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Applicazioni dei Marcatori molecolari

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21/11/14
Valutazione e analisi dei dati molecolari
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Valutazione dei pattern molecolari evidenziati da una delle tecniche di MM
traduzione in problema biologico
una volta effettuato lo scoring delle bande dai gel
i dati sono pronti per essere analizzati in vari modi grazie a software specifici
PDF allegato: software for population genetic analyses of molecular marker data
Tre principali applicazioni:
Tipizzazione e identificazione varietale
Caratterizzazione e dissezione della variabilità genetica
Costruzione di mappe genetiche e mappaggio genico
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Robustezza e riproducibilità
Alcune delle classi di marcatori più utilizzate (specialmente i RAPD) sono stati
criticati per la loro mancanza di robustezza ed affidabilità.
Infatti molte riviste non prendono più in considerazione i lavori fatti con i RAPD
Recentemente questi problemi sono stati notati per molte classi di marcatori
dimostrando che nessuna di esse è perfetta
Reliability
Al fine di aumentare l’affidabilità del dato, molti autori propongono la ripetizione dei
vari step dei protocolli (amplificazione ed elettroforesi) per 2 o 3 volte
Lo scoring è meno riproducibile del resto, per cui è importante avere
due persone che fanno lo scoring in maniera separata
Competitive priming = problema dei RAPD che porta all’insorgenza di false bande
Artefatti dovuti a frammenti riarrangiati a causa di annealing “nested” e
all’interazione all’interno e fra filamenti di DNA durante la PCR
Tra i dominanti gli AFLP sono più affidabili dei RAPD grazie alle
condizioni di temperatura più stringenti
Differenze nel profilo di amplificazione AFLP
tra radici e foglie di uno stesso genotipo
ha permesso di evidenziare l’importanza della qualità del DNA da analizzare
cosi come la dipendenza dal pattern di metilazione dei vari organi
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Ma in genere questo non è un problema perché difficilmente queste tecniche
vengono utilizzate per comparazioni tra laboratori
Per contro gli SSR sono considerati il metodo da scegliere per questo scopo
Gli SSR vengono considerati molto riproducibili
Band homology – co-migrazione
I marcatori multi-locus sono stati utilizzati in moltissimi studi sulla similarità genetica
Assunto: bande che co-migrano rappresentano uno stesso tratto cromosomico
Ma non è sempre così…..
Si ha “Size homoplasy” quando 2 o + bande della stessa lunghezza e ottenute con una
stessa combinazione di primer, non hanno origine comune
Molto comune per i RAPD
osservato, però, anche con AFLP per frammenti piccoli
molto frequente per SSR a causa dell’alto tasso mutazionale e può divenire un
problema quando gli SSR si usano per studi fra inter-specifici
(es Arabis e Arabidopsis)
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Band linkage and neutrality
Un problema comune a tutti i marcatori è la possibilità che marcatori trattati come
indipendenti, in realtà possono essere linked (associati)
quindi…..
I loro alleli non vengono trasmessi indipendentemente ma a mò di “aplotipo”
Evitabile facendo uno screening delle bande in una popolazione di mappaggio
Queste due bande in uno studio di genetica di popolazione
tenderebbero a sovrastimare la similarità fra gli individui
Fragment sizing and matching
Per valutare e comparare i dati molecolari provenienti da campioni diversi
è necessario che:
bande singole di ciascun campione vengano rilevate individualmente e venga loro
assegnata un’etichetta (di solito si fa con il peso molecolare)
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..poi vanno individuate le bande co-migranti (MATCHING)
nelle varie corsie (lane)
PROBLEMI LEGATI AL FRAGMENT
SIZING AND MATCHING
Lo scoring va fatto
con precisione ed
accuratezza e
dipenda da:
Qualità del DNA
Completezza della
restrizione
Condizioni di
elettroforesi
Intensità media
del segnale
Le condizioni di elettroforesi sono molto importanti
In quanto la mobilità dei frammenti potrebbe risultare
ineguale nel gel
Un esempio è dato dal cosiddetto SMILE
Lo shift delle bande può causare errori nel
“band matching”
Si può ovviare replicando i campioni
(cioè due amplificazioni per ogni campione di partenza)
e aggiungere il LADDER
Quando possibile far correre i campioni da comparare in lane adiacenti
Cambio di fluorocromo determina diversa mobilità
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Fare lo scoring solo delle bande certe (evitare quelle dubbie)
Le bande che non è possibile analizzare con la stessa accuratezza in tutto
il gel devono essere eliminate
Frammenti co-migranti di diversa intensità non devono essere trattati come stessa banda
(anche se un fattore 2 potrebbe essere sinonimo di omo/eterozigote)
equipment
I fingerprint possono essere “letti” manualmente dal ricercatore oppure con l’ausilio di
specifici software
Manuale: di solito è limitato allo screening di lastre autoradiografiche o fotografie
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Recentemente una serie di analizzatori d’immagine sono stati approvati per l’uso in
biologia molecolare
Es: Gel Quantifier Image
Immagine iniziale:
Riconoscimento automatico delle lanes:
Lane straightening
Standards Line Up
Removing "Smiles”
Standards Setting
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Lane Profiles
Data Table
ABI
GeneScan
Lane
tracking
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Scoring automatico
Utilizzo di:
in-lane molecular weight
F
C
F1
F1
Le impronte digitali hanno svolto per decenni un ruolo centrale
nei casi di accertamento di identità degli individui
si basa sul presupposto che non esistono due individui con
impronte identiche
si basa sul presupposto che non esistono due individui con
impronte identiche
Il genoma umano contiene 3x109 coppie di basi
Il tasso di mutazione è 10-4 e 10-6
Numerose sostituzioni sono silenti (avvengono in zone non
codificanti) e quindi tendono ad accumularsi
nel genoma durante il corso dell’evoluzione
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Recentemente è stato dimostrato che il
genoma umano contiene un
gran numero di differenti tipi
di polimorfismi del DNA
che possono essere usati in casi di
attribuzione di paternità
Questi polimorfismi possono
determinare
DNA fingerprint
l’impronta del DNA
Il miglioramento genetico vegetale è da sempre basato
sull’individuazione e l’impiego della variabilità genetica
I breeder devono prendere molte decisioni
importanti durante i veri step
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Primo:
nel decidere i parentali più appropriati da
incrociare e poi….
poi nella strategia di selezione utilizzata per
identificare gli individui migliori all’interno
della progenie dell’incrocio
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Ad es. grandi programmi di breeding
per le colture annuali
possono richiedere lo screening di
centinaia di migliaia di linee per
produrre ogni paio di anni una sola
nuova varietà
I field trials possono essere
molto dispendiosi e la
valutazione di alcuni
carattere (es. qualità e
stabilità produttiva)
difficili da valutare
Negli ultimi decenni i marcatori molecolari si sono dimostrati molto utili nel rimpiazzare i
saggi biologici
L’uso dei MM per seguire determinati loci o regioni genomiche è ormai di routine nei
programmi di breeding
Si conosce la localizzazione cromosomica di molti loci per la resistenza a malattie,
tolleranza a stress e per i caratteri di qualità
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23
34
66
71
99
103
107
109
Part
h.
EAG
ECA C\MCA
A
C\M
AAT \115
\186
EAG
A\M
CTG
\145
EAG
A\M
C AC
\303
Non solo nelle piante…..
….ma anche in molti animali
EC C
ECC A\MACA
A\M
\4
ACT 58
\134
EAG
ECA C\MCT
ECC C\MAC G\122
AS1 A\MAC A\115
\MA
CT\8T\109
2
Per essere utile, un marcatore
molecolare
deve essere strettamente associato
al locus di interesse
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Scelta della giusta metodologia
nella scelta della metodologia da applicare nei propri studi
molti sono i punti da considerare:
Che tipo di informazione si vuole ottenere?
E’ importantissimo scegliere la giusta tecnica in modo da ottenere la giusta informazione.
Per ottenere informazioni sulla genealogia di una popolazione o sulle relazioni filogenetiche,
dovrebbero ottenersi delle sequenze o utilizzare metodi basati sulla restrizione del genoma
Discriminazione
a quale livello tassonomico la variazione genetica viene misurata
(entro popolazione, fra specie, fra generi?)
il metodo che si sta scegliendo ci permette di avere informazioni dettagliate sul tipo di
discriminazione che vogliamo ottenere?
Numero di loci
vengono richieste informazioni su pochi o molti loci?
RFLP, isoenzimi etc danno informazioni su pochi loci mentre RAPD, AFLP etc. danno una
panoramica allargata a moltissimi loci.
Costo
gli isoenzimi sono i più economici seguiti da RAPD e RFLP. Gli AFLP, SAMPL, S-SAP e I
metodi basati sul sequenziamento sono i più costosi.
Se le sonde, o i primer specifici, non sono precedentemente disponibili, tecniche come
SCAR e SSR risultano altamente costose perchè coinvolgono lo sviluppo di primer/sonde
prima di poter essere applicate.
Velocità
I metodi basati sulla PCR danno sicuramente risultati più rapidi laddove i primer sono
gia’ disponibili. I metodi basati sull’ibridazione sono invece più lenti.
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Impieghi
I marcatori molecolari possono essere di grande utilità quando utilizzati per
verificare il modo di riproduzione (sessuale vs. apomittico)
verificare il sistema di unione (autofecondazione vs. fecondazione incrociata),
identificare varietà coltivate
per stimare le distanze genetiche
sia per studi evoluzionistici e tassonomici che caratterizzare germoplasma
Caratterizzazione individuale (genotyping) e varietale (DNA fingerprinting)
Il primo esempio di DNA fingerprinting in pianta risale al 1988:
basato su Southern e RFLP
“The data (lanes 22,23) show that hypervariable polymorphic
patterns can be obtained for barley
demonstrating the possibilities for characterizing inter-variety
distinctions and identifying varieties”
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L’entrata in scena dei metodi basati sulla PCR
Rappresenta una pietra miliare nel campo del DNA fingerprinting
Ha avuto inizio con due lavori pubblicati nel 1990 e uno nel 1991
M
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9 10 11
L’uso di primer arbitrari si è dimostrata utile nel generare ampliconi anonimi che
risultavano in banding pattern polimorfici
Dopo alcuni anni sono stati introdotti gli AFLP
Caratterizzazione individuale (genotyping) e varietale (DNA fingerprinting)
Il fine ultimo del lavoro di miglioramento genetico è quello di ottenere varietà
superiori, aventi le caratteristiche desiderate e rispondenti ad un ideotipo prefissato.
Il termine varietà indica un insieme di piante coltivate contraddistinte per caratteri
morfologici, fisiologici, citologici, chimici, molecolari, ecc. che quando riprodotte, per via
sessuale o asessuale, nei modi indicati dal costitutore, conservano i loro caratteri distintivi
“D.U.S. testing” (Distinctiveness, Uniformity, Stability).
La nuova varietà deve quindi possedere caratteristiche peculiari che permettano di
distinguerla da tutte le altre varietà della stessa specie già iscritte al Registro
Nazionale o al Catalogo Comune Europeo delle varietà.
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Le differenze possono essere di natura fisiologica
(ad esempio, epoca di fioritura/spigatura o di maturazione, e presenza/assenza
di determinati composti, principi nutritivi e specifiche resistenze) oppure
morfologiche (ad esempio, presenza/assenza di peli o di reste, e colore delle
foglie o dei fiori).
I requisiti di distinguibilità, uniformità e stabilità possono essere verificati con relativa facilità
nelle varietà fondate su singole linee pure (varietà di specie autogame)
o su singoli genotipi (ibridi semplici, varietà di specie a propagazione vegetativa).
Per caratterizzare le varietà di piante coltivate e quindi verificare la loro distinguibilità
possono essere impiegati i marcatori biochimici (isoenzimi e proteine di riserva).
Da più parti viene auspicato un maggiore
uso dei marcatori biochimici e molecolari
per la
caratterizzazione varietale
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Il secondo è, invece, basato sul
“fingerprinting” al fine di individuare
marcatori polimorfici discriminanti tra varietà
in termini di presenza/assenza. In questo
ultimo caso i marcatori più affidabili sono
probabilmente gli RFLP ma quelli più
informativi sembrano essere gli AFLP ed i più
riproducibili gli SSR.
esempio di caratterizzazione varietale basati sui profili elettroforetici
generati dai prodotti di amplificazione.
Il DNA fingerprinting è stato introdotto la prima volta nell’analisi del genoma vegetale nel
1988
Ryskov et al. distinguono 2 genotipi di orzo utilizzando una sonda M13 su DNA digerito con
HaeIII
Ryskov et al. (1988). FEBS letter 233:388-392
Patenting e Plant breeders’ right
Le moderne tecniche molecolari di analisi del genoma applicate per la protezione
dei Diritti del Costitutore (Plant Breeder’ Rights).
Tuttavia, bisogna tenere presente che la normativa vigente nella UE in materia di
brevetti afferma chiaramente che le varietà vegetali costituite secondo i metodi
tradizionali di selezione sono escluse da tale sistema di protezione giuridica
Per ottenere il PBR si deve dimostrare il DUS
Problema: minima distanza genetica fra le varietà
Differenze per una singola base non garantiscono l’iscrizione della nuova varietà
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Il sistema di caratterizzazione molecolare finalizzato all’identificazione varietale
deve essere potenziato per tutelare i costitutori, visto anche che per il principio del
libero accesso alle risorse genetiche, possono essere ottenute nuove varietà a
partire da varietà già iscritte, note come varietà essenzialmente derivate
(essentially derived varieties, EDV) a seguito di reincroci
o per ingegneria genetica
Sono molto simili a quelle protette ma
abbastanza diverse da poter avere un loro proprio nome
In questo caso, l’accertamento della derivazione e
della minima distanza genetica tra le varietà richiederà
necessariamente l’adozione di metodi di analisi a livello molecolare
Scarse possibilità di evidenziare polimorfismi tra originale e EDV
Esperimenti replicati in più laboratori per annullare l’errore sperimentale
DNA fingerprinting può diventare parte di un passaporto della nuova varietà
ben descritta
Difficilmente rimpiazzerà completamente la caratterizzazione morfologica
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Casi di studio
Caratterizzazione molecolare di
varietà locali abruzzesi di olivo
(Dritta, Gentile di Chieti e Tortiglione)
in prospettiva della
tutela degli olii monovarietali
Distinte nettamente le varietà locali
Dritta
Gentile di Chieti
Gentile dell’Aquila
Tortiglione
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Caratterizzazione della lenticchia di
castelluccio
C- = canadese e turca
G r a d o d i s i m i la r i t à g e n e t ic a
0 .9 2
0 .9 4
0 .9 6
0 .9 8
1 .0 0
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Caratterizzazione popolazioni locali di fave siciliane
AZ. DUCA DI MISTERBIANCO
AZ. TIMPANARO
LOCALE DI MODICA
AZ. MANNA
AZ. VARVERI
AZ. LEONFORTE
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Forensic genetic
Omicidio di Gubbio (1997)
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Tribunale di XXX
49
50
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XXXXX
D
56
57
55
64
65
66
74
75
73
53
54
52
C
E
D
B
61
62
63
67
68
70
71
72
79
58
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A
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C
A
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22
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