semina, quella posticipata ha indotto riduzione della
densità d’investimento, riduzione dell’altezza della pianta, incremento del diametro mediano dello
stelo, aumento della produzione di seme e minore produzione di steli. L’epoca di raccolta, a sua
volta, ha influito sulla resa in seme, sul peso 1000 semi e sulla germinabilità degli stessi, nonché
sulla produzione di steli. Oltre a tali aspetti vengono discussi gli effetti indotti dalle interazioni
“cultivar x epoche di raccolta” e “epoche di semina x epoche di raccolta” sulle caratteristiche
biometriche e produttive delle piante.
Parole chiave: canapa da seme, epoche di semina, epoche di raccolta, raccolta meccanica.
ABSTRACT
Influence of sowing and harvest date on the biometric and productive characteristics of seed
hemp (Cannabis sativa L.)
In Italy, initial experiments on the mechanical harvesting of hemp seed with combine machines
revealed problems due mainly to the height of the plants; the huge fibrous mass of the plants causes
considerable stress and frequent obstruction of the machine.
In order to identify the culture options most suited to mechanical seed harvesting, a trial was
carried out, comparing the combinations of two sowing dates (April 30th and May 30th), two dioecious
cvs. (Carmagnola and Fibranova) and five harvesting dates. The harvesting dates were staggered at
one-week intervals and started at the first appearance of brown achenes wrapped by partially necrotic
bracts (September 11th). The experiment was carried out at Anzola Emilia (Bologna), with a splitplot design. Four replications were made, and the cultivars in the different plots were randomised,
as well as the sowing periods in the sub-plots and the harvesting periods in the sub-sub-plots. For
each harvest, the following characters were measured: plant density, plant height, stem diameter at
half-height, seed production, stem production, 1000-seed weight and seed germinability.
The results obtained showed significant effects of the variables both individually and in combination.
Carmagnola showed higher final plant density, greater height and better dry matter production. The
later sowing date caused reduced plant density and height, an increase in the stem diameter and in
seed production, but lower stem production.
The harvesting date also influenced seed yield, 1000-seed weight, seed germinability and stem
production. The combined effects “cultivar x harvesting date” and “sowing date x harvesting date”
were also very interesting for their influence on biometric and production characters of the plants.
Key words: seed hemp, sowing dates, harvesting dates, mechanical harvesting.
INTRODUZIONE
Il crescente interesse per le colture da fibra è dovuto fondamentalmente ai seguenti
tre motivi: 1) grande potenzialità, a livello
internazionale, delle fibre naturali, sia per
impiego tessile, sia per impieghi alternativi
(materiali compositi, componentistica per
auto, bioedilizia, ecc.), per i quali si prevede
Autore corrispondente: Di Candilo M.
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di
Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia
Tel. (051) 6316833 - Fax (051) 374857
E-mail: [email protected]
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
28 Agroindustria / Aprile 2002
una notevole espansione; 2) forte interesse
del mondo agricolo per le colture industriali
non alimentari alternative a quelle tradizionali, sempre più eccedentarie e meno
remunerative; 3) crescente sensibilità per le
problematiche ambientali che spinge sempre più ad utilizzare risorse rinnovabili, quali
le piante erbacee da fibra in sostituzione di
piante legnose (per la salvaguardia del patrimonio forestale) o di altre colture erbacee
richiedenti elevati input energetici (in termini
di combustibili, diserbo chimico, concimazione, irrigazione, ecc.).
La canapa, indubbiamente, è la pianta che
risponde meglio a tali esigenze, in quanto presenta elevate potenzialità produttive, ottima
idoneità per svariati usi, buona rusticità e
capacità fitodepurative del terreno da metalli pesanti (Przemyslaw et al., 1995); inoltre, è in grado di soffocare le infestanti. Dunque, la coltura non richiede interventi di difesa, trattamenti di diserbo chimico e neppure l’irrigazione, per lo meno nel Nord Italia. Tuttavia, la sua reintroduzione negli ordinamenti colturali richiede un forte
ammodernamento del processo produttivo,
al fine di semplificare la coltivazione e renderla economicamente competitiva nei confronti di altre colture e di produzioni estere.
La meccanizzazione integrale della coltivazione sarà fondamentale per il rilancio
della canapicoltura in Italia. In tale contesto, la meccanizzazione della raccolta del
seme riveste un ruolo molto importante per
l’abbattimento dei costi della fase agricola
di tutte le possibili filiere (tessile, cellulosa,
energetica, seme, ecc.).
In Francia, dove le varietà (monoiche)
sono di taglia più ridotta rispetto a quelle
italiane (dioiche) si è imposta la
mietitrebbiatura con macchine tradizionali
ad una altezza di taglio di 1.5 m. I vantaggi
evidenti di tale soluzione consistono nel
contenimento dei costi di investimento e
nella gestione di macchine già largamente
utilizzate e diffuse.
In Italia, le prime esperienze di raccolta
meccanica con mietitrebbiatrici, effettuate con
le varietà ‘Carmagnola’ e ‘Fibranova’, hanno
messo in evidenza la notevole complessità del
problema, dovuta fondamentalmente ai seguenti principali motivi: i) la canapa, a causa
della sua allogamia obbligata, presenta variabilità genetica, che può essere fortemente
aggravata da fallanze, irregolarità di semina,
diverso grado di ramificazione delle piante
(Venturi, 1970) ; ii) il seme presenta
maturazione scalare e una volta maturo, cade
facilmente dalla pianta; iii) le piante normalmente raggiungono altezze notevoli (fino a 5
m), perciò la raccoglitrice meccanica è costretta a lavorare su una massa elevata che
comporta forti sollecitazioni e frequenti
intasamenti della macchina stessa; iv) il materiale fibroso attorcigliandosi sugli organi
rotanti della raccoglitrice (aspo, rulli, dischi,
battitore) ne blocca i movimenti, costringendo a soste forzate per la pulizia degli stessi
organi anche dopo breve periodo di impiego
della macchina (Di Candilo et al., 2000).
Tenendo conto di tale problematica, nell’ambito del progetto di ricerca “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione” è
stata avviata una sperimentazione finalizzata
ad individuare le soluzioni meccaniche e
Tabella 1 - Caratteristiche biometriche e produttive delle cultivar.
Table 1 - Cultivar biometric and production characteristics.
Cultivar
Piante m
(n.)
Carmagnola
Fibranova
Medie
22.0*
20.1
21.0
-2
Altezza
pianta
(cm)
Diametro
mediano stelo
(mm)
278.8**
273.0
275.9
9.3
9.9**
9.6
Produzione
steli
-1
(t ha s.s.)
11.1**
10.2
10.6
* = significativo a P =0.05; ** = significativo a P≤0.01 (test F).
colturali idonee per la meccanizzazione della
raccolta del seme. Con riferimento a queste
ultime, nel 2001 sono stati investigati gli effetti svolti dall’epoca di semina e di raccolta
sulla produzione di seme e sulle principali caratteristiche qualitative di quest’ultimo.
MATERIALI E METODI
La sperimentazione è stata svolta ad
Anzola dell’Emilia (BO), impiegando le varietà Carmagnola e Fibranova in combinazione con due epoche di semina (30 aprile e
30 maggio, scelte sulla base di precedenti
esperienze) e con cinque epoche di raccolta,
intervallate di una settimana l’una dall’altra
e con avvio alla comparsa dei primi acheni
imbruniti avvolti da brattee parzialmente
necrotizzate (11 settembre).
L’esperimento è stato impostato secondo
lo schema sperimentale a split-plot, con quattro ripetizioni e randomizzazione delle
cultivar nei parcelloni, delle epoche di semina nelle sub-parcelle e delle epoche di
raccolta nelle sub-sub-parcelle.
Le semine sono state effettuate con
seminatrice parcellare pneumatica a distanze di 50 cm fra le file e 3 cm sulla fila.
Ciascuna parcella elementare, con superficie di 16 m2, comprendeva 8 file di piante lunghe 4 m. Due settimane dopo l’emergenza è
stato effettuato il diradamento, lasciando le
piantine sulla fila a distanza di 6 cm l’una
dall’altra, pari ad un investimento di
33.3 piante m-2.
Per ciascuna epoca di raccolta sono stati rilevati i seguenti caratteri: densità
Figura 1 - Temperature e precipitazioni registrate nel corso delle prove a confronto con i valori medi poliennali.
Figure 1 - Temperature and rainfall recorded during the test period and mean levels of the twenty years.
d’investimento, altezza della pianta, diametro mediano dello stelo, produzione di seme,
peso 1000 semi, produzione di steli e germinabilità del seme.
Nel corso delle prove sono stati rilevati i
principali parametri climatici (precipitazioni
e temperature, sia nei valori minimi che massimi), per il raffronto con le medie storiche.
I dati rilevati sono stati sottoposti ad analisi della varianza, con scomposizione di
quest’ultima nelle quote relative alle diverse fonti di variazione (effetti principali, effetti di interazione ed errore).
Il confronto fra le medie è stato effettuato
mediante il test di Duncan, nel caso degli
effetti principali, e con il calcolo delle differenze minime significative, nel caso delle
interazioni.
Andamento meteo. La piovosità cumulata
nel periodo aprile-settembre è stata di 316 mm,
contro i 289 mm della norma. Le maggiori precipitazioni si sono avute in maggio, luglio e
settembre, mentre in giugno ed agosto esse
sono state inferiori ai valori del poliennio.
Le temperature minime decadiche si sono
collocate quasi sempre al di sopra dei valori
della norma durante le fasi di crescita delle
piante, fioritura ed allegagione; a fine ciclo,
invece, sono risultate sensibilmente inferiori ai valori del poliennio. Le temperature
massime, anch’esse generalmente superiori
a quelle poliennali, hanno raggiunto i valori
più elevati nella prima decade di agosto, poi
si sono progressivamente ridotte (Fig. 1).
RISULTATI
I risultati ottenuti hanno messo in evidenza effetti significativi semplici, indotti dalle
singole variabili allo studio, ed effetti di
interazione fra le stesse variabili.
a) Effetti semplici. Fra le due cultivar,
Carmagnola ha mostrato maggiore densità
d’investimento (+9.5%), maggiore altezza
della pianta (+2.1%), minore diametro dello
stelo (-6.1%) e maggiore produzione di steli,
espressa in sostanza secca (+8.8%) (Tab. 1).
Riguardo alle epoche d’impianto della
coltivazione è emerso che per quella posticipata (fine maggio) sono stati ottenuti: minore densità d’investimento (-40.5%), riduzione dell’altezza della pianta (-13.3%), incremento del diametro mediano dello stelo
(+18.2%), maggiore resa in seme (+32.6%)
e minore produzione di sostanza secca
(-9.8%) (Tab. 2).
L’epoca di raccolta, a sua volta, ha influito sulla resa in seme, sul peso 1000 semi e
sulla germinabilità del seme, nonché sulla
produzione di steli. Di fatto, la resa in seme
è aumentata significativamente passando
dalla prima alla seconda raccolta e da quest’ultima alla terza, con incrementi pari a
104.2 e 36.7%. Nelle successive due raccolte la produzione non ha più subito variazioni significative.
Il peso 1000 semi è stato significativamente più basso nelle prime due raccolte, poi è
Agroindustria / Aprile 2002 29
Tabella 2 - Effetti medi delle epoche di semina sulle caratteristiche biometriche e produttive delle
piante.
Table 2 - Average effects of the sowing dates on plant biometric and production characteristics.
Epoche
di semina
Piante m
(n.)
30 Aprile
30 Maggio
Medie
Altezza
pianta
(cm)
-2
26.4**
15.7
21.0
Diametro
mediano stelo
(mm)
295.6**
256.3
275.9
Produzione
seme
-1
(t ha )
Produzione
steli
-1
(t ha s.s.)
0.46
0.61**
0.53
11.2**
10.1
10.6
8.8
10.4**
9.6
** = significativo a P≤0.01 (test F).
-1
Steli (t ha s.s.)
cresciuto progressivamente fino all’ultima
raccolta.
La germinabilità del seme è aumentata
sensibilmente in seconda raccolta (+14.5%
rispetto alla prima); successivamente, ha teso
a ridursi in quarta raccolta e ad aumentare
nell’ultima raccolta, ma non in modo significativo.
Stesso andamento è stato riscontrato per
la produzione di steli secchi, per la quale si
sono avuti incrementi del 6.1 e 13.1% passando dalla prima alla seconda e poi alla terza raccolta (Tab. 3).
b) Effetti di interazione. Le cultivar hanno interagito con le epoche di semina influenzando sensibilmente la produzione di
sostanza secca (steli), così mentre per
Carmagnola la seconda epoca d’impianto ha
provocato una riduzione contenuta della resa,
per Fibranova, invece, la flessione produttiva indotta dalla posticipazione della semina
è stata molto più consistente (-15.5%)
(Fig. 2).
Inoltre, le cultivar hanno interagito con le
epoche di raccolta evidenziando comportamenti produttivi differenziati. Di fatto, la
produzione di seme di Carmagnola ha teso a
crescere progressivamente passando dalla
prima alla quinta raccolta, con incrementi
statisticamente significativi fra la prima e la
seconda e fra la terza e la quinta raccolta. La
produzione di Fibranova, invece, ha raggiunto il valore massimo già in terza raccolta,
con incrementi molto significativi fra la prima e la seconda (+117.4%) e fra quest’ultima e la terza (+56%), successivamente si è
avuta una riduzione della resa (Fig. 3).
Altri effetti combinati sono stati indotti
dalle variabili epoche di semina ed epoche
di raccolta sulla produzione di seme (Fig. 4)
e sulla germinabilità dello stesso seme
(Fig. 5). In sostanza, le rese in seme per le
due epoche d’impianto, analoghe alla prima
raccolta, hanno poi mostrato incrementi
molto più marcati per la seconda epoca di
semina, sia in seconda che in terza raccolta
(+130.4 e +47.2% rispettivamente, contro i
corrispondenti 73.1 e 24.4% della prima epoca d’impianto).
Analogamente, la germinabilità del seme
ha risentito delle raccolte in relazione all’epoca di semina: per il primo impianto si è
avuta una germinabilità dell’80% già in prima raccolta, che non è poi variato significativamente nelle successive raccolte; per il
secondo impianto, invece, la germinabilità
è stata bassa in prima raccolta (69%), è aumentata poi molto marcatamente in seconda
raccolta (+25.5%), ha teso a crescere ulteriormente in terza raccolta, superando significativamente il corrispondente valore della
prima semina.
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
La posticipazione dell’epoca di semina in
canapa, al fine di ridurre l’altezza della pianta
per facilitare la raccolta meccanica del seme
ha avuto effetti positivi, anche se inferiori a
quanto desiderato. Di fatto, proprio per le
peculiari caratteristiche di rusticità, di vigoria ed elevato ritmo di accrescimento della
specie, la pianta ha risentito in misura contenuta dello scostamento di un mese dall’epoca usuale di semina. Tuttavia, considerando che l’altezza massima di taglio delle
normali mietitrebbie è di 1.5 m e che le piante
della coltura con semina posticipata hanno
presentato un’altezza media di 2.56 m, all’interno della raccoglitrice transiterebbero
segmenti di piante di circa un metro di lunghezza, corrispondenti a poco più delle parti fruttifere (portasemi).
Il ritardo dell’impianto, a causa della minore disponibilità di umidità nel terreno, può
comportare problemi di emergenza e, quindi, di scarso investimento. Perciò, per le semine di fine maggio bisogna mettere in conto leggeri interventi irrigui ripetuti subito
dopo la semina, evitando la formazione di
crosta nel terreno.
Nell’impianto posticipato della prova, nonostante simili accorgimenti, è stata ottenuta
15
10
Semina 30 APR.
Semina 30 MAG.
5
0
Carmagnola
Fibranova
-1
Seme (t ha )
Figura 2 - Effetti dell’interazione “cultivar x epoche di semina” sulla produzione di steli.
Figure 2 - Effects of the “cultivars x sowing dates” interaction on stem production.
1
Carmagnola
Fibranova
0,5
0
I
II
III
Raccolte
Figura 3 - Effetti dell’interazione “cultivar x epoche di raccolta” sulla produzione di seme.
Figure 3 - Effects of “cultivars x harvesting dates” interaction on seed production.
30 Agroindustria / Aprile 2002
IV
V
Tabella 3 - Effetti medi delle epoche di raccolta sulle caratteristiche produttive e sulla qualità del seme.
Table 3 - Average effects of the harvesting dates on production characteristics and seed quality.
Produzione
seme
-1
(t ha )
Raccolte
a
0.24 c
0.49 b
0.67 a
0.62 a
0.65 a
0.53
1
a
2
a
3
a
4
a
5
Medie
Germinabilità
seme
(%)
74.6 c
85.4 ab
85.7 ab
82.7 b
87.7 a
83.2
Peso
1000 semi
(g)
15.9 bc
15.4 c
16.4 b
17.8 a
18.3 a
16.8
Produzione
steli
-1
(t ha s.s.)
9.9 c
10.5 b
11.2 a
10.9 ab
10.7 ab
10.6
I valori della medesima colonna contrassegnati da lettere diverse differiscono
significativamente per P≤0.05 (test di Duncan).
-1
Seme (t ha )
una densità d’investimento significativamente
inferiore a quella della prima semina; conseguentemente, le piante hanno presentato steli
con diametro mediano maggiore. Ovviamente, nei casi in cui tali diametri risultassero
eccessivi potrebbero insorgere difficoltà nell’azione di taglio da parte della raccoglitrice.
La produzione di steli, espressa in sostanza secca, più che del diametro delle bacchette, pare essere stata influenzata soprattutto
dall’altezza e dal numero di piante.
L’incremento significativo della produzione di seme indotto dalla seconda epoca d’impianto della coltura non era atteso ed è di
non facile spiegazione. Si potrebbe forse
ipotizzare che le piante del secondo impianto abbiano penalizzato la fase vegetativa a
vantaggio di quella riproduttiva. Molto più
probabilmente però le differenti produzioni
di seme riscontrate per le due epoche d’impianto sono da ricollegare alle differenti disponibilità idriche nel terreno. Di fatto,
l’11 agosto, in concomitanza della piena
fioritura delle piante della seconda semina,
allorché quelle della prima semina erano
giunte a fine fioritura, sono caduti 25 mm di
pioggia che hanno verosimilmente consentito una maggiore allegagione nella coltura
del secondo impianto. Ne consegue che nel
Nord Italia, contrariamente a quanto si fa per
la coltura da fibra generalmente condotta in
asciutto, potrà essere necessario supportare
la coltura da seme con un intervento irriguo
di soccorso all’epoca dell’antesi.
Relativamente all’epoca ottimale di raccolta va ricordato che per entrambe le epoche d’impianto la massima produzione di seme è stata raggiunta in terza raccolta, ovvero
a distanza di due settimane dalla comparsa dei
primi semi imbruniti avvolti da brattee parzialmente necrotizzate. Sempre a tale riguardo va tenuto in considerazione anche il diverso comportamento delle due cultivar nel
senso che Fibranova è parsa più precoce e forse
più sensibile alla crodatura del seme maturo
rispetto a Carmagnola. Quest’ultima supposizione deriva dalla constatazione che per Fibranova dopo la terza raccolta la produzione di
seme si è ridotta molto sensibilmente, mentre per Carmagnola la resa è cresciuta progressivamente fino all’ultima raccolta.
Carmagnola si è distinta dall’altra cultivar
anche per un maggior numero di piante
sopravissute alla raccolta e per la maggiore
produzione di steli.
Per una ulteriore riduzione dell’altezza
della pianta e per l’incremento della produzione di seme si ritiene opportuno proseguire le ricerche avviate allargandole anche alla
concimazione azotata e alla fittezza delle
piante. È noto infatti che l’azoto esercita un
potente stimolo sull’accrescimento delle
piante, le quali rispondono prontamente con
una maggiore rigogliosità. Un attento
dosaggio di tale elemento potrebbe, quindi,
consentire una minore vigoria della pianta
ed una diminuzione della scalarità di fioritura e maturazione del seme. A loro volta, il
numero ottimale di piante per unità di superficie ed un appropriato sesto d’impianto
assumono notevole importanza, date le loro
conseguenti ripercussioni sul L.A.I. (leaf
area index) e perciò sull’efficienza fotosintetica della coltura.
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Przemyslaw B., Grabowska L., and Mankowski
J., 1995. Recultivation of degraded areas
through cultivation of hemp. Proceedings of
Biorohstoff Hanf Symposium, Frankfurt am
Main, Germany, 2-5 March 1995.
Venturi G., 1970. Ricerche sulle modalità
colturali nella canapacciaia al fine di
facilitare la raccolta meccanica. Rivista di
Agronomia 1/2, 25-34.
1
Semina 30 APR.
Semina 30 MAG.
0.5
0
I
II
III
IV
V
Raccolte
Germinabilità (%)
Figura 4 - Effetti dell’interazione “epoche di semina x epoche di raccolta” sulla produzione di seme.
Figure 4 - Effects of “sowing dates x harvesting dates” interaction on seed yield.
100
Semina 30 APR.
50
Semina 30 MAG.
0
I
II
III
IV
V
Raccolte
Figura 5 - Effetti dell’interazione “epoche di semina x epoche di raccolta” sulla germinabilità del seme.
Figure 5 - Effects of “sowing dates x harvesting dates” interaction on seed germinability.
Agroindustria / Aprile 2002 31
Influenza dell’epoca di semina e del regime irriguo sulla canapa nel Sud d’Italia
Vito Di Bari, Pasquale Tedeschi1, Rosa Colucci, Marcello Mastrorilli, Franco Carone2
Istituto Sperimentale Agronomico, Bari
1
CNR – ISPAIM, Ercolano (NA)
2
DIAAT, Università Federico II, Portici (NA)
RIASSUNTO
Lo studio svolto dal 1999 a 2001 a Rutigliano (BA) ha avuto l’obiettivo di valutare i consumi idrici
e la miglior data di semina della canapa. Nel 2001 la prova irrigua è stata realizzata anche a Vitulazio
(CE). Sono state esaminate tre epoche di semina (inizio, metà e fine marzo) e diversi regimi idrici
che hanno previsto, al momento programmato dell’irrigazione, la restituzione di percentuali diverse dell’acqua disponibile. Le rese migliori sono state ottenute nell’anno 1999 che ha presentato una
piovosità superiore alla norma; al contrario, le rese si sono ridotte nelle altre due annate,
climaticamente peggiori. Le rese in biomassa verde e di corteccia secca sono aumentate con l’elevarsi dei volumi irrigui erogati. In generale, in entrambi gli ambienti di prova, la tesi che ha previsto la restituzione del 66% dell’acqua disponibile (70% a Vitulazio) ha fornito i risultati produttivi
migliori, con consumi stagionali di 400-460 mm. Circa le epoche, quella di fine marzo ha presentato piante più sviluppate ma la produzione finale in corteccia secca non si è differenziata statisticamente tra le tesi esaminate.
Parole chiave: epoca di semina, irrigazione, consumi idrici, genotipi, canapa.
ABSTRACT
Sowing time and water regime affecting hemp productivity in Southern Italy
The paper reports the results achieved in hemp, from a series of field trials aiming to optimise
sowing time and irrigation volume in Southern Italy environments. Experiments were carried out
for three years (1999-2001) at Rutigliano (BA). In 2001 the irrigation trial was repeated at Vitulazio
(CE). The split-plot experimental design, replicated four times (surface of each sub-plot equal to 20
m²), was adopted to evaluate separately the effects of the sowing time and of the water regimes
(main plots) on different genotypes (sub-plot).
As for the first objective, three sowing times (the beginning, middle and end of March) and two
genotypes (Carmagnola and Red petiole) were compared. Despite the greater size in height and in
basal diameter of the plants from the third sowing time, their productivity in dry cortex did not
differ statistically from the plants sown earlier. Performances of “Carmagnola” were better than
those of “Red petiole”.
As for the second objective, the study was carried out in two steps. The first step aimed to evaluate
the effect of different irrigation volumes on the behaviour of two genotypes: “Fibranova” and “Red
petiole”. They grew under two water regimes: I100 (irrigation volume equal to 100% of the amount
of water required to bring a soil layer of 0.40 m in depth to “field capacity”), and I66 (the irrigation
volume was reduced to 66%). Irrigations were scheduled whenever the soil moisture, detected
weekly by the gravimetric method, was close to the “soil wilting point”. Since the I100 treatment
consumed huge water amounts, in the second step (in 2001) three genotypes (Fibranova, Red
petiole, and Kompolti) and three reduced water regimes were compared. At Rutigliano the water
regimes were I66, I50, and I33, while at Vitulazio they were I70, I35 and I0 (rainfed).
In Italy the hemp season started in March and ended at the beginning of August. During the 1999
season, the air temperature was not different from the long-term average, and rainfall was well
distributed; in 2001 air temperature was higher and the scarce rainfall fell within the first half of
May.
As a general result, the hemp showed a good adaptation to the tested environment, where it adequately
yielded both biomass and dry cortex, even under dramatic climatic seasons. Among the water
treatments, I66 (I70 at Vitulazio) seems the most suitable, in that it limits water consumption
(400-460 mm) without losing hemp productivity in terms of fiber quantity. The Kompolti genotype
showed best water use efficiency in the irrigation experiments.
Key words: sowing time, irrigation, water requirements, genotypes, hemp.
Autore corrispondente: Vito Di Bari - Istituto
Sperimentale Agronomico, Bari via Celso
Ulpiani, 5 - 70125 Bari, Italia
Tel. (080) 5475011 - Fax (080) 5475023
e-mail: [email protected]
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
32 Agroindustria / Aprile 2002
INTRODUZIONE
La canapa è stata una delle colture da fibra più coltivate in Italia sino alla prima metà
del XX secolo. Successivamente, nel 1965,
con il divieto di coltivazione della canapa
da marijuana, anche la superficie destinata
alla specie da fibra si è lentamente ridotta
sino ad azzerarsi completamente, dato che i
due tipi di piante sono praticamente identici
ed erano e sono spesso confuse dai tutori
dell’ordine pubblico.
Negli ultimi anni c’è stata una riscoperta
della Canapa da fibra la cui utilizzazione può
trovare impiego in molteplici settori, da quello dell’industria tessile (l’Italia è uno dei produttori principali) a quello della carta, combustibili, costruzioni, isolanti termici, ecc.
(Amaducci, 1969; Venturi ed Amaducci,
1999).
Attualmente, anche se la superficie coltivata è ancora minima ed inferiore a quella
di altre nazioni europee, sono molte le ricerche che riguardano questa coltura, grazie
soprattutto al MiPAF che ha finanziato diversi progetti finalizzati (Casarini, 1994;
Ranalli e Casarini, 1997).
Questi studi sono articolati in diversi settori e per quanto concerne le tecniche
agronomiche, prevedono ricerche in diversi
ambienti.
Nel Sud d’Italia esse riguardano, in particolare, il momento più idoneo in cui effettuare la semina e lo studio dei consumi idrici
della coltura, dato che in molti areali l’irrigazione risulta il fattore limitante per ottenere rese economicamente remunerative.
MATERIALI E METODI
Si è operato in due ambienti meridionali
ubicati in Puglia e Campania; le principali
caratteristiche dei terreni, sedi delle prove,
sono state riportate nella tabella 1.
In questa nota sono riportati i risultati ottenuti nel triennio 1999-2001; in particolare, nel 1999-2000 a Rutigliano sono stati
confrontati due genotipi (Fibranova e Red
petiole) e due regimi irrigui: l’irrigazione era
programmata al raggiungimento del punto
di appassimento e il volume irriguo della tesi
ottimale era pari al 100% dell’acqua disponibile (quantità d’acqua necessaria a riportare alla capacità di campo lo strato di suolo
profondo 40 cm) = I100; si riduceva al 66%
nella tesi sub-ottimale = I66.
Nel 2001 sono stati esaminati 3 genotipi
(Fibranova, Red petiole, Kompolti) e, per
l’irrigazione, scartata la I100 perché troppo
dispendiosa, alla I66 sono state aggiunte due
tesi che prevedevano apporti irrigui inferiori (I50 e I33 = restituzione rispettivamente del
50 e 33% dell’acqua disponibile).
A Vitulazio, nel 2001, si è operato con gli
stessi genotipi ma, per l’irrigazione, accanto a 2 tesi irrigue (I70 e I35 = restituzione del
70 e 35% dell’acqua disponibile) del tutto
Tabella 1 - Principali caratteristiche dei terreni sedi delle prove.
Table 1 - Main soil characteristics of the experimental sites.
sabbia grossa
sabbia fine
limo grosso
limo fino
argilla
N totale
s.o.
CIC (-0.03 MPa)
PA (-1,50 MPa)
acqua disponibile*
acqua disponibile*
Rutigliano
Vitulazio
1,10
10,40
11,00
26,50
51,00
0,08
1,40
29,20
17,10
12,10
530
10,90
28,90
12,20
23,70
24,30
0,08
1,66
29,50
12,00
17,50
700
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
3
-1
(m ha )
strato 0 – 40 cm
simili alle I66 e I33 di Rutigliano, è stato confrontato un testimone in asciutto (I0).
L’umidità del terreno è stata monitorata
settimanalmente (metodo gravimetrico).
La semina è avvenuta normalmente a fine
marzo.
Accanto a queste, nel 2001 a Rutigliano è
stata effettuata una prova che prevedeva 3
diverse epoche di semina (inizio, metà e fine
marzo) per 3 genotipi di canapa
(Carmagnola, Red petiole e Kompolti).
Per tutte le prove è stato adottato un disegno sperimentale a split-plot, ripetuto 4 volte, considerando come effetto principale l’irrigazione (o l’epoca di semina) e secondario i genotipi; la parcella elementare era di
20 m 2, con interfila di 20 cm (25 cm a
Vitulazio).
Tranne che per l’irrigazione, le colture
sono state sottoposte alle normali tecniche
agronomiche; in particolare, prima della semina sono stati interrati 150 kg ha-1 di P2O5
e 100 kg ha-1 di K2O (200 kg a Vitulazio) e
in copertura sono stati distribuiti in 2 volte
150 kg ha-1 di N (a Vitulazio, avendo seminato dopo un medicaio, la dose si è ridotta a
60 kg).
La raccolta delle piante è avvenuta in tutte le annate tra la fine di luglio e l’inizio di
agosto, a fioritura completa delle piante
maschili.
Durante il ciclo colturale sono state rilevate le principali fenofasi e a piena fioritura, sono state asportate le cime di 50 piante
femminili che, opportunamente trattate, sono
state utilizzate per la determinazione del contenuto in THC (analisi eseguite presso la sede
dell’Istituto Sperimentale per le Colture Industriali). Alla raccolta, sono state rilevate
le principali caratteristiche biometriche e
Tabella 2 - Rutigliano (BA): principali parametri produttivi e qualitativi rilevati alla raccolta della
canapa seminata in tre epoche diverse nel 2001.
Table 2 - Rutigliano (BA): yield and main bio-morphology and quality parameters measured at
harvesting of hemp crops sown at three different dates in 2001.
Genotipi
Carmagnola
Piante m
-2
Altezza piante
Date di semina
Red petiole
5/03
15/03
30/03
(n.)
87,00 b
91,00 a
88,88 b
94,38 a
83,75 c
(cm)
188,69 a
186,37 a
183,03 b
182,44 b
197,11 a
Diam basale
(mm)
7,08 a
7,25 a
6,72 b
7,37 a
7,41 a
Biomassa
(t ha )
-1
30,97 a
28,59 b
29,49 b
31,11 a
28,73 b
Steli freschi
(t ha )
-1
24,17 a
21,78 b
22,37 a
24,03 a
22,51 a
-1
-1
Steli secchi
(t ha )
9,92 a
9,02 b
8,82 b
9,47 ab
10,12 a
Corteccia
(t ha )
5,14 a
4,26 b
4,44 a
4,79 a
4,87 a
THC
(%)
0,05 a
0,04 a
0,04 a
0,04 a
0,05 a
Le medie non aventi in comune alcuna lettera sono significativamente differenti per
P < 0,05 (SNK Test)
produttive delle piante, secondo il protocollo sperimentale stabilito in sede collegiale. I
principali parametri sono stati sottoposti all’analisi della varianza e per la significatività
è stato adottato il test SNK e per soglia lo
0.05 P.
Per quanto riguarda l’andamento climatico durante il ciclo della canapa, a Rutigliano
il triennio di prove è stato caratterizzato da
temperature superiori alla norma (di poco nel
1999 ma nel biennio 2000-2001 le massime
hanno superato spesso i 35-40 °C, con punte di 46 °C a luglio 2000). La piovosità è
stata buona nel 1999 (da aprile a luglio
215.8 mm vs, 133.5 della “norma”), praticamente assente nel 2000 (8.2 mm per l’intero ciclo) e nel 2001 di poco inferiore alla
norma nella fase iniziale e nulla da fine maggio a luglio.
Anche a Vitulazio le temperature sono risultate superiori alla media (ma inferiori di
quelle di Rutigliano) e le precipitazioni hanno interessato la parte iniziale del ciclo
(78.8 mm di piogge utili); da metà maggio
alla raccolta non è stato registrato alcun evento utile alla coltura.
RISULTATI
Rutigliano (BA): epoche di semina,
anno 2001. Poiché nell’analisi della varianza
eseguita sui principali parametri produttivi
non è mai risultata significativa l’interazione
”epoche x genotipi”, nella tabella 2 sono state
riportate le medie dei soli effetti principali.
Si può osservare come, pur in presenza di
differenze statisticamente significative, i valori tra le 3 epoche esaminate non siano
molto differenti.
L’altezza delle piante è risultata inferiore
di circa 14 cm nelle due semine più precoci
(in media, 182 vs. 197 cm); minime, invece,
le variazioni dei diametri basali.
Le rese più elevate della produzione in
biomassa verde sono stati ottenute nella tesi
intermedia (31 t ha-1 vs. 29 t circa delle altre
due) ma la produzione in corteccia non si è
differenziata statisticamente (da 4.44 a 4.87
t ha-1).
Il contenuto in THC non è variato in funzione degli effetti in prova (epoche e varietà).
In generale, i risultati conseguiti non permettono di trarre alcuna valida indicazione,
sia perché riguardano una sola annata di prova ma, soprattutto, perché l’intervallo temporale prescelto (inizio – fine marzo) è risultato troppo breve per evidenziare differenze morfoproduttive notevoli tra le piante. Considerando che normalmente la semina della canapa si effettua entro la seconda
metà di marzo, negli ambienti meridionali
l’operazione potrebbe essere anticipata anche in febbraio (Ranalli e Casarini, 1998).
Per quanto riguarda poi i genotipi in prova, questi hanno presentato altezza e diametri basali simili ma, a livello produttivo,
“Carmagnola” ha garantito migliori perforAgroindustria / Aprile 2002 33
66% (409 mm)
8
50% (338 mm)
33% (262 mm)
mm/d
6
4
2
0
90
105
120
135
150 165 180
giorni del 2001
195
210
225
Figura 1 - Rutigliano (BA): andamento dell’evapotraspirazione giornaliera (mm d-1) della canapa nel 2001.
Figure 1 - Rutigliano (BA): daily evapotranspiration trend (mm d-1) of hemp during the 2001 season.
mance di “Red petiole”.
Rutigliano (BA): prova irrigua, biennio
1999-2000. Sono stati esaminati 2 differenti
regimi idrici (I100 e I66 = restituzione del 100
o 66% dell’acqua disponibile) e due genotipi
(Fibranova e Red petiole).
L’analisi statistica ha evidenziato la
significatività tra gli anni e dei trattamenti
irrigui mentre i genotipi si sono differenziati solo per i parametri produttivi (Tab. 3).
Delle interazioni, la “anni x irrigazione x
genotipi” non è mai risultata significativa
così come “anni x genotipi” e “irrigazione x
genotipi”; al contrario, quella “anni x irrigazione” è stata significativa per tutti i parametri esaminati, tranne che per la densità di
piante alla raccolta.
L’andamento climatico rilevato durante il
ciclo della canapa nei 2 anni di prova è ri-
sultato molto diverso; ad un 1999 poco più
caldo della media ma caratterizzato da una
piovosità superiore ai valori normali, è seguito un 2000 più caldo e senza piogge: è
stato, così, necessario aumentare il ritmo
delle irrigazioni tanto che nel 2000 il volume stagionale si è raddoppiato rispetto al
1999 e sono state necessarie anche 2
irrigazioni di soccorso per evitare stress
irreversibili alla coltura (Di Bari et al, 2000).
Conseguentemente, nel 1999 le piante
sono risultate più alte e caratterizzate da
maggiori dimensioni degli steli (Tab. 3).
Anche le rese in biomassa si sono differenziate statisticamente ma la maggior produzione sembra sia stata determinata dalla presenza di foglie, notevole nel 1999 ma inferiore nell’anno successivo per le eccessive
temperature e per la notevole ventosità di
Tabella 3 - Rutigliano (BA): principali parametri produttivi e qualitativi rilevati alla raccolta della
canapa sottoposta a due differenti regimi irrigui nel biennio 1999-2000.
Table 3 - Rutigliano (BA): yield and main bio-morphology and quality parameters measured at
harvesting of hemp crops grown under two different water regimes in 1999 and 2000.
Genotipi
Fibranova
Piante m
-2
Regimi idrici
Red petiole
(n.)
90,00 a
89,33 a
Altezza piante
(cm)
227,26 a
220,77 a
Diam basale
(mm)
Biomassa
Steli freschi
Steli secchi
I100
93,33 a
Anni
I66
1999
2000
86,00 b
85,67 a
93,67 a
231,40 a 216,37 b
245,70 a
202,34 b
8,40 a
8,65 a
9,04 a
8,00 b
10,30 a
6,74 b
-1
43,44 a
37,96 b
42,52 a
38,87 b
43,99 a
37,40 b
-1
31,74 a
27,26 b
31,22 a
27,78 b
29,20 a
29,80 a
-1
13,72 a
11,92 b
13,08 a
12,56 a
12,00 a
13,64 a
-1
(t ha )
(t ha )
(t ha )
Corteccia
(t ha )
6,86 a
5,08 b
6,25 a
5,68 a
5,76 a
6,18 a
THC
(%)
0,15 a
0,04 b
0,16 a
0,05 b
0,11 a
0,05 b
Le medie non aventi in comune alcuna lettera sono significativamente differenti per
Test)
34 Agroindustria / Aprile 2002
P < 0,05 (SNK
luglio che hanno determinato la precoce
defogliazione delle piante, accellerandone la
maturazione: alla raccolta, infatti, la percentuale di sostanza secca è stata superiore a
quella riscontrata nelle piante coltivate nel
1999.
Circa i regimi idrici esaminati, i volumi
più elevati erogati nella tesi ottimale (I100)
hanno favorito nei due anni lo sviluppo delle dimensioni delle piante; anche le rese in
biomassa e steli freschi della I66 sono state
statisticamente inferiori ma le differenze si
sono annullate a livello di steli secchi e di
resa in corteccia.
Tra i due genotipi in prova i risultati produttivi migliori sono stati ottenuti da
“Fibranova” (Tab. 3).
Circa il contenuto in THC, questo è risultato più elevato in “Fibranova” del 1999,
sottoposta ad irrigazione ottimale: questo
valore, forse anomalo, ha poi determinato la
significatività tra regimi e gli anni di prova;
in ogni caso, si tratta sempre di valori inferiori a quelli previsti dalla U.E.
Rutigliano (BA): prova irrigua, anno
2001. La prova prevedeva il confronto di 3
regimi irrigui (I33, I50 e I66 = restituzione del
33, 50 e 66% dell’acqua disponibile), in
interazione con 3 genotipi (Fibranova, Red
petiole e Kompolti).
Trattandosi di una sola annata di prova, le
considerazioni successive hanno semplice
valore indicativo.
L’analisi statistica ha evidenziato differenze significative per effetto dei due fattori
principali; l’interazione tra i due è scattata
solo per la densità finale di piante e le rese
in biomassa e steli freschi.
L’irrigazione ha condizionato soprattutto
l’altezza delle piante, che aumenta da 160 a
192 cm passando dalla I33 alla I66; per gli altri caratteri le due tesi meno irrigate si sono
normalmente attestate sullo stesso livello di
significatività, differenziandosi dalla I66, che
ha fornito normalmente le medie più elevate (Tab. 4).
Non è stata registrata alcuna variazione
del contenuto di THC al variare degli effetti
in esame.
Tra i genotipi, “Kompolti” sembra essersi
meglio adattato alle condizioni ambientali,
dato che ha mostrato una buona produttività
anche nelle condizioni irrigue più difficili.
Infatti, l’interazione “irrigazione x genotipi”
ha evidenziato come i 3 genotipi abbiano
fornito produzioni in biomassa pressoché
simili in corrispondenza dei volumi irrigui
massimi (da 26 t ha-1 per Red petiole a circa
29 t per gli altre due); con il ridursi dell’irrigazione, mentre le rese di “Red petiole” e
“Fibranova” si sono ridotte a 20-22 t ha-1
(valori pressoché simili tra I 50 e I 33 ),
“Kompolti” ha prodotto 27.2 t ha-1 con il
regime irriguo più basso (I33).
Se confrontiamo i risultati conseguiti in
questa annata da “Fibranova” e “Red petiole”
nel regime I66 con quelli ottenuti nel biennio
Tabella 4 - Rutigliano (BA): principali parametri produttivi e qualitativi rilevati alla raccolta della
canapa sottoposta a tre differenti regimi irrigui nel 2001.
Table 4 - Rutigliano (BA): yield and main bio-morphology and quality parameters measured at
harvesting of hemp crops grown under three different water regimes in 2001.
Genotipi
Regimi idrici
Fibranova
Red petiole
Kompolti
I66
(n)
101,00 b
88,75 c
113,50 a
98,33 b
Altezza piante
(cm)
178,13 a
169,43 b
174,81 ab
Diam basale
(mm)
Piante m
-2
Biomassa
Steli freschi
Steli secchi
I50
I33
99,00 b 105,92 a
192,04 a 170,25 b 160,08 c
7,45 a
7,08 b
6,91 b
7,46 a
7,23 a
6,76 b
-1
23,92 b
22,25 c
26,90 a
28,09 a
21,84 c
23,14 b
-1
18,72 b
17,20 c
20,71 a
22,13 a
16,98 b
17,52 b
-1
7,56 a
6,79 b
7,58 a
8,77 a
6,53 b
6,64 b
-1
(t ha )
(t ha )
(t ha )
Corteccia
(t ha )
4,55 b
3,73 b
6,07 a
5,55 a
4,42 b
4,39 b
THC
(%)
0,04 b
0,03 b
0,09 a
0,06 a
0,05 a
0,06 a
edie non aventi in comune alcuna lettera sono significativamente differenti per P < 0,05 (SNK Test)
precedente, sempre per lo stesso livello
irriguo, si può notare come, pur avendo presentato consumi irrigui pressoché simili
(460 mm circa nel biennio vs 409 del 2001),
le piante siano state caratterizzate da altezze, diametri e resa in biomassa decrescenti
dalla prima alla terza annata di prova: le condizioni climatiche hanno influenzato i risultati più delle tesi in esame.
Nonostante questo, la produzione in corteccia non si è molto diversificata nel
triennio, variando da 5 a 6 t ha-1, in funzione
soprattutto del genotipo; la maggior produzione di biomassa verde è stata annullata
dalle maggiori percentuali di sostanza secca
e dai più elevati rapporti corteccia/stelo che
le piante hanno presentato nelle annate più
siccitose. In ogni caso, solo le analisi
qualitative sulla fibra potranno servire a
meglio interpretare i risultati ottenuti in questa ricerca.
Vitulazio (CE): prova irrigua, anno
2001. La ricerca prevedeva il confronto di
3 regimi irrigui (I0 = test non irrigato, I35 e
I70 = restituzione del 35 o 70% dell’acqua disponibile, nello strato 0-40 cm) sulle stesse
varietà esaminate a Rutigliano.
Dal punto di vista statistico, l’irrigazione
ha determinato differenze significative su
tutti i parametri analizzati mentre minore è
risultata l’azione del genotipo; l’interazione
tra i due ha influito solo sulla resa di steli
secchi e corteccia.
Dai dati in tabella 5 si può notare come
entrambe le tesi irrigue si siano differenziate dal testimone, tranne che per la densità di
piante alla raccolta; inoltre, le medie più elevate sono state ottenute sempre nella tesi più
irrigata (I70). Tra i genotipi, “Fibranova” ha
fornito le rese maggiori di biomassa verde,
steli freschi e secchi; gli altri 2 genotipi,
meno produttivi, si sono attestati normalmente sulla stessa soglia di significatività.
Se però esaminiamo le rese in corteccia, i valori più elevati sono stati ottenuti da
“Fibranova” e “Kompolti” (4.05 e 4.27 t ha-1)
Tabella 5 - Vitulazio (Ce): principali parametri produttivi rilevati alla raccolta della canapa sottoposta a
tre differenti regimi irrigui nel 2001.
Table 5 - Vitulazio (CE): yield and main bio-morphology parameters measured at harvesting of hemp
crops grown under three different water regimes in 2001.
Genotipi
Fibranova
Piante m
-2
Red petiole
Regimi idrici
Kompolti
I70
I35
I0
73,67 ab
62,11 b
(n.)
71,56 a
66,22 a
76,89 a
78,89 a
Altezza piante
(cm)
254,44 a
253,44 a
239,89 a
280,67 a
254,56 b
212,56 c
Diam basale
(mm)
10,48 a
10,13 a
10,98 a
11,12 a
10,76 a
9,71 b
-1
45,72 a
39,11 b
36,78 b
49,94 a
44,11 b
27,56 c
-1
35,82 a
30,98 b
28,75 b
39,44 a
34,58 b
21,54 c
-1
14,56 a
12,15 b
10,61 c
16,38 a
13,24 b
7,69 c
-1
4,05 a
3,28 b
4,27 a
5,09 a
4,09 b
2,42 c
Biomassa
(t ha )
Steli freschi
(t ha )
Steli secchi
Corteccia
(t ha )
(t ha )
medie non aventi in comune alcuna lettera sono significativamente differenti per P < 0,05 (SNK Test)
in cui la bassa produzione di steli secchi è
stata compensata da maggiori rapporti percentuali tra corteccia e steli.
Le due interazioni significative presentano andamenti simili: mentre “Fibranova” e
“Kompolti” hanno aumentato le loro rese in
steli secchi e corteccia in modo direttamente proporzionale ai volumi erogati, la “Red
Petiole” ha raggiunto il suo massimo produttivo in corrispondenza della tesi I35 e non
ha evidenziato ulteriori incrementi di produzione con l’aumentare del volume stagionale.
Consumi idrici ed efficienza dell’acqua.
Nella tabella 6 sono stati riportati i consumi
idrici calcolati in base al bilancio idrico. Essi
risultano massimi nella tesi ottimale (I100),
aumentano nelle annate caratterizzate da
temperature elevate e piovosità ridotte. Con
la riduzione dei volumi di adacquamento, i
consumi stagionali tendono proporzionalmente a diminuire.
Superata la fase iniziale (con il conseguente calo dovuto al diradamento), la canapa raggiunge i valori massimi di evapotraspirazione
(ET = 6 mm d-1 nelle condizioni idriche migliori) due mesi dopo la semina e li conserva
nei mesi più caldi dell’anno, sino alla raccolta, dato che questa è normalmente programmata a piena fioritura delle piante.
Questo andamento è stato osservato anche nel 2001 differenziando i volumi irrigui
(Fig. 1). La figura mette in evidenza una brusca riduzione dell’ET verso la fine del ciclo,
dovuta alle temperature elevate associate a
venti di notevole intensità, che hanno accelerato la defogliazione delle piante.
In generale, tra le tesi confrontate, la I66
(a Rutigliano) e la I70 (a Vitulazio) hanno conseguito i migliori risultati produttivi (in termini di resa in steli secchi e corteccia) col
minor impiego di acqua irrigua. Un consumo stagionale di acqua compreso tra 400 e
450 mm può, quindi, essere considerato
ottimale per la canapa allevata nell’ambiente meridionale. Confrontando, comunque, i
consumi idrici della canapa con quelli di altre specie coltivate nella stessa azienda di
Rutigliano, essi sono risultati più elevati di
quelli della soia (344 mm), simili a quelli
del girasole (400 mm), ma inferiori a quelli
del sorgo da granella (545 mm) o zuccherino (550 mm).
Nella tabella 6 si riportano i valori di efficienza di utilizzazione dell’acqua (WUE),
calcolata come rapporto tra corteccia secca
prodotta (che rappresenta il prodotto utile,
in g m-2) e l’acqua perduta per evapotraspirazione dalle colture (l m-2). Come per altre
colture da biomassa (Mastrorilli et al., 1999)
o da granella (Mastrorilli et al., 1995) allevate in ambiente meridionale, i valori più
elevati di WUE sono stati riscontrati adottando i regimi idrici più ridotti (1.67 g l-1 nel
trattamento I33 di Rutigliano e 1.32 g l-1 nel
trattamento I0 di Vitulazio). Questi regimi
irrigui molto ridotti, però, non consentono alla
Agroindustria / Aprile 2002 35
Tabella 6 - Consumi idrici stagionali (mm) e WUE (g l-1).
Table 6 - Seasonal water consumption (mm) and WUE (g l-1).
Regimi idrici (mm)
I100
I66
-1
mm g l
Rutigliano
Vitulazio*
mm g l
I50
-1
mm g l
I33
-1
-1
mm g l
1999
545 1,24
453 1,04
-
-
2000
680 0,84
460 1,44
-
-
2001
-
409 1,35
338 1,31
262 1,67
423 1,20
302 1,35
184 1,32
2001
Vitulazio i regimi idrici I66, I50 e I33 corrispondono rispettivamente a I70, I35 e I0.
canapa di esprimere al meglio la propria
potenzialità produttiva negli ambienti meridionali.
Il pieno soddisfacimento dei fabbisogni
idrici non si è rivelata una buona strategia
irrigua nemmeno in termini di WUE. Altre
colture, infatti, in condizioni idriche ottimali
utilizzano più efficacemente l’acqua irrigua:
con 1 litro di acqua la canapa produce 2.1g
(a Rutigliano) di biomassa secca, mentre
5.2 g il sorgo zuccherino, 3.6 il girasole, 3.7
il sorgo da granella e 2.8 la soia (Mastrorilli
et al., 1997).
Infine, dei tre genotipi a confronto i migliori risultati in termini di WUE sono stati
raggiunti da “Kompolti” (1.84 g l -1 a
Rutigliano e 1.51 g l-1 a Vitulazio, come
media dei tre trattamenti irrigui).
CONCLUSIONI
Lo studio dei consumi idrici della canapa
ha evidenziato come, in molti ambienti del
Sud d’Italia, siano soprattutto le condizioni
climatiche a condizionare i risultati produttivi (Di Candilo et al., 2001). In annate caratterizzate da scarsa pluviometria ed elevate temperature, anche aumentando i volumi
stagionali non si riesce a compensare la riduzione delle rese.
La canapa ha comunque mostrato di adattarsi all’ambiente di prova. In genere, le rese
ottenute in queste ricerche sono comunque
state simili o superiori a quelle ottenute in
altre ricerche effettuate in ambienti simili con
genotipi diversi (Basso e Ruggiero, 1976;
Rivoira e Marras, 1976).
Pur sottoposta a volumi stagionali ridotti rispetto a quello ottimale (I100), la coltura
36 Agroindustria / Aprile 2002
ha mostrato rese valide in termini di steli e
corteccia. Restituendo ad ogni intervento
il 66% dell’acqua disponibile (tesi I66) a
Rutigliano la canapa ha prodotto da 28 a
38 t ha-1 di biomassa verde, con consumi
stagionali di 410-460 mm.
Più elevate le produzioni ottenute a
Vitulazio, dove con consumi di 400 mm si
sono avute rese di 48 t ha-1.
Le produzioni di corteccia secca sono comunque risultate simili in entrambe le località: le minori produzioni di biomassa verde
di Rutigliano sono state compensate da valori maggiori di sostanza secca e dei rapporti corteccia/steli, che hanno finito per livellare i dati finali.
Purtroppo, non avendo a disposizione le
analisi quanti-qualitative sulla produzione di
fibra, non è possibile stilare un giudizio
obiettivo sulla validità dei risultati ottenuti.
In generale, i consumi e l’efficienza nell’utilizzazione dell’acqua della canapa nell’ambiente pugliese sono stati superiori a
quelli della soia, simili a quelli del girasole
ma inferiori a quelli ottenuti con il sorgo da
granella o zuccherino.
Anche la scelta del genotipo assume notevole importanza: nei due ambienti la
“Kompolti” ha presentato l’efficienza maggiore. In realtà, sarebbe auspicabile avere a
disposizione nuovo materiale genetico e soprattutto acquisizioni idonee ad ambienti
particolarmente difficili, come alcuni areali
del Sud d’Italia.
Per quanto riguarda l’epoca di semina,
non si possono fornire conclusioni certe
perché si dispone dei risultati di una singola annata; inoltre, le tre date considerate
(inizio, metà e fine marzo) sono apparse
troppo ravvicinate, e in ogni caso manca il
confronto con una tesi in cui la semina della coltura venga ulteriormente anticipata
(l’inizio di febbraio) per valutare effettivamente la resistenza alle basse temperature
e il contributo delle piogge primaverili all’alimentazione idrica della canapa.
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L’Informatore Agrario 1, 61-65.
Valutazione triennale del contenuto di THC nella canapa da fibra
G. Grassi, M. Diozzi. M. Doimo, T. Baschieri, M. Fiorilli e M. C. Moliterni
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia.
RIASSUNTO
Negli ultimi tre anni è stato rilevato l’andamento delle concentrazioni del tetraidrocannabinolo
(THC) nelle coltivazioni di canapa da fibra realizzate in Italia. Sono stati considerati e confrontati
i metodi di campionamento per le analisi del THC in modo da poter equiparare ed uniformare i
dati raccolti nei vari anni ed al fine di rispettare i diversi limiti massimi del cannabinoide che la UE
ha nel tempo imposto sulle coltivazioni di canapa da fibra. Tra i fattori che hanno evidenziato
maggiore effetto sulla sintesi di THC, quelli genetici svolgono il ruolo predominante, anche se i
fattori ambientali sono da tenere in stretta considerazione, in modo particolare la disponibilità
idrica.
Parole chiave: CBD, gas-cromatografo, stress idrico, canapa.
ABSTRACT
Triennial evaluation of fibre hemp THC content
Over the last three years the concentrations of tetrahydrocannabinol (THC) have been monitored
in hemp crops in Italy. The THC sampling and analysis methods were chosen and assessed to
compare the data collected, as regards time and succession, thus obtaining a uniform evaluation of
the various maximum cannabinoid limits, imposed by the EU over time on hemp crops for fibre
production. Amongst the factors which revealed the greatest effect on THC synthesis, genetic
aspects played a predominant role, even if the ambient factors must be kept in mind, especially
availability of water.
Keywords: CBD, gas-chromatography, hemp, water stress.
INTRODUZIONE
Il tetraidrocannabinolo (THC) è l’unico
terpenoide, dei 60 prodotti dalla Cannabis
sativa L., che induce effetti psicotropi
(Turner et al. 1980). In base al contenuto di
THC la legislazione italiana e quella europea stabiliscono che la Cannabis sia ammessa alla coltivazione per la produzione di fibra, semi e altri prodotti; condizioni per poter anche avere dei contributi che l’UE concede per questa coltura (regolamento CE n°
2860/2000).
Fino al 2000 il livello di THC tollerato
nelle varietà di canapa da fibra era lo 0.3%,
mentre, dal 2001, questo limite è stato portato allo 0.2%, con una tolleranza dello
0.03%. Va precisato che questo limite ha
valore solo ai fini della concessione dei contributi. Agli effetti legali, invece, il limite
che discrimina una pianta di canapa da fibra
da una per droga è pari allo 0.5% della sostanza secca (Avico e Zuccaro, 1984, Froldi
et al., 1987).
L’abbassamento del limite massimo di
THC nelle varietà di canapa ha obbligato i
costitutori e i sementieri, interessati alla produzione di seme di canapa, a selezionare ulAutore corrispondente: Grassi Gianpaolo
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di
Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia
Tel. (051) 6316833 - Fax (051) 374857
e-mail: [email protected]
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
teriormente le varietà incluse nella lista di
quelle ammesse a contributi.
Per usufruire dei sostegni pubblici, ogni
Paese ha dovuto organizzare anche un servizio di controllo della canapa coltivata. Fino
al 1999 il metodo ufficiale adottato per accertare il contenuto di THC era basato sull’analisi gas cromatografica di un estratto
ottenuto da un campione fogliare ricavato
da 500 parti di altrettante piante (regolamento CE n. 1164/89). Nel 2000, il metodo di
analisi è stato rivisto e con il nuovo (regolamento CE n. 1177/2000), sono state date
nuove disposizioni per eseguire i controlli
del contenuto di THC sulle coltivazioni.
A partire dal 1999 l’Istituto Sperimentale
per le Colture Industriali (ISCI) è stato incaricato dal Ministero delle Politiche Agricole
e Forestali (MiPAF) di effettuare i controlli
richiesti dall’UE. Ogni Paese membro, in
quell’anno, ha avuto la possibilità di eseguire
la valutazione del contenuto di THC nella
canapa riferendosi al metodo ufficiale riportato nel regolamento del 1989, eventualmente adeguato, in maniera da renderlo più praticabile e semplice. È stato possibile perciò,
apportare delle modifiche, salvo ottenere dei
dati “equivalenti” a quelli ottenibili con il
metodo ufficiale.
Nel 2001 è stato definitivamente
formalizzato un accordo con l’agenzia responsabile della distribuzione dei contributi
per la coltivazione della canapa (AGEA), in
modo da fissare le modalità di esecuzione
dei controlli. In questo lavoro si riferisce sui
dati riguardanti il contenuto di THC rilevati
sulle coltivazioni italiane di canapa da fibra
effettuate negli ultimi tre anni.
MATERIALI E METODI
Prove di campo. Nel triennio 1999-2001,
sono stati effettuati controlli ufficiali per la
determinazione del contenuto di THC nelle
aziende dove era coltivata la canapa da fibra.
Nel primo anno, 1999, le indagini hanno
interessato una percentuale di aziende e, di
conseguenza, di superfici investite a canapa, più ampia di quella richiesta dalle norme che prevedevano inizialmente il controllo di almeno il 5% delle superfici. Si è voluto infatti associare a questi controlli un’indagine più allargata, per stimare come variasse la concentrazione del THC in funzione delle varietà utilizzate e degli ambienti di
coltivazione.
Nel 1999 sono arrivate dagli assessorati
regionali le segnalazioni di 51 aziende in cui
era stata seminata canapa, per complessivi
180.08 ha e di queste ne sono state campionate 43, pari al 78% della superficie (141.59
ha). Le aziende erano distribuite in prevalenza nelle regioni dell’Italia centrosettentrionale, 25 in Toscana, 8 in Piemonte e 7 in
Emilia-Romagna. Le varietà di canapa interessate sono state: Kompolti, Fedora, Futura, Carmagnola, Fedrina e Felina. Il campione raccolto ed analizzato in ogni parcella
con superficie massima di 2 ettari, era costituito da 30 cime di 10 cm derivate da altrettante piante femminili. Quindi, l’Istituto
Sperimentale per le Colture Industriali
(ISCI), deputato ai controlli, ha ridotto (rispetto alle norme Comunitarie), sia il numero dei campioni effettuati 30 piante anziché
500, sia la parte di pianta campionata 10 cm
anziché il terzo superiore. La riduzione della parte campionata da 1/3 della pianta a soli
10 cm della cima, ha indotto l’ISCI al calcolo di un coefficiente di correzione. Tale
coefficiente è stato determinato su due varietà allevate a Bologna, Carmagnola e
Kompolti TC.
Il contenuto di THC è stato valutato su
ogni singola pianta. In totale sono stati presi
20 individui femminili per varietà. Il campione analizzato è stato ricavato dalla polvere prodotta attraverso la frantumazione
delle singole cime, da cui sono stati eliminati i semi e la parte legnosa. Da ogni pianta
è stata raccolta separatamente la restante parte che formava la cima di 40 cm, in modo da
accertare quale fosse il rapporto tra le concentrazioni dei cannabinoidi in queste due
parti (10 e 40 cm di cima). Il processo di estrazione ed analisi mediante gas-cromatografo
Agroindustria / Aprile 2002 37
Tabella 1 - Concentrazioni del THC, rapporti tra CBD e THC rilevati su due apici (di 10 e 40 cm) di
piante appartenenti a due varietà di canapa da fibra.
Table 1 - THC concentration, CBD and THC ratio found in the two top parts (10 cm and 40 cm) of
plants derived from two fibre hemp varieties.
Varietà
Carmagnola
Piante
singole
THC %
(apice 10)
THC %
(apice 40)
CBD/THC
(apice 10)
CBD/THC
(apice 40)
Coef. Corr.
40/10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
0.09
0.26
0.09
0.06
0.12
2.49
0.14
0.13
0.13
0.11
0.11
0.17
0.20
0.13
0.15
0.16
0.15
2.82
3.04
0.20
0.09
0.18
0.07
0.06
0.09
1.56
0.08
0.05
0.06
0.08
0.08
0.11
0.16
0.10
0.11
0.11
0.11
1.05
2.06
0.14
80.0
70.0
77.0
83.0
76.0
0.5
80.0
73.0
72.0
86.0
78.0
71.0
81.0
75.0
80.0
61.0
71.0
1.9
2.0
56.0
80.0
58.0
74.0
81.0
79.0
0.1
77.0
84.0
80.0
79.0
82.0
78.0
79.0
68.0
80.0
67.0
66.0
2.3
2.1
55.0
0.96
0.68
0.79
1.03
0.73
0.63
0.57
0.38
0.46
0.73
0.73
0.65
0.80
0.77
0.73
0.69
0.73
0.37
0.68
0.70
0.54
0.32
63.7
63.6
0.69
2.55
0.09
2.32
0.18
1.80
2.73
1.14
1.48
2.41
0.10
0.23
0.22
1.55
1.13
3.15
1.26
0.20
1.68
2.47
0.03
1.96
0.10
1.37
0.43
1.53
0.28
0.68
0.81
1.36
0.07
0.13
0.10
0.83
0.72
2.17
1.15
0.08
1.25
2.44
0.04
2.5
0.0
0.0
34.6
4.3
2.3
2.8
3.8
0.0
66.3
57.0
52.0
1.8
3.5
0.2
7.2
35.0
4.3
2.4
35.0
2.7
0.3
0.3
34.3
7.0
2.3
2.8
3.8
0.0
66.0
57.0
52.0
1.8
3.5
0.2
7.2
35.0
4.3
2.4
35.0
0.77
1.11
0.59
2.41
0.85
0.10
0.60
0.55
0.56
0.70
0.57
0.45
0.54
0.64
0.69
0.91
0.40
0.74
0.99
1.33
1.34
0.87
15.8
15.9
0.77
Media
Kompolti TC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Media
38 Agroindustria / Aprile 2002
è stato effettuato in maniera uguale a quello
previsto dal metodo ufficiale. Dalla medesima analisi, oltre al THC è stato possibile rilevare anche il contenuto di cannabidiolo
(CBD) e pure questo dato è stato utilizzato
per valutare il chemotipo delle piante.
Nel secondo anno, 2000, sono state segnalate dagli assessorati 64 aziende per equivalenti 143.93 ha e di queste ne sono state visitate e campionate 52, pari a più del 86%
della superficie a canapa.
A seguito dell’approvazione in sede Comunitaria del nuovo metodo di valutazione
del THC, è stata impostata una seconda prova finalizzata ad accertare se il nuovo metodo fosse rispondente ed equivalente a quello previsto nel precedente regolamento, sulla base del quale era stato definito il limite
massimo di THC da rispettare. Rispetto all’annata precedente la valutazione del contenuto di THC ha interessato due varietà
italiane (Carmagnola e Fibranova), sempre
allevate a Bologna. Sono state raccolte
200 piante femminili per ogni varietà all’epoca della piena fioritura e sono stati ricavati 4 sotto gruppi di 50 individui ciascuno. Nella prova le 200 piante erano state scelte alte 360 cm in modo che il terzo superiore
fosse pari a 120 cm. Da ogni pianta sono
stati ricavati due frammenti: il primo era costituito dall’apice di 30 cm, il secondo era la
parte sottostante di 90 cm che rappresentava la frazione rimanente del terzo superiore.
Il materiale vegetale è stato essiccato in stufa a 50°C per due giorni dopodiché la parte
fogliare, depurata degli steli, è stata frantumata, omogeneizzata e setacciata con una
maglia della larghezza di 1 mm. Sono stati
isolati da prima i campioni di polvere ottenuta dai 4 sottogruppi costituiti dalle cime
di 30 cm, poi i campioni delle rimanenti parti
di 90 cm del terzo superiore e infine sono
stati ricavati i campioni delle polveri derivate dall’unione delle due frazioni precedentemente indicate. Le tre classi di campioni
sono state estratte in doppio come prevede
il metodo ufficiale del 2000 ed analizzati al
gas cromatografo due volte. I dati ottenuti
sono stati utilizzati per definire un coefficiente
di correzione che permettesse di riportare il
valore ottenuto, analizzando la cima di 30 cm
(da prelevare da 50 individui con la procedura A del nuovo metodo ufficiale), al valore
ottenuto dal campione corrispondente al terzo superiore della pianta (parte richiesta nell’analisi prevista nel metodo del 1989).
Nel terzo anno, 2001, ci si è attenuti agli
impegni definiti dal contratto con l’AGEA,
quindi, sono stati visitati ed analizzati i campi
corrispondenti ad una percentuale appena più
elevata di quella richiesta dalle nuove norme (30% della superficie). Le denunce segnalate dall’agenzia erano di 60 aziende per
complessivi 175.64 ha e di questi ne sono
stati campionati 64.12 ha, corrispondenti a
15 aziende per circa il 36% delle superfici.
Dati climatici. Dal momento in cui, la
0.60
THC % s.s.
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
1
5
9 13 17 21 25 29 33 37 41
N° Azienda
Figura 1 - Livelli di THC nelle coltivazioni di canapa del 1999.
Figure 1 - THC level of the hemp crops in 1999.
produzione di THC è fortemente influenzata dalle condizioni climatiche verificatesi durante il ciclo vegetativo della coltura, nelle
due prove preliminari effettuate a Bologna
negli anni 1999-2000 sono stati considerati
i dati climatici registrati dalla stazione meteorologica dell’azienda sperimentale di
Budrio (BO) distante circa 20 km dai campi
dove si sono svolte le prove. Per brevità abbiamo considerato le prime 39 settimane
dell’anno, periodo che comprende l’intervallo più significativo del ciclo di sviluppo della canapa.
RISULTATI
Anno 1999. Nel primo anno, le prove preliminari indirizzate a definire un metodo di
valutazione del THC più praticabile, ha confermato che in funzione della dimensione
della parte apicale della pianta considerata
si ottengono dei campioni il cui il tenore di
THC è sensibilmente diverso: esso è più
basso per i campioni ottenuti dalle cime di
40 cm (Tab.1).
La varietà Carmagnola ha mostrato un
contenuto medio di THC pari allo 0.32%,
quando il campione era costituito da cime di
40 cm, mentre ha evidenziato un valore di
0.54%, se il campione derivava da cime di
10 cm, con il rapporto medio tra i valori ottenuti dall’analisi dei due tipi di campioni
pari a 0.69. Il rapporto tra il contenuto di
CBD e THC di ogni singola pianta è stato
costante nei due campioni costituiti dalle due
diverse parti di pianta, a conferma della stabilità e attendibilità di questo parametro per
il giudizio sul chemiotipo della canapa analizzata. Nelle piante di Carmagnola a più
basso contenuto di THC questo rapporto ha
oscillato costantemente tra 70 e 80, mentre,
nelle piante ad alto contenuto di principio
stupefacente questo rapporto è stato sempre
Tabella 2 - Variazione del contenuto di THC e CBD nelle diverse parti apicali di Carmagnola e
Fibranova nel 2000.
Table 2 - Variability of THC and CBD content in the top parts of Carmagnola and Fibranova in the
year 2000.
Varietà
Prelievo
cm
30
120-30
120
Media
50 p.
A
0.09
0.07
0.07
Media
50 p.
B
0.10
0.05
0.07
Media
50 p.
C
0.14
0.10
0.10
Media
50 p.
D
0.12
0.06
0.08
Media
4 gruppi
Coef. corr.
0.11
0.07
0.08
C = 0.72
CBD (%)
30
120-30
120
1.43
0.90
0.96
1.24
0.85
1.05
1.80
1.41
1.46
1.67
1.17
1.28
1.53
1.30
1.18
C = 0.77
THC (%)
30
120-30
120
0.11
0.07
0.07
0.09
0.05
0.05
0.05
0.03
0.03
0.21
0.09
0.12
0.11
0.06
0.07
C = 0.64
30
120-30
120
1.19
0.73
0.74
1.41
0.91
0.91
1.32
0.83
0.96
1.37
0.82
0.91
1.32
0.82
0.88
C = 0.67
Cannabinoide
THC (%)
Carmagnola
Fibranova
CBD (%)
inferiore a 5.
Anche per la varietà Kompolti TC i risultati hanno confermato che la concentrazione di THC è sempre più alta nella cima della
pianta e con un rapporto tra i valori derivati
dai due diversi tipi di campioni (cima di
10 cm e cima di 40 cm) pari a 0.77. Il contenuto medio di THC nella varietà Kompolti
TC è risultato più del doppio nelle corrispondenti porzioni di pianta della varietà italiana
e anche in questa cultivar il rapporto tra CBD
e THC è rimasto costante nella stessa pianta
e indipendente dalla parte analizzata.
In entrambe le popolazioni di canapa da
fibra erano presenti individui con livelli sensibilmente alti di THC e solo il dato medio
nella Carmagnola ha rispettato il limite CE,
considerando anche la tolleranza, solo quando è stata campionata la cima di almeno
40 cm.
Sulla base di queste indicazioni sono stati
eseguiti i campionamenti e le analisi sulle
coltivazioni del territorio nazionale. In figura 1 sono rappresentate le concentrazioni rilevate nelle aziende campionate. I dati finali sono stati prodotti tenendo conto delle evidenze raccolte preliminarmente sulla distribuzione dei cannabinoidi. Il valore del THC
nel campione raccolto è stato corretto moltiplicando il dato originale per un fattore pari
a 0.7 (ricavato dalla prova preliminare dello
stesso anno) . Nelle 4 aziende in cui il valore del THC ha superato il limite massimo
dello 0.3% era coltivata la varietà Fedora.
La stessa varietà, anche in altri Paesi europei e nel medesimo anno, ha presentato spesso valori superiori al limite. Le aziende in
cui il THC è stato più elevato erano localizzate nelle province di Viterbo, Ascoli Piceno,
Piacenza e Asti.
I dati meteorologici nel 1999 (Fig. 2),
mostrano come nell’intervallo che va dalla
25a alla 31a settimana (metà giugno fine di
luglio) le precipitazioni siano state abbastanza inconsistenti (circa 11 mm), facendo ipotizzare che la disponibilità idrica nel periodo più caldo (cioè di maturazione della canapa) sia stata insufficiente.
Anno 2000. Il nuovo metodo UE di analisi del THC non considera l’applicazione
di un fattore di correzione. Il fattore medio
di correzione (0.68), ottenuto mediante la
prova preliminare effettuata nel 2000 sulle
due varietà italiane (Tab. 2) non si discosta
molto da quello calcolato nella prova preliminare del 1999.
I risultati dei rilievi riguardanti il contenuto di THC e CBD sulle due varietà italiane coltivate nei campi sperimentali a Bologna hanno messo in evidenza la costante
maggiore concentrazione di entrambi i
cannabinoidi nella cima di 30 cm. Il rapporto tra le concentrazioni di THC rilevate sulle due parti della cima (30 cm e 120 cm) è
risultato abbastanza simile nelle due varietà: era di 0.72 nella varietà Carmagnola e
0.64 nella varietà Fibranova. Va rilevato che,
Agroindustria / Aprile 2002 39
70
60
Temp. °C / mm H2O
50
40
30
20
10
0
-10
0
5
10
15
20
25
30
Settimana
35
40
Temp. Media
Temp. Minima
Temp. Massima
mm pioggia
Figura 2 - Andamento meteorologico dell’anno 1999
Figure 2 - Meteorological trend for the year 1999
mentre le concentrazioni dei due
cannabinoidi erano relativamente costanti
nei quattro sotto campioni della prima varietà, i valori variavano un po’ di più nella
seconda cultivar. In questa prova le concentrazioni di THC nelle due varietà italiane
sono risultate molto basse rispetto a quelle
ottenute nel 1999 e ben al di sotto del limite
europeo, anche analizzando il campione costituito dall’insieme delle cime di 30 cm.
Nelle indagine sulle colture nazionali effettuate nel secondo anno, è stato applicato
per la prima volta il nuovo metodo di valu-
tazione del THC ed i dati ottenuti sono riportati in figura 3. I campioni fogliari analizzati, come prevede il metodo ufficiale,
erano costituiti da 50 cime di 30 cm. Delle
52 aziende campionate, solo 32 presentavano il livello di THC delle coltivazioni entro
il limite dello 0.3% ed in alcuni casi il valore del THC superava lo 0.5%. In quest’anno
la varietà Fedora non è stata coltivata e la
quasi totalità dei campioni che hanno superato il limite erano derivati da coltivazioni
della varietà Kompolti.
Per quanto riguarda le condizioni climati-
Livelli di THC nelle coltivazioni
di canapa del 2000
0.70
0.60
THC % s.s.
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
N° Azienda
Figura 3 - Livelli di THC nelle coltivazioni di canapa del 2000.
Figure 3 - THC level of the hemp crops in 2000.
40 Agroindustria / Aprile 2002
che registrate nel 2000, vedi in figura 4, occorre sottolineare come le precipitazioni, rispetto all’anno precedente, sono state meglio distribuite nel periodo di crescita e
maturazione della canapa ed anche le temperature si sono mantenute entro limiti normali.
Anno 2001. I risultati dell’indagine sul
contenuto del THC delle coltivazioni del terzo anno sono riportate nella figura 5. Delle
15 aziende sorteggiate da cui sono stati raccolti i campioni, 4 (26% del totale) hanno
evidenziato un valore del THC superiore al
nuovo limite dello 0.2%. In quest’anno la
varietà di canapa più coltivata è stata ancora
la Kompolti (più dell’70% della superficie)
ed i campioni in cui il THC ha superato il
limite derivavano tutti da questa varietà straniera.
~~~
Dei tre anni di valutazione effettuati sulle
coltivazioni di canapa è emerso che il livello di THC ha subito delle variazioni rilevanti nel corso del tempo, infatti nel 1999 la
media generale del contenuto di THC, ottenuta dall’esame delle 43 aziende era 0.24%,
nel 2000 dall’esame di 52 aziende è risultata una media di 0.31%, mentre nell’ultimo
anno, con 15 aziende saggiate, il valore medio di THC è risultato lo 0.18%.
A livello europeo, nell’ultimo anno del
triennio, si è provveduto a divulgare i dati
relativi alle valutazioni del THC nei vari Paesi, principalmente allo scopo di appurare
se le varietà incluse nella lista rispettavano
il limite massimo di THC stabilito dal regolamento. I dati riportati in tabella 3 mettono
in evidenza come, delle 13 varietà di canapa
impiegate in Europa, solo due sono dioiche,
di cui una è italiana e l’altra è ungherese
(Kompolti). Al momento è proprio quest’ultima varietà quella che più spesso ha mostrato valori di THC vicini o anche superiori
al limite di THC ammesso. I quasi 600 campioni analizzati riferibili a circa 3000 ettari
di canapa hanno fornito dati sul livello di
THC che per le medesime varietà sono abbastanza uniformi nei diversi Paesi. L’unica varietà italiana presente in questi controlli
(Carmagnola) è caratterizzata da un contenuto di THC ben al di sotto del limite massimo (0.14%) e la varietà che ha presentato il
valore mediamente più basso in quasi tutti i
Paesi in cui è stata coltivata (0.04%), è risultata la USO 31 che è monoica, di origine
ucraina.
CONCLUSIONI
Le prove eseguite in questo lavoro hanno
confermato le esperienze riportate in letteratura (Fetterman et al., 1971) che dimostrano il variare crescente del contenuto di THC
nelle porzioni più alte che compongono la
cima della canapa. Pare opportuno che la
Commisiione europea tenga conto di queste
indicazioni e che introduca un coefficiente
di correzione che trasformi il dato ottenuto
Tabella 3 - Livelli di THC nelle coltivazioni di canapa da fibra rilevati nel 2001 in Europa
Table 3 - THC content of fibre hemp crops surveyed in Europe in 2001
Varietà
Rilievi
Carmagnola
(dioica)
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N°campioni
THC-max.
THC-min.
THC-med.
N° camp.
Ha coltiv.
Ha saggiati
Beniko
(monoica)
Bialobrzeskie
(monoica)
Epsilon 68
(monoica)
Fedora 17
(monoica)
Fedora 19
(monoica)
Felina 34
(monoica)
Ferimon
(monoica)
Futura
(monoica)
Futura 75
(monoica)
Uso 14
(monoica)
Kompolti
(dioica)
Uso 31
(monoica)
Totale
EU
2
0.15
0.13
0.14
12
0.15
0.00
0.05
13
0.21
0.02
0.11
20
0.15
0.03
0.05
192
0.14
0.01
0.05
13
0.26
0.05
0.10
212
0.25
0.00
0.09
15
0.10
0.02
0.04
64
0.28
0.00
0.09
7
0.11
0.03
0.07
2
0.03
0.01
0.02
14
1.03
0.06
0.43
29
0.11
0.00
0.04
595
8300
3000
Germania
Francia
Italia
Olanda
Austria
12
0.06
0.02
0.04
7
0.13
0.05
0.08
16
0.21
0.02
0.12
26
0.08
0.01
0.05
2
0.15
0.13
0.14
9
0.15
0.04
0.08
8
0.21
0.08
0.12
10
0.06
0.03
0.05
47
0.14
0.02
0.06
5
0.26
0.06
0.13
19
0.25
0.04
0.11
2
0.05
0.04
0.05
4
0.11
0.03
0.07
2
0.03
0.01
0.02
1
0.28
0.28
0.28
17
0.03
0.01
0.01
3
0.03
0.02
0.02
5
0.10
0.02
0.05
9
0.15
0.04
0.05
107
0.11
0.01
0.03
1
0.09
0.09
0.09
106
0.18
0.01
0.07
15
0.10
0.02
0.04
1
0.05
0.05
0.05
1
0.07
0.07
0.07
1
0.08
0.08
0.08
70
61
0.28
0.09
0.15
3
0.10
0.04
0.07
1
1.025
1.025
1.025
1
0.05
0.05
0.05
10
0.31
0.06
0.20
10
0.03
0.01
0.01
2
0.19
0.21
0.20
1
0.11
0.11
0.11
dall’analisi del campione formato dalle cime
di 30 cm nel dato derivante dall’analisi del
campione costituito dall’insieme dei terzi
superiori della pianta, visto che è proprio su
questo ultimo campione che sono stati definiti i limiti massimi di THC da rispettare.
In precedenti lavori è stata accertata una
stretta relazione tra contenuto di CBD e THC
nella medesima pianta (Small e Beckstead,
1973). Se prendiamo come parametro di giudizio il rapporto tra il contenuto di CBD e
THC (Braut-Boucher et al., 1980), si può
rilevare che nei dati relativi alla prova preliminare del 1999 (Tab. 1), solo tre piante di
Carmagnola hanno presentato un rapporto
CBD/THC inferiore a 3 e proprio queste
piante avevano il contenuto di THC più elevato (superiore al 2%). In tutte le altre il rapporto è stato almeno superiore a 50 e il contenuto relativo di THC non superava lo 0.2%.
Una popolazione di Carmagnola interamente costituita da individui in cui il rapporto
tra CBD e THC fosse stato superiore a 50
avrebbe mostrato un contenuto medio di
THC pari a 0.14% (media di 17 piante), anche se si fosse analizzato il campione ottenuto dalle cime di 10 cm. Anche le poche
piante della varietà Kompolti TC che hanno
rispettato questa condizione (rapporto CBD/
THC > di 30), hanno mostrato il livello medio di THC di 0.16%. Questi risultati ci
portano ad affermare che per rispettare agevolmente il limite massimo di THC consentito dall’UE, le varietà di canapa dovrebbero essere costituite da un insieme di individui il cui rapporto tra CBD e THC sia quanto più possibile vicino a 50. A confermare
questa ipotesi sono i dati sul contenuto di
THC, non riportati in questa nota, raccolti
sulle tre cultivar italiane (Fibranova,
Carmagnola e C.S.). A seguito di selezione
individuale mediante analisi dei due
cannabinoidi, da ognuna di queste tre varietà sono stati eliminati tutti gli individui che
presentavano un rapporto CBD/THC minore di 20. Le analisi delle successive
discendenze delle tre varietà selezionate, effettuata con il nuovo metodo ufficiale, hanno confermato che il valore medio del THC
non raggiunge lo 0.2% e si colloca mediamente attorno allo 0.15%. In definitiva, per
valutare correttamente una varietà di canapa da fibra, è necessario misurare il contenuto in valore assoluto del THC. Però, aggiungendo a questo dato il rapporto tra il contenuto di CBD e THC, si ottiene un secondo
parametro di valutazione che risulta più stabile nelle diverse porzioni di pianta analizzata e che è strettamente correlato con il
chemiotipo della pianta.
La domanda a cui manca al momento una
chiara risposta è quella relativa alla stabilità
di questa condizione nel prosieguo delle riproduzioni del seme. Certamente l’isolamento e l’assenza nelle vicinanze dei centri di
moltiplicazione di coltivazioni clandestine
di canapa ad alto contenuto di THC è fondaAgroindustria / Aprile 2002 41
70
60
Temp. °C / mm H2O
50
40
30
20
10
0
-10
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Settimana
Temp. Media
Temp. Minima
Temp. Massima
mm pioggia
Figura 4 - Andamento meteorologico dell’anno 2000
Figure 4 - Meteorological trend for the year 2000.
mentale. Per limitare questo problema sarebbe preferibile utilizzare varietà monoiche
in quanto l’eventuale contaminazione con
polline dioico (e le varietà da droga sono
quasi tutte dioiche), causerebbe anche la contemporanea comparsa di piante maschili all’interno della popolazione monoica. Mediante epurazione quanto meno il 50% di
piante dioiche, cioè quelle maschili, potrebbero essere eliminate nella successiva riproduzione, prima che i fiori rilascino il polli-
ne, infatti in queste piante al carattere maschio potrebbe essere associato l’alto contenuto di THC. Sfuggirebbero comunque le
piante femminili dioiche non distinguibili
morfologicamente dalle monoiche.
L’indagine triennale sul contenuto di THC
della canapa da fibra coltivata in Italia ha
consentito, nel limite derivante dalle variazioni avvenute in corso d’opera (metodi di
analisi, selezione delle varietà, diversi momenti
delle semine e terreni investiti di diversi
Livelli di THC nelle coltivazioni
di canapa del 2001
0.35
THC % s.s.
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
1
3
5
7
9
N° Azienda
Figura 5 - Livelli di THC nelle coltivazioni di canapa del 2001.
Figure 5 - THC level of the hemp crops in 2001.
42 Agroindustria / Aprile 2002
11
13
15
zone), di poter stimare la variazione del contenuto medio del THC nelle coltivazione
della canapa. Il dato più elevato è stato rilevato nel 2000 (0.31%), mentre quello più
basso è stato raggiunto nel 2001 (0.18%). In
questi due anni il metodo di analisi è stato lo
stesso ed anche le semine sono avvenute circa nello stesso periodo (inizio di maggio).
L’elemento di variabilità che ha probabilmente influito in maniera più significativa
sull’esito dei rilievi, per il quale al momento non possiamo riferire compiutamente, è
dato dall’effetto derivante dalla selezione per
bassi livelli di THC delle varietà coltivate.
La varietà di canapa Kompolti più coltivata
in Italia avrebbe dovuto essere già ben selezionata e da quanto è dato sapere (comunicazione personale del Prof. Bocsa), il contenuto medio di THC avrebbe dovuto essere
ampiamente sotto lo 0.2%. Ciononostante,
in Francia, l’unico campione valutato della
varietà in questione ha superato l’1% di THC
e la conseguente decisione della Commissione europea è stata quella di escludere
definitivamente la Kompolti dalla lista delle
varietà ammesse a contributi.
È noto che la sintesi dei cannabinoidi è
influenzata da vari fattori ambientali che
sono stati studiati in precedenti lavori sperimentali. Tra i più significativi sono stati indicati l’alta temperatura (Hakim et al., 1986),
l’intensità dei raggi ultravioletti (Lydon et
al., 1987, Pate, 1983), alcuni elementi nutritivi, la composizione e la conseguente
struttura del terreno e certamente molto influente è la disponibilità d’acqua (Murari et
al., 1983, Pate, 1994). Lo stress idrico è stato da noi valutato in prove in fitotrone e si è
visto che gioca un ruolo significativo (dati
non pubblicati).
I dati raccolti nei due anni in cui sono state fatte le prove sperimentali, anche se prodotti da una stazione collocata un po’ distante
dai campi di Bologna, consentono di avanzare prudenti considerazioni. In particolare,
pare che la distribuzione e la quantità delle
piogge, nel 1999, nel periodo che va tra la
25a settimana (metà giugno), alla 31a settimana (fine luglio) sia stata ben diversa di
quella registrata nel 2000. Nel primo anno
nell’intervallo di tempo considerato sono
caduti 11 mm di pioggia e nello stesso periodo nel 2000 ne sono caduti più di 80 mm.
Le rilevanti differenze di concentrazione del
THC riscontrate nella stessa varietà saggiata nei due anni (Carmagnola) probabilmente possono anche essere la conseguenza di
questo evento.
Sulla base di quest’ultima deduzione, qualora attraverso il miglioramento genetico si
raggiungesse il limite al di sotto del quale
non fosse possibile portate il contenuto di
THC, e questo limite non fosse abbastanza
più basso di quello previsto dalle norme
CEE, l’unico intervento agronomico possibile, che avrebbe probabilmente un effetto
sul contenimento della sintesi dei canna-
binoidi ed in particolare del THC, potrebbe
essere quello dell’irrigazione di soccorso nei
periodi più caldi ed asciutti. Tale pratica è
sicuramente vantaggiosa se si prevede di
raccogliere oltre alla pianta, anche il seme.
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Agroindustria / Aprile 2002 43
Meccanizzazione della raccolta della canapa da seme
Cesare De Zanche, Luigi Sartori, Stefano Beria, Mario Di Candilo1
Dipartimento Territorio e Sistemi Agro-forestali, Università degli Studi di Padova
1
Istituto Sperimentale per le Colture Industriali, Bologna
RIASSUNTO
La raccolta della canapa da seme con mietitrebbiatrice rappresenta la linea di meccanizzazione più
proponibile soprattutto perché tali macchine sono largamente utilizzate e diffuse. Le esperienze
effettuate sia su operatrici modificate che su alcune presenti nel mercato danno indicazioni sulle
soluzioni e sulle modifiche da apportare in relazione anche alle particolari caratteristiche delle
varietà coltivate in Italia. Nel caso di mietitrebbiatrici modificate, la ridotta potenza e la spesa per
gli interventi di adattamento costituiscono il più evidente vincolo alla loro diffusione, mentre per le
mietitrebbiatrici tradizionali la soluzione proponibile sembra essere la combinazione tra una piattaforma di taglio specifica per girasole e corpo macchina con battitore assiale, preferibilmente
dotata di sistema di autolivellamento integrale.
Dal punto di vista delle tecniche colturali e per facilitare l’operatività delle macchine è necessario
in ogni caso adottare tutti gli interventi atti a ridurre la disomogeneità della coltura.
Parole chiave: canapa, seme, raccolta, mietitrebbiatrici.
ABSTRACT
Mechanisation of hemp seed harvesting
The most reliable line of mechanisation for hemp seed harvesting is a self-propelled combine
because the use of such machinery is widespread.
The experience gained with both a modified combine and traditional ones present on the Italian
market indicate solutions and modifications in relation also to the particular features of the Italian
hemp cultivars.
The results achieved during three-year tests suggest that increasing the height of cut is important to
prevent clogging risks, the greatest obstructions occurring in the front mechanism of the combine
(above all in feeding systems, cylinder and concave clearance adjustment), while the equipment
for separating and cleaning are not affected by these problems.
The best header is the 10-row sunflower picker; the grain losses occurring in the cutter bars and the
reel position need to be correctly adjusted.
As regards the cultivation techniques, in order to maximise combine performances it is necessary
to adopt all the interventions to achieve uniform hemp height.
Key words: hemp, seed, harvest, combines.
INTRODUZIONE
Il rilancio della canapa da fibra in Italia
presuppone un forte ammodernamento della coltura, che dovrà essere organizzata per
filiere (tessile, cartaria, biomassa, seme,
ecc.). Fra queste, quella tessile, per il maggiore valore aggiunto, assumerà un ruolo
molto probabilmente trainante rispetto alle
altre. Inoltre, va anche sottolineato che nel
nostro Paese opera una industria tessile
d’avanguardia, ora costretta ad importare fibre di canapa dall’Est-Europa e dall’Asia e
per le quali lamenta la scarsa qualità specie
per disomogeneità del prodotto fra ed entro
lotti.
Storicamente, la fibra prodotta in Italia era
di eccellente qualità, grazie alla vocazione
Autore corrispondente: De Zanche C.
Dipartimento Territorio e Sistemi Agroforestali
AGRIPOLIS, Via Romea, 16, 35020 Legnaro
Padova, Italia - Tel. (049) 8272727 - Fax (049)
8272774.
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
44 Agroindustria / Aprile 2002
degli ambienti di coltivazione, alle varietà
locali selezionate e alle tecniche di coltivazione e di macerazione adottate.
L’abbandono della coltura, dopo un lento
declino dal dopoguerra agli anni sessanta, è
stato provocato oltre che dall’avvento delle
fibre sintetiche anche dalla mancanza di una
adeguata meccanizzazione. Di fatto, la coltura richiedeva un notevole impiego di manodopera (1300-1350 h ha -1) (Bignardi,
1987), soprattutto per la raccolta, per la lavorazione delle bacchette (preparazione di
manipoli, sbattitura, impilatura, tiratura,
ecc.) e per la macerazione rustica.
Oggi vi sono notevoli prospettive per la
reintroduzione della coltura grazie alla grande potenzialità, a livello internazionale, delle fibre naturali sia per usi tessili, sia per impieghi moderni (materiali compositi,
componentistica per auto, bioedilizia, ecc.).
Ovviamente, non si potrà prescindere dalla
competitività economica della coltura nei
confronti di altre. In tale contesto la meccanizzazione della raccolta del seme riveste
grande importanza perché contribuisce ad
abbattere i costi della fase agricola di tutte
le possibili filiere. In merito, va evidenziato
che il seme reperibile all’estero costa molto
(4 €kg-1), inoltre è relativo quasi esclusivamente a varietà monoiche idonee per usi
cartari piuttosto che tessili.
Nei Paesi in cui la coltura è diffusa, la raccolta del seme viene realizzata con tecniche
diverse. Più in particolare, nei Paesi dell’Est
(Polonia, Ungheria e Romania) si ricorre sovente a tecniche in abbinamento con la raccolta delle fibre, tramite macchine appositamente costruite allo scopo come le
mietilegatrici, le falcia-andanatrici, le carica-legatrici di andane e le trebbiatrici stazionarie o mobili (Bocsa, 1999, comunicazione personale; Kozlowski, 1999, comunicazione personale). Si tratta di attrezzature
che richiedono comunque un impiego elevato di manodopera per la gestione del cantiere e per la movimentazione delle piante
in fasci.
In Francia, dove le varietà (quasi tutte
monoiche) sono di taglia più ridotta rispetto
a quelle italiane (dioiche), si è imposta la
mietitrebbiatura con macchine tradizionali
ad una altezza di taglio di 1.5 m. Tale tecnologia risulta essere una alternativa alla
trebbiatura in andana effettuata mediante una
particolare macchina sgranatrice (Van der
Werf, 1992; Bassetti et al., 1998).
Per le condizioni italiane, la raccolta dei
semi con mietitrebbiatrice, rispetto all’adozione di altri cantieri più complessi, rappresenta la linea di meccanizzazione più
proponibile soprattutto perché tali macchine sono largamente utilizzate e diffuse.
I primi tentativi di raccolta meccanizzata
delle nostre varietà dioiche sono stati effettuati nel 1998 dall’Istituto Sperimentale per
le Colture Industriali (ISCI), presso la Sezione operativa periferica di Osimo (AN).
In tale annata su colture di “Fibranova” e
“Carmagnola” sono state provate tre mietitrebbiatrici (New Holland TR85, New
Holland 80-70 e New Holland 1550). Tali
prove hanno messo subito in evidenza la
notevole complessità del problema e la impossibilità di eseguire l’operazione senza
adattamenti della raccoglitrice alle peculiari
caratteristiche della coltivazione. Infatti gli
inconvenienti incontrati sono stati i seguenti: 1) il taglio delle piante è risultato difficoltoso a causa del diametro piuttosto elevato degli steli, dovuto anche al basso investimento; 2) il materiale fibroso attorcigliandosi sugli organi rotanti della raccoglitrice
(aspo, rulli, flange) ne bloccava i movimenti; 3) l’alto volume di biomassa provocava
elevate sollecitazioni nella macchina; 4) la
notevole massa fibrosa causava frequenti
Figura 1 - Mietitrebbiatrice modificata Laverda M84.
Figure 1 - The Laverda M84 self-propelled modified combine.
intasamenti a monte del battitore, costringendo la raccoglitrice a soste forzate per il
suo smaltimento; 5) impiego di lavoro manuale per la pulizia degli organi della macchina dopo breve periodo di impiego.
Sulla base dell’esperienza maturata, la
sperimentazione negli anni successivi ha
avuto come obiettivo la verifica della possibilità di meccanizzare la raccolta del seme
di canapa con due diverse tipologie di macchine raccoglitrici: entrambe utilizzano
mietitrebbiatrici in commercio, ma nel primo caso la macchina è costruttivamente semplice e fortemente modificata nell’apparato
di taglio; nel secondo invece si impiegano
semoventi più complesse e relativamente
poco modificate.
MATERIALI E METODI
Le sperimentazioni hanno coperto un
periodo di 3 stagioni di raccolta dal 1999 al
2001.
Nel 1999 le prove si sono svolte presso
l’azienda della sezione operativa periferica
di Osimo dell’ISCI, su una superficie pianeggiante di circa 6000 m2. È stata seminata la varietà dioica “Fibranova” a metà aprile, impiegando una seminatrice a righe e disponendo il seme su file distanziate di 50 cm
l’una dall’altra. L’emergenza delle plantule,
avvenuta a distanza di una settimana dalla
semina, è stata abbastanza regolare ed uniforme. La distanza fra le piante sulla fila, in
media, è stata di 8 cm, pari ad un investimento di 25 piante m-2. La coltivazione è
stata condotta in asciutto, senza alcun bisogno di effettuare né trattamenti di diserbo,
né trattamenti di difesa delle piante. La fioritura è avvenuta a fine luglio, mentre il seme
è maturato alla fine di settembre. Le piante
hanno raggiunto una altezza media di 3.4 m,
restando erette per tutto il ciclo colturale.
Alla raccolta, effettuata all’inizio di ottobre,
la coltivazione presentava una certa disformità per l’altezza delle piante che in alcune
zone del campo era sensibilmente al di sotto della media. Le piante presentavano steli con diametro basale di 14-16 mm, senza
Tabella 1 - Alcuni dati riassuntivi delle condizioni di raccolta della canapa nel secondo anno.
Table 1 - Some data of crop characteristics in 2000
umidità pianta intera (%)
distanze tra le file (cm)
distanze sulla fila di piante femminili (cm):
media
minima
massima
deviazione standard
-2
investimento (piante m )
altezza piante (cm):
media
minima
massima
deviazione standard
67
45
38
2
241
± 49
6.1
209
50
360
± 61
ramificazioni; le infruttescenze erano portate quasi esclusivamente negli ultimi
20-25 cm dello stelo; l’umidità della pianta
era del 59%, mentre quella del seme era del
30-35%.
Nell’annata 2000, in altri appezzamenti,
sempre nella stessa località, le condizioni
specifiche della coltura erano sensibilmente
diverse con un investimento medio finale di
6 piante m-2 dovuto alla scarsa emergenza
delle piante sulla fila e, dato più importante
per l’operazione di raccolta, con elevata
disformità nell’altezza delle piante stesse,
con minimi di 50 cm fino a massimi di 3.6 m
(Tab. 1). Il ridotto investimento delle piante
femminili alla raccolta è da ascriversi prevalentemente alle difficili condizioni meteorologiche del periodo tra la semina e l’emergenza.
Nel 2001 le sperimentazioni si sono svolte a Savarna (RA) in un appezzamento della
superficie di circa 1 ha condotto dall’az. sperimentale “M. Marani” di Ravenna. La varietà coltivata è stata CS con investimenti di
30.6 piante m-2 e distanze tra le file di 45 cm.
La semina è stata effettuata con seminatrice
pneumatica il 26 aprile 2001 su terreno affinato e la concimazione si è limitata alla
somministrazione in copertura di 100 kg ha-1
di azoto (Tab. 2).
L’attività si è articolata nel seguente modo:
- prove funzionali di raccolta del seme di
canapa con mietitrebbiatrice modificata
(anni 1999 e 2000);
- prove di raccolta con mietitrebbiatrici convenzionali nel 2001.
La macchina modificata è una Laverda
M84 (Fig. 1) dotata di battitore a flusso
trasversale (Di Candilo et al., 2000). Le
modifiche apportate hanno interessato
l’intera piattaforma di taglio e il nastro trasportatore. Più in particolare, sono stati
effettuati i seguenti interventi:
- la barra falciante è stata inserita in una
struttura metallica di sostegno, fissata sulle
fiancate della testata originaria, con un rinvio ad angolo della trasmissione del moto
agli elementi oscillanti. L’altezza di taglio
è stata quindi resa variabile e regolabile
da 1.00 a 1.80 m da terra. È stato poi mantenuto lo stesso sistema di sollevamento
con martinetto idraulico a doppio effetto
che consentiva alla piattaforma così modificata di aumentare l’altezza di ulteriori
80 cm. L’aumento dell’altezza di taglio
rappresenta un’esigenza imprescindibile
per la funzionalità degli organi battitori
essendo così meno disturbati dagli
intrecciamenti della vegetazione;
- lo spazio creatosi tra la barra falciante e
la piattaforma convogliatrice è stato occupato da un pannello di plexiglas con
telaio in metallo per permettere all’operatore la necessaria visibilità anteriore;
- gli elementi a denti flessibili dell’aspo
abbattitore sono stati sostituiti con tavole
trasversali di legno parallele alla barra della
Agroindustria / Aprile 2002 45
separatore rotativo. Il battitore trasversale a
8 spranghe ha una lunghezza di 1.3 m e un
diametro di 603 mm; il controbattitore avvolge il battitore per 111° e ha una superficie di 0.79 m2; il post-battitore è a 4 pale,
mentre il separatore rotativo, posto a monte
prima degli scuotipaglia, ha un diametro di
0.59 m, una larghezza di 1.3 m ed è composto 10 traverse con 7 denti ciascuna. Gli
scuotipaglia sono 5 con 5 gradini e sviluppano una superficie di 4.36 m2.
Figura 2 - Mietitrebbiatrice Laverda 3890 con testata specifica da girasole.
Figure 2 - The Laverda 3890 self-propelled combine with 10-row sunflower picker.
larghezza di circa 10 cm e ridotti ad un
numero di tre. L’inserimento delle tavole
in sostituzione dei pettini e la riduzione
del loro numero è volto a limitare il contatto tra gli organi rotanti e la vegetazione. La velocità e la posizione dell’aspo
sono regolabili tramite sistemi idraulici dal
posto di guida.
Le mietitrebbiatrici commerciali utilizzate sono Laverda 3890 e New Holland AL59.
La prima (Fig. 2) ha un motore della potenza di 147 kW ed è dotata di battitore trasversale a 8 spranghe della lunghezza di
1600 mm e diametro di 600 mm, un controbattitore a 12 spranghe con superficie di
0.99 m2 e angolo di avvolgimento di 106° e
un organo post-battitore a 4 pale. La separazione della paglia avviene tramite 6 scuotipaglia a 5 elementi per una superficie totale di separazione pari a 7.94 m2, mentre l’apparato di pulizia con vagli ha una superficie
di 5.51 m2. La piattaforma di taglio è specifica per la raccolta del girasole. La motivazione di questa scelta risiede nella più regolare e omogenea alimentazione del battitore
e maggior accuratezza nel taglio rispetto alla
barra convenzionale da frumento. La barra
è sprovvista di aspo, ha una larghezza di lavoro di 4.5 m ed è predisposta per la raccolta di 10 file. Gli elementi spartitori sono a
piatti con bordi rialzati e con punte carenate,
i convogliatori longitudinali sono costituiti
da coppie di catene rivestite con nastro in
gomma con la funzione di trasportare gli steli
al convogliatore trasversale a coclee contrapposte. Un dispositivo di taglio degli steli,
costituito da una serie di dischi controrotanti
dentati, è inserito nella parte inferiore dei
convogliatori. Infine un imboccatore centrale
a pale convoglia il prodotto nel gruppo
elevatore e di alimentazione del battitore.
La New Holland AL59 (Fig.3) è una
mietitrebbiatrice con sistema di autolivellamento integrale, in grado cioè di mantenere l’assetto del corpo trebbiante sia quando si opera secondo le linee di livello che in
quelle di massima pendenza. Questo modello
nelle prove è stato scelto con la finalità di
innalzare il livello di taglio per consentire
l’ingresso nell’apparato trebbiante solamente
della parte terminale dello stelo evitando
fenomeni di ingolfamento. Allo scopo è stato sfruttata la capacità di autolivellamento
longitudinale abbassando completamente i
martinetti dell’assale posteriore. La
mietitrebbia ha una potenza di 168 kW ed è
equipaggiata con una testata falciante per
frumento della lunghezza di 5,18 m. L’aspo
conta 6 barre con denti elastici metallici e
ha un diametro di 1.07 m; il canale elevatore
è composto da un rullo di alimentazione a
diti retrattili e da catene portanti 28 spranghe. L’apparato trebbiante è composto dal
battitore, controbattitore, post-battitore e
Tabella 2 - Alcune caratteristiche della coltura relative all’anno di prova 2001.
Table 2 - Crop characteristics in 2001
Investimento alla semina (piante/m2)
Altezza piante (m)
Diametro mediano dello stelo (mm)
Produzione seme con campionamento manuale (t/ha)
46 Agroindustria / Aprile 2002
30.6
3.29
10.3
1.06
RISULTATI
La mietitrebbiatrice modificata. Le condizioni vegetative della canapa in cui la macchina si è trovata ad operare sono state molto variabili nei due anni di prova, per effetto
sia delle diverse varietà e delle tecniche di
coltivazione, sia dell’andamento climatico.
Nel 1999, la raccoglitrice Laverda M84
modificata ha evidenziato complessivamente
una sufficiente funzionalità ed una buona
capacità di lavoro; la qualità del lavoro è parsa buona con raccolta di acheni relativamente
puliti frammisti con semi verdi e brattee a
causa dell’umidità elevata del prodotto. Probabilmente, tale tipo di problema può essere
superato con un trattamento disseccante delle
piante, a patto che lo stesso trattamento non
faciliti la caduta del seme.
Maggiori difficoltà sono state riscontrate
relativamente alle perdite dovute sia alla
mancata raccolta di piante, a causa della loro
bassa statura, sia alla tipologia della barra
falciante e sia al fatto che circa l’8% dei semi
venivano dirottati nel raccoglitore dei semi
minuti.
Nell’anno successivo, la stessa macchina
ha operato su canapa caratterizzata da un ridotto investimento di piante femminili alla
raccolta da ascriversi prevalentemente alle
difficili condizioni meteorologiche del periodo tra la semina e l’emergenza.
Considerando che l’altezza minima di lavoro della barra è di 1.7 m tale difformità è
stata la causa del ridotto quantitativo di
semente raccolta dal momento che solamente
poco più della metà delle piante sono state
interessate dalla mietitrebbiatrice, come dimostra la tabella 3. In particolare non sono
state raccolte le piante con altezza inferiore
a quella della barra di taglio che rappresentavano il 26% della popolazione, mentre raccolte in maniera approssimativa quelle la cui
zona fruttifera cadeva proprio in corrispondenza con la barra (21%). La rimanente parte è stata raccolta regolarmente, ma occorre
precisare come le taglie più alte fra questa
apportino maggiore quantità di vegetazione
e di stelo all’interno della macchina aumentando il rischio di ingolfamenti e rotture.
La mietitrebbiatrice tradizionale. La
Laverda 3890 equipaggiata con testata da
girasole è stata impiegata nella raccolta di
una superficie di circa 700 m2 al termine dei
quali è stata bloccata per avvolgimenti della
fibra sugli organi rotanti. La capacità effetti-
Tabella 3 - Percentuale di piante interessate dalla raccolta
Table 3 - Percentage of harvested plants
altezza minima di taglio della barra (cm)
% piante non raccolte
% piante parzialmente raccolte
% piante totalmente raccolte
va di lavoro limitatamente all’area lavorata è
stata di 1.1 ha h-1 con velocità di avanzamento di 2.4 km h -1 . La causa degli
ingolfamenti è da ricercare soprattutto nella
forma aggressiva del post-battitore, che ha
risentito più degli altri di questo inconveniente. Inoltre, essendo l’altezza di taglio di
1.25 m, gran parte della vegetazione veniva
immessa nel gruppo trebbiante aumentando
il rischio di ingolfamento.
Nonostante questo inconveniente, peraltro previsto, durante il funzionamento si è
potuto apprezzare la buona prestazione della piattaforma di taglio che è stata in grado
di tagliare nettamente gli steli e garantire una
buona funzionalità degli apparati di alimentazione inserendo gli steli orientati in modo
uniforme. Questo fatto, abbinato alla particolare conformazione degli elementi
spartitori, ha avuto come conseguenza
l’ottenimento di limitate perdite alla testata
quantificabili a valori inferiori al 5%.
La seconda mietitrebbiatrice (New
Holland AL59) ha raccolto la rimanente superficie dell’appezzamento con continuità e
senza apprezzabili perditempi. La velocità
media di avanzamento è stata di 1.25 km h-1
con una capacità effettiva di lavoro di
0.65 ha h-1; l’altezza di taglio è di 1.95 m.
Il prodotto raccolto è stato di 0.69 t.
Al termine della raccolta la macchina presentava evidenti intrecciamenti, ma tali da
170
26
21
53
non comprometterne la funzionalità interna.
Tali zone, tutte interessate da movimenti
rotatori, come assali anteriori, coclea
convogliatrice trasversale, rullo di alimentazione, aspo, possono essere facilmente
schermate con opportune lievi modifiche in
maniera tale da impedire o limitare il contatto con la fibra. La mancanza di intasamenti
all’interno del complesso trebbiante è dovuta in parte alla minor massa vegetativa entrante (inferiore di circa il 40% rispetto alla
soluzione precedente), in parte alla conformazione del post-battitore che ha un maggior diametro e pale meno aggressive, in
parte ancora alla presenza del separatore
rotativo che in qualche maniera sembra possa
aver tenuto puliti gli apparati trebbianti
precedenti.
Per contro la piattaforma di taglio ha fatto
registrare notevoli perdite di prodotto legate soprattutto al mancato convogliamento degli steli alla coclea e alla conseguente caduta a terra. L’entità delle perdite alla testata sono
state consistenti e oscillanti dal 22 al 26%.
Per entrambe le mietitrebbiatrici le perdite a valle dell’apparato trebbiante e di pulizia sono rimaste entro i limiti caratteristici
della raccolta meccanizzata e cioè inferiori
al 3%.
L’analisi della germinabilità evidenzia
come i semi derivanti dalla mietitrebbiatrice
abbiano valori oscillanti attorno al 60%,
Figura 3 - Mietitrebbiatrice autolivallante New Holland AL59.
Figure 3 - The New Holland AL 59 self-propelled hillside combine.
molto inferiori rispetto a quelli raccolti a
mano (90%). Questa ridotta germinabilità
sembra essere stata causata sia da
microlesioni a livello superficiale, probabilmente derivanti dall’azione energica del
battitore, sia dal fatto che tra la raccolta e
l’analisi è intercorso un periodo di tempo
superiore a 24 ore che potrebbe avere innescato fermentazioni anaerobiche a scapito
della capacità germinativa.
DISCUSSIONE DEI RISULTATI E
CONCLUSIONI
Per una raccolta meccanica di buona qualità è fondamentale l’uniformità di sviluppo
delle piante, da ricercare attraverso l’impiego di sementi caratterizzate da elevata purezza, ottima germinabilità e alto vigore
germinativo, tali da ottenere emergenze
pronte ed uniformi. Inoltre, allo scopo di ridurre la variabilità indotta dall’ambiente è
molto importante adottare idonee tecniche
colturali. A quest’ultimo riguardo assume
grande importanza la preparazione del terreno e l’impianto da eseguire nelle epoche e
con le modalità appropriate. Se necessario,
il terreno va innanzitutto livellato e sistemato superficialmente, sia per migliorare lo
sgrondo delle acque in eccesso (la canapa,
più di altre piante, risente negativamente dei
ristagni di umidità, bloccando la crescita ed
ingiallendo), sia per migliorare la qualità del
lavoro delle macchine impiegate per le successive operazioni colturali e la raccolta. Al
momento della semina il terreno non deve
presentare zollosità troppo elevata, che ostacolerebbe una regolare deposizione del seme
ed una uniforme profondità di semina, con
effetti negativi sulla emergenza. Va sottolineato, in particolare, che la disformità delle
nascite si ripercuote anche sul successivo
sviluppo delle piante, fino a tradursi in una
maggiore scalarità di maturazione del seme.
Inoltre, è molto importante contenere il diametro degli steli (al fine di favorire l’azione
di taglio). Al riguardo, è consigliabile adottare distanze ravvicinate fra le file (non più
di 50 cm) ed investimenti non inferiori alle
20-25 piante m-2, corrispondenti a distanze
sulla fila non superiori agli 8-10 cm. In tali
condizioni il diametro basale degli steli difficilmente supererà i 14-16 mm ed inoltre,
altro fatto molto importante, gli steli non presenteranno ramificazioni che sono responsabili di incremento della scalarità di
maturazione del seme.
Nelle coltivazioni da seme è importante
contenere anche l’altezza delle piante, tale
da ridurre la massa fibrosa in transito all’interno della raccoglitrice. A quest’ultimo scopo, nel 1999 è stata effettuata una prova di
confronto fra successive epoche di semina
in combinazione con trattamenti chimici
delle piante con prodotti nanizzanti
(Cycocel, Alar 85), con prodotti ormonici
“Ethrel” e con la cimatura delle piante stesse. I risultati ottenuti hanno evidenziato che,
Agroindustria / Aprile 2002 47
fra le tesi a confronto, solo l’epoca di semina
notevolmente ritardata (metà giugno) ed i
trattamenti ripetuti con Ethrel hanno ridotto
sensibilmente l’altezza delle piante (1.7-1.8
contro 3-4 metri delle altre tesi).
La canapa per sua natura (fecondazione
allogama obbligata) presenta una certa
disformità genetica fra le piante, la quale può
essere fortemente aggravata da fallanze, irregolarità di semina, diverso grado di ramificazione delle piante, ecc. (Venturi, 1970).
Ai fini della meccanizzazione della raccolta
del seme è fondamentale ridurre al minimo
tale variabilità, sia operando una selezione
costante delle piante portasemi in modo da
uniformare il più possibile la varietà rispetto ai caratteri morfologici e biologici delle
piante (selezione conservativa), sia attraverso l’adozione di tecniche colturali
appropriate, in grado di ridurre quanto più
possibile l’eterogeneità di sviluppo delle
piante e la scalarità di maturazione del seme
indotte dall’ambiente.
Dal punto di vista meccanico, le esperienze effettuate con mietitrebbiatrici modificate nella piattaforma di taglio indicano che è
possibile meccanizzare la raccolta del seme
anche per le varietà dioiche. I vantaggi di
tale soluzione consistono nel contenimento
dei costi di investimento e nella gestione di
macchine già largamente utilizzate e diffuse. I maggiori limiti sono legati alla possibilità di effettuare in azienda rimaneggiamenti
consistenti della testata raccoglitrice e nella
limitata potenza disponibile a fronte di raccolte di masse elevate in ristretti periodi utili.
Nel caso di adozione di questa alternativa
le raccomandazioni che derivano dalla
sperimentazioni sono le seguenti:
- barra falciante in posizione fortemente
avanzata e ad altezza di taglio variabile
per adattarsi a qualsiasi condizione;
- aspo abbattitore di grande diametro
(1.8-2.0 m) con 3-4 barre in legno e posto
in posizione avanzata per permettere un
migliore convogliamento del prodotto;
- inserimento di una seconda barra di taglio
per tagliare subito dopo gli steli al piede e
sotto l’inserzione delle infruttescenze.
48 Agroindustria / Aprile 2002
In tal modo, la parte apicale della pianta
verrà convogliata verso il battitore, mentre la parte basale dello stelo (circa 2/3)
sarà lasciata in andane sul terreno. Dopo
essiccamento in campo, gli steli potranno
essere rotoimballati e, quindi, destinati alla
produzione di cellulosa o alle corderie e
saccherie. Sarà possibile così incrementare il reddito della coltivazione e lasciare
il terreno pulito da resti della coltura, fra
l’altro non facilmente trinciabili data la
loro natura fibrosa.
L’alternativa delle macchine di elevata potenza è praticabile e spesso economica perché il loro costo viene già ammortizzato dalla
raccolta delle principali colture e generalmente non sussiste una sovrapposizione nel
rispettivo periodo di raccolta.
Inoltre sono caratterizzate da maggiore
capacità di lavoro e offrono migliori garanzie di affidabilità. Sulla base dell’esperienza effettuata in campo e considerando quelle di altre realtà europee (Anonimo, 1995;
Bassetti et al., 1998) è possibile delineare
alcune considerazioni per guidare alla scelta della raccoglitrice ottimale:
- tutte le parti in rotazione e che possono
entrare in contatto con la fibra devono essere opportunamente schermate. Questo
è possibile con semplici deflettori o protezioni anche in materiale plastico,
attuabili in azienda e facilmente
asportabili;
- la piattaforma di taglio specifica per girasole è consigliata per le ridotte perdite e
per l’omogeneità di raccolta. Con testate
da frumento l’aspo deve essere avanzato
e sostituiti i denti con assi di legno per
evitare intrecciamenti nella fase di
abbattitura;
- il battitore trasversale deve essere accompagnato da dispositivi come il separatore
rotativo di elevato diametro; il battitore
trasversale potrebbe ridurre ulteriormente i rischi di intrecciamento e soprattutto
potrebbe limitare i danneggiamenti alla superficie del seme che ne compromettono
la germinabilità;
- il controbattitore ideale per il seme di ca-
napa è quello universale;
- la mietitrebbiatrice autolivellante integrale, quando disponibile, è ottimale per ridurre la fitomassa lavorata dal battitore e
quindi limitare i rischi di intasamento. La
macchina è ideale per la raccolta di grandi superfici;
- i trinciapaglia posteriori vanno asportati.
Durante il suo utilizzo infine andrebbero
consigliate le seguenti regolazioni:
- raccolta tardiva;
- altezza di taglio massima;
- velocità di avanzamento piuttosto elevata
per limitare la caduta di seme a terra;
- aspo avanzato e rotante a velocità adeguata
per abbattere le piante verso la barra di
taglio;
- battitore a basso regime di rotazione; ventilatore a velocità media;
- controllare periodicamente le zone più
sensibili all’intrecciamento;
- ventilare la granella subito dopo la raccolta per non ridurre la germinabilità dei
semi.
Ancora molto resta comunque da verificare nella continuazione della ricerca nei prossimi anni. Occorre provare, in particolare,
gli allestimenti già delineati focalizzando
l’attenzione sui problemi delle perdite a terra e dell’effetto della raccolta meccanica
sulla germinabilità del seme.
BIBLIOGRAFIA
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producteurs de chanvre.
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Mans, France, Agricultural University, Dept
of Agronomy, Wageningen, 30-31 July 1992.
Selezione, caratterizzazione ed impiego di ceppi batterici nella macerazione
controllata della canapa
Elena Tamburini, Mario Di Candilo1, Brunella Perito, Mario Polsinelli, Paolo Ranalli1, Giorgio Mastromei
Dipartimento di Biologia Animale e Genetica, Università di Firenze, Via Romana 17, 50125 Firenze, Italia.
1
Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia.
RIASSUNTO
Allo scopo di ottimizzare il processo di macerazione della canapa in acqua, sono stati selezionati
ceppi batterici, aerobi e anaerobi, dotati d’attività pectinolitica elevata e sono state effettuate prove
di macerazione, inoculando con ceppi selezionati. Sono state così individuate combinazioni di
microrganismi e condizioni di macerazione che consentono di diminuire i tempi del processo e,
allo stesso tempo, di migliorare la qualità della fibra prodotta. È stata inoltre effettuata per la prima
volta la caratterizzazione molecolare dei microrganismi pectinolitici anaerobi che operano la degradazione delle sostanze cementanti durante la macerazione della canapa in acqua.
Parole chiave: canapa, macerazione, microrganismi, Clostridium, Bacillus, 16S rDNA.
ABSTRACT
Selection, characterisation and utilization of selected bacterial strains in hemp water retting
In the traditional process of hemp water retting, depolymerization of pectic material is carried out
by naturally occurring bacteria. The retting step is a major limitation to efficient production of
hemp fibres and of a high quality end product. The retting affects fibre quality and should be
improved to increase the efficiency and the control of this process.
With the aim of improving hemp retting, we isolated several bacterial strains, both aerobic and
anaerobic, with a high pectinolytic activity. Hemp retting was tested in four small tanks: (1) with
the addition of anaerobic strain spores (L1-6 or C1-6), (2) with the addition of both aerobic (ROO-2A)
and anaerobic (L1-6) strain spores, (3) with the addition of aerobic strain spores (ROO-2A) and
continuous aeration of the water tank, (4) traditional retting without any bacterial inoculum (control).
The optimum retting time was the same in the control and aerated tanks. In aerobic retting, the end
product quality was low because of a brown colour of the fibres. The best result was obtained by
adding both aerobic and anaerobic strains. Under this condition optimum retting was achieved in
four days only and a high quality product was obtained. The same retting was achieved in 6 days
with anaerobic strain and in 12 days in the control tank.
So far, identification of the microbial population during tank retting has been based only on phenotypic
studies (Donaghy et al., 1990). The pectinolytic anaerobic bacteria, involved in water retting, were
classified as belonging to two single Clostridium species (C. felsineum and C. acetobutylicum).
In this study, we performed the first systematic characterisation of anaerobic pectinolytic bacteria
involved in hemp water retting by using molecular techniques. The pectinolytic isolates were divided
into five groups by ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis). The 16S rDNA of
at least one strain for each ARDRA group was sequenced. This analysis showed that the bacteria
involved in hemp water retting belong to at least four different Clostridium species.
Key Words: hemp, retting, microrganism, Clostridium, Bacillus, 16S rDNA.
INTRODUZIONE
La produzione di tiglio di canapa per scopo tessile impiega le fibre floematiche dello
stelo delle piante. Un passaggio fondamentale in questa produzione è la macerazione
che porta alla liberazione delle fibre corticali
dagli altri tessuti a seguito della degradazione delle sostanze pectiche, costituenti principali della lamella mediana della parete
cellulare. Le pectine sono polisaccaridi comAutore corrispondente: Mastromei G.
Dipartimento di Biologia Animale e Genetica,
Università di Firenze, Via Romana 17, 50125
Firenze, Italia - Tel. (055) 2288240 - Fax (055)
2288250.
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
plessi composti principalmente da catene di
galatturonato, parzialmente metilate.
Nel corso degli anni sono state adottate
diverse strategie di macerazione: 1) macerazione meccanica, ovvero la separazione fisica delle fibre dalle bacchette; 2) macerazione chimica, che impiega sostanze che
degradano selettivamente i componenti della lamella mediana; 3) macerazione biochimica, che impiega miscele di enzimi pectinolitici di diversa composizione; 4) macerazione microbiologica, operata dall’azione
sinergica di differenti enzimi extracellulari
(pectina-liasi, metilesterasi, poligalatturonasi
e pectato-liasi) prodotti da microrganismi,
funghi o batteri, naturalmente presenti sulle
piante o nel suolo (Donaghy et al., 1990;
Hugouvieux et al., 1996).
Ad oggi, il processo più promettente per
un rilancio della produzione di filato di canapa a scopo tessile sembra essere la
macerazione microbiologica. La degradazione enzimatica presenta, infatti, elevati costi
energetici da imputare alle temperature elevate (intorno a 45°C) alle quali deve essere
svolto il processo. Su scala industriale, non
risultano applicabili neppure la macerazione
meccanica, che produce una fibra di qualità
scadente ed è difficilmente standardizzabile,
né la macerazione chimica per la difficoltà
ad individuare sostanze che non compromettano la qualità del prodotto.
La macerazione microbiologica può essere
attuata mediante due diversi procedimenti:
la macerazione in acqua o in vasca (water
retting) e la macerazione alla rugiada (dew
retting). Metodiche analoghe vengono impiegate anche per la macerazione del lino.
Il processo in acqua viene effettuato nei
maceri, vasche di notevoli dimensioni, colme di acqua stagnante dove vengono immersi gli steli delle piante. Durante la prima fase
del processo, i composti solubili presenti
negli steli (zuccheri, sostanze azotate ecc.),
passano in soluzione, permettendo lo sviluppo di una comunità batterica. La
penetrazione d’acqua all’interno degli steli
causa il distacco della corteccia, consentendo l’ingresso dei batteri macerativi che demoliscono le sostanze pectiche cementanti
le fibre (Donaghy et al., 1990). Il processo
macerativo è inizialmente portato avanti da
batteri aerobi; allorché l’aerazione del macero si fa più scarsa, divengono predominanti i batteri anaerobi. I principali agenti
degradatori aerobi sono stati attribuiti al genere Bacillus (spp. subtilis, cereus e
licheniformis); mentre gli agenti degradatori
anaerobi al genere Clostridium (spp.
acetobutylicum e felsineum) (Donaghy et al.,
1990).
Nella tecnica alla rugiada gli steli delle
piante sono lasciati sul terreno dopo la
battitura. La macerazione viene operata dalle pectinasi prodotte principalmente da funghi filamentosi presenti nel suolo o sulle
piante (Henriksson et al., 1997). Il processo
degradativo è facilitato dall’alternanza tra le
basse temperature e l’umidità della notte e
le alte temperature e l’ambiente asciutto del
giorno.
Tradizionalmente, nell’area mediterranea,
veniva impiegata la metodica di macerazione
in vasca. Il rilancio della produzione di fibra
Agroindustria / Aprile 2002 49
di canapa in Italia dovrebbe basarsi proprio
su questo processo, che, oltre ad essere più
adeguato al nostro clima, produce un filato
di qualità superiore. Esso risulta, inoltre,
maggiormente controllabile e produce una
fibra più uniforme. I batteri svolgono un ruolo chiave nella biodegradazione del materiale pectico e le proprietà dei microrganismi
degradatori influenzano sia l’andamento del
processo che la qualità del prodotto finale.
L’utilizzo di ceppi opportunamente selezionati, come inoculi nelle vasche, potrebbe rappresentare una valida strategia per migliorare
la tecnica tradizionale di macerazione in acqua, rendendola indipendente dai batteri
residenti.
Con lo scopo di ottimizzare il processo di
macerazione della canapa in acqua, nel presente lavoro, sono stati selezionati ceppi
batterici aerobi e anaerobi dotati di attività
pectinolitica elevata. Sono state poi effettuate
prove di laboratorio di macerazione, impiegando spore dei ceppi selezionati. I risultati
di tali esperimenti hanno permesso di individuare combinazioni di microrganismi e
condizioni di macerazione che consentono
di diminuire i tempi del processo e, allo stesso tempo, di aumentare la qualità della fibra
prodotta.
In questo lavoro è stata inoltre svolta la
prima caratterizzazione molecolare, con tecniche basate sull’analisi del gene codificante il 16S rRNA (16S rDNA), dei microrganismi pectinolitici anaerobi che operano
la biodegradazione delle sostanze cementanti
durante la macerazione in acqua.
MATERIALI E METODI
Isolamento dei ceppi batterici. L’isolamento di ceppi batterici pectinolitici, aerobi
ed anaerobi, è stato effettuato a partire da
campioni di diversa provenienza (acqua di
maceri, canapa, lino e suolo). La selezione
delle spore dei ceppi sporigeni è stata effettuata mediante bollitura dei campioni per
5 minuti a 80°C. I ceppi aerobi sono stati
isolati su terreno massimo (0.5% estratto di
lievito, 0.5% pectone, 1% triptone) a 30°C.
I ceppi anaerobi sono stati isolati su terreno
massimo con la stessa composizione e aggiunta di 0.05% di cisteina e 2% di glucosio
in atmosfera di CO2 (Oxoid AnaeroGen kit
AN25) a 37°C.
I ceppi batterici pectinolitici sono stati
individuati facendo crescere su terreno massimo solido contenente 0.5% di pectina, al
termine della crescita le piastre sono state
inondate con una soluzione 1% di cetiltrimetil ammonio bromuro (Donaghy et al.,
1990). La comparsa di un alone chiaro intorno alla colonia indica la presenza di un’attività pectinolitica. Il ceppo tipo (T) di collezione Clostridium felsineum DSM 794T
(T = type strain) è stato impiegato come controllo.
Determinazione dell’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico. Tut50 Agroindustria / Aprile 2002
Tabella 1 - Attività pectinolitica su piastra dei ceppi anaerobi isolati.
Table 1 - Bacterial strains with pectinolytic activity on solid medium.
Campione
Letame
Frammenti di canapa e lino macerati
Liquido di macerazione di lino
Liquido di macerazione di canapa
TOTALE
ti i ceppi pectinolitici isolati, aerobi e
anaerobi, sono stati caratterizzati per l’attività di degradazione dell’acido
poligalatturonico. L’attività enzimatica è stata misurata, con il metodo DNS (Miller,
1959), sul sopranatante delle colture fatte
crescere in terreno massimo contenente 0.5%
di pectina. Nel caso di ceppi anaerobi il saggio è stato eseguito dopo 3 giorni di crescita
in anaerobiosi a 37°C, mentre, nel caso dei
ceppi aerobi, dopo 2 giorni di crescita a 30°C
in agitazione (250 rpm). Il ceppo tipo di collezione Clostridium felsineum DSM 794T è
stato impiegato come controllo.
Materiale vegetale. La canapa (Cannabis
sativa L. cv Fibranova), cresciuta ad Anzola
(Bologna), è stata raccolta una settimana circa dopo il punto medio di fioritura. La canapa verde è stata fatta seccare nel campo fino
a che il contenuto di acqua ha raggiunto circa il 10% e quindi è stata ridotta in balle,
queste sono state conservate al coperto e
dopo un periodo di due mesi sono state aperte
ed impiegate per gli esperimenti.
Prove di laboratorio di macerazione. Per
le prove di laboratorio sono state allestite
vasche di plastica colme d’acqua. Una delle
vasche non è stata inoculata con alcun ceppo (controllo). Sono state allestite vasche in
cui sono state mantenute condizioni
d’aerobiosi per tutto il processo, facendo
gorgogliare acqua mediante una pompa (vasche areate), e vasche non areate. Ogni vasca è stata inoculata con spore di differenti
ceppi (aerobi, anaerobi o in combinazione
mista, aerobi e anaerobi) precedentemente
selezionati per l’elevata attività pectinolitica.
In ogni vasca sono stati introdotti quattro
mazzi, ognuno di quattro steli, e sono stati
prelevati dopo tempi di macerazione diversi
(3, 6, 9 e 12 giorni). I fasci di fibre sono stati
N° Ceppi isolati
41
128
22
85
Ceppi con attività
276
120
6
44
22
48
analizzati valutandone le proprietà morfologiche e fisiche.
Analisi delle fibre. Dei campioni di fasci
di fibre ottenuti dalle prove di macerazione
in vasca sono stati valutati il colore, il grado
di separazione e la sofficità. È stata determinata la finezza delle fibre valutata come
rapporto peso/lunghezza.
Analisi del 16S rDNA. Per l’analisi del
16S rDNA il DNA totale è stato estratto con
il kit FastDNA (BIO 101) e il FastPrep
Instrument da cellule cresciute su terreno
solido. Il gene 16S rDNA è stato amplificato impiegando una coppia di primer universali (P0, GAG AGT TTG ATC CTG GCT
CAG [posizione 7-27] e P6, CTA CGG CTA
CCT TGT TAC GA [posizione 1514-1495].
La numerazione è riferita alla sequenza del
16S rDNA di Escherichia coli). L’avvenuta
amplificazione di un prodotto delle dimensioni attese (di 1507 pb) è stata verificata
mediante corsa elettroforetica su gel di
agarosio. Per l’analisi ARDRA (Amplified
Ribosomal DNA Restriction Analysis), il prodotto d’amplificazione così ottenuto è stato
trattato, in reazioni enzimatiche singole, con
i tre enzimi di restrizione Alu I, Rsa I e Hinf
I. I profili ARDRA così ottenuti sono stati
visualizzati mediante corsa elettroforetica su
gel di agarosio al 2.5%.
RISULTATI
Isolamento di ceppi pectinolitici anaerobi. Da campioni di diversa provenienza
sono stati selezionati 276 ceppi sporigeni
anaerobi (Tab. 1). Mediante saggio enzimatico su piastra sono stati individuati 120 ceppi
pectinolitici. È stata quindi misurata l’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico di tutti i ceppi pectinolitici. L’attività
è stata misurata sui sopranatanti di colture
Tabella 2 - Attività di degradazione dell’acido poligalatturonico. I risultati sono espressi in U.I.,
definite come mmoli di gruppi riducenti (il prodotto finale della reazione) rilasciati in un minuto a 45°C
per 1 ml di sopranatante. Le U.I. sono corrette per il peso umido delle colture.
Table 2 - Polygalacturonic acid degrading activity. Results are expressed in I.U., defined as mmol of
reducing groups (the reaction end product) produced after one minute at 45°C by 1 ml supernatant.
I.U. are divided by the culture wet weight.
N° di ceppi
C. felsineum DSM 794
7
19
25
23
46
T
Attività enzimatica
-1
U.I. mg cellule
0.03
0.1 - 0.2
0.031 - 0.09
0.02 - 0.03
0.01 - 0.019
< 0.01
Tabella 3 - Risultati di prove di laboratorio di macerazione. L’acqua delle vasche è stata inoculata con
spore di ceppi di Clostridium selezionati.
Table 3 - Retting in laboratory tanks, supplemented with different Clostridium strains.
Tipo di
macerazione
Temperatura
dell’acqua (°C)
Tempo di
macerazione
(giorni)
Sofficità delle
a
fibre (S)
Finezza delle
-1
fibre (g m )
Colore delle
fibre
20.2
6
5.0
0.030
Bianco
argentato
20.1
6
5.0
0.037
20.2
12
4.0
0.062
L1-6
C1-6
a
Controllo
Analisi visiva (1-5).
liquide cresciute a 37°C e in condizioni
d’anaerobiosi, per tre giorni in terreno massimo contenente 0.5% di pectina. Indagini
condotte su miscele enzimatiche di varie
composizioni sembrano dimostrare come la
capacità macerativa sia correlata con l’attività di degradazione della componente non
metilata della pectina (Zhang et al., 2000).
L’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico potrebbe dunque fornire indicazioni sulle potenzialità macerative dei ceppi
isolati. Questa analisi ha consentito di identificare 26 ceppi dotati di attività pectinolitica
superiore al controllo, il ceppo tipo di collezione della specie C. felsineum DSM 794T
(Tab. 2), (Mastromei et al., 2001).
Prove di laboratorio di macerazione con
inoculi di ceppi anaerobi. Sono state allestite prove preliminari di laboratorio di
macerazione in acqua; all’inizio del processo, l’acqua di ognuna delle vasca è stata inoculata con uno dei ceppi anaerobi selezionati, dotati di attività pectinolitica superiore
al controllo C. felsineum DSM 794T. Al termine della macerazione le fibre sono state
separate dagli steli manualmente e sottoposte a determinazione delle proprietà morfologiche, e fisiche.
Tra gli 11 ceppi batterici saggiati, due ceppi, L1-6 e C1-6, hanno fornito i migliori risultati. Nonostante la temperatura piuttosto
bassa dell’acqua delle vasche (20°C), il grado ottimale di macerazione è stato ottenuto
in soli 6 giorni, contro i 12 del controllo
(Tab. 3). Nel caso degli altri ceppi analizzati
il grado ottimale di macerazione veniva raggiunto in tempi superiori rispetto ai ceppi
L1-6 e C1-6, ma sempre inferiori rispetto al
controllo. Oltre a accelerare il processo, dimezzandone la durata, i due ceppi con capacità macerativa maggiore hanno prodotto
una fibra di qualità superiore rispetto al
Bianco
argentato
Grigio
controllo, più soffice, più sottile e di colore
chiaro (Tab. 3), (Di Candilo et al., 2000).
Isolamento di ceppi pectinolitici aerobi.
L’inoculo delle vasche con ceppi anaerobi
selezionati consente di diminuire i tempi di
macerazione e aumentare la qualità del prodotto. Tuttavia la germinazione delle spore
dei ceppi anaerobi richiede l’istaurarsi di
condizioni di anaerobiosi nel macero, che si
realizzano solo dopo una fase di accrescimento di batteri aerobi. La selezione di ceppi aerobi, dotati di attività pectinolitica elevata, potrebbe permettere un ulteriore miglioramento e accelerazione del processo.
L’impiego combinato di ceppi (aerobi e/o
anaerobi), opportunamente selezionati, potrebbe permettere di ottenere un miglior controllo sul processo e una qualità della fibra
più uniforme.
Da campioni d’acqua di macerazione di
canapa provenienti da maceri con diversa
localizzazione geografica (Tab. 4) sono stati isolati un totale di 123 ceppi. Tra gli isolati sono stati individuati 25 ceppi pectinolitici,
mediante saggio enzimatico su piastra. Per
tutti i ceppi pectinolitici aerobi è stata misurata l’attività di degradazione dell’acido
poligalatturonico sui sopranatanti di colture
liquide cresciute per due giorni a 30°C in
terreno massimo contenente 0.5% di pectina.
Tra tutti i ceppi isolati il ceppo ROO-2A si è
dimostrato quello dotato di attività
pectinolitica maggiore. La determinazione
della sequenza parziale del 16S rDNA ha
permesso di attribuire il ceppo ROO-2A al
genere Bacillus.
Prove di laboratorio di macerazione di
canapa con inoculi di ceppi aerobi ed
anaerobi. Sono state allestite prove di laboratorio di macerazione in vasca in modo da
confrontare quattro diverse condizioni di
macerazione; all’inizio della macerazione
sono state inoculate nell’acqua delle vasche
spore di un ceppo anaerobio (L1-6 o C1-6)
oppure di un ceppo aerobio (ROO-2A) e di
un ceppo anaerobio (L1-6). Nella terza vasca sono state mantenute condizioni di
areazione per tutto il processo e l’acqua della vasca è stata inoculata con spore del ceppo aerobio ROO-2A. Il controllo dell’esperimento è consistito in una vasca senza alcun inoculo in cui si è operata una
macerazione tradizionale.
Non è stato rivelata alcuna accelerazione
della macerazione, rispetto alla vasca di controllo, quando il processo è stato effettuato
in condizioni di areazione continua e inoculo di un ceppo aerobio. La fibra ottenuta è
inoltre risultata scadente presentando, al termine del processo, una vistosa colorazione
bruna. I migliori risultati sono stati ottenuti
con l’inoculo combinato di un aerobio e di
uno anaerobio; in queste condizioni il grado
ottimale di macerazione è stato raggiunto
dopo solo quattro giorni, contro i 12 del controllo o i 6 della vasca inoculata con il solo
ceppo anaerobio.
Caratterizzazione molecolare dei ceppi
anaerobi pectinolitici. I 122 ceppi anaerobi
pectinolitici isolati sono stati caratterizzati
mediante ARDRA. L’ARDRA è una metodica rapida e riproducibile che consente la
tipizzazione di ceppi batterici, ovvero permette di suddividere degli isolati batterici in
più gruppi omogenei, che spesso corrispondono a specie batteriche (Vaneechoutte et al.,
1992).
L’analisi ARDRA con gli enzimi di restrizione Alu I, Rsa I e Hinf I ha consentito di
suddividere i 120 isolati in 5 gruppi, ciascuno contenente isolati con lo stesso profilo
con i tre enzimi (Fig. 1). Il gruppo ARDRA
C è risultato essere il più popolato raccogliendo l’86% degli isolati. I 26 ceppi dotati
di attività pectinolitica superiore al controllo (> 0.03 U.I. mg-1 di cellule) sono stati raggruppati in 3 gruppi ARDRA (Fig. 2).
Tabella 4 - Ceppi aerobi isolati da acqua di maceri di diversa provenienza.
Table 4 - Aerobic strains isolated from retting tank water from different areas.
Provenienza
N° Ceppi isolati
Ceppi con attività
pectinolitica
Nadlac, Romania
Nagylak, Ungheria
67
56
18
7
TOTALE
123
25
Figura 1 - Distribuzione dei ceppi pectinolitici
nei gruppi ARDRA.
Figure 1 - Distribution of the pectinolytic
strains in the 5 ARDRA groups.
Agroindustria / Aprile 2002 51
rispetto ad altre specie di Clostridium, di
6 ceppi pectinolitici rappresentativi dei
5 gruppi individuati con l’analisi ARDRA
(Fig. 3).
Figura 2 - Distribuzione nei gruppi ARDRA dei
ceppi con attività pectinolitica superiore al
controllo (C. felsineum DSM 794T).
Figure 2 - Distribution of the strains with
pectinolytic activity higher than C. felsineum
DSM 794T in the ARDRA groups.
È stata quindi determinata la sequenza
nucleotidica del 16S rDNA di almeno un rappresentante di ciascun gruppo ARDRA. Nel
caso del gruppo ARDRA A è stato sequenziato il 16S rDNA dei due ceppi, L1-6 e
C1-6, impiegati nelle prove di macerazione
in vasca, mentre nel caso del gruppo C è stata
determinata la sequenza nucleotidica del 16S
rDNA di 4 ceppi. Il risultato del confronto
delle sequenze determinate con quelle depositate in banca dati ha permesso di ricostruire
l’albero filogenetico che mostra la posizione,
Figura 3 - Albero filogenetico basato sul
confronto delle sequenze dei 16S rDNA che
mostra la posizione rispetto ad altre specie di
Clostridium di 5 ceppi pectinolitici
rappresentativi dei 5 gruppi individuati con
l’analisi ARDRA.
Figure 3 - Phylogenetic tree of the 16S rRNA
gene sequences of 5 pectinolytic strains
representing the 5 ARDRA groups and of related
species of Clostridium.
52 Agroindustria / Aprile 2002
DISCUSSIONE
Per secoli la macerazione biologica in acqua della canapa è avvenuta ad opera di popolazioni microbiche naturali, presenti nel
terreno e sulle piante. La macerazione è indubbiamente il passaggio che più limita la
produzione di filato di canapa. Un’efficiente produzione su scala industriale richiede
dunque un ammodernamento e un’ottimizzazione di questa fase, che consentano un
aumento dell’efficienza produttiva e un maggior controllo sul processo.
L’attività svolta ha riguardato l’isolamento e la caratterizzazione di ceppi batterici
dotati d’attività pectinolitica elevata. Nella
prima fase del lavoro la ricerca si è concentrata sui batteri del genere Clostridium che,
almeno nella fase anaerobia del processo in
acqua, rappresentano i principali agenti
degradatori. Prove di laboratorio preliminari hanno dimostrato che l’impiego dei ceppi
selezionati, dotati di elevata attività di degradazione dell’acido poligalatturonico,
come inoculi dell’acqua di macerazione, rappresenta una valida strategia che ha consentito di diminuire i tempi di macerazione, rispetto al processo tradizionale, e di migliorare la qualità della fibra prodotta. L’attività
di degradazione dell’acido poligalatturonico
sembra dunque fornire valide indicazioni
sulle potenzialità macerative degli isolati.
Inoculando nelle vasche, all’inizio del processo, spore di un ceppo aerobio e di uno
anaerobio selezionati si è riusciti ad accelerare ulteriormente il processo. Il grado ottimale di macerazione è stato raggiunto dopo
solo quattro giorni, contro i 12 del controllo
o i 6 della vasca inoculata con il solo ceppo
anaerobio. Poiché la germinazione delle
spore dei ceppi anaerobi richiede l’istaurarsi
di condizioni di anossia nel macero, che si
realizzano solo dopo una fase di accrescimento di batteri aerobi, possiamo ritenere
che l’inoculo di due ceppi, uno aerobio ed
uno anaerobio, velocizzi il processo rendendolo in entrambe le fasi indipendente dall’insediamento della popolazione di degradatori residente.
In passato la comunità microbica che opera la macerazione microbiologica in acqua è
stata caratterizzata esclusivamente sulla base
di caratteri fenotipici. In questo modo erano
state caratterizzate solo due specie di batteri
degradatori anaerobi, C. felsineum e C.
acetobutylicum.
La caratterizzazione molecolare degli isolati pectinolitici anaerobi, condotta in questo lavoro, ha dimostrato come la comunità
microbica anaerobia, che interviene nella
macerazione in acqua della canapa, sia molto più complessa. L’analisi ARDRA ha permesso di suddividere i 120 isolati anaerobi
in 5 gruppi ARDRA. L’86% degli isolati si
colloca all’interno del gruppo ARDRA C,
comprendente anche il 65% degli isolati con
attività elevata. Le sequenze del 16S rDNA
di ceppi appartenenti ad uno stesso gruppo
presentano una similitudine del 99%, confermando l’elevato grado di relazione
filogenetica tra ceppi di uno stesso ribotipo.
Il sequenziamento del 16S rDNA di almeno un rappresentante di ciascun gruppo
ha dimostrato che gli isolati, suddivisi in
5 gruppi ARDRA, appartengono ad almeno
4 diverse specie del genere Clostridium
(Fig. 3). Sulla base dell’analisi della sequenza del 16S rDNA, gli isolati del gruppo C
risultano filogeneticamente distanti dai ceppi tipo delle specie C. acetobutylicum e C.
felsineum, precedentemente considerate le
uniche specie anaerobie implicate nella macerazione in acqua. Questi isolati si collocano invece vicino al ceppo NCP 262, formalmente appartenente alla specie C.
acetobutylicum, ma attualmente in corso di
riclassificazione come specie distinta,
C. saccharobutylicum (Keis et al., 1995).
Gli isolati appartenenti ai gruppi ARDRA
A e E sono filogeneticamente vicini alle specie C. acetobutylicum e C. felsineum, due
specie che presentano una elevata relazione
sulla base dell’analisi del marcatore 16S
rDNA (Tamburini et al., 2001). Questi due
gruppi sono composti per la maggior parte
da isolati dotati di attività pectinolitica elevata. I due rappresentanti del gruppo
ARDRA B, dotati di una bassa attività
pectinolitica, sembrerebbero invece appartenere ad una nuova specie batterica. La sequenza del 16S rDNA di uno dei due ceppi
mostra infatti una bassa similitudine con le
sequenze presenti in banca dati.
CONCLUSIONI
L’impiego di tecniche di caratterizzazione dell’attività pectinolitica e d’identificazione molecolare della microflora che interviene nella macerazione in acqua della canapa si sono dimostrati validi strumenti per
la messa a punto di strategie di miglioramento e di ottimizzazione del processo tradizionale. Prove preliminari di laboratorio, condotte impiegando ceppi selezionati hanno
consentito una riduzione dei tempi di
macerazione e di migliorare la qualità del
prodotto finale. Le condizioni saggiate in
laboratorio possono dunque rappresentare un
punto di partenza per prove di macerazione
su scala più ampia.
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Agroindustria / Aprile 2002 53
Effetto dello spargimento dei reflui della macerazione della canapa sulla comunità
batterica del suolo e la produzione del grano
Fabiani, F. Santomassimo, S. Landi, D. Lami, M. Di Candilo1, N. Miclaus
Istituto Sperimentale per lo Studio e la Difesa del Suolo P.za D’Azeglio 30, Firenze
1
Istituto Sperimentale per le Colture Industriali Via Corticella 133, Bologna
M. Castaldini, A.
RIASSUNTO
L’effetto delle acque di macerazione della canapa sulla microflora del suolo e sulle piante di parcelle sperimentali coltivate a grano è stato indagato mediante analisi molecolari ed agronomiche, per
valutarne lo smaltimento eco-compatibile negli agroecosistemi.
L’analisi molecolare indica che immediatamente dopo lo spargimento vi è una modesta modificazione della microflora, successivamente sovrastata dalla stagionalità. Inoltre, se da un lato non si
riscontrano sostanziali differenze nella ricchezza delle specie, dall’altro si verifica un effetto più
marcato sulla ricchezza relativa delle specie presenti, indicando una possibile azione a livello della
funzionalità della comunità eubatterica tellurica.
I dati biometrici non indicano un’influenza delle acque sui caratteri fenotipici e produttivi della
pianta.
Parole chiave: macerazione, acque reflue, canapa, eubatteri, rDNA, batteri ammonio ossidanti.
ABSTRACT
Effects of hemp retting water on the composition of soil bacterial community and on wheat
yield
The effect that the hemp retting water has on test plots was evaluated by means of molecular and
agronomic analyses. The purpose was to consider the possibility of ecologically compatible disposal
of these effluents in agricultural ecosystems, in the event of a revival of industrial hemp cultivation.
Plots of wheat received 3 doses (0, 80 and 160 m3 ha-1 in 2000 and double doses in 2001) of the
retting water. During the cultivation cycle, soil samples from the 0-20 cm layer were collected and
analyzed molecularly (DNA extraction, DGGE analysis, phylogenetic analysis of patterns and
specific detection by hybridization) for the presence of eubacterial and autotrophic ammonia oxidizing
communities. The agronomic analyses examined the biometric and productive characteristics at
harvesting: plant density and height, the number of kernels per spike, seed weight, and grain
production.
Molecular analysis showed that a slight modification in the microflora occurred as soon as the
water was spread. During the vegetative cycle this fluctuation of the microflora disappeared and
the DGGE profiles of different trials were not very different in May and July both in 2000 and
2001, indicating a major seasonal influence. Moreover, none of the main bands of the DGGE
profiles of the hemp retting water spread were retrieved in the soil profiles, even immediately after
spreading. The UPGMA analysis of the profiles, however, showed a more general effect on the
evenness than on the richness of the soil’s eubacterial population, probably related to some shifts in
the functional diversity of this soil community, due to the input of particular organic substances
present in retting water. The DGGE investigation of the ammonia oxidizing bacterial community
indicated that Nitrosospira was the most represented genus in soil.
The biometric and productive data do not indicate that the water affected the plants’ phenotypic and
productive characteristics.
Key words: retting, soil bacterial, rDNA, DGGE, UPGMA, ammonia oxidizers, wheat production.
INTRODUZIONE
In questi ultimi anni si è assistito ad un
rinnovato e crescente interesse per la coltivazione della canapa. Di conseguenza, anche lo smaltimento delle acque, derivanti dal
processo microbiologico che separa le fibre
dagli steli e ne garantisce la migliore qualità ai
fini tessili (Di Candilo et al., 2000), necessita
Autore corrispondente: Miclaus N.
Istituto Sperimentale per lo Studio e la Difesa
del Suolo, Piazza M. D’Azeglio, 30 - 50121
Firenze, Italia - Tel. (055) 2491249 - Fax (055)
241485.
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
54 Agroindustria / Aprile 2002
di valutazione dell’impatto ambientale. Le
acque residue della macerazione potrebbero
essere sparse sui suoli agricoli immediatamente o dopo un periodo di lagunaggio,
come accade per gli effluenti della produzione dell’olio d’oliva.
Scarsi sono i dati disponibili riguardo agli
effetti che le acque di macerazione della canapa possono produrre sulle piante e sulle
comunità batteriche del suolo e sui loro meccanismi di resilienza, i quali a vari livelli
agiscono da tampone nei confronti dei diversi input che raggiungono gli agroecosistemi. Dati analoghi, relativi alla
macerazione del lino, indicano che le acque
di macerazione contengono una varia
microflora batterica che si sviluppa naturalmente e i cui principali generi sono
Clostridium, Achromobacter, Pseudomonas,
Bacillus, Cellulomonas, Lactobacillus e
Flavobacterium. Questi batteri agiscono sia
attraverso un’azione pectinolitica sia contribuendo alla formazione di vari acidi organici quali l’acido acetico, propionico, lattico e
butirrico, che abbassano il pH delle acque
(Donaghy et al., 1990).
Per valutare, su parcelle coltivate a grano, l’effetto dello spargimento delle acque
di macerazione, lagunate per sei mesi nel
primo anno e sparse immediatamente dopo
la macerazione il secondo anno, sono state
utilizzate da un lato le tecniche molecolari
basate sugli acidi nucleici per quanto riguarda il monitoraggio delle comunità batteriche
e dall’altro la valutazione delle caratteristiche biometriche e dei dati produttivi per determinare l’effetto sulla coltivazione.
Le metodiche molecolari adottate prevedevano l’estrazione diretta del DNA dal suolo e la successiva amplificazione selettiva
del 16S rDNA, molecola ampiamente utilizzata per lo studio delle comunità batteriche
ambientali (Amann et al., 1995; Tiedje et al.,
1999; van Elsas et al., 1998), perché consente uno studio svincolato dalla necessità
di coltivazione dei batteri ed è per questo in
grado di prendere in considerazione un più
ampio numero di specie batteriche. In particolare, l’analisi DGGE (Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis) (Muyzer et al., 1998)
eseguita sulla regione V6-V8 del 16S rDNA
eubatterico fornisce profili elettroforetici che
sono da intendere come una vera e propria
impronta molecolare della comunità
eubatterica totale presente nel suolo, come
pure di specifiche comunità di particolare
interesse ecologico. L’analisi statistica
UPGMA (Unweighted Pair Grouping with
Mathematical Averages) dei profili consente, successivamente, di mettere in evidenza
le variazioni a carico del numero di specie
(richness) e della distribuzione relativa delle specie presenti (evenness).
MATERIALI E METODI
Campionamenti. La prova sperimentale
è stata condotta ad Anzola (Bologna) presso
l’azienda Cà Rossa dell’I.S.C.I. su un suolo
classificato come typic Udifluvent (Soil
Survey Staff, 1996) caratterizzato da un clima temperato e da precipitazioni di 618 mm
annui (media ventennale). La prova consisteva di parcelle coltivate a grano (cv. Serio),
irrigate con tre differenti volumi di acque di
Tabella 1 - Composizione delle acque di
macerazione (anno 2000).
Table 1 - Hemp retting water composition (year
2000).
Composizione delle acque di macerazione
Azoto come N
Sostanza organica
Fosforo come P
Potassio come K
Cloro come Cl
-1
23.8 mg l
-1
2150 mg l
-1
6.91 mg l
-1
118 mg l
-1
64.0 mg l
macerazione (C: 0, D1: 80 e D2 160 m3 ha-1
nell’anno 2000 e volumi doppi nell’anno
2001); è stato adottato un modello a blocchi
randomizzati con quattro ripetizioni su parcelle di 25 m2. Le acque sono state distribuite a marzo nel 2000 e ad aprile e ottobre nel
2001. Esse provengono dalla macerazione
per sette giorni di 2.5 q di steli in un bacino
contenente 9 m3 di acqua. La composizione
delle acque sparse nel 2000 è mostrata nella
tabella 1. Le pratiche agricole prevedevano
nel 2000 la fertilizzazione minerale con 160
kg ha-1 di P2O5 più 100 kg ha-1 di N in forma
ammoniacale e 78 kg ha -1 di N come
NH4NO3 rispettivamente all’impianto e durante il ciclo di coltivazione; nel 2001 la fertilizzazione minerale con 400 kg ha-1 di
Figura 1 - Analisi DGGE della regione V6-V8
del 16S rDNA della comunità batterica del
suolo e delle acque di macerazione dei
campioni raccolti nel 2000. 1→3: C, D1, D2
suolo campionato in febbraio; 4→6: C, D1, D2
in marzo; 7→9: C, D1, D2 suolo campionato in
maggio; 10→12: C, D1, D2 suolo campionato
in luglio; I acque raccolte nel 1999; II acque
raccolte nel 2000.
Figure 1 - DGGE analysis of 16S rDNA V6-V8
region of soil and hemp retting water bacterial
community. 1→3: C, D1, D2 soil sampled in
February 2000; 4→6: C, D1, D2 soil sampled
in March 2000; 7→9: C, D1, D2 soil sampled
in May 2000; 10→12: C, D1, D2 soil sampled
in July 2000; I hemp retting water collected in
1999; II hemp retting water collected in 2000.
Ca(H2PO4)2·H2O (perfosfato triplo) all’aratura più 130 kg ha-1 di N come NH4NO3 in
due interventi in copertura. Il trattamento con
erbicidi è stato eseguito nel 2000 applicando 5 l ha-1 di INEX (pendimethalin + linuron)
prima della semina e 3 l ha-1 di ARIANE
(fluroxipir, clopiralid e MCPA) dopo
l’accestimento, nel 2001 applicando solamente INEX in pre-emergenza.
I campioni di suolo sono stati raccolti nei
mesi di febbraio, marzo, maggio e luglio nel
2000 e nei mesi di marzo, maggio, luglio,
ottobre e novembre nel 2001 ad una profondità di 15-20 cm. La composizione del suolo è mostrata nella tabella 2. Il suolo è stato
vagliato a 2 mm e conservato al buio a -20° C
fino al momento dell’analisi.
Analisi molecolari. Estrazione del DNA.
Il DNA è stato estratto direttamente utilizzando il FastDNA Spin kit per il suolo
(QBIOGENE).
Amplificazione dell’rDNA eubatterico.
L’rDNA 16S per gli esperimenti di
ibridazione è stato ottenuto amplificando in
triplo il DNA direttamente estratto dal suolo
mediante i primer eubatterici universali p0f/
p6r (Lane, 1991) nelle condizioni descritte
da (Castaldini et al. 1998a). Il 16S rDNA
per l’analisi DGGE della regione V6-V8 è
stato amplificato in triplo con i primer e nelle condizioni descritte da (Felske et al.,
1998a). I tre amplificati sono stati riuniti in
un unico pool per l’analisi DGGE.
Amplificazione dell’rDNA dei batteri
ammonio ossidanti autotrofi. Il 16S rDNA
per l’analisi DGGE è stato amplificato in
triplo con i primer e nelle condizioni descritte
da (Kowalchuk et al, 1997).
Analisi DGGE della comunità eubatterica
e ammonio ossidante autotrofa. L’analisi
della regione V6-V8 per gli eubatteri è stata
svolta utilizzando il BIORAD D-gene
system su gel di poliacrilammide al 6%
(acrilammide/bis 37.5:1) con urea 7M e
formammide 40% come denaturanti ed un
gradiente da 42 al 58%. Il gel è stato fatto
correre in 1 x TAE a 75 V per 16 ore alla
temperatura di 60° C e colorato con SYBR®
Green I.
L’analisi DGGE del 16S degli ammonio
ossidanti è stata svolta su gel di
poliacrilammide al 8% (acrilammide/bis
37.5:1) con urea 7M e formammide 40%
come denaturanti ed un gradiente da 46 al
54%. Il gel è stato fatto correre in 0.5 x TAE
a 75 V per 17 ore alla temperatura di 55° C.
e colorato con SYBR® Green I.
Ibridazione mediante Slot-blot del rDNA.
È stata utilizzata una sonda generale per gli
eubatteri marcata con digoxigenina nelle
condizioni di ibridazione descritte da (Manz
et al., 1992). La densità ottica riportata nei
grafici è stata valutata con il sistema
BioImage nel 2000 e con il Quantity One
Software (BIORAD) nel 2001.
Dendogrammi di similarità dei pattern
DGGE. È stato utilizzato il Dice coefficient
valutando la posizione delle bande con e
Figura 2 - Dendrogrammi derivanti dai profili dell’analisi DGGE dei campioni di suolo raccolti nel
2000. La similarità dei profili è stata calcolata utilizzando il Dice Coefficient e raggruppando i dati con
l’analisi UPGMA escludendo (A) o considerando l’intensità delle bande (B). 1→3: C, D1, D2 suolo
campionato in febbraio; 4→6: C, D1, D2 in marzo; 7→9: C, D1, D2 suolo campionato in maggio;
10→12: C, D1, D2 suolo campionato in luglio.
Figure 2 - Dendrogram structures of DGGE pattern comparisons. Through the use of Diversity
Database Software, the similarity of patterns was calculated using the Dice coefficient without (A) and
with (B) weighting of band intensities. Unweighted Pair Grouping with Mathematical Average was
used for clustering. 1→3: C, D1, D2 soil sampled in February 2000; 4→6: C, D1, D2 soil sampled in
March 2000; 7→9: C, D1, D2 soil sampled in May 2000; 10→12: C, D1, D2 soil sampled in July
2000.
Agroindustria / Aprile 2002 55
Tabella 2 - Composizione del suolo.
Table 2 - Soil composition.
Composizione del Suolo
Sabbia
Limo
Argilla
Sostanza organica
Azoto come N
Ca CO3
PH
23 %
44 %
33 %
1.60 %
1.2 %
15.0 %
7.95
Analisi molecolare. I anno. Lo studio della comunità eubatterica del suolo mediante
l’analisi DGGE della regione V6-V8 del 16S
rDNA non ha mostrato sostanziali variazioni nella struttura complessiva della
microflora per effetto dello spargimento delle
acque di macerazione (Fig. 1). Solo immediatamente dopo lo spargimento si
evidenziano alcune bande caratteristiche, che
scompaiono successivamente, indicando una
modificazione momentanea della comunità
indotta dal trattamento. Inoltre, anche la
stagionalità influisce sulla comunità, special-
Controllo
senza la pesatura dell’intensità delle stesse
e elaborando i dati in cluster con UPGMA
secondo il Diversity Database Software
(BIORAD).
Determinazioni biometriche e produttive
delle piante. Si sono determinate le seguenti caratteristiche biometriche e produttive all’epoca della raccolta (luglio 2000 e 2001):
densità delle piante per m2, altezza delle piante (media di 100 piante parcella-1), numero
di cariossidi per spiga (media di cento spighe per parcella), peso di 1000 semi e produzione di granella ha-1.
RISULTATI E DISCUSSIONE
56 Agroindustria / Aprile 2002
Dose 1
Dose 2
0,45
O
D
0,3
0,15
0
Febbraio
Marzo
Maggio
Luglio
Figure 3 - Valori di densità ottica dei segnali di ibridazione del 16S rDNA amplificato della comunità
eubatterica del suolo del 2000 con la sonda universale per gli eubatteri, Eub 338.
Figure 3 - Optical density values of 16S rDNA of 2000 soil bacterial community hybridization with
eubacterial specific probe Eub 338.
A
Figura 4 - Analisi DGGE della regione V6-V8
del 16S rDNA della comunità batterica del suolo
e delle acque di macerazione dei campioni
raccolti nel 2001. 1→3: C, D1, D2 suolo
campionato in marzo; 4→6: C, D1, D2 in
maggio; 7→9: C, D1, D2 suolo campionato in
luglio; 10→12: C, D1, D2 suolo campionato in
ottobre; 13→15: C, D1, D2 suolo campionato in
novembre; I acque raccolte a luglio; II acque
raccolte ad ottobre.
Figure 4 - DGGE analysis of 16S rDNA V6-V8
region of soil and hemp retting water bacterial
community. 1→3: C, D1, D2 soil sampled in
March 2001; 4→6: C, D1, D2 soil sampled in
May 2001; 7→9: C, D1, D2 soil sampled in July
2001; 10→12: C, D1, D2 soil sampled in
October 2001; 13→15: C, D1, D2 soil sampled
in November 2001; I Hemp retting water
collected in July 2001; II hemp retting water
collected in October 2001.
mente a livello della distribuzione relativa
delle singole specie (evenness), perché si riscontra una diversa intensità delle bande presenti sia nelle parcelle trattate sia nel controllo. L’analisi filogenetica dei profili ottenuti basata solo sul n° di bande (richness),
indica una sostanziale omogeneità dei campioni (Fig. 2A); infatti il valore 0.90 come
indice di similarità determina i due raggruppamenti principali dei campioni. È da notare l’alto grado di similarità (95-97%) delle
parcelle di Febbraio prima del trattamento e
del controllo di Marzo (rispettivamente cam-
B
Figura 5 - Dendrogrammi derivanti dai profili dell’analisi DGGE dei campioni di suolo raccolti nel
2001. La similarità dei profili è stata calcolata utilizzando il Dice Coefficient e raggruppando i dati con
l’analisi UPGMA escludendo (A) o considerando l’intensità delle bande (B). 1→3: C, D1, D2 suolo
campionato in marzo; 4→6: C, D1, D2 in maggio; 7→9: C, D1, D2 suolo campionato in luglio;
10→12: C, D1, D2 suolo campionato in ottobre; 13→15: C, D1, D2 suolo campionato in novembre.
Figure 5 - Dendrogram structures of DGGE patterns comparisons. Through the use of Diversity
Database Software, the similarity of patterns was calculated using the Dice coefficient without (A) and
with (B) weighting of band intensities. Unweighted Pair Grouping with Mathematical Average was
used for clustering. 1→3: C, D1, D2 soil sampled in March 2001; 4→6: C, D1, D2 soil sampled in
May 2001; 7→9: C, D1, D2 soil sampled in July 2001; 10→12: C, D1, D2 soil sampled in October
2001; 13→15: C, D1, D2 soil sampled in November 2001.
Tabella 3 - Dati biometrici e produttivi della coltivazione di grano (anno 2000). I valori della stessa
colonna contrassegnati dalla stessa lettera non presentano si differenziano significativamente per
P≤0.05 (test di Duncan).
Table 3 - Wheat biometric and production data (year 2000). Means with the same letters are not
significantly different P≤0.05 (Duncan test).
Trattamenti
Anno 2000
Piante m
(n°)
-2
Altezza
piante
(cm)
Peso di Cariossidi Produzione
3
10 semi per spiga di granella
-1
(g)
(n°)
(t ha )
Controllo
752 a
63.9 a
40.0 a
32.4 a
6.51 a
Dose 1
758 a
65.0 a
39.0 a
33.1 a
6.56 a
Dose 2
755 a
66.3 a
40.2 a
32.6 a
6.57 a
Dose 1
Dose 2
Controllo
1600
1400
1200
1000
O
800
D
600
400
200
0
Marzo
Maggio
Luglio
Ottobre
Novembre
Figura 6 - Valori di densità ottica dei segnali di ibridazione del 16S rDNA amplificato della comunità
eubatterica del suolo del 2001 con la sonda universale per gli eubatteri Eub 338.
Figure 6 - Optical density values of 16S rDNA of 2001 soil bacterial community hybridization with
eubacterial specific probe Eub 338.
pioni 1, 2, 3 e 4), parcelle non trattate con le
acque e sostanzialmente omogenee rispetto
all’epoca di campionamento. Anche il livello di dose sparsa non sembra incidere in
maniera marcata sulla biodiversità
eubatterica (94% di similarità dei campioni
5 e 6 con quelli precedenti). Verosimilmente, proprio la stagionalità incide in maniera
più netta per le parcelle soggette a spargimento (87-90% di similarità tra il gruppo di
campioni dal n° 8 al 12 con i 7 precedenti),
mentre per il controllo non è possibile ricondurre ad una ipotesi definita l’andamento dei pattern. Il dendrogramma compren-
dente anche l’intensità delle singole bande
(Fig. 2B) indica un minor grado di similarità
tra i vari campioni, specialmente per le tesi
trattate con la dose doppia rispetto alla dose
singola e al controllo.
Le possibili variazioni indotte dallo spargimento delle acque sulla microflora
eubatterica sono state indagate con la sonda
universale Eub 338 specifica per gli
eubatteri. La sonda non ha indicato una variazione della microflora immediatamente
dopo il trattamento, mentre un possibile effetto delle acque sembra emergere dai dati
del campionamento di maggio (Fig. 3).
Tabella 4 - Dati biometrici e produttivi della coltivazione di grano (anno 2001). I valori della stessa
colonna contrassegnati dalla stessa lettera non presentano si differenziano significativamente per
P≤0.05 (test di Duncan).
Table 4 - Wheat biometric and production data (year 2001). Means with the same letters are not
significantly different P≤0.05 (Duncan test).
Trattamenti
anno 2001
Piante m
(n°)
-2
Controllo
669 a
Altezza
piante
(cm)
65.8 a
Peso di
3
10 semi
(g)
38.4 a
Cariossidi Produzione
per spiga di granella
-1
(n°)
(t ha )
28.9 a
4.3 a
Dose 1
683 a
63.3 a
41.8 a
26.9 a
4.6 a
Dose 2
607 a
68.6 a
37.9 a
30.1 a
4.6 a
II anno. L’analisi DGGE della regione
V6-V8 dell’rDNA non mette in evidenza differenze tra le varie parcelle per quanto riguarda il numero delle specie presenti
(Fig. 4). Il grado di diversità tra le parcelle
basato sull’analisi UPGMA (Fig. 5A) indica in questo caso un certo effetto della
stagionalità e delle lavorazioni di preparazione per le colture successive, con i campioni di ottobre e novembre raggruppati tra
loro rispetto agli altri (90% di similitudine
tra i campioni 10-15 e gli altri). L’analisi
UPGMA comprendente anche l’intensità
delle bande, mette in luce anche nel secondo anno un minor grado di similarità tra i
vari campioni (Fig. 5B), e una certa particolarità di quelli che hanno ricevuto una dose
doppia (n° 6 e 9) che per il 2001 è stata pari
a 4 volte la dose iniziale unitaria; ciò indica
probabilmente un effetto soglia della dose
da poter spargere. Le acque di macerazione,
d’altro canto, presentano pattern molto diversi in relazione alla durata di stoccaggio,
e comunque entrambe hanno profili di bande diversi rispetto a quelli del suolo, e non
sembrano in grado di modificarne la comunità eubatterica in maniera diretta.
L’ibridazione con la sonda per gli eubatteri
(Fig. 6) non mette in evidenza una definita
azione delle acque sulla microflora nel suo
complesso, indicando che le modificazioni
a carico delle singole popolazioni mantengono costante il numero complessivo della
microflora eubatterica.
Per quanto riguarda la popolazione ammonio ossidante autotrofa, lo studio effettuato il II anno con la tecnica DGGE (Fig. 7)
non indica differenze significative nella comunità in seguito alla somministrazione delle
acque; anche con questa tecnica emerge chiaramente che il genere più rappresentato nel
suolo è Nitrosospira, e nemmeno l’apporto
di ammonio ossidanti diversi, presenti nelle
acque, riesce ad influenzarne la presenza.
Dati biometrici e produttivi. Le caratteristiche biometriche e produttive della coltura, indicate nelle tabelle 3 e 4, non mostrano differenze significative per effetto
dello spargimento delle acque (P≤0.05) (test
di Duncan) per i singoli anni considerati.
La variazione di produzione tra i due anni
(circa 20 q ha-1) è al momento imputabile
agli effetti dell’andamento climatico del
2001, come evidenziato dalla generale diminuzione della produzione nelle zone circostanti.
CONCLUSIONI
Dalla analisi DGGE e la successiva elaborazione UPGMA emerge che, dopo lo
spargimento delle acque di macerazione della canapa sul suolo, avvengono delle
modificazioni a carico della comunità
eubatterica del suolo che si possono definire temporanee e che riguardano non tanto il
numero delle specie maggiormente presenti, quanto la loro distribuzione relativa. D’alAgroindustria / Aprile 2002 57
Figura 7 - Analisi DGGE del 16S rDNA della comunità batterica ammonio ossidante autotrofa del
suolo e delle acque di macerazione dei campioni raccolti nel 2001. 1→3: C, D1, D2 suolo campionato
in marzo; 4→6: C, D1, D2 in maggio; 7→9: C, D1, D2 suolo campionato in luglio; 10→12: C, D1, D2
suolo campionato in ottobre; 13→15: C, D1, D2 suolo campionato in novembre; I acque raccolte a
luglio; II acque raccolte ad ottobre; Nm: Nitrosomonas europaea; Nl: Nitrosospira multiformis.
Figure 7 - DGGE analysis of 16S rDNA of soil and hemp retting water ammonia oxidizers bacterial
community. 1→3: C, D1, D2 soil sampled in March 2001; 4→6: C, D1, D2 soil sampled in May 2001;
7→9: C, D1, D2 soil sampled in July 2001; 10→12: C, D1, D2 soil sampled in October 2001; 13→15:
C, D1, D2 soil sampled in November 2001; I hemp retting water collected in July 2001; II hemp retting
water collected in October 2001; Nm: Nitrosomonas europaea; Nl: Nitrosospira multiformis.
tronde, è possibile che variazioni nel numero delle specie della comunità batterica, nell’ambito dei suoli trattati, siano a carico delle popolazioni meno rappresentate, che pertanto potrebbero essere penalizzate nel processo di amplificazione di una miscela molto eterogenea di DNA quale quella estratta
dal suolo (Felske et al.,1998b).
Anche le variazioni a carico della
microflora messe in luce con la sonda generale per gli eubatteri non sembrano in correlazione con la dose specifica somministrata,
e sono più spiegabili come risposta ai fattori
climatici e stagionali. La popolazione ammonio ossidante autotrofa, presa in esame
come importante indicatore ambientale
(Ceccherini et al., 1998) non è influenzata
nella sua composizione dal refluo versato.
Infine anche i parametri morfo-biometrici
e produttivi presi in considerazione mostrano un andamento legato verosimilmente all’andamento climatico e/o agli interventi di
conduzione. A tal proposito, l’ipotesi che
l’apporto delle acque, dato il loro modesto
contenuto di carbonio organico, potesse svol-
58 Agroindustria / Aprile 2002
gere una azione positiva sulla produzione
incrementando la dose sparsa (Castaldini et
al., 2002) non sembra suffragato dai dati
produttivi del 2° anno.
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Caratterizzazione strutturale e istologica di fibre di canapa (Cannabis sativa L.)
P. Medeghini Bonatti1, B. Focher, C. Grippo, C. Ferrari1, G. Pellacani
Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia
Dipartimento di Ingegneria dei Materiali e dell’Ambiente, Via Vignolese 905/C - 41100 Modena
1
Dipartimento Interdisciplinare di Scienze Agrarie, Via J. Kennedy 17- 42100 Reggio Emilia
RIASSUNTO
Su due varietà di canapa destinate al settore tessile, Carmagnola (dioica), tradizionale cultivar
italiana da fibra e Fedora (monoica), di origine francese, è stato condotto uno studio istologico e
strutturale delle fibre, rispettivamente contenute nel fusto integro e nello stigliato. L’analisi istoanatomica ha consentito una precisa caratterizzazione delle due varietà relativamente alle dimensioni dei fascetti di fibre primarie, al gradiente di maturazione delle stesse lungo il fusto, alla produzione di fibre secondarie. Comparativamente, nella cv Carmagnola i fascetti appaiono meglio individuati, a contorno più regolare e significativamente più sottili in ogni segmento di fusto considerato; a parità di età delle piante e di distanza dalla base, in questa stessa cultivar la maturazione delle
fibre risulta più omogenea e la quantità di fibre secondarie è globalmente inferiore. L’analisi
composizionale e strutturale ha mostrato contenuto di lignina analogo nelle due varietà e una struttura meno ordinata della cellulosa nella varietà Fedora.
Parole chiave: Cannabis sativa L., cv Carmagnola, cv Fedora, fibra tessile, analisi istologica, cellulosa,
analisi composizionale, analisi NMR.
ABSTRACT
Structural and histological characterisation of hemp (Cannabis sativa L.) fibers
Histo-anatomical, compositional and solid-state NMR analysis were carried out on primary bast
fibres of dioecious hemp variety Carmagnola and monoecious Fedora one, to comparatively define
the main quality traits related to their textile use. Field grown plants in the vegetative stage were
harvested at week 14 after sowing. The plant density was approximately 120 plants m-2. The plant
height averaged 230 cm in cv Carmagnola and 165 cm in cv Fedora. Microscopical observations
and image analysis were carried out on stem cross-sections at 50, 100 and 150 cm above ground.
Compositional and structural analysis were performed in toto on primary fibres manually extracted
from stem segments up to 150 cm above ground. The two cultivars showed significant differences
in the size of fibre bundles, in fibre ripeness degree and in the proportion of secondary fibres in
every stem segment examined. In cv Fedora the primary fibre bundles appeared consistent, irregularly
defined and frequently interconnected, whereas in cv Carmagnola they were thinner and regularly
spaced. The fibre maturity index, defined by cell-wall/cell-lumen ratio (P/L), was high in cv Fedora
up to 100 cm above ground and very low in the upper third of the stem. The fibre ripeness degree in
cv Carmagnola was lower than in cv Fedora up to 100 cm height; nevertheless, the primary fibres
appeared well differentiated up to 150 cm above ground, with constant values of maturity index.
Differences in secondary fibre production were also observed, related to the different growth pattern
of the two cultivars. The proportion of secondary fibres in stem cross-sections at 50 cm above
ground averaged 25% of total bast area in cv Carmagnola and 28% in cv Fedora plants; at 100 cm
secondary bast fibres were observed only in cv Fedora. On the whole, histo-anatomical conditions
consistent with textile uses were observed up to 150 cm above ground in cv Carmagnola and up to
100 cm in cv Fedora, at parity of plant age. Chemical composition of primary fibres was substantially
similar, the only significant difference being the higher amount of extractive components recorded
in cv Fedora. On the other hand, the NMR spectra pointed out a fairly lower intensity signal of
lignin in cv Fedora, together with a partial reduction in the pentosane signals. Moreover, the NMR
spectrum recorded for cv Carmagnola fibres showed the cellulose profile typically found in primary
fibres of herbaceous plants, with a C-4 related crystallinity degree near to 50%. In the cv Fedora
NMR spectrum, the band width of the C-4 and C-6 peaks prevents the determination of the crystalline
phase, due to the greater amount of more disordered cellulose.
Key words: Cannabis sativa L., cv Carmagnola, cv Fedora, fiber hemp, histology, cellulose, fibre
composition, NMR analysis.
Autore corrispondente: Medeghini Bonatti P.
Dipartimento di Scienze Agrarie – Università
degli Studi di Modena e Reggio Emilia,
Via Kennedy 17, 42100 Reggio Emilia, Italia
Tel. (0522) 383232 - Fax (0522) 304217
E-mail: [email protected]
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
INTRODUZIONE
L’impiego di colture agricole per usi industriali si pone come strategia di
diversificazione produttiva in una situazione prospettica caratterizzata dalla riduzione
delle risorse finanziarie disponibili per il
sostegno dell’agricoltura e dall’imponente
disavanzo della bilancia commerciale delle
materie prime fibrose della maggior parte dei
paesi dell’UE. Non è tuttavia sufficiente produrre materiale fibroso in quantità industriali
per essere certi dell’accettazione del mercato; impatto ambientale e qualità sono i fattori che condizionano l’impiego di qualsiasi
materia prima.
Definire la qualità di una fibra cellulosica
vegetale in termini del tutto oggettivi è un
compito estremamente arduo sia per la variabilità intrinseca dei prodotti naturali sia
per la molteplicità dei settori d’impiego. In
linea di principio, al momento dell’acquisto
i parametri di riferimento del prezzo sono: il
contenuto di fibra lunga nello stelo, la resistenza dei fascetti fibrosi, la finezza della
fibra tecnologica. Detti parametri sono generalmente valutati manualmente dall’acquirente al momento stesso dell’acquisto e, solo
nei casi dubbi, confermati in laboratorio su
piccolissime campionature. Il passaggio da
criteri soggettivi a criteri oggettivi basati su
parametri morfologici e strutturali richiede
in ogni caso un approfondimento della conoscenza della materia prima fibrosa.
Vari caratteri isto-anatomici del fusto di
canapa sono correlabili a caratteristiche tecnologiche delle fibre quali elasticità, resistenza e finezza (Sankari, 2000). Ai fini della
destinazione d’uso e della lavorazione, può
rivestire notevole interesse definire sia la
consistenza dei singoli fascetti, cioè il numero di fibre di cui sono composti, sia la
quantità di altri tessuti ad essi associati, che
possono restare a far parte dello stigliato
come impurezze. Un ulteriore elemento significativo è il grado di maturazione e
lignificazione della parete delle singole fibre, che risulta correlato a vari fattori
(Horkay and Bócsa, 1996; Mediavilla,
Leupin and Keller, 2001; Keller et al., 2001;
Sankari, 2000): sesso della pianta, stadio di
sviluppo, età del tessuto. Una consistente
presenza di lignina può influire direttamente sul grado di rigidità e fragilità della fibra;
peraltro, una scarsa lignificazione è propria
di fibre non mature. Infine, è da considerare
che l’accrescimento in diametro del fusto
comporta, parallelamente alla formazione
della massa legnosa, la produzione di fibre
floematiche secondarie, molto lignificate e
di lunghezza e diametro molto ridotti (fibre
corte): un’abbondante presenza di fibre secondarie nello stigliato incide negativamente sulla qualità (Mediavilla, Leupin and
Keller, 2001).
Lo scopo della presente ricerca è la caratterizzazione istologica delle fibre nel fusto
integro, unitamente all’analisi composizionale
Agroindustria / Aprile 2002 59
Tabella 1 - Consistenza dei fascetti di fibre primarie a 100 cm di altezza nel fusto delle cultivar
Carmagnola e Fedora, a 14 settimane dalla semina.
Table1 - Primary fibre strand consistency in cv Carmagnola and Fedora stems, 100 cm above ground,
at week 14 after sowing.
n° medio di fibre
per fascetto
Carmagnola
range
27.6
costolature
39.6
12 - 66
tra costolature
18.6
11 - 31
Fedora
57.6
costolature
71
30 - 91
tra costolature
46
36 - 63
e strutturale delle componenti polimeriche
delle fibre nello stigliato. Questo lavoro riporta una prima serie di osservazioni utili a
definire comparativamente due varietà destinate al settore tessile: Carmagnola, dioica,
tradizionale varietà da fibra italiana, e Fedora,
monoica, di origine francese.
Tabella 2 - Indice di maturazione delle fibre
primarie (P/L) a diverse altezze nel fusto delle
cv Carmagnola e Fedora, a 14 settimane dalla
semina.
Table 2 - Primary fibres maturity index (P/L)
along the stem of cv Carmagnola and cv
Fedora, at week 14 after sowing.
50 cm
100 cm
150 cm
Carmagnola
0.69
0.56
0.54
Fedora
0.84
0.66
0.22
Figura 1 - Porzione di fusto di C. sativa cv
Carmagnola in sezione trasversale, a 100 cm
dalla base, 14 settimane dopo la semina (x 70).
Figure 1 - A cross-section of C. sativa cv
Carmagnola stem, 100 cm above ground, at
week 14 after sowing (x 70).
60 Agroindustria / Aprile 2002
MATERIALI E METODI
Campionamento e conservazione. I
campioni sono stati ottenuti nell’estate 2000
da piante cresciute in campo a densità di
120 m-2 e distanza tra file di 20 cm. Le condizioni colturali hanno previsto concimazione azotata e fosfatica in ragione di
150 kg ha-1 e nessun trattamento di diserbo.
All’epoca del prelievo (inizio luglio, 14 settimane dalla semina) gli individui prescelti
per l’analisi non presentavano segni evidenti
di avvio della fioritura, benché la maggior
parte delle piante della cv Fedora avesse raggiunto questo stadio; l’altezza media era di
230 cm per la cv Carmagnola e di 165 cm
per la cv Fedora. Segmenti di fusto di tre
piante per ogni cultivar, dalla base a 150 cm
di altezza, conservati a –80 °C, sono stati
destinati alle analisi composizionali e strutturali. Per le analisi isto-anatomiche, frammenti di circa 2 cm di lunghezza sono stati
prelevati dalle stesse piante a distanza di 50,
100, 150 cm dalla base e opportunamente
trattatati per le osservazioni microscopiche.
Microscopia. I campioni di fusto sono sta-
Figura 2 - Sezione trasversale del fusto di C.
sativa cv Fedora, a 100 cm dalla base,
14 settimane dopo la semina (x 70).
Figure 2 - Cross-section of C. sativa cv Fedora
stem, 100 cm above ground, at week 14 after
sowing (x 70).
ti fissati per almeno 24 ore a 4 °C in
glutaraldeide 3% (p/v) in tampone fosfato
0.1 M, pH 6.8, successivamente disidratati
in alcool e inclusi in istoresina (Technovit
7100, Kulze). Sezioni trasversali dello spessore di 2-4 µm, ottenute con Ultramicrotomo
Reichert Jung, sono state colorate con blu di
toluidina carbonato, osservate e fotografate
ad un microscopio ottico Leitz Orthoplan.
Su almeno sei sezioni non seriali per ogni
campione è stata eseguita l’analisi di immagine. Il grado di maturazione delle fibre primarie è stato quantificato attraverso la misura, su singole fibre, del rapporto parete/
lume cellulare (P/L); la consistenza dei singoli fascetti è stata valutata sulla base del
numero di fibre adiacenti, non separate da
cellule parenchimatiche.
Isolamento delle fibre. Le fibre tecnologiche sono state isolate dallo stelo e pulite
manualmente, quindi separate dai tessuti non
fibrosi tramite un pettine industriale da
23 punte pollice-1.
Analisi chimica delle fibre stigliate.
Determinazione degli estrattivi. La quantità di estrattivi è stata determinata per estrazione delle fibre stigliate in miscela di
cicloesano/etanolo (2:1), a ricadere per 8 h
e successivamente con etanolo per 5 h (Tappi 264 om-82).
Determinazione della lignina. La frazione di lignina insolubile è stata determinata,
secondo la norma Tappi T 222 om-88, per
dissoluzione delle componenti polisaccaridiche in H2SO4 72% (p/p) per 2 h a 25°C e
successivo trattamento in H2SO4 3% (p/p) a
ricadere per 4 h. Il residuo insolubile è stato
lavato con H2O bollente sino a neutralità. La
Figura 3 - Particolare di un fascetto di fibre
primarie, a grado di maturazione non omogeneo,
nella cv Fedora (x 270).
Figure 3 - Detail of a primary bast fibre bundle
of cv Fedora, showing maturity gradient of
fibres (x 270).
frazione di lignina solubile è stata determinata spettrofotometricamente (205 nm) sulla frazione solubile in H2SO4.
Determinazione dei pentosani. La determinazione dei pentosani è stata condotta secondo la norma Tappi 223 cm-84, sul distillato in HCl 13,15% (p/p) dopo addizione di
NaCl (20 g). A 5 ml del distillato sono stati
aggiunti 25 ml di reagente orcinolo e 20 ml
di etanolo; la determinazione spettrofotometrica del contenuto di xilano è stata condotta a 630 nm.
Determinazione delle ceneri. La quantità
di ceneri è stata determinata per calcinazione
in muffola a 560 °C (Tappi 211 os-58).
Analisi spettroscopica NMR allo stato
solido. Gli spettri CP-MAS 13C-NMR sono
stati registrati a temperatura ambiente, a
75.4 MHz mediante uno spettrometro per lo
stato solido Bruker ASX -300, usando un rotore (ZrO2) di 7 mm. Il tempo di contatto di
cross polarisation (CP) era 1 ms, mentre il
tempo di ripetizione e l’impulso 1H90°, rispettivamente di 4 s e 3,5 µs. I chemical
shifts erano misurati rispetto alla glicina (riferimento esterno) a 42 ppm dal TMS. Per
ogni spettro sono state accumulate da 500 a
2000 registrazioni (1K data points). La velocità di rotazione del rotore era di 4.5 kHz;
gli spettri sono stati fasati manualmente.
Tabella 3 - Analisi composizionale delle fibre stigliate.
Table 3 - Compositional analysis of scutched fibres.
Carmagnola
(%)
Fedora
(%)
Estrattivi
1,8
3,9
Lignina solubile
2,1
2,1
Lignina insolubile
2.3
2.7
Lignina totale
4,4
4,8
Pentosani
8,0
7,9
Ceneri
4,9
4,4
80,9
79,1
Cellulosa
(*)
(*) Determinata come differenza
RISULTATI E DISCUSSIONE
Caratterizzazione isto-anatomica. Le fibre primarie occupano nel fusto una regione
periciclica che negli stadi iniziali
dell’ontogenesi, e particolarmente in corrispondenza delle costolature, diviene
Figura 5 - Aspetto dei fascetti di fibre primarie a 100 cm di altezza nel fusto della cv Carmagnola (x 150).
Figure 5 - Primary bast fibre bundles in the stem of cv Carmagnola, 100 cm above ground (x 150).
Figura 4 - Composizione percentuale della zona
di fusto esterna al cambio cribro-legnoso, a 50
cm dalla base, 14 settimane dopo la semina.
Figure 4 - Proportion of primary fibres,
secondary fibres and other tissues in the bast
zone of stem basal segment of cv Carmagnola
and cv Fedora, at week 14 after sowing.
Figura 6 - Aspetto dei fascetti di fibre primarie a 100 cm di altezza nel fusto della cv Fedora (x 150).
Figure 6 - Primary bast fibre bundles in the stem of cv Fedora, 100 cm above ground (x 150).
Agroindustria / Aprile 2002 61
Figura 7 - Fibre primarie in avanzato stadio di
maturazione e scarso sviluppo delle fibre
secondarie nel fusto della cv Carmagnola a
50 cm dalla base (x 170).
Figure 7 - Detail of cv Carmagnola stem, 50 cm
above ground, showing nearly mature primary
fibres and moderate development of secondary
phloem fibres (x 170).
Figura 8 - Particolare del fusto della cv
Carmagnola a 150 cm dalla base; le fibre
primarie mostrano minore diametro, ma buon
grado di maturazione; non sono presenti fibre
secondarie (x 170).
Figure 8 - Detail of cv Carmagnola stem,
150 cm above ground, showing good
differentiation of thin primary fibres; secondary
fibres are not visible (x 170).
Figura 9 - Fibre primarie completamente
mature e consistente sviluppo di fibre
secondarie nel fusto della cv Fedora a 50 cm
dalla base (x 170).
Figure 9 - Detail of cv Fedora stem, 50 cm
above ground, showing development of fully
mature primary fibres and secondary phloem
fibres (x 170).
pluristratificata. La distribuzione in fascetti
separati (Figg. 1, 2) evidenzia che non tutte
le cellule della regione periciclica si differenziano in fibre; a separare i singoli fascetti
permangono quindi cellule di tipo
parenchimatico, di piccole dimensioni e
provviste di parete cellulosica sottile. Il numero di fibre per fascetto risulta determinato molto precocemente e, in uno stesso individuo, non presenta significative variazioni
a diverse altezze lungo il fusto.
La maturazione delle fibre, indicata dalla
progressiva deposizione di strati di parete
cellulare secondaria, procede nell’ambito di
ogni fascetto secondo gradiente, in senso
radiale rispetto al centro del fusto (Fig. 3).
Il processo di lignificazione è pure avviato
molto precocemente, contemporaneamente
all’inizio di formazione della parete secondaria: riguarda inizialmente la lamella mediana e la sottile parete primaria, procede
poi interessando, sebbene più debolmente,
gli strati di parete secondaria.
Le varietà Carmagnola e Fedora appaiono distintamente caratterizzate sia per la diversa consistenza dei fascetti (Tab. 1) che per
lo stato di maturazione delle fibre a date altezze lungo il fusto (Tab. 2).
La cv Fedora presenta fibre primarie aggregate in fascetti consistenti e compatti,
estesi in senso tangenziale, a contorno irregolarmente sinuoso, spesso indistintamente
separati (Figg. 6, 9).
La maturazione delle fibre, a 14 settimane
dalla semina, risulta molto avanzata fino a 100
cm di altezza (Tab. 2). A 150 cm dalla base le
fibre presentano valori del rapporto P/L estremamente bassi: raramente è stato ottenuto un
indice pari a 1, che rappresenta la condizione
di completa maturazione, vale a dire lume
cellulare completamente occluso. Il dato è
facilmente giustificabile se viene riferito all’altezza media (165 cm) delle piante campionate: il segmento di fusto prelevato in questa cultivar a 150 cm dalla base è, in effetti,
situato in prossimità dell’apice vegetativo,
perciò ad esso corrispondono tessuti di recente
formazione e relativamente immaturi.
La produzione di fibre floematiche secondarie è evidente sia nella zona basale del fusto (Fig. 9) che in quella mediana (Fig. 6),
mentre risulta assente a 150 cm di altezza
(Fig. 10).
Nella cv Carmagnola i fascetti appaiono
meglio individuati, a contorno più regolare
e significativamente più sottili in ogni segmento di fusto considerato (Figg. 5, 7;
Tab. 1).
Il grado di maturazione delle fibre, fino a
100 cm di altezza, è inferiore a quello registrato in Fedora (Tab. 2); il valore del rapporto P/L si mantiene tuttavia costante nel
segmento di fusto sovrastante, dove peraltro le fibre presentano diametro minore
(Fig. 8).
Anche la scalarità di produzione delle fibre secondarie riflette differenze significative nel modello di sviluppo e nel ritmo di
accrescimento rispetto alla cv Fedora: a
50 cm dalla base (Figg. 4, 7), la zona di fusto esterna al cambio (tiglio) è occupata per
il 25% da fibre secondarie e per il 43% da
fibre primarie; nei segmenti di fusto successivi (Figg. 5, 8) la quantità di fibre secondarie è irrilevante.
Le valutazioni quantitative consentite dall’analisi microscopica concordano globalmente con quelle espresse per cultivar di
canapa dioiche e monoiche sulla base di analisi di altro tipo (Horkay and Bócsa, 1996).
Nel caso specifico, a parità di età delle piante, le condizioni isto-anatomiche adeguate
alla destinazione tessile si riscontrano fino a
150 cm di altezza nel fusto della cv
Carmagnola e fino a 100 cm di altezza nel
fusto della cv Fedora.
Analisi chimica. L’analisi composizionale
delle fibre stigliate è riportata in tabella 3.
La composizione delle due varietà è sostanzialmente simile; l’unica differenza significativa riguarda il contenuto di estrattivi – di
probabile natura lipidica, visto il tipo di sol-
Figura 10 - Particolare del fusto della cv Fedora
a 150 cm di altezza; le fibre primarie non sono
differenziate (x 170).
Figure 10 - Detail of cv Fedora stem, 150 cm
above ground; differentiated primary fibres are
not present (x 170).
62 Agroindustria / Aprile 2002
180
160
140
120
100
(ppm)
80
60
40
20
Figura 11 - Spettro 13C CP-MAS NMR della cv
Carmagnola.
Figure 11 - 13C CP-MAS NMR spectrum of cv
Carmagnola.
180
160
140
120
100
(ppm)
80
60
40
20
Figura 12 - Spettro 13C CP-MAS NMR della cv
Fedora.
Figure 12 - 13C CP-MAS NMR spectrum of cv
Fedora.
vente utilizzato – sensibilmente superiore
nella cultivar Fedora. È verosimile che la
componente fibrosa isolata dal segmento
subapicale del fusto di quest’ultima sia costituita da fibre immature e trattenga una
maggiore quantità di altri tessuti vivi: è quindi possibile che i componenti lipoproteici
cellulari incidano sui valori riscontrati.
Spettroscopia NMR allo stato solido. Lo
spettro 13 C CP-MAS NMR delle fibre
stigliate della varietà Carmagnola (Fig. 11)
mostra i segnali propri delle tre componenti
polimeriche: lignina, pentosani e cellulosa,
unitamente a quelli dei gruppi metilici, com-
presi tra 20 e 40 ppm delle componenti non
fibrose.
Segnali relativi alla lignina sono presenti
sia a campi alti che a campi bassi: il segnale
a 21 ppm è stato attribuito ai gruppi metilici,
mentre la spalla a 56 ppm ai gruppi
metossilici presenti nella lignina, ma anche
nei pentosani. Il segnale a 180 ppm è dovuto alla presenza nella struttura della lignina
di gruppi carbonilici. I segnali dei carboni
α, β e γ delle unità di fenilpropano non sono
distinguibili perché sovrapposti a quelli della
cellulosa, mentre i segnali dei carboni dell’anello del fenilpropano appaiono ampi e
di debole intensità nell’intervallo 120130 ppm. I segnali dei pentosani, oltre che a
56 ppm, sono evidenti a campi bassi
(175 ppm) e dovuti alla presenza di gruppi
acetilici (Focher, 1992).
Il segnale del carbonio anomerico C-1
della cellulosa appare a 105 ppm, mentre i
segnali a 89 ppm e la spalla a 84 ppm sono
stati assegnati al carbonio C-4, presente rispettivamente nelle zone ordinate e meno
ordinate della cellulosa. Anche il segnale del
carbonio C-6 è scomposto nella componente ordinata (65 ppm) e meno ordinata
(63 ppm). L’apparente doppietto nell’intervallo 70-80 ppm è dovuto ai carboni C-2,
C-3 e C-5 dell’anello anidroglucosidico che
generalmente appare come tripletto solo in
composti cellulosici altamente cristallini.
Il profilo dello spettro NMR delle fibre
stigliate della cv Fedora (Fig. 12) mostra, a
differenza dell’analisi chimica, una riduzione di intensità dei segnali della lignina (intensità prossima al limite di sensibilità dello
strumento). Anche i segnali dei pentosani
mostrano una parziale riduzione della loro
intensità.
Lo spettro NMR della cv Carmagnola presenta un profilo tipico della cellulosa delle
fibre primarie di piante annuali (Focher et
al., 2001) con un grado di cristallinità, calcolato sul carbonio C-4, prossimo al 50%.
Nello spettro della cv Fedora la larghezza
di riga dei picchi relativi ai carboni C-4 e
C-6, dovuta alla maggior presenza della componente meno ordinata della cellulosa, non
permette la determinazione della componente cristallina e necessita pertanto di uno studio più approfondito.
CONCLUSIONI
Pur presentando ampia variabilità, i caratteri rilevati con l’analisi isto-anatomica
rispecchiano significative differenze varietali
costitutive e consentono valutazioni anche
di ordine qualitativo. Nelle condizioni sperimentali e meteoclimatiche relative ai campioni esaminati, la cv Carmagnola sembra
presentare parametri di qualità superiore per
quanto riguarda la maturazione più veloce e
più omogenea delle fibre primarie e la formazione di minori quantità di fibre secondarie. Inoltre, la morfologia dei fascetti di
fibre primarie, contraddistinti da bassa consistenza e da dimensioni relativamente omogenee, può rappresentare un elemento di non
secondaria importanza per la produzione di
filato di elevata finezza.
Infine, benché le osservazioni si riferiscano a uno stadio di crescita non definitivo ai
fini della raccolta, si evidenzia la possibilità
di utilizzazione del fusto della cv
Carmagnola per un’altezza considerevolmente superiore rispetto alla cv Fedora.
Tra i dati ottenuti dall’analisi strutturale
risulta di particolare rilievo la struttura
sopramolecolare più ordinata della cellulosa
nella cv Carmagnola.
La correlazione tra dati di tipo chimicostrutturale e osservazioni isto-anatomiche
può dunque fornire utili riferimenti nella
definizione oggettiva delle proprietà della
fibra richieste per diverse destinazioni d’uso,
nonché indicazioni per programmi di selezione e miglioramento.
RINGRAZIAMENTI
Si ringrazia il Dott. Luigi Maffettone, per
l’assistenza tecnica prestata nella composizione delle tavole.
BIBLIOGRAFIA
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fibre. In: “The Biology and Processing of
Flax Fibre”. H.S. Shekkar Sharma and
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Agroindustria / Aprile 2002 63
Impiego della canapa nella fitodepurazione da metalli pesanti
A. Ciurli, A. Alpi e P. Perata1
Dipartimento di Biologia delle Piante Agrarie - Università degli Studi di Pisa, Via Mariscoglio 34, 56124 Pisa
1
Dipartimento di Scienze Agrarie - Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia, Via Kennedy 17,
42100 Reggio Emilia
RIASSUNTO
È stata effettuata l’analisi di germinazione ed individuato il tempo medio di germinazione di semi
di Cannabis sativa var. Fibranova. La percentuale di germinazione è stata studiata inoltre in presenza di sali di zinco: solfato di zinco, ZnSO4, nitrato di zinco, Zn (NO3)2 e cloruro di zinco, ZnCl2,
usando concentrazioni 0 (controllo), 0.05, 0.1, 0.2, e 0.4 M, e per ogni sale, sia in presenza di luce
sia al buio. È stato messo a punto un sistema di coltivazione della canapa in coltura idroponica, in
condizioni di crescita controllate, dopo la sua germinazione nel terreno. La percentuale di
germinazione dei semi è circa del 18%, a causa della presenza di numerosi semi malformati e
morti. La pianta invece si adatta bene alla crescita in coltura idroponica e non presenta “shock” da
trapianto dopo il trapianto dal terreno all’idroponica stessa. Per evidenziare una soglia di tossicità
al metallo, quando le piante avevano raggiunto un’altezza di 30 cm, la soluzione nutritiva
dell’idroponica veniva sostituita con una soluzione nutritiva contenente gli stessi sali di Zn delle
prove di germinazione, rispettivamente alle concentrazioni 0.0 (controllo), 0.05, 0.1, 0.2 e 0.4 M.
Sono stati evidenziati danni sulle piante alle diverse concentrazioni di sali di zinco ed individuata
una soglia di tolleranza della canapa ai sali di zinco nel terreno.
Parole chiave: canapa, metalli pesanti, fitodepurazione, coltura idroponica
ABSTRACT
Use of hemp for phytoremediation of soil metals
Germination analyses were carried out for seeds of Cannabis sativa variety “Fibranova” and the
relative average germination time was determined. Germination percentage was also studied in the
presence of zinc salts such as zinc chloride (ZnCl2) zinc sulphate (ZnSO4), zinc nitrate (Zn(NO3)2)
at the following concentrations: 0.0, (control), 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 M, both in light and dark. We
established a cultivation system in hydroponics culture for Cannabis plants in controlled growth
chamber, after seed germination in soil.
The aim of the present research was to evaluate the tolerance of Cannabis to zinc salts for restoration
of soil metals. Although we observed a scarce adaptability of Cannabis to zinc salts in the hydroponics
cultivation system, we chose this growth method because of the need to obtain a repeatable
experiment, regardless of soil composition, intrinsically variable.
Germination percentage of Cannabis sativa seeds was about 18%, because of the presence of
several deformed, broken, empty and dead seeds. On the contrary, the plants adapted to hydroponics
culture condition grew very well and did not present transplantation shock from soil to the
hydroponics. When the plants reached a height of 30 cm, the nutritive solution was replaced with
another containing zinc salts at: 0.0 M, (control), 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.4 M.
The toxic effects of the different salts were evaluated and a tolerance threshold for zinc toxicity
plant growth was determined. The obtained results demonstrate a low tolerance of hemp to the
presence of ZnCl2 in hydroponics cultivation (< 0.1 M), whereas the same concentration appears to
be well tolerated by Cannabis grown in soil.
Key words: hemp, heavy metal, phytoremediation, hydroponics cultivation.
INTRODUZIONE
La tecnica che prevede l’utilizzazione di
piante per il trattamento di suoli contaminati e acque reflue inquinate, nota con il termine di “fitodepurazione”, è un processo di
recente sviluppo che si sta imponendo come
Autore corrispondente: Perata P. - Dipartimento
di Scienze Agrarie - Università degli Studi di
Modena e Reggio Emilia, Via Kennedy 17,
42100 Reggio Emilia, Italia - Tel. (0522)
383232 - Fax (0522) 304217 - E-mail:
[email protected]
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
64 Agroindustria / Aprile 2002
una soluzione efficace, a basso impatto ambientale ed applicabile ad una ampia gamma di situazioni dove i sistemi tradizionali
appaiono onerosi e di difficile gestione. Questa nuova tecnologia risulta molto vantaggiosa anche per la notevole abilità delle piante ad estrarre sequestrare e/o detossificare
inquinanti presenti nel terreno o nelle acque
(Meagher, 2000). Sebbene il termine
fitodepurazione attribuisca una funzione predominante all’azione delle piante, in realtà
il processo è molto più complesso e si basa
sull’azione svolta da alcune specie vegetali
sul refluo da depurare in stretta connessione
con i batteri presenti nella rizosfera e nel
suolo (Salt et al., 1998).
Sia negli Stati Uniti che in diversi Paesi
Europei sono stati realizzati negli ultimi anni
numerosi impianti per la fitodepurazione di
reflui provenienti da un’ampia gamma di
attività: trattamento secondario e terziario di
reflui urbani, industriali, agricoli e
zootecnici. Infine, da pochi anni, si stanno
utilizzando organismi vegetali per la
depurazione delle acque inquinate e/o
eutrofiche tramite la ricostruzione di
ecosistemi acquatici (constructed wetland),
aventi la funzione di filtro biologico e di tampone delle acque scaricate dai processi civili, industriali ed agricoli (Mannini, 1997).
La fitodepurazione si attua secondo diverse strategie di depurazione, infatti, la
fitoestrazione (phytoextraction) prevede la
estrazione dell’inquinante (ad esempio metalli pesanti) da parte della pianta, che tende
ad accumulare l’inquinante stesso nei suoi
tessuti. L’impiego di vegetali in grado di produrre una notevole biomassa è vantaggiosa
in questo approccio. La fitoestrazione può
essere ulteriormente suddivisa in
“fitoestrazione indotta” e “fitoestrazione
continua”: la distinzione è basata sulla necessità di aggiunta di un fattore chelante per
indurre l’assorbimento del metallo pesante
nel caso della fitoestrazione indotta, mentre
la fitoestrazione continua si basa sull’impiego di piante tipiche di zone caratterizzate da
terreni ricchi in metalli pesanti. Lo svantaggio di questo ultimo approccio è dato dal limitato tasso di crescita di tali piante, unita
alla frequente incapacità di iperaccumulare
metalli pesanti quali piombo, cadmio, arsenico ed uranio (Salt et al. 1998).Alla
fitoestrazione si affiancano altri processi,
come la capacità delle piante di “stabilizzare” un inquinante nel terreno (phytostabilization), di estrarlo e renderlo in seguito
volatile (phytovolatilization), oltre alla capacità di alcune piante di degradare
(phytodegradation) alcuni inquinanti (PilonSmits and Pilon, 2000; Salt et al., 1998).Inoltre, la pianta può, in particolari casi indurre
la degradazione degli inquinanti da parte
della microflora del terreno (phytostimulation).
Attualmente la fitodepurazione di suoli
contaminati da metalli pesanti rappresenta,
tra i metodi di decontaminazione noti, quello a più basso costo. Tuttavia nella
decontaminazione dei suoli da metalli,
l’individuazione dei fenotipi naturali di piante iperaccumulatrici ha un ruolo fondamentale. La ipertolleranza ai metalli rappresenta
la caratteristica vegetale chiave per ottenere
Tabella 1 - Nella tabella sono riportati gli effetti tossici rilevati sulle piante di Cannabis sativa
cresciute in coltura idroponica, in condizioni di crescita controllate:
++++ essiccamento e morte della pianta tre giorni dopo l’inizio del trattamento
+++ essiccamento e morte della pianta cinque giorni dopo
++
appassimento delle foglie, essiccamento e morte della pianta otto giorni dopo
+
appassimento e ripiegamento verso il basso delle foglie, essiccamento e morte della pianta dieci
giorni dopo
Table 1 - The toxic effects of different zinc salts were evaluated on Cannabis sativa growth in
hydroponics culture in controlled growth chamber, as reported:
++++ plant drying up and death three days after the beginning of the treatment
+++ plant drying up and death five days after the beginning of the treatment
++ leaves wilted, plant drying up and death eight days after the beginning of the treatment
+
leaves wilted and bending down, plant drying up and death ten days after the beginning of the
treatment
Concentrazione (M)
Zn SO4
Zn(NO3)2
ZnCl2
0
0
0
0
0.05
+
+
+
0.1
++
++
++
0.2
+++
+++
+++
0.4
++++
++++
++++
l’iperaccumulazione degli stessi e la
compartimentalizzazione vacuolare rappresenta la spiegazione dell’iperaccumulazione.
Sono noti dalla letteratura esempi di
“phytovolatilization” di Se o Hg ed emendamenti per phytostabilization dovuti
all’inattivazione nel suolo di Pb e Cr+6. Ancora scarse sono tuttavia le conoscenze relative alle basi molecolari della phytoremediation, anche se recenti progressi sono
stati raggiunti nella caratterizzazione dell’assorbimento di Fe, Cd e Zn in Arabidopsis.
Inoltre mutanti di lievito indicano probabili
strategie per la costituzione di cultivar
transgeniche per la fitodepurazione (Chaney
R. L. et al., 1997).
Il presente lavoro affronta una tematica
particolarmente innovativa in quanto tratta
la possibile applicazione di tecniche di
fitodepurazione impiegando una pianta ad
elevata biomassa quale la Canapa, (Cannabis
sativa L.), una pianta annuale, a sessi separati (dioica) che appartiene alla famiglia delle
Cannabinacee (Small and Conquist, 1976).
Studi di tipo ecologico e fitogeografico, condotti su ampie collezioni, hanno permesso
di separare dalla Cannabis sativa, comprendente le varietà coltivate per la produzione
di fibra, la Cannabis indica, cui afferiscono
i tipi caratterizzati da un maggior contenuto
di cannabinoidi, in particolare di d9-tetraidrocannabinolo (THC), principale agente
psicotropico della canapa (Schultes, 1973;
Ranalli e Mastromei, 2000). La canapa ha
avuto in passato una grande tradizione di
coltivazione nel nostro Paese; negli anni ’30
Figura 1 - La figura mostra le piante di Cannabis nel sistema di coltura idroponica allestito: vasi con
particolari fenditure contenenti argilla espansa vengono immersi per pochi cm nella soluzione nutritiva
contenente i metalli pesanti, in condizioni di crescita controllata.
Figure 1 - Drawing showing Cannabis plants in hydroponics culture: pots containing expanded clay
plunged in nutritive solution with heavy metals in controlled growth chamber.
era coltivata su una superficie di oltre
100.000 ha e produceva una fibra di eccellente qualità. Successivamente la coltura
andò in declino fino ad annullarsi agli inizi
degli anni ’60, sia per la gravosità degli interventi manuali necessari per la coltura che
si scontravano con le esigenze di un’agricoltura che diventava sempre più di scala,
sia per la diffusione dell’impiego, come stupefacenti, dei derivati della canapa (hashish
e marijuana). Questi fatti portarono al bando della coltivazione della canapa indiana e
di riflesso anche della canapa comune. Infatti, l’art. 26 del D.P.R. n° 309 del 1990,
sancisce il divieto della coltivazione di canapa indiana nel territorio dello Stato e poiché dal punto di vista botanico non esistono
differenze univoche e riproducibili tra canapa da droga e da fibra, a parte il differente
contenuto di THC, di conseguenza la coltivazione di canapa da fibra ha generato equivoci negli organi preposti alla repressione
dell’uso degli stupefacenti; infatti, scambiando la canapa comune per canapa indiana si
sono attivate spesso istruttorie con sequestro
della coltura e sanzioni per l’agricoltore
(Ranalli, 1998).
Negli ultimi anni si è assistito comunque
ad un rinnovato interesse per la canapicoltura
giustificato da fattori agronomici e dai molteplici impieghi della pianta e dei suoi derivati. Infatti, da un punto di vista agronomico,
la canapa ha la proprietà di migliorare la
fertilità del terreno, di sopprimere le erbe
infestanti (evitando l’uso di erbicidi) e di
tollerare molte fitopatie (riducendo l’uso di
pesticidi e di disinfettanti del suolo). Per
queste caratteristiche la canapa rientra perfettamente nelle attuali esigenze di coltura
eco-compatibile, a ridotto impatto ambientale (Ranalli et al., 1999). Accanto all’uso
tradizionale nell’industria tessile e cartaria,
la canapa, infatti, sta ritornando oggi sul
mercato da protagonista nel settore dell’abbigliamento; inoltre si assiste ad un impiego
crescente dei derivati della canapa nei prodotti geotessili per contenere l’erosione dei
terreni, nella bioedilizia come materiale isolante e per alleggerire i conglomerati
cementizi, nell’industria automobilistica
come materiale fonoassorbente e in vari
composti dell’industria chimico-farmaceutica. Il ruolo della canapa appare pertanto
particolarmente rilevante e rafforzato dal
possibile utilizzo nella fitodepurazione di
terreni inquinati da metalli pesanti.
MATERIALI E METODI
Materiale vegetale. Sono stati utilizzati
semi di Cannabis sativa L. varietà
Fibranova.
Prodotti. Sali di zinco: ZnSO4 al 99%,
Zn(NO3)2 al 98%, ZnCl2, al 97% (Sigma).
Soluzione nutritiva Hoagland’s (Sigma).
Germinazione in piastra. L’analisi di
germinazione è stata effettuata in cella
climatizzata ad una temperatura di 22° C,
Agroindustria / Aprile 2002 65
Figura 2 - L’analisi di germinazione è stata
effettuata utilizzando 100 semi, in condizioni di
crescita controllate. I dati rappresentano la
media ± errore standard (SE, n = 4)
semi germinati
semi deformati, rotti o vuoti
semi morti
semi imbibiti ma non germinanti
Figure 2 - Germination analyses carried out
employing 100 seeds in controlled growth
chamber. Data are mean ± SE (n = 4).
germinated seeds
deformed, broken or empty seeds
dead seeds
vital soaked seeds but not germinating
umidità 65%. I dati sono stati rilevati dopo
una settimana di germinazione in piastre
Petri, utilizzando 100 semi, la prova è stata
replicata quattro volte mantenendosi il più
possibile in condizioni di sterilità (secondo
i metodi Ufficiali di Analisi delle Sementi,
Gazzetta Ufficiale, 1993). Per il calcolo del
tempo medio di germinazione (TMG) è stata
utilizzata la formula: TMG = ∑ (n x d) / N,
(Gazzetta ufficiale, 1993).
Le concentrazioni utilizzate nelle prove di
germinazione in piastra e nella coltura
idroponica, per i tre sali ZnCl 2, ZnSO 4,
Zn(NO3)2 sono state 0 (controllo), 0.05, 0.1,
0.2 e 0.4, in acqua. La scelta di suddette concentrazioni deriva da precedenti esperimenti
che utilizzavano terreno, (Przemyslaw, 1997).
Figura 3 - Nella figura sono riportati i valori del
tempo medio di germinazione (TMG) in
condizioni di crescita controllata. I dati
rappresentano la media ± errore standard (SE, n =
4).
Figure 3 - The figure shows the mean
germination time (MGT) values in controlled
growth conditions. The data represent
the mean ± standard error (SE, no. = 4).
66 Agroindustria / Aprile 2002
Crescita nel terreno. La canapa è stata
preventivamente fatta germinare e crescere
in vaso con terreno (miscela speciale di
terriccio Hawita-Flor), fino all’altezza desiderata ed in condizioni di crescita controllate, successivamente travasata in coltura
idroponica.
Crescita in coltura idroponica. Le piante di 30 o 50 cm allevate nel terreno, sono
state trapiantate in vasi da idrocoltura, dopo
aver opportunamente lavato le radici per togliere ogni eventuale traccia di substrato,
prestando attenzione che la parte terminale
delle radici raggiunga la zona basale del
vaso, che viene quindi opportunamente riempito con argilla espansa per idrocoltura
(Blesana). I vasi, cinque per volta, sono collocati in apposite vasche da coltura
idroponica, dove viene mantenuta la soluzione nutritiva contenente il sale fino ad un
adeguato livello (Fig. 1), e mantenuti in cella climatizzata ad una temperatura di 22° C,
umidità 65%, con luce continua ad una intensità luminosa di 250 µmol s-1m-2.
RISULTATI
L’analisi di germinazione evidenzia una
percentuale di germinazione molto bassa, al
di sotto del 20% (Fig. 2). Circa il 45% dei
semi risultano morti; il 30% degli stessi subisce un’imbibizione dei tegumenti ma non
segue la germinazione e circa un 10% presentano spaccature e/o deformazioni del
seme, pertanto risultano anch’essi compromessi per la germinazione. I semi in grado
di germinare presentano tuttavia un buon
TMG, raggiungendo il suo massimo intorno
a 5 (Fig. 3). La percentuale di germinazione
in piastra, è stata effettuata anche utilizzando i tre sali di Zn alle varie concentrazioni
ed in presenza ed assenza di luce (Fig. 4).
Dalla figura 4 si osserva che la % di
germinazione al buio si mantiene moderatamente più elevata di quella alla luce soltanto nel caso del controllo, mentre varia in presenza dei tre sali di zinco alle diverse concentrazioni. Nel caso del ZnCl2 (Fig. 4A) si
osserva una riduzione della germinazione
all’aumentare della concentrazione del sale,
sia al buio sia alla luce. Un’analoga riduzione non si osserva invece con gli altri due
sali (Fig. 4B e 4C). La presenza del sale alla
più bassa concentrazione (0.05 M) determina, rispetto al controllo, una forte riduzione
della germinabilità che tende a ridursi ulteriormente alle altre concentrazioni di
Zn(NO3)2 ed alla luce, mentre al buio concentrazioni di 0.1 e 0.2 M incrementano la
germinazione a livelli paragonabili al controllo. Nel caso del ZnSO4 (Fig. 4B) alle concentrazioni di 0.1 e 0.2 M si può notare una
forte ripresa della germinazione sia al buio
sia alla luce, ma con un maggior incremento
della germinazione alla luce, per poi diminuire di nuovo a concentrazioni di 0.4 M.
La figura 5 mostra come apparivano le
piante di canapa (altezza di 30 cm), in coltura
Figura 4 - Percentuale di germinazione di semi
di Cannabis sativa in presenza dei seguenti sali:
ZnCl2, Zn SO4, Zn(NO3)2 alle concentrazioni
0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 M
alla luce
ed al buio
Figure 4 - Germination percentage of Cannabis
sativa seeds in the presence of the following salts:
ZnCl2, Zn SO4, Zn(NO3)2 at the concentrations of
0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 M and in light
or
dark
idroponica, dopo una settimana dalla sostituzione della soluzione nutritiva con quella
contenente ZnCl2, 0.4 M. A questa concentrazione, anche con gli altri sali di zinco,
l’azione tossica è molto marcata; per semplificare la comprensione dei danni
fitotossici si può osservare la Tabella 1, che
evidenzia un’azione tossica direttamente
proporzionale alla concentrazione dei tre sali
di zinco. Ritenendo che l’entità dei danni potesse derivare almeno in parte dall’utilizzo
di piante troppo giovani (altezza di 30 cm)
sono state replicate le prove in coltura
idroponica utilizzando piante alte 50 cm, ma
il risultato è rimasto immutato anche riducendo la concentrazione di zinco a 0.1 M
come si può verificare osservando la figura 6. Successivamente, utilizzando sempre
piante di canapa a 50 cm di altezza e le stesse concentrazioni dei tre sali di zinco, ma
crescendo le piante nel terreno anziché in
coltura idroponica, abbiamo evidenziato che
ZnCl2 alla concentrazione 0.1 M consente
la crescita della pianta (Fig. 7). Dopo due
settimane dall’inizio del trattamento, la pianta
Ulteriori studi devono essere intrapresi per
una più chiara comprensione delle soglie di
tolleranza della pianta ai metalli pesanti, nel
sistema di idrocoltura messo a punto; sarà
anche utile mettere in evidenza la localizzazione cellulare dei metalli stessi.
CONCLUSIONI
Obiettivo dell’indagine era lo studio della tolleranza della canapa ad alcuni sali di
Zn. Abbiamo volutamente scelto di effettuare
la nostra ricerca utilizzando la coltura
idroponica in condizioni controllate, come
substrato di crescita, anziché il terreno (in
letteratura il terreno è il substrato più utilizzato), per porci inequivocabilmente in condizioni di ripetibilità dell’esperimento e per
svincolarci completamente dalle interferenze della qualità del terreno stesso. La
sperimentazione condotta, infatti, evidenzia
Figura 5 - La foto mostra in primo piano, come
apparivano le piante di canapa, ad una altezza di
30 cm, dopo una settimana dalla sostituzione
della soluzione nutritiva pura con quella
contenente ZnCl2 0.4 M, rispetto al controllo in
secondo piano.
Figure 5 - Cannabis plants with a height of
30 cm, in hydroponics culture, after one week
from the replacement of the nutritive solution
with another containing ZnCl2 0.4 M.
Figura 7 - La sezione A e la sezione B mostrano
rispettivamente il Tempo 0 ed il Tempo 14 di un
esperimento in cui le piante venivano cresciute
in un terreno contenente ZnCl2, 0.1 M.
Figure 7 - Sections A and B show Time 0 and
Time 14 respectively of an experiment in which
the plants were grown in contaminated soil with
ZnCl2, 0.1 M.
appariva in buone condizioni ed addirittura
sembrava aver subito un apprezzabile allungamento degli internodi.
DISCUSSIONE
La scarsa germinazione dei semi osservabile in figura 2 può derivare presumibilmente dalle non idonee condizioni di raccolta e conservazione del seme, peculiarità
peraltro già osservata da altri ricercatori nell’ambito di questo progetto. L’andamento
della germinazione (Fig. 4) in presenza dei
sali: ZnSO4, Zn(NO3)2, non è quello che ci
si poteva attendere, cioè un calo della
germinabilità all’aumentare della concentrazione, come peraltro avviene nel caso del
ZnCl2. Riteniamo che questo fenomeno sia
determinato presumibilmente da un effetto
positivo sulla germinazione, derivante dallo
ione solfato e nitrato che contrastano parzialmente l’effetto inibente del metallo. Nel
caso della crescita in suolo della canapa in
presenza di ZnCl2, 0.1 M (Fig. 7) appare
evidente l’effetto tampone esercitato dal terreno rispetto alla coltura idroponica. È possibile che i sali del metallo rimangano legati
alla sostanza organica del terreno, consentendo la sopravvivenza della pianta. Da successive prove effettuate su un maggior numero di individui sembra che l’allungamento degli internodi possa derivare da una variabilità individuale piuttosto che ad un effetto del sale stesso.
Figura 6 - La figura mostra un confronto fra
piante di canapa cresciute in coltura idroponica.
La sezione A rappresenta il Tempo 0
dell’esperimento, la sezione B mostra le piante
14 giorni dopo la sostituzione della soluzione
nutritiva con un’altra contenente ZnCl2, 0.1 M
(Tempo 14).
Figure 6 - The figure shows a comparison of
Cannabis plants grown in hydroponics
culture. Section A represents Time 0 and
section B shows the plants 14 days after the
replacement of the nutritive solution with
another one containing ZnCl 2, 0.1 M (Time
14).
una bassa tolleranza (< 0.1 M) della canapa
ai sali di Zn, in coltura idroponica, mentre
la stessa concentrazione nel terreno è ben
tollerata dalla pianta. Occorre pertanto fare
una distinzione tra tolleranza in idrocoltura
e tolleranza nei suoli; la prima risulta molto
utile per studi fisiologici della
fitodepurazione e per uno “screening”
varietale volto ad individuare i fenotipi naturali più adatti; la seconda riguarda invece
la verifica in campo di tutto ciò che emerge
dagli studi di laboratorio.
La canapa risulta una pianta ad elevate
potenzialità produttive e ridotto impatto ambientale. La resistenza a molti insetti tellurici,
la tolleranza a molte fitopatie fungine,
batteriche e virotiche, associate ad una elevata competitività per le erbe infestanti, (poiché trattandosi di pianta ad elevata biomassa
riesce a sopprimerle), ed alla capacità di
esplorare elevati volumi di terreno, rendono
questa pianta adatta ad una agricoltura sostenibile. Il suo ruolo nella tutela dell’ambiente appare ancora più rilevante allorché
si consideri il suo utilizzo nella
fitodepurazione di terreni inquinati. La canapa può contribuire al risanamento ed al
recupero di aree compromesse da lunghi
periodi di agricoltura intensiva, depauperate
e contenenti inquinanti nel suolo e nelle acque di falda.
Il trasferimento e la implementazione a
livello applicativo di tali conoscenze conAgroindustria / Aprile 2002 67
sentiranno lo sviluppo di varietà migliorate
(per la produttività, adattabilità all’ambiente, rispondenza alle varie utilizzazioni industriali) e tecnologie di processing più predittive ed efficaci (Ranalli, 2000).
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Possibilità di impiego della canapa nella fitoestrazione di metalli pesanti in terreni
contaminati: primi risultati
Romano Giovanardi, Luca Marchiol, Gianni Tassan Mazzocco1, Fabio Zuliani.
Dipartimento di Produzione Vegetale e Tecnologie Agrarie Università di Udine
1
Azienda Agraria universitaria “A. Servadei”, Università di Udine
RIASSUNTO
Le indicazioni bibliografiche disponibili attribuiscono alla coltura della canapa interessanti caratteristiche per essere impiegata nella fitoestrazione di metalli pesanti dai terreni e acque. Con la presente ricerca sono state studiate le potenzialità della coltura per il disinquinamento di un terreno
agrario fortemente contaminato da Cd, Cr, Cu, Pb, e Zn. Operando in vaso ed in ambiente controllato sono state poste a confronto in combinazione fattoriale tre diluizioni del terreno considerato
con sabbia (1/2, 1/4 e 1/8) e tre varietà di canapa da fibra commerciali (Kompolti, Fibranova e
Carmagnola); la prova ha preso in esame una porzione limitata del ciclo vegetativo della coltura
(fino all’altezza di circa 80 cm) in modo da evitare la perdita di foglie.
Al termine della prova le frazioni vegetali (foglie, fusti e radici) sono state sottoposte ad analisi
chimica per la determinazione del contenuto in metalli pesanti assorbiti dal terreno.
Se, da un lato, è emerso come la canapa non abbia caratteristiche di pianta iperaccumulatrice, è
stata anche evidenziata una notevole capacità della coltura di fissare nella biomassa elevate quantità degli elementi considerati, senza differenze tra le cultivar a confronto ma con risposte diverse
nei confronti dei singoli elementi. In corrispondenza del livello più elevato di contaminazione del
terreno, la coltura ha ridotto la quantità assorbita di Cu, Cr e Pb rispetto alle altre diluizioni; nel
caso di Zn e Cd l’assobimento è risultato direttamente proporzionale alla concentrazione nel terreno.
In considerazione di due ipotesi praticabili di asportazione di biomassa dal terreno (fusti+foglie e
solo fusti) è stato evidenziato come le foglie rivestano un ruolo importante nell’accumulo di elementi assorbiti dall’intera pianta, da cui la necessità, al fine di massimizzare la fitoestrazione, di
raccogliere la pianta in modo da avere le minori perdite delle stesse.
Infine è apparso evidente che una quota consistente di elementi viene fissata nelle radici contribuendo in qualche modo a ridurre il rischio di lisciviazione degli stessi dal terreno.
Parole chiave: canapa, metalli pesanti, fitoestrazione.
ABSTRACT
Possibility of using hemp in heavy metal phytoextraction from contaminated soils: preliminary
results
Fiber hemp has good prospects as a crop for phytoextraction programmes of contaminated soils,
according to the high ability of soil exploration by the root system and the high levels of biomass
production.
As a result of the “difficult” position of the plant from a legal point of view (restriction/ban of
cultivation for THC content of plant) investigations of the performance of the plant for phytoextraction
of contaminated soils are at an initial stage. The interest in the plant cultivated for fiber is increasing
in Europe and America (Canada and USA) and, as a consequence, the good qualities of the crop are
being rediscovered.
An experiment was carried on to study the phytoextraction capability of the plant from a soil
contaminated by different Heavy Metals (HM): Cu, Cd, Cr Pb and Zn. Different soil/sand mixturerates were used to cultivate three fiber hemp cultivars (Kompolti, Fibranova and Carmagnola). A
limited part of the vegetative cycle was considered (max 80 cm height), in order to avoid loss of
senesced leaves.
Cultivation was carried out, monitoring crop growth and water consumption; at the end of the
considered period yield of aboveground biomass was determined. Plant samples were analysed for
HM content (in leaves, stem and roots) in order to determine HM uptake by the plants.
In this study the hemp behaved as a non hyperaccumulating plant but was able to fix high levels of
HM; differences on HM absorption were observed as affected by different HM: Cd, Cr, Cu, Pb, Zn
but also due to HM level in the soil (dilution rate). In particular, Cd and Cu decreased HM
phytoextraction at higher levels of HM content while Pb and Zn uptake was proportional to soil
content at considered levels.
No differences between cultivars were observed.
Considering that HM uptake is higher in leaves, crop harvest for phytoextraction should consider
minimising leaf losses through short crop cycles; HM fixation in root biomass reduces the risk of
leaching losses.
Key words: hemp, heavy metals, phytoextraction.
Autore corrispondente: Romano Giovanardi
Dipartimento di Produzione Vegetale e
Tecnologie Agrarie - Università di Udine
Via delle scienze, 208, 33100 Udine, Italia
Tel. (0432) 558601 - Fax (0432) 558603.
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
INTRODUZIONE
La contaminazione dei suoli da parte dei
metalli pesanti di origine antropica deriva
da attività industriali (es. siderurgica, tessile) ed agricole (impiego di fertilizzanti,
antiparassitari, di compost e di fanghi di
depurazione).
La bonifica ed il recupero ambientale delle
aree inquinate mediante l’impiego dei mezzi tradizionali richiede considerevoli risorse
economiche e tecnologiche (Evanko e
Dzombak, 1997). Per questo motivo negli
ultimi anni si è sviluppato un grande interesse per le tecniche di bonifica basate su
organismi vegetali (phytoremediation) e
microrganismi
(bioremediation)
(Cunningham and Ow, 1996). In particolare, per l’intervento in aree contaminate da
metalli pesanti è stato proposto l’impiego di
piante iperaccumulatrici (Brooks et al.,
1977), specializzate nell’accumulo di elevate
concentrazioni di elementi inquinanti. I lavori fondamentali di Baker (1987) e Baker e
Brooks (1989) dimostrarono che le specie
iperaccumulatrici tendono ad essere molto
efficienti per uno o due metalli, ma i suoli
contaminati da fonti antropiche spesso contengono diversi elementi, determinando in
sostanza condizioni lontane da quelle che
hanno determinato la selezione naturale delle
piante iperaccumulatrici. Questo è il motivo
fondamentale per il quale la fitoestrazione
viene considerata come una tecnica promettente ma ancora da mettere a fuoco (Marchiol
e Zerbi, 2000).
L’utilizzo su larga scala delle specie
iperaccumulatrici adatte ai climi continentali è al momento non praticabile perchè
quelle di cui si dispone hanno ridotta produzione di biomassa e soprattutto accrescimento particolarmente lento. Pertanto attualmente la ricerca è impegnata nello studio delle potenzialità di fitoestrazione anche di specie delle quali sono note, almeno in parte, le
pratiche di gestione agronomica ma non si
conoscono le prestazioni in termini di
fitoestrazione; l’ipotesi allo studio è quella
di compensare la minore efficienza di
fitoestrazione dei metalli pesanti con la maggiore produzione di biomassa vegetale che
sono capaci di produrre molte specie agrarie. Tra queste, la canapa (un tempo ampiamente diffusa nei nostri areali), risulta di particolare interesse per la sua elevata capacità
di esplorare il terreno e perché fornisce un
prodotto a destinazione non alimentare (tessile, cellulosa, energia, ecc.).
Gli studi in tal senzo su questa coltura sono
ancora molto limitati e prevalentemente rivolti a verificare le possibilità di
fitodepurazione delle acque reflue derivanti
da depuratori urbani con risultati che appaiono incoraggianti (Lauda et al., 1999;
Michaloich et al., 1999; Wisniewsky et al.,
1999; Filiepek et al., 1999).
Agroindustria / Aprile 2002 69
Tabella 1 - Caratteristiche chimico-fisiche del suolo e della sabbia utilizzati per la ricerca in vasi.
Table 1 - Physical and chemical analysis of soil and sand used for the pot trial.
Parametri
Risultati
Terreno
Sabbia
Metodo
Scheletro (>2 mm)
setacciatura
% p/p
Terra fine (<2 mm)
“
“
Sabbia (t.f.)
sedimentazione
“
“
“
Argilla (t.f.)
“
“
Limo (t.f.)
pH (H2O 1:2.5)
potenziometrica
“
PH (KCl 1:2.5)
gasvolumetria
% p/p
Calcare (CaCO3)
Carbonio (C) organico
Walkley - Black
“
Humus
“
Azoto (N) totale
Kijeldhal
“
C/N
Fosforo (P) estraibile
Olsen
mg/kg
“
Potassio (K) scambiabile
BaCl2 pH 8.1
Magnesio (Mg) scambiabile “
“
Ferro (Fe) estraibile
DTPA pH 7.3
“
Manganese (Mn) estraibile
“
“
Zinco (Zn) estraibile
“
“
Rame (Cu) estraibile
“
“
Boro (B) estraibile
“
“
Calcio (Ca) estraibile
acqua bollente
“
Cmol(+)/kg
Capacità di scambio cationico BaCl2 pH 8.1
Cadmio (Cd) totale
“
mg/kg
Zinco (Zn) totale
“
Rame (Cu) totale
“
Nichel (Ni) totale
“
Piombo (Pb) totale
“
Cromo Cr) totale
“
(*) valori elevati in rapporto alle esigenze e/o tolleranza delle piante
(*) values exceeding request/tolerance by plants.
MATERIALI E METODI
Nel corso del periodo maggio-luglio 2002,
è stata condotta una prova sperimentale in
vasi contenenti terreno fortemente contaminato da metalli pesanti (Cu, Cr, Pb e Zn) raccolto nel comune di Carpiano (Milano), in
un appezzamento coltivato per lungo tempo
a marcita; l’irrigazione con acque di cattiva
qualità aveva determinato nel tempo un anomalo accumulo nel suolo di metalli pesanti
(Tab. 1).
0
0
37
11
52
6.6
6.6
4.0
2.8
4.8
0.3
9.3
104*
145
244*
3.1
0.6
35.2*
26.3*
2.1*
3300*
14.7
70.9
*
12670*
549*
64.3*
1517*
0
0
97
3
8.3
8.5
9
0.1
0.2
0.01
10
8
64
42
10.7*
7.2*
13.2*
0.7
0.1
660
0.4
-
Da prove preliminari, il terreno considerato è apparso non idoneo per l’emergenza e
la crescita della coltura della canapa e di altre colture agrarie e, conseguentemente, si è
provveduto ad effettuare la diluizione dello
stesso con sabbia nei rapporti 1/2, 1/4 e 1/8.
Sono stati messi a confronto in combinazione fattoriale tre livelli di contaminazione
e tre cultivar di canapa scelte tra quelle in
studio per valutare le potenzialità nell’impiego come colture da fibra ed autorizzate
Tabella 2 - Effetti della cultivar e delle concentrazioni di metalli pesanti (diluizione del terreno) sullo
sviluppo vegetativo alla raccolta.
Table 2 - Effects of cultivar and heavy metal concentration (dilution of soil) on plant growth, at
harvest.
Cultivar
Carmagnola
Fibranova
Kompolti
Diluizione del
terreno con sabbia
1 /2
1 /4
1/ 8
Numero nodi Lunghezza media
(n./pianta)
internodi (cm)
Altezza piante
Area fogliare
(cm)
(cm /pianta)
68.0
67.8
70.2
463
512
458
8.7 a
8.0 b
7.8 b
5.5 b
5.8 a
6.2 a
37.5 b
83.6 a
85.0 a
322 b
558 a
553 a
7.0 b
8.5 a
9.0 a
2.6 b
7.3 a
7.6 a
70 Agroindustria / Aprile 2002
2
alla coltivazione con riferimento al contenuto di THC.
La coltivazione ha considerato un periodo limitato del ciclo colturale fino al
raggiungimento di uno sviluppo in altezza
massimo di circa 80 cm, al fine da ridurre la
perdita di foglie da parte della coltura; in
particolare la semina è stata effettuata il 24/5
e la raccolta il 19/7 nel 2001. Nel corso di
tale periodo alla coltura è stata somministrata
la soluzione nutritiva Hoagland e sono stati
continuamente controllati i consumi idrici,
lo sviluppo vegetativo mentre in alcune occasioni sono stati rilevati parametri fisiologici relativi agli scambi gassosi (assimilazione fotosintetica, CER e traspirazione mediante l’analizzatore IRGA LiCor 6400).
Alla fine di tale periodo è stata raccolta
l’intera biomassa aerea distinta in foglie, fusti
e radici per la determinazione del rispettivo
peso secco; il contenuto in Cd, Cr, Cu, Pb e
Zn delle frazioni vegetali è stato determinato per le sole diluizioni 1/2 ed 1/8 mediante
analisi di spettrometria di massa (ICP-MS)
previa mineralizzazione dei campioni con
HNO3. Nelle analisi della varianza i confronti
multipli sono stati effettuati col criterio
Duncan.
RISULTATI SPERIMENTALI
Sviluppo vegetativo, produzione e consumi idrici. Nei riguardi delle diluizioni di
terreno a confronto e della conseguente concentrazione di metalli pesanti, la canapa ha
evidenziato una regolare emergenza ed una
sufficiente crescita nel periodo considerato
(Tab. 2).
Alla raccolta sono apparsi tuttavia evidenti
sensibili differenze tra le tesi in esame verosimilmente dovute agli effetti depressivi dei
metalli pesanti presenti alle concentrazioni
più elevate (diluizione 1/2), che hanno comportato una riduzione dell’altezza della pianta e della lunghezza degli internodi superiore al 50% ed una diminuzione dell’area
fogliare dell’ordine del 30%, rispetto alle altre due diluizioni; anche il numero di nodi
per pianta, è diminuito di circa il 20% alle
concentrazioni più elevate.
Non sono state invece osservate differenze di comportamento tra le varietà considerate e interazioni significative tra le diluizioni
del terreno e le cultivar.
La maggiore incidenza di metalli pesanti
alla diluizione 1/2, ha avuto un effetto negativo particolarmente accentuato sulla produzione di sostanza secca totale che appariva
ridotta, alla raccolta, di oltre il 70% rispetto
agli altri livelli di diluizione del terreno
(Tab. 3). Più in particolare la componente
relativa alla biomassa fogliare è diminuita
nella misura di circa il 60% e i fusti e le radici nella misura dell’80%.
L’analisi dei consumi idrici stagionali e
dei parametri di efficienza d’uso dell’acqua,
confermano le differenze tra i trattamenti a
confronto precedentemente osservate sugli
Tabella 3 - Effetti della cultivar e delle concentrazioni di metalli pesanti (diluizioni del terreno) sulla
produzione di biomassa secca e sulle sue principali componenti (g ss vaso-1).
Table 3 - Effects of cultivar and heavy metal concentration (dilution of soil) on dry matter and its main
components (g dm pot-1)
Cultivar
Totale
-1
Produzione di biomassa secca
Foglie
Fusti
-1
-1
Radici
-1
(g ss vaso )
(g ss vaso )
(g ss vaso )
(g ss vaso )
19.0
17.4
19.7
8.4
8.0
8.4
8.7 ab
7.8 b
9.2 a
1.8 ab
1.6 b
2.1 a
6.9 b
24.6 a
24.6 a
4.1 b
10.3 a
10.6 a
2.3 b
11.8 a
11.6 a
0.5 b
2.5 a
2.5 a
Carmagnola
Fibranova
Kompolti
Diluizione del
terreno con sabbia
1 /2
1 /4
1/ 8
Figura 1 - Contenuto in metalli pesanti (a) nella pianta (ppm) e rapporto (b) con la concentrazione nel
terreno (%).
Figure 1 - Heavy metals in plant tissues (a) and rate (b) of plant/soil content (%).
Tabella 4 - Effetti della cultivar e delle concentrazioni di metalli pesanti sulla assimilazione
fotosintetica (CER), traspirazione (T) ed efficienza d’uso dell’acqua (WUE).
Table 4 - Effects of cultivar and heavy metal concentration (dilution of soil) on gas exchange of plants
and water use efficiency.
Cultivar
Consumo WUE
CER
T
WUE
-2 -1
-2 -1
idrico (g ss-1) (µmol CO2 m s ) (mmol H2O m s ) (mmol CO2 mmol H2O)
Carmagnola
Fibranova
Kompolti
10.18 ab
9.88 b
10.37 a
1.73
1.65
1.82
30.2 a
26.3 ab
25.5 b
4.18
3.51
2.94
7.52
8.28
9.46
Diluizione del
terreno con sabbia
1 /2
1 /4
1/ 8
7.68 b
11.53 a
11.21 a
0.88 b
2.14 a
2.19 a
25.1 b
28.8 a
29.1 a
3.69
3.81
3.47
6.92
8.40
9.23
aspetti vegetativi e produttivi (Tab. 4). Su
tali parametri sono apparse evidenti anche
variazioni dipendenti dal rapporto tra la traspirazione e l’evaporazione della coltura che
è risultato inferiore nel caso della diluizione
1/2.
Le varietà a confronto non si sono differenziate sia a livello di consumo idrico che
di efficienza di uso dell’acqua.
Gli effetti dei fattori considerati si sono
manifestati anche sulla intensità degli scambi
gassosi (acqua e CO2) rilevati in prossimità
della raccolta.
Con riferimento a una giornata tipo, l’assimilazione fotosintetica più elevata è stata
rilevata in Carmagnola e, per quanto concerne il flusso traspirativo, in Carmagnola e
Fibranova (Tab. 4). La maggiore concentrazione di metalli pesanti ha influenzato negativamente il flusso di CO2.
Concentrazione e fissazione di metalli
pesanti nella biomassa. Nel caso del rame,
dello zinco e del cadmio il loro contenuto
nei tessuti vegetali è risultato maggiore nei
terreni caratterizzati dalle concentrazioni
degli stessi più elevate (diluizione 1/2). Precisamente, a fronte di una maggiore concentrazione del 300% nel terreno diluito 1/2,
rispetto a quello diluito 1/8, sono stati riscontrati incrementi dell’80% nel caso del rame,
del 218% nel caso dello zinco e del 280%
nel caso del cadmio (Tab. 5).
Per il cromo l’assorbimento è al contrario
diminuito nella misura del 48% circa in corrispondenza delle concentrazioni più elevate mentre è rimasto pressoché invariato nel
caso del piombo.
Per quanto riguarda l’assorbimento dei
metalli pesanti il comportamento delle tre
cultivar non si è differenziato ad eccezione
dell’assorbimento del cromo, risultato maggiore nel caso della varietà Kompolti.
Per valutare l’efficienza di fitoestrazione
della coltura è stato calcolato il rapporto tra
le concentrazioni dei singoli metalli nei tessuti vegetali e nei terreni.
Da questa analisi la canapa non ha
evidenziato le caratteristiche tipiche delle
specie iper-accumulatrici di metalli pesanti
(ovvero un rapporto superiore all’unità), presentando concentrazioni degli stessi nei tessuti sempre inferiori a quelle presenti nel
terreno (Fig. 1). In ogni caso la coltura è
apparsa in grado di assorbire cospicue quantità di elementi, in rapporto al normale range
di variazione degli stessi nei tessuti vegetali.
Le concentrazioni di metalli pesanti nelle
frazioni vegetali hanno raggiunto valori
massimi intorno al 15-20% rispetto a quelle
rilevate nel terreno per il rame, lo zinco ed il
cadmio senza comportare sensibili decrementi produttivi. In particolare, passando
dalla diluizione 1/2 a 1/8, il rapporto percentuale tra le concentrazioni di metalli presenti nei tessuti vegetali e nel terreno è aumentato sensibilmente nel caso del rame e
del piombo, è diminuito nel caso dello zinAgroindustria / Aprile 2002 71
Tabella 5 - Influenza dei fattori in studio sulle concentrazioni dei metalli pesanti sulla biomassa (ppm).
Table 5 - Effects of considered factors on heavy metal concentration in plant biomass (ppm)
Fattori in studio:
Cr
Cu
Pb
Zn
Cd
Diluizione
1 /2
1.41 b
19.8 a
7.63
820 a
5.38 a
terreno
1 /8
2.71 a
11.0 b
10.26
196 b
1.41 b
Carmagnola
1.82
16.6
7.32
499
3.19
Fibranova
1.94
15.5
9.92
505
2.58
Kompolti
2.43
14.1
9.59
520
4.41
2.06
15.4
8.94
508
3.39
Cultivar
Medie
co ed è rimasto invariato nel caso del cadmio.
Anche le quantità complessive di metalli
pesanti presenti nella biomassa sono variate
sensibilmente in relazione sia all’elemento
considerato che alla concentrazione dello
stesso nel terreno (Tab. 6).
In corrispondenza dei livelli più elevati di
contaminazione l’assorbimento di cromo,
rame e piombo è diminuito mentre quello di
zinco e cadmio è rimasto invariato. In particolare per il cromo, precedentemente segnalato per le basse concentrazioni nelle
piante allevate nei terreni maggiormente
contaminati, l’assorbimento è risultato pari
ad appena il 15% di quello relativo ai terreni meno contaminati.
Un comportamento analogo ma meno accentuato si è osservato nel caso del piombo
e del rame.
La fissazione dello zinco nella biomassa
è apparsa poco influenzata dal livello di
contaminazione del terreno; questo metallo,
è stato assunto in quantità molto elevate (circa 1 mg per pianta), ed appare ben sopportato dalla canapa anche alle concentrazioni più
elevate.
Solo nel caso del cromo le tre cultivar si
sono differenziate nella capacità di assorbimento dei metalli pesanti mostrando, nell’ordine, una maggiore abilità per Kompolti se-
guita da Fibranova e Carmagnola.
I rapporti tra le quantità di metalli pesanti
accumulate nella pianta e quelle presenti nel
terreno risultano sempre molto bassi; anche
a causa della forte sproporzione tra massa
del terreno considerato e biomassa vegetale
in esso sviluppata, essi raggiungono appena
lo 0.4 - 0.5‰ nel caso di rame, zinco e
cadmio e valori poco superiori allo 0.1‰ nel
caso del piombo (Tab. 7).
Essi, inoltre, appaiono tendenzialmente
minori in presenza di concentrazioni di metalli nel terreno più alte.
Ripartizione nella biomassa e potenziali
asportazioni dei metalli pesanti. La diversa ripartizione dei metalli pesanti nelle varie parti della biomassa (foglie, fusti e radici) (Tab. 8), ha messo in evidenza risultati
molto diversi in funzione delle due differenti
ipotesi di raccolta della biomassa stessa (fusti + foglie e solo fusti) (Tab. 9).
Con riferimento alla asportazione dal terreno di tutta la parte aerea, la quantità complessiva di metalli asportata dal suolo ha raggiunto circa 4.1 mg vaso -1, mentre con
l’asportazione dei soli fusti, essa ha raggiunto circa 0.9 mg vaso-1. Le due ipotesi considerate ipotizzano ovviamente anche due differenti destinazioni dei prodotti asportati dal
campo: produzione di energia, nel primo
caso, e per uso tessile o per cellulosa, nel
secondo.
La frazione di biomassa più interessata
all’accumulo dei metalli pesanti è risultata
percentualmente quella delle radici. Poiché
non è possibile effettuare la raccolta di questa componente, si può comunque ipotizzare un beneficio della coltura derivante dalla
consistente nella temporanea fissazione dei
metalli nella sostanza organica non asportata del suolo con riduzione del rischio di
dilavamento degli stessi dal terreno.
In relazione ai metalli pesanti prelevati dal
terreno, le asportazioni nel caso di zinco e
cadmio sono variate in misura proporzionale al contenuto di metalli del terreno, mentre sono risultate maggiori nel caso di cromo, rame e piombo con diluizione 1/8.
CONCLUSIONI
Dai primi risultati ottenuti, l’impiego della canapa da fibra per la fitoestrazione di
metalli pesanti è risultata interessante in relazione sia alla capacità della coltura di
esplorare il terreno in profondità, assorbendo grandi volumi di acqua e cospicue quantità di elementi posti in soluzione, sia alla
sua buona produttività e tolleranza nei riguardi dei metalli pesanti.
La diversa ripartizione nelle frazioni del-
Tabella 6 - Influenza dei fattori in studio sull’accumulo dei metalli pesanti nella biomassa totale (µg vaso-1).
Table 6 - Effects of considered factors on heavy metal concentration in plant biomass (µg pot-1).
Fattori in studio:
Cr
Cu
Pb
Zn
Cd
Diluizione
1 /2
9.7 b
126 b
56 b
5528
37.6
terreno
1 /8
65.1 a
267 a
246 a
4688
33.5
Carmagnola
Cultivar
28.5 c
197
121
4474
25.1
Fibranova
37.9 ab
194
197
4659
25.9
Kompolti
45.7 a
199
136
6191
55.6
37.4
197
151
5108
35.5
Medie
72 Agroindustria / Aprile 2002
genotipi, diversi substrati pedologici e tecniche di intervento (ricorso a composti chelanti).
Tabella 7 - Influenza dei fattori in studio sul rapporto (‰ del valore iniziale) tra metalli pesanti
presenti nella pianta e nel terreno.
Table 7 - Effects of considered factors on plant/soil concentration rate (‰ of soil original value).
Fattori in studio:
Cu
Pb
Zn
Diluizione
1 /2
0.092 b
0.015 b
0.175 b
0.212 b
terreno
1 /8
0.779 a
0.260 a
0.592 a
0.756 a
Carmagnola
0.478
0.123
0.378
0.400
Fibranova
0.430
0.199
0.344
0.380
Kompolti
0.399
0.090
0.427
0.673
0.436
0.137
0.383
0.484
Cultivar
Medie
la biomassa ed il particolare accumulo dei
metalli nelle foglie, suggerisce la raccolta
anticipata della coltura prima che inizi la
naturale defogliazione della pianta, asportando l’intera parte aerea al fine di massimizzare
l’effetto di fitoestrazione.
L’eccessiva presenza di metalli pesanti
deprime, in generale, le potenzialità di bonifica dei terreni da parte della coltura, con
l’eccezione di alcuni elementi che sono par-
BIBLIOGRAFIA
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Michalojc, Z., Nurzynski, J, 1999. Folia
Universitatis-Agriculturae-Stetiniensis,
Agricoltura 77, 271-276.
Wisniewski, J., Kolodziej, B, 1999. Folia
Universitatis-Agriculturae-Stetiniensis,
Agricoltura 77, 379-385.
Cd
ticolarmente ben tollerati come lo zinco.
I genotipi a confronto, caratterizzati da
analoghe capacità produttive, non hanno
evidenziato una diversa abilità nella fitoestrazione.
La ricerca, ancora in fase di completamento, si propone innanzitutto la conferma
delle indicazioni fin d’ora acquisite e, sulla
base di ulteriori aprofondimenti, di ampliare
le conoscenze con riferimento a nuovi
Tabella 8 - Concentrazione di metalli pesanti sulle varie frazioni della pianta (ppm).
Table 8 - Heavy metals concentration in plant fractions (ppm).
Frazioni
della pianta
Foglie
Diluizioni
del terreno
Cr
Cu
Pb
Zn
Cd
1 /2
1 /8
0.63 b
2.80 a
1.71
15.98 a
4.00 b
9.99
0.36 b
9.47 a
4.91
916 a
238 b
577
2.83 a
0.42 b
1.62
1 /2
1 /8
0.45 b
1.15 a
0.80
16.04 a
8.81 b
12.42
6.86 a
2.58 b
4.72
494 a
50 b
273
2.43 a
0.27 b
1.35
1 /2
1 /8
8.94
9.61
9.28
58.4
48.6
53.5
51.3
46.0
48.6
1303 a
692 b
997
30.3 a
10.6 b
20.4
Medie
Fusti
Medie
Radici
Medie
Tabella 9 - Fitoestrazione di metalli pesanti (µg vaso-1) in relazione alla diluizione del terreno e a differenti ipotesi di asportazione della biomassa.
Table 9 - Phytoextraction of heavy metals (µg pot-1) related to soil dilution and different biomass harvesting hypotheses.
Frazioni della
pianta
Diluizioni
del terreno
Foglie + Fusti
Cr
Cu
Pb
Zn
Cd
1 /2
1 /8
3.9 b
40.8 a
22.3
97.7
144.2
121.0
24.2
132.4
78.3
4764 a
2964 b
3864
17.1 a
7.2 b
12.1
1 /2
1 /8
0.9 b
12.9 a
6.9
33.1 b
103.2 a
68.2
22.7
32.4
27.6
1024 a
584 b
804
5.6
3.0
4.3
Medie
Fusti
Medie
Agroindustria / Aprile 2002 73
Utilizzo in pieno campo dei reflui da macerazione della canapa: influenza sulla
microflora tellurica
C. Gamba, C. Piovanelli, S. Simoncini, M. Di Candilo1
Istituto Sperimentale per lo Studio e la Difesa del Suolo - Piazza M. D’Azeglio 30, FI
1
Istituto Sperimentale per le Colture Industriali, Bologna.
RIASSUNTO
In una prova di campagna sono state distribuite, sul terreno coltivato a grano, diverse quantità di
acque reflue da macerazione della canapa per studiarne l’influenza sulla microflora del suolo.
La biomassa microbica nei suoli trattati aumenta soprattutto quando si innalza la temperatura che
stimola la crescita dei microrganismi eterotrofi. Questo aumento della biomassa è positivo poiché,
come dimostrano la costanza del tasso di mineralizzazione della S.O. e la diminuzione del quoziente metabolico, non determina condizioni anomale nel terreno.
L’attività respiratoria e il contenuto della S.O. del terreno non sono influenzati dalla somministrazione
dei reflui.
Dopo un ripetuto apporto di reflui al suolo si è verificata una inibizione dell’attività ureasica limitata alla prima settimana dallo spandimento. Ad un mese dal trattamento si osserva invece un
aumento, proporzionale alle dosi di refluo, della fosfatasi. L’attività ammonio-ossidante presenta
transitorie variazioni positive una settimana dopo lo spandimento. L’attività enzimatica denitrificante
assume valori considerevoli solo nel periodo autunnale, caratterizzato da piogge intense, allorché
presenta anche modeste variazioni dovute all’apporto di acque da macerazione.
Parole chiave: canapa; reflui da macerazione; biomassa microbica; quoziente metabolico; attività
enzimatiche.
ABSTRACT
Effects on soil microflora of the use of hemp wastewater in the open air
During a test carried out in the country, different quantities of wastewater coming from the soaking
of hemp were spread over a soil cultivated with wheat (0.80 and 160 m ha in the year 2000 and
double doses, repeated after six months, in the following year). The aim of this test was to see, by
means of biochemical techniques, how the soil microflora composition and its activity is affected
by the treatment with wastewater in the long run.
The microbial biomass turns out to be greatly stimulated by the treatment, especially when a rise of
temperature produces a stimulus in the heterotrophic micro-organisms feeding on the nutrients in
the soil. This rise of the biomass can be considered a positive fact because, as shown by the
invariariability of the S.O. mineralization rate and the decrease in the metabolic quotient, it does
not cause any anomalous conditions in the treated soil.
Respiration is not notably affected by wastewater doses, as this parameter changes especially as a
result of the seasonal rise in temperature. The contents of S.O. in the soil are also not affected by the
wastewater.
As for the study of enzymatic activity, an inhibition of the ureasic activity in the soils treated with
wastewater during the first week following the treatment can be seen; this inhibition disappears
completely after the first month. On the contrary, during the subsequent period there is an increase
in the phosphates proportional to the doses which were spread over the soil. The ammonification
turns out to be stimulated by the wastewater addition, although this effect does not last beyond the
first week after the treatment. Due to the incoherent nature of the soil, the enzymatic denitrification
activity is rather moderate and slightly increased as a result of the wastewater addition. In autumn,
when heavy rain occurs, the potential denitrification activity reaches considerably high values,
showing the effect of the soaking waters only for the intermediate dose.
Key words: hemp; wastewater; microbial biomass; metabolic quotient; enzymatic activities.
INTRODUZIONE
La macerazione degli steli di canapa è normalmente eseguita in apposite vasche con
Autore corrispondente: Piovanelli C - Istituto
Sperimentale per lo Studio e la Difesa del Suolo
Piazza M. D’Azeglio 30 Firenze, Italia - Tel.
(055) 2491227 - Fax (055) 241485 - E mail:
[email protected] oppure [email protected]
Lavoro svolto con finanziamento MiPAF
nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra
tessile: dalla produzione alla utilizzazione”.
74 Agroindustria / Aprile 2002
acqua stagnante; alla fine del ciclo si ha un
refluo ricco di sostanze organiche e con alta
carica microbica, che potrebbe essere utilmente impiegato in agricoltura, direttamente o tramite compostaggio. La restituzione
ai suoli coltivati di questi reflui può rappresentare una soluzione per ridurre l’impoverimento in sostanza organica dei terreni poiché, di solito, le sostanze organiche contenute nei reflui migliorano le caratteristiche
chimiche e biologiche del suolo (Piccone,
1991).
Scarsi sono in bibliografia i dati concernenti gli effetti della somministrazione di
reflui da macerazione della canapa sulle
piante e sulla comunità batterica del suolo.
A tal fine è stata impostata una prova di campagna distribuendo, sul terreno coltivato a
grano, diverse quantità di refluo, per seguire nel tempo l’influenza che esso ha sulla
composizione della microflora del suolo e
sulle sue attività biochimiche, nonché sulla
vegetazione della coltura.
Per le analisi biochimiche, su terreni prelevati in epoche successive, abbiamo determinato la biomassa microbica totale, col metodo SIR (Substrate-Induced Respiration).
Sebbene la biomassa microbica sia solo una
piccola parte (dall’ 1 al 4%) del C organico
del terreno (Jenkinson e Ladd, 1981;
Anderson e Domsch, 1989) essa ha una grande importanza per la nutrizione della pianta
(Schnürer et al., 1985) e i suoi valori sono
riconosciuti essere molto sensibili alle variazioni che si verificano nel suolo
(Powlson et al., 1987; Brookes, 1995; Kaiser
et al., 1995) per cui la sua determinazione è
frequentemente impiegata nel confronto di
diversi trattamenti agronomici (Lynch e
Panting, 1980; Drury et al., 1991; Smith et
al., 1995). Abbiamo altresì determinato l’attività respiratoria della microflora, perché
questa attività riflette la velocità di degradazione della sostanza organica da parte dei
microrganismi (Nannipieri, 1991) ed è un
utile indice per quantificare l’attività
microbiologica globale del suolo. Poiché nel
terreno trattato si può avere una esaltazione
dei processi catabolici, abbiamo calcolato
l’indice di mineralizzazione del C
(Florenzano, 1982) e il quoziente metabolico (qCO2) (Anderson e Domsch, 1985), che
sono indici adatti a quantificare lo stato di
efficienza e di affaticamento della microflora.
Inoltre, dal momento che l’aggiunta al suolo di substrati organici labili contenuti nei
reflui di macerazione può stimolare le attività enzimatiche, soprattutto di quelle coinvolte nel ciclo dell’azoto, abbiamo esteso le
nostre indagini allo studio dell’attività
denitrificante potenziale (DEA), che risulta
generalmente ben correlata al contenuto di
sostanza organica facilmente assimilabile
(Burford e Bremner, 1975), dell’attività ammonio ossidante potenziale (PNA),
dell’ureasi, nonché della fosfatasi. I cambiamenti delle attività enzimatiche sono spesso
utilizzati per valutare la fertilità del suolo
(Nannipieri, 1994), poiché permettono di integrare gli studi biochimici sulla microflora,
Tabella 1 - Contenuto medio di carbonio organico, respirazione e coefficiente di mineralizzazione del
suolo sottoposto allo spandimento di reflui il 2/03/00.
Table 1 - Organic carbon amount, soil respiration and organic carbon mineralization after
wastewater spreading (02/02/01).
C.O.
%
Respirazione
-1
mgCO2 kg dm 24h
-1
Coef. min. C
%
10/03/00
Test
80
160
0.985 ± 0.006
1.013 ± 0.063
0.994 ± 0.014
62.69 ± 0.98
67.16 ± 0.32
70.61 ± 0.51
1.202 ± 0.181
1.259 ± 0.139
1.343 ± 0.101
19/04/00
Test
80
160
1.010 ± 0.030
1.117 ± 0.003
1.027 ± 0.027
73.53 ± 0.49
96.93 ± 0.84
66.34 ± 0.38
1.377 ± 0.128
1.639 ± 0.143
1.230 ± 0.037
29/05/00
Test
80
160
0.996 ± 0.021
1.023 ± 0.026
1.115 ± 0.028
105.90 ± 1.40
105.73 ± 0.72
103.95 ± 0.52
2.008 ± 0.254
1.955 ± 0.179
1.788 ± 0.112
dal momento che le attività enzimatiche
extracellulari svolgono un ruolo indipendente dai microrganismi e non risentono dei fattori che influenzano la vita di questi ultimi.
MATERIALI E METODI
Piano sperimentale. La prova di campagna è stata effettuata ad Anzola dell’Emilia
(BO), presso l’azienda “Ca’ Rossa”, dell’Istituto Sperimentale per le Colture Industriali.
Il terreno delle parcelle è pianeggiante, franco, posto in zona a regime climatico temperato, con piovosità di 618 mm (media annua
ventennale), classificato come Udifluvent
tipico (Soil Survey Staff, 1996).
Il piano sperimentale prevede il confronto fra parcelle coltivate a frumento tenero
(cv Serio), trattate con tre diversi volumi di
acque reflue: 0, 80 e 160 m3 ha-1 nell’anno
2000 e volumi doppi nel 2001. È stato adottato uno schema sperimentale a blocco
randomizzato, con quattro ripetizioni e parcelle da 25 m 2 (Fig. 1). Le operazioni
colturali, come nella norma, sono state limitate alla concimazione minerale e al diserbo
chimico. La prima è stata realizzata con apporti all’impianto della coltura (160 kg ha-1
di P 2O 5 e 100 kg ha -1 di N sotto forma
ammoniacale) e in copertura (78 kg ha-1 di
N sotto forma nitrica).
Nel primo anno i reflui sono stati distribuiti il 2 marzo, prelevandoli da contenitori
in cui erano state stoccate le acque utilizzate per la macerazione della canapa. Circa
2,5 quintali di steli, riuniti in mannelli, sono
stati immersi in una vasca di 9 m3 contenente acqua di falda e sono stati lasciati a macerare per 7 giorni (Fig. 2). La distribuzione in
campo è stata effettuata con apparato artigianale riprodotto in figura 3. Le acque di
spargimento sono il risultato di 2 cicli di
macerazione. I prelievi del terreno per le analisi sono stati effettuati il 10 marzo, il 19 aprile e il 29 maggio, a 0-20 cm di profondità.
Nell’anno successivo la prova è stata realizzata su terreni contermini; i reflui sono
stati distribuiti il 24 aprile e, sempre sulle
stesse parcelle, una seconda volta il 16 ottobre, al fine di valutare l’effetto di dosi ripetute. I prelievi, eseguiti con la stessa metodica
Tabella 2 - Contenuto di carbonio organico, respirazione e coefficiente di mineralizzazione del suolo
sottoposto allo spandimento di reflui il 24/04/01 ed il 16/10/01.
Table 2 - Organic carbon amount, soil respiration and organic carbon mineralization after
wastewater spreading (24/01/01 and 16/10/01).
C.O.
%
Respirazione
-1
-1
mgCO2 kg dm 24h
Coef. min. C
%
24/05/01
Test
160
320
0.991 ± 0.001
0.944 ± 0.007
0.924 ± 0.082
55.25 ± 5.39
64.39 ± 14.57
51.47 ± 10.08
1.054 ± 0.103
1.289 ± 0.292
1.052 ± 0.206
03/07/01
Test
160
320
0.927 ± 0.027
0.934 ± 0.031
0.888 ± 0.031
93.82 ± 5.99
91.58 ± 13.79
92.80 ± 12.09
1.912 ± 0.122
1.853 ± 0.279
1.975 ± 0.257
23/10/01
Test
160
320
0.889 ± 0.093
0.954 ± 0.008
0.862 ± 0.129
69.85 ± 3.84
66.30 ± 3.82
68.86 ± 8.81
1.485 ± 0.082
1.313 ± 0.075
1.509 ± 0.193
19/11/01
Test
160
320
0.895 ± 0.025
0.868 ± 0.099
0.852 ± 0.031
70.87 ± 12.66
59.74 ± 1.98
61.92 ± 2.60
1.496 ± 0.267
1.301 ± 0.043
1.373 ± 0.058
dell’anno precedente, sono stati effettuati il
24 maggio ed il 3 luglio, dopo il primo trattamento, ed il 23 ottobre e il 19 novembre
dopo il trattamento ripetuto. Per tutti i prelievi il terreno è stato vagliato a 2 mm e conservato in frigorifero a +4°C. Prima delle
analisi biochimiche, esso è stato umidificato
alla capacità di campo e preincubato per una
settimana a +24°C.
Analisi biochimiche. Il carbonio organico (C.O.) è stato determinato, sia nel terreno che nelle acque di macerazione, per
ossidazione a caldo con bicromato di potassio, in presenza di acido solforico, e successiva titolazione con sale di Möhr
(Yeomans e Bremner, 1988). La misurazione dell’attività respiratoria del suolo è stata effettuata incubando 100 grammi di terreno in contenitori chiusi e determinando
la CO2 prodotta per differenza di pesata utilizzando calce sodata (Edwars, 1982; Raich
et al., 1990). La biomassa microbica è stata valutata col metodo SIR (Anderson e
Domsch, 1978), incubando il terreno con
l’aggiunta di glucosio e determinando la
CO2 prodotta per via gascromatografica,
con rivelatore TCD. Dal rapporto fra la respirazione, misurata su 7 giorni, ed il contenuto di carbonio organico si evince il
coefficiente di mineralizzazione del
carbonio (Dommergues, 1960). Il quoziente metabolico (qCO2) è espresso dal rapporto fra C-CO2 emessa dal suolo in 24 ore
e C della biomassa (Anderson e Domsch,
1985).
L’attività enzimatica denitrificante (DEA)
è stata determinata utilizzando il metodo di
Smith e Tiedje (1979) e successive modifiche (Tiedje, 1994), che prevede l’incubazione del terreno con una soluzione di KNO3
(1 mM) e glucosio (1 mM) in presenza di
cloramfenicolo (1 g l-1), in beute chiuse con
atmosfera priva di ossigeno e con il 10% di
acetilene (Yoshinari e Knowles, 1976). La
lettura dell’N2O prodotta è effettuata per
gascromatografia, con rivelatore ECD, su
colonna capillare 1000plot.
L’attività enzimatica ammonio-ossidante
potenziale (PNA) è stata valutata col metodo proposto da Belser e Mays (1982) con
cui si incuba il terreno per 6 ore a 26°C, in
soluzione tampone con aggiunta di solfato
d’ammonio 2 mM. La produzione di –NO2
e –NO3 è determinata per via colorimetrica
con autoanalyzer.
L’ureasi è stata determinata col metodo
proposto da Kandeler e Gerber (1988) usando urea come substrato e misurando la quantità di ammonio prodotto con spettrofotometro a 690 nm. La fosfatasi è stata valutata utilizzando la metodologia proposta
da Tabatabai e Bremner (1969), basata sulla
determinazione con spettrofotometro a
400 nm della quantità di paranitrofenolo
(PNF) formatosi per idrolisi enzimatica a
pH 6,5 dal paranitrofenilfosfato, dopo un’ora
di incubazione a 37°C.
Agroindustria / Aprile 2002 75
refluo, tende a diminuire gradualmente in
funzione della dose distribuita (Fig. 5); come
si può osservare nel secondo anno, in seguito a somministrazioni di dosi doppie e ripetute, le differenze si manifestano fra testimone e refluo, indipendentemente dalle dosi.
Per quanto concerne le attività enzimatiche
studiate, nel primo anno di prova si sono riscontrate variazioni statisticamente significative per l’attività ammonio-ossidante nei
terreni trattati con diversi apporti di refluo
(Tab. 3): dopo circa una settimana dalla
somministrazione del refluo si verifica un
incremento transitorio dell’attività
enzimatica nei terreni trattati, che si esaurisce in breve tempo e non è rilevabile nei mesi
successivi.
L’attività enzimatica denitrificante è risultata nel complesso modesta, vista la natura
abbastanza sciolta del terreno (Fig. 6). Si
osserva in luglio un incremento dell’attività
di riduzione dei composti azotati nei terreni
trattati con refluo, indipendentemente dalle
dosi somministrate. L’attività enzimatica è
molto più stimolata nel periodo autunnale,
non tanto dalla somministrazione del refluo
quanto dall’aumento dell’umidità del suolo
che, diminuendo la disponibilità di ossigeno nei pori, favorisce i processi di riduzione
enzimatica.
In conseguenza allo spandimento
autunnale dei reflui si osserva una repentina
Figura 1 - Parcelle sperimentali.
Figure 1 - Experimental plots.
Tutte le misure microbiologiche e biochimiche sono state effettuate in triplo. I risultati sono stati elaborati statisticamente con analisi della varianza (ANOVA) a due vie con
blocchi completamente randomizzati, le medie sono state comparate impiegando il test
di Duncan (Duncan’s multiple range test).
RISULTATI
Il contenuto di carbonio organico del suolo mostra delle differenze statisticamente significative solo nel primo anno di prova
(Tab. 1); nella seconda prova, nonostante il
maggior apporto di refluo non si riscontrano
differenze apprezzabili rispetto al testimone
in nessuna data di campionamento (Tab. 2).
L’attività respiratoria e la mineralizzazione
del carbonio organico non risentono in maniera notevole dell’apporto dei reflui; la variazione di questi parametri risulta maggiormente legata allo stagionale innalzamento di
temperatura, che determina un normale incremento delle attività metaboliche della
microflora, sia nel primo come nel secondo
anno di prova, indipendentemente dalle dosi
di refluo aggiunte, poiché valori più elevati
si riscontrano in prossimità della piena
allegagione (primo anno) o completa
maturazione del grano (secondo anno).
La biomassa microbica risulta essere molto stimolata dalla presenza del refluo, indipendentemente dalle dosi somministrate
(Fig. 4), questo è più evidente nei mesi primaverili–estivi (fine di maggio nel primo
anno e inizio di luglio nel secondo), allorché
l’aumento della temperatura genera uno stimolo nei microrganismi eterotrofi che utilizzano i nutrienti disponibili nel terreno per
la loro crescita.
Il quoziente metabolico della biomassa del
suolo (qCO 2), dopo lo spandimento del
Tabella 4 - Attività enzimatiche del suolo a diversi intervalli di tempo dallo spandimento dei reflui.
Lettere diverse indicano differenze significative tra le medie secondo il Test di Duncan.
Table 4 - Soil enzymatic activities at different times from the wastewater spreading. Different
letters show significant differences (Duncan’s test).
-1
-1
Ureasi (µgN-NH4 g dm 2h )
Test
160
320
Test
80
160
19/04/00
29/05/00
4.379 b
9.023 a
7.489 a
2.562 a
2.623 a
2.148 b
6.491 a
4.228 a
5.153 a
76 Agroindustria / Aprile 2002
-1
03/07/01
23/10/01
19/11/01
23/10/01
19/11/01
48.90 b
43.72 b
68.12 a
62.11 a
45.31 b
41.67 c
40.30 a
37.16 a
41.61 a
547.86 a
539.13 a
538.24 a
567.09 c
657.31 b
719.25 a
Tabella 3 - Attività enzimatica ammonioossidante del suolo (mgN g-1 6h-1). Lettere
diverse indicano differenze significative tra le
medie secondo il Test di Duncan.
Table 3 - The enzymatic ammoniumoxidation of soil (mgN g-1 6h-1). Different
letters show significant differences (Duncan’s
test).
10/03/00
-1
Fosfatasi (µgPNF g dm h )
Figura 2 - Vasche di macerazione della canapa.
Figure 2 - Hemp soaking tanks.
inibizione dell’attività ureasica proporzionale alla dose somministrata (Tab. 4); tale inibizione scompare già dopo un mese dal trattamento. Nel precedente prelievo primaverile, corrispondente a circa 3 mesi dal primo
trattamento, si verifica una ripresa dell’attività enzimatica nel suolo trattato con refluo.
L’attività fosfatasica, dopo un periodo di
latenza di circa un mese dalla seconda
somministrazione, in cui non si osservano
differenze significative fra le tesi, mostra una
stretta correlazione con le dosi di acque di
macerazione distribuite, manifestando un
aumento dell’attività enzimatica proporzionale alle quantità di refluo (Tab. 4).
Figura 3 - Apparecchiatura per la distribuzione delle acque reflue.
Figure 3 - Wastewater spreading equipment.
Biomassa C
1000
Ln(mgC 100g-1)
a
100
a
c
b
b
a
b
b
Test
b
80
160
10
1
10/03/00
19/04/00
29/05/00
Biomassa C
Ln(mgC 100g-1)
1000
100
a
a
a
b a
a
a
a
a
a a
a
Test
160
10
320
1
24/05/01
03/07/01
23/10/01
19/11/01
Figura 4 - Biomassa microbica C nel suolo trattato con diverse dosi di refluo da macerazione della
canapa. Le frecce indicano il periodo dello spandimento del refluo. Lettere diverse indicano differenze
significative fra le medie (Duncan’s test).
Figure 4 - Microbic biomass C in the soil treated with various wastewater doses. The arrows
show the period of treatment with wastewater. Different letters show significant differences
among the means (Duncan’s test).
DISCUSSIONE
Con la distribuzione delle acque di
macerazione, contenenti circa lo 0,1‰ di
carbonio, si effettua un modesto apporto al
suolo di carbonio organico, stimabile in 8 e
16 kg ha-1, rispettivamente per i trattamenti
effettuati nell’anno 2000 e del doppio per
quelli effettuati nel 2001. Nel complesso
questo apporto di sostanza organica determina un lieve incremento del contenuto di
C.O. del suolo. Si riscontra invece un aumento della biomassa in funzione del refluo
somministrato. La biomassa è un indice
molto sensibile alle variazioni che si verificano nel suolo; la sua misurazione è stata
spesso utilizzata per confrontare diversi trattamenti e gestioni del suolo (Smith et al.,
1995) e può servire come un preallarme per
tali effetti molto prima che possono essere
evidenziati in altri modi (Brookes, 1995).
Nelle nostre prove abbiamo riscontrato un
aumento della biomassa tellurica soprattutto nei mesi più caldi; questo evidenzia come
le sostanze apportate al terreno mediante le
acque reflue da macerazione della canapa
siano state metabolizzate dai microrganismi
tellurici, stimolando la riproduzione cellulare
e la crescita complessiva della microflora.
Da notare che questo aumento è accompagnato da una parallela diminuzione del qCO2
nei terreni trattati mostrando così l’assenza
di condizioni anomale, poiché non vi è necessità da parte dei microrganismi tellurici
di ossidare una maggior quantità di C.
Il qCO2, che esprime la quantità di CO2
sviluppata per unità di biomassa, è
unanimemente considerato un indicatore di
stress ambientale molto preciso (Piovanelli
et al., 1999) e molto sensibile alle perturbazioni dell’ecosistema perché, quando la
biomassa microbica è sottoposta a condizioni
di vita non ottimali, il quoziente metabolico
aumenta, cioè una maggior quantità di C viene ossidata per unità di biomassa, al fine di
riparare e mantenere attiva la macchina biochimica della cellula (Nannipieri et al.,
1995).
Il più alto grado di efficienza della
microflora nei terreni trattati, è confermato
dall’assenza di aumento della mineralizzazione del carbonio organico che, se non sarà
Agroindustria / Aprile 2002 77
*10-3
q CO2
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
a
a
ab
b
b
ab
Test
a
80
b
160
c
10/03/00
19/04/00
29/05/00
* 10-3
q CO2
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
a
b
a
a
a a a
b
Test
a
a a
a
24/05/01
03/07/01
23/10/01
160
320
19/11/01
Figura 5 - Quoziente metabolico della microflora nel suolo trattato con diverse dosi di refluo da
macerazione della canapa. Le frecce indicano il periodo dello spandimento del refluo. Lettere diverse
indicano differenze significative fra le medie (Duncan’s test).
Figure 5 - Metabolic quotient of the microflora in the soil treated with various wastewater
doses. The arrows show the period of treatment with wastewater. Different letters show
significant differences among the means (Duncan’ s test).
DEA
-1
ln(µgN-N2O g )
10000
1000
b a b
a a a
b a a
Test
100
160
320
10
1
24/05/01
03/07/01
23/10/01
Figura 6 - Attività enzimatica denitrificante del suolo (DEA) trattato con diverse dosi di refluo da
macerazione della canapa. Le frecce indicano il periodo dello spandimento del refluo. Lettere diverse
indicano differenze significative fra le medie (Duncan’s test).
Figure 6 - Denitrification Enzyme Activity (DEA) of the soil treated with various wastewater
doses. The arrows show the period of treatment with wastewater. Different letters show
significant differences among the means (Duncan’s test).
78 Agroindustria / Aprile 2002
attuata una rotazione colturale depauperatrice, nel tempo si tramuterà in un accumulo di C nel terreno con aumento della
S.O..
Per quanto concerne le attività enzimatiche
è da rilevare che gli enzimi svolgono un ruolo
importante nell’ecologia del suolo, poiché
catalizzano numerose reazioni correlate con
le trasformazioni delle sostanze nutritive
(Madejón et al., 2001). Nelle nostre prove
si sono riscontrate solo modeste e transitorie influenze sull’attività ammonio ossidante, con aumento dell’attività seguita dopo
poco tempo dal suo riequilibrio, e sull’ureasi,
con un iniziale effetto inibitorio, seguito a
distanza di qualche mese dallo spandimento,
da un incremento dell’attività in
concomitanza con l’aumento della biomassa
microbica. Un concreto stimolo dell’attività
enzimatica, imputabile all’effetto del refluo,
si è riscontrato nella fosfatasi, dopo un periodo di latenza in cui non si sono osservate
differenze fra trattamenti. L’attività
denitrificante potenziale risulta leggermente stimolata dall’apporto di sostanza organica labile contenuta nelle acque di
macerazione indipendentemente dalle dosi
somministrate; le perdite di azoto tramite
questo processo sono perciò da ritenersi
trascurabili. Il maggior stimolo per tale attività è il grado di saturazione idrica del suolo
che diminuendo la disponibilità di ossigeno
favorisce i processi di riduzione (Fireston,
1982; Williams et al., 1992; Arcara et al.,
1999).
CONCLUSIONI
I reflui derivanti dalla macerazione della
canapa sono prodotti naturali, privi di elementi xenobiotici, ottenuti senza manipolazioni chimiche e, come tali, non dovrebbero
presentare problemi tossicologici per i
microrganismi tellurici. Tuttavia il loro apporto al terreno ha comprensibili riflessi su
tutte le caratteristiche pedologiche ed implica la conoscenza dei complessi problemi di
ordine agronomico e ambientale legati al loro
uso, poiché i substrati organici labili contenuti nelle acque di vegetazione possono stimolare nel terreno processi catabolici e nuove sintesi, per l’esaltazione alla crescita dei
microrganismi eterotrofi. Nel complesso la
somministrazione al terreno di acque derivanti da macerazione della canapa, alle dosi
da noi sperimentate, peraltro assai elevate
se rapportate alle dosi permesse per legge
per altri reflui, non sembra avere influenze
negative sulla microflora tellurica e sulle
attività biochimiche ed enzimatiche indagate. Si rileva un lieve transitorio incremento del tenore di sostanza organica del terreno e dell’attività enzimatica ammonio-ossidante, e un aumento più significativo della
biomassa microbica. La diminuzione del
qCO2 e l’aumento della fosfatasi nei terreni trattati, testimoniano il miglior grado di
efficienza della microflora e, come i reflui
somministrati, determinino effetti positivi sul
metabolismo del complesso microbico, anche
alle dosi più elevate. Le transitorie
modificazioni delle attività enzimatiche di
denitrificazione e di idrolisi dell’urea sono di
modesta entità e tali da non avere influenze
negative determinanti sulla fertilità del suolo.
I risultati delle ricerche ci sembrano sufficientemente validi nel dimostrare una completa assenza di effetti negativi sulla
microflora tellurica dei reflui derivanti dalla macerazione della canapa, almeno alle
dosi e per gli aspetti indagati, e permettono
di ipotizzare che tali reflui possono essere
distribuiti al suolo senza pericolo di alterare
l’equilibrio del sistema della microflora.
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Agroindustria / Aprile 2002 79
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energia, da biomassa, da fibra e cellulosa, da
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stesso anno dello stesso Autore, all’anno si
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senza numerazione. I lavori di uno stesso Autore saranno disposti seconda la data di pubblicazione; per quelli pubblicati da uno stesso Autore in uno stesso anno verrà utilizzata
una lettera dell’alfabeto da inserire subito
dopo l’anno.
- Alcuni esempi di citazione sono riportati di
seguito:
- Articolo pubblicato su di una rivista scientifica: Martin C., Smith A.M., 1995. Starch
biosynthesis. The Plant Cell 7, 971-985.
- Articolo contenuto in un libro o in un’opera che ha un Coordinatore: Ziegler P.
1995. Carbohydrate degradation during
germination. In: Kigel J., Galili G.(eds).
Seed Development and Germination.
Marcel Dekker, New York, pp. 447-474.
- Libro con Autore: Eames A.J., 1961.
Morphology of Angiosperms. McGraw
Hill, New York.
- Gli stessi dati non possono essere presentati
in tabelle e in figura. Nel testo, le citazioni
delle tabelle e delle figure se inserite tra parentesi tonde devono usare la abbreviazione
Tab. e Fig., mentre se non inserite tra parentesi devono essere scritte in carattere minuscolo e non abbreviate.
- Le didascalie delle tabelle e delle figure,
dattiloscritte a parte, dovranno essere
autoesplicative e scritte in lingua italiana ed
inglese.
- Le tabelle, presentate su foglio a parte, devono essere limitate al minimo indispensabile, devono riportare dati arrotondati alla pri-
ma cifra decimale, devono essere intelligibili
senza dover ricorrere alla lettura del testo e
numerate con numero arabo progressivo. Le
unità di misura debbono essere chiaramente
indicate.
- Le illustrazioni, riportate separatamente dal
testo su fogli singoli, saranno solo in bianco
e nero, tutte indicate come figure (foto, disegni, grafici), numerate con numero arabo progressivo.
- Le linee e le lettere dei grafici devono essere
di colore nero e di dimensioni e nitidezza tali
da essere riprodotte senza essere ridisegnate,
tenendo conto che la base delle figure stampate potrà essere di 5.8 (1 colonna),
12.2 (2 colonne), 18.5 cm (tutta la pagina).
3. TERMINOLOGIA
- Le unità di misura e relativi simboli devono
essere quelle del sistema internazionale (S.I.).
Il simbolo, senza punto, deve seguire il valore numerico da cui sarà spaziato da uno spazio. Nel riportare brevi formule matematiche
nel testo, si deve fare uso dell’esponente negativo invece del segno di frazione (g m-2 d-1
invece di g/m2 d). Le espressioni latine, i nomi
delle entità sistematiche, le parole straniere,
limitate a quelle per le quali non esiste il corrispondente termine italiano, saranno sottolineati perché siano stampati in corsivo o riportati direttamente in corsivo (es.: in situ;
Cannabis sativa). Il nome italiano delle specie deve essere scritto con l’iniziale minuscola
(es.: barbabietola). Il nome delle cultivar o
di un ibrido va scritto con la prima lettera
maiuscola, senza virgolette. L’abbreviazione
della cultivar è cv senza punto.
4. REVISIONE DEL MANOSCRITTO
- Il Direttore responsabile della Rivista
Agroindustria esamina l’articolo appena ricevuto valutandone l’attinenza agli scopi della Rivista stessa. Qualora ciò non si riscontrasse il Direttore si riserva la possibilità di
rifiutarne la pubblicazione senza inviarlo ai
Revisori. I lavori vengono inviati, a giudizio
del Direttore, ad uno o più Revisori esperti
degli argomenti in essi trattati. I rilievi dei
Revisori vengono trasmessi all’Autore corrispondente del lavoro. L’Autore deve provvedere, nel più breve tempo possibile, ad apportare le modifiche proposte e ad inviare
(entro 7 giorni) alla Redazione della Rivista
due copie dell’articolo corretto su carta e una
su floppy disk, nonché copie riviste dai Revisori con la scheda riportante le loro osservazioni. Qualora le bozze corrette non pervengano in tempo utile e il fascicolo sia già pronto per la stampa, le bozze verranno corrette
d’ufficio limitatamente agli errori e ai reflui
della tipografia. In questo caso la Redazione
declina ogni responsabilità per le inesattezze
di nomi, di simboli o di concetti che si potranno rilevare a stampa avvenuta.
- Il lavoro accettato sarà pubblicato nella versione definitiva senza invio delle bozze per
la correzione.
5. RESPONSABILITÀ
- La responsabilità del contenuto dell’articolo spetta interamente all’Autore.
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