CARATTERIZZAZIONE DELLE INTERAZIONI ¾ Costante di legame ¾ Concentrazione delle due specie Interazione ¾ Competizione con altre proteine ¾ Cofattori ¾ Compartimentazione cellulare ¾ Fattori che influenzano l’interazione (forza ionica, pH…) Quali sono le conseguenze dell’interazione tra le due proteine? kon koff Dipende anche dalle “caratteristiche” dell’interazione Le costanti di Equilibrio e Cinetiche sono correlate A+B kon AB koff 9 Velocità di associazione: d[AB] = kon . [A] . [B] dt 9 Velocità di dissociazione: d[AB] = koff . [AB] dt 9 All’equilibrio: Velocità di Associazione = Velocità di Dissociazione kon . [A] . [B] = koff . [AB] 9 Le costanti di Equilibrio: [AB] kon KA = = [A] . [B] koff Koff [A] . [B] KD = = [AB] kon Costanti Cinetiche Definizione Unità di misura Significato Valori tipici Costante cinetica di Associazione kon Costante cinetica di Dissociazione koff kon koff A+B AB AB A+B [M-1s-1] [s-1] Velocità di formazione del complesso Quantità di AB formata al secondo, in una soluzione 1 M di A e B Stabilità del complesso Frazione di complesso AB che decade al secondo 10-3 – 107 10-1 – 10-6 COSTANTI DI EQUILIBRIO Costante di Dissociazione all’Equilibrio KD Definizione Unità di misura [A] . [B] [AB] = koff kon Costante di Associazione all’Equilibrio KA [AB] [A] . [B] = kon koff [M] [M-1] Significato Tendenza alla Dissociazione Bassa KD = alta affinità Tendenza alla Associazione Alta KA = alta affinità Valori tipici 10-5 – 10-12 105 – 1012 SPERIMENTALMENTE…. KD [PL] [P]TOT = [P] + [PL] KD = [P] x [L] [P]TOT - [PL] = [P] KD = [PL] KD [PL] = [P]TOT [L] - [PL] [L] [PL] = [P] x [L] [P]TOT [L] - [PL] [L] [PL] KD [PL] + [PL] [L] = [P]TOT [L] [P]TOT [L] KD + [L] Se [PL] è direttamente proporzionale al cambiamento di “un segnale” rilevabile (risonanza plasmonica di superficie, spettroscopico/spettrofluorimetrico, area……) abbiamo: ∆S = KD + [L] ∆Smax [ L ] KD + [ L ] ∆S Segnale [PL] = [P]TOT [L] Concentrazione Tutti i metodi che permettono di monitorare la formazione di un “complesso” sono accettabili!! Ogni tipo di interazione viene sempre analizzata secondo la stessa logica. Es: interazione farmaco-recettore Gel filtrazione Il volume di eluizione di una proteina o di un complesso proteico dipende dal suo raggio di Stokes kon ABS 280 nm koff KD = 0 30 ml [P]x[L] [ PL ] ABS 280 nm ABS 280 nm Si ripetono gli esperimenti con concentrazione differenti di proteine 30 ml 0 30 ml 0 30 ml 0 30 ml ABS 280 nm ABS 280 nm 0 [ PL ] Area KD = [P]x[L] Concentrazione SAGGI IMMUNOLOGICI Proteine immobilizzate su supporto • Si aggiunge il ligando a differenti concentrazioni • Tempo di incubazione • Lavaggi • Si aggiunge un anticorpo Segnale • Si rivela il segnale…. Kd Concentrazione Ligando ULTRACENTRIFUGA ANALITICA (AUC) • rotore speciale (due celle: cella analitica e cella di bilanciamento) • sistema ottico (che permette di osservare il materiale biologico mentre sedimenta) Il sistema ottico sfrutta il principio secondo cui la luce viene deviata quando passa attraverso una soluzione con zone a diversa densità e viene rifratta nel punto di demarcazione queste zone. tra Quali informazioni possono essere ottenute da esperimenti di AUC: 9 Coefficiente di sedimentazione 9 Massa molecolare relativa 9 Purezza di una particella 9 Forma delle particelle INTERAZIONI FRA BIOMOLECOLE 2 APPROCCI SPERIMENTALI: • Velocità di sedimentazione • Sedimentazione all’equilibrio VELOCITÀ DI SEDIMENTAZIONE Sottoponendo una soluzione, contenente un determinato soluto, ad un elevato campo centrifugo si otterrà un movimento radiale (rispetto all’asse di rotazione) delle particelle di soluto FRONTE DI SEDIMENTAZIONE (fra solvente puro e soluzione contenente il materiale sedimentante) Lo spostamento del FRONTE DI SEDIMENTAZIONE nel tempo, monitorato mediante il sistema ottico, permette di definire il COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE (s). Da tale valore è possibile risalire alla MASSA MOLECOLARE RELATIVA (Mr). METODO NON PRECISISSIMO; il valore dovrebbe essere corretto tenendo conto delle variazioni di viscosità e di temperatura SEDIMENTAZIONE ALL’EQUILIBRIO Ad una determinata velocità di rotazione (campo centrifugo), dopo un determinato tempo, si raggiunge una situazione di equilibrio a cui non si osserva più migrazione del soluto. LA MASSA MOLECOLARE RELATIVA È FUNZIONE DELLA POSIZIONE RADIALE Permette di stimare l’abbondanza relativa di complessi proteici Di solito: SEDIMENTAZIONE ALL’EQUILIBRIO A BASSA VELOCITÀ (tempi molto lunghi; da giorni a settimane….) L’ analisi delle differenze di velocità di sedimentazione con AUC, variando concentrazione e velocità di centrifugazione o prima e dopo trattamento con agenti denaturanti, fornisce informazioni: 9 Variazioni conformazionali 9 Formazione di complessi Proteina-proteina Proteina-substrato Proteina-ligando …… 9 costanti associazione/dissociazione Tecniche spettroscopiche ¾ Fotometria ¾ Fluorescenza ¾ CD ¾ Ligth scattering Intensità Cambiamento nell’intensità del picco Intensità Lunghezza d’onda Spostamento del picco Lunghezza d’onda Peso molecolare Light scattering Radiazione incidente KD Radiazione riflessa Concentrazione proteica Risalire al peso molecolare Si possono ricavare informazioni sul raggio idrodinamico di particelle in sospensione Light Scattering (LS) Il LS è una tecnica di spettroscopia ottica, che, attraverso lo studio della diffusione di determinate lunghezze d'onda, permette di avere informazioni su forma, dimensioni e dinamica delle particelle. Lo studio della radiazione diffusa (scattering), infatti, poiché le caratteristiche della radiazione diffusa dipendono dai gradi traslazionali e rotazionali delle molecole nel mezzo in esame, permette di risalire al coefficiente di diffusione. In particolare, il LS si usa per studiare un sistema costituito da particelle (polimeri, macromolecole, proteine, nanocapsule, ecc.) che si muovono in un fluido sospendente in concentrazione molto bassa. Biacore Assay A B ANALITA LIGANDO Surface preparation Analysis Cycle Sample injection Con: Flusso del tampone, salto di pH; Sali; agenti denaturanti, detergenti... Permette di: • Riutilizzare la superficie biospecifica • Usare minime quantità di ligando Regeneration Evaluation Generazione dei dati desiderati Equilibrio e Cinetica con Biacore A+B kon koff A ANALITA B LIGANDO AB 9 A è l’analita in soluzione CONCENTRAZIONE NOTA E COSTANTE (grazie al flusso continuo) 9 AB è il complesso CONCENTRAZIONE MISURATA DIRETTAMENTE ed espressa in R o RU 9 B è il ligando sulla superficie • La CONCENTRAZIONE TOTALE può essere espressa in RU e rappresenta la massima capacità legante Rmax • Rmax-R rappresenta il ligando libero SENSOGRAMMA La velocità con cui cambia il segnale R, permette di determinare i valori di kon e koff Informazioni in un sensogramma KD è la concentrazione di ANALITA a cui si ha il 50% di saturazione ANALISI DELL’AFFINITÀ 1. Quanto è FORTE il legame all’equilibrio? DETERMINAZIONE dei valori delle costanti di affinità all’equilibrio (associazione e di dissociazione). • • • Plot Req against C Steady state model Concentration at 50% saturation is KD Analisi di Specificità Sovrapposizione dei sensogrammi ottenuti dall’interazione di diverse lectine con tiroglobulina immobilizzata. STESSA AFFINITA’ MA CINETICA DIFFERENTE I 4 composti hanno la stessa affinità: KD = 10 nM = 10-8 M Le costanti cinetiche di binding variano fino a 4 ordini di grandezza Concentration = 100 nM 1035 Response Tutti i siti di legame sono occupati Time Concentration = 1000 nM kon koff M-1s-1 s-1 106 10-2 105 10-3 104 10-4 103 10-5 I composti con una bassa velocità di dissociazione, occupano il target più a lungo. 1035 Time Flexibility in Assay Design • Multiple assay formats providing complementary data Direct measurement Direct Binding Assay (DBA) Indirect measurement Surface competition assay (SCA) Inhibition in solution assay (ISA)
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