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15. duplicazione del DNA - E

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02/04/14
15. La DUPLICAZIONE del DNA contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è
consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale
IL DNA E IL MATERIALE GENETICO EREDITARIO Esperimento di Griffith Le cellule ba)eriche avevano ricevuto le istruzioni gene4che per trasformarsi in cellule ba0eriche patogene e quindi causare la polmonite. Era una trasformazione permanente, cioè ereditabile, poiché i ba)eri delle generazioni discenden4 dalle cellule ba)eriche che avevano subito trasformazioni provocavano anch essi la polmonite. Quindi esiste qualcosa che si trasme)e da un organismo all altro portando cara)eris4che ereditarie……… Ma cos è?
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Esperimento di Avery Frazionamento dell estra0o in classi molecolari E il DNA che porta l informazione ereditabile Il DNA, prima di essere trasmesso da una cellula alle cellule figlie, deve essere duplicato Il processo di duplicazione del DNA è detto replicazione e si verifica prima che la cellula si divida. 2
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Ognuno dei frammenF di DNA può fungere da stampo Ogni frammento con4ene una sequenza nucleo4dica complementare a quella del filamento opposto Si o0engono 2 doppie eliche complete iden9che alle preceden9 3
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La replicazione del DNA è semiconservaFva: elica madre + elica figlia di nuova sintesi Esperimento di Meselson-­‐Stahl centrifugazioni in gradiente di densità del DNA (in soluzione di CsCl) Crescita batteri in terreno di coltura ricco dell'isotopo pesante 15N (DNA pesante). Batteri trasferiti in un nuovo terreno in cui cioè era presente 14N anziché 15N (DNA più leggero). Trascorso tempo necessario per la successiva replicazione del DNA è ripetuta la procedura (due bande di DNA) 4
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Replicazione conservativa
Replicazione distributiva
Replicazione semi-conservativa
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La sintesi del DNA parte dalle ORIGINI DI REPLICAZIONE dalle origini di replicazione hanno inizio 2 FORCELLE di REPLICAZIONE v di replicazione = 50 nucleotidi/sec DNA umano= 150 x 106 bp Tempo replicazione = 0,02 x 150 x 106 = 800 ore 6
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Replicazione avviene in tempo molto più breve Come mai fase S dura 8 ore in una cellula animale? Durante fase S si attivano varie unità di replicazione (da 20 a 80) anche se non tutte insieme Le origini di Replicazione si trovano ad intervalli di 30 – 300 bp Una forcella si arresta quando ne trova un altra che procede in senso opposto 7
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Le proteine vengono sintetizzate nell interfase Gli ISTONI sono sintetizzati in FASE S, in cui vengono trascritti molti mRNA Il DNA viene replicato tutto ed una sola volta in FASE S grazie ad un BLOCCO di REPLICAZIONE: -­‐  impedisce che si compiano ulteriori cicli di replicazione -­‐  assicura che ogni regione di replicazione si replichi una sola volta -­‐  viene rimosso in prossimità della Mitosi Meccanismi di replicazione -­‐ Eliche si devono separare in modo che basi complementari vengano allineate (elicasi) 8
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Meccanismi di replicazione -­‐ La DNA polimerasi catalizza l aggiunta di un deossiribonucleotide trifosfato all estremità 3 -­‐
OH Alla forcella replicativa i due filamenti di DNA hanno polarità opposta DNA polimerasi catalizza solo in direzione 5 – 3 9
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Se entrambe le catene fossero sintetizzate in maniera continua nella direzione in cui si muove la forcella di replicazione, si dovrebbe verificare una sintesi in senso 3' -­‐> 5'; la spiegazione di come ciò non avvenga fu provata da Okazaki. Filamento guida Filamento lento una delle due catene verrà sintetizzata in modo continuo, e sarà la cosiddetta catena veloce (o catena leader), la cui sintesi nel senso 5' -­‐> 3' procede nella stessa direzione della forcella di replicazione; l'altra catena è sintetizzata in maniera discontinua, detta perciò catena lenta (o catena ritardata), ed è quella in cui la sintesi in senso 5' -­‐>3' procede in direzione opposta all'avanzamento della forcella di replicazione, sotto forma di frammenti di Okazaki, che verranno uniti successivamente dalla DNA ligasi. La forcella di replicazione è ASIMMETRICA
-­‐  Un filamento è sintetizzato in maniera continua : FILAMENTO GUIDA -­‐  Un filamento è sintetizzato a frammenti (frammenti di Okazaki): FILAMENTO LENTO 10
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DNA polimerasi
(dNMP)n + dNTP ———→ (dNMP)n+1 + PPi
La struttura della DNA polimerasi assomiglia ad una mano Il palmo contiene il sito catalitico: controlla correttezza appaiamento basi le dita trattengono i dNTP nella corretta posizione per la reazione catalitica; provocano curvatura stampo per esporre solo la prima base dopo l innesco Il pollice stabilizza complesso tra DNA polimeasi e substrato 11
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Come la DNA polimerasi discrimina tra desossinucleotidi
trifosfato e ribonucleotidi trifosfato
La DNA polimerasi non può utilizzare gli rNTP
Sebbene gli rNTP siano nella cellula 10 volte più concentrati dei dNTP, essi sono incorporati
ad una velocità 1,000 volte più bassa rispetto ai dNTP.
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nel Filamento discontinuo (lento) si possono formare dei ripiegamenti (strutture a
forcina), quindi per far in modo che la DNA pol possa lavorare
Intervengono Single Strand Binding Protein (SSBP) stabilizzano il singolo
filamento di DNA
DNA polimerasi: problemi (e soluzioni)
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Le nuove catene di DNA per essere sintetizzate hanno bisogno di un INNESCO (PRIMER) di RNA di ≈ 10 basi sintetizzato dalla PRIMASI La PRIMASI al contrario della polimerasi è in grado di iniziare una nuova catena unendo due ribonucleotidi trifosfati. -­‐  Filamento guida: 1 solo primer -­‐ Filamento lento: 1 primer ogni frammento Per avere filamento di DNA continuo: -­‐  nucleasi: degrada RNA -­‐  polimerasi riparativa: DNA al posto di RNA -­‐  DNA ligasi unisce il P in 5 di un frammento con l OH in 3 dell altro 14
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scorre sul DNA e lo aggancia allo stampo e ne aumenta la processività Per duplicare il DNA occorrono anche altre proteine -­‐  Elicasi: separa i 2 filamenti con consumo di ATP -­‐  Proteine che legano il filamento singolo -­‐  Morsetto scorrevole: mantiene la polimerasi salda sullo stampo -­‐  fissatore del morsetto: chiude il morsetto scorrevole attorno al DNA REPLISOMA 15
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Come si replicano le parti terminali dei cromosomi? 1. 
Sintesi DNA si arresta poco prima che finisca lo stampo 2.  Si aggiungono sequenze ripetitive a 3 dello stampo 3.  La telomerasi ha un tratto RNA complementare alla sequenza ripetitiva 4.  Sintetizza DNA telomerico La DNA poilmerasi si autocorregge
1 errore ogni 107 bp
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La DNA polimerasi presenta siti separati
per la sintesi del DNA e per l attività di autocorrezione
1. viene aggiunto nucleotide sbagliato 2. DNA di nuova sintesi NON appaiato allo stampo 3. Cambiamento conformazione polimerasi 4. Sito E rimuove il nucleotide legato per ultimo L attività di autocorrezione spiega perché sintesi avviene solo in direzione 5 – 3
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Gli errori durante la replicazione del DNA vanno corretti per evitare una mutazione Se riparazione sul filamento stampo: Mutazione persiste Se riparazione sul filamento nuovo: Mutazione evitata Correttore di appaiamento del DNA Distingue filamento sintetizzato per ultimo
(dove si trova l errore) da quello vecchio
grazie a delle interruzioni (nick) presenti nei
filamenti lenti che durano molto poco:
correzione è molto veloce
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Riparazione del DNA avviene in 3 fasi ESCISSIONE Tratto danneggiato reciso da NUCLEASI RISINTESI All OH in 3 del filamento tagliato si lega una DNA polimerasi di riparazione SALDATURA Da parte della LIGASI che unisce i frammenti Riparo per escissione di basi (BER) 19
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Riparo per escissione di nucleotidi (NER) sistema di riparazione codificato dai geni uvr (uvrA, uvrB e uvrC). I cui prodotti formano complesso UvrABC-­‐endonucleasi. Piegatura DNA
Taglio a monte del
sito di distorsione
Rotture DNA su doppio filamento Ricongiunzione NON omologa delle estremità Riavvicinamento per
mezzo di enzimi appositi
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Ricongiunzione omologa Rottura poco dopo replicazione del DNA (le eliche sono molto vicine) NUCLEASI degrada a ritroso uno dei 2 filamenti complementari formando un terminale a filamento singolo Uno dei 2 filamenti singoli INVADE il duplex di DNA : si genera un punto di diramazione Il filamento invasore si allunga ad opera di una DNA polimerasi di riparazione NB lo scambio di informazione genetica durante la meiosi avviene per ricombinazione omologa Procarioti il cromosoma è circolare la replicazione comincia in un solo punto sul DNA circolare la duplicazione avviene nel citoplasma Eucarioti i cromosomi sono lineari e molto lunghi i cromosomi possiedono numerose origini di replicazione la duplicazione avviene nel nucleo 21
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DIFFERENZE NELLA REPLICAZIONE TRA PROCARIOTI ED EUCARIOTI PROCARIOTI EUCARIOTI Non hanno nucleo Hanno il nucleo Il DNA è circolare Il DNA è lineare Enzima principale della replicazione: DNA-­‐polimerasi III DNA-­‐polimerasi alfa e delta Molte bolle di replicazione 1 sola bolla di replicazione 1/2 forcelle di replicazione 2 forcelle di replicazione (uni/bidirezionale) 22
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