Effetti sulle microvescicole plasmatiche indotti dal fumo di sigaretta Laura Pergoli Dipartimento di Scienze Cliniche e di Comunità, Università degli Studi di Milano e Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano ‘Clinica del Lavoro Luigi Devoto’ FUMO E MALATTIE CARDIOVASCOLARI Infiammazione polmonare Aumentato rischio cardiovascolare Attivazione dell’endotelio IPOTESi: MV COME MEDIATORI DELL’INFIAMMAZIONE CIGARETTES SMOKING VESCICOLE EXTRACELLULARI VESCICOLE EXTRACELLULARI: DIMENSIONI MICROVESCICOLE E microRNA • Le MV contengono, oltre a proteine e DNA, anche mRNA e miRNA. • I miRNA rappresentano un meccanismo di controllo epigenetico in grado di regolare a distanza l’espressione genica agendo a livello post-trascrizionale. Nobel Medicina 2013 James Rothman, Randy Schekman e Thomas Südhof per la scoperta dei meccanismi che regolano il traffico delle vescicole, uno dei più importanti sistemi di trasporto della cellula POPOLAZIONE IN STUDIO: CARATTERISTICHE 106 soggetti obesi/sovrappeso (studio pilota del progetto SPHERE finanziato dai grant ERC europei) reclutati dal nostro Centro per l’Obesità e il Lavoro, con età media di 51 anni (±14). SESSO BMI FUMO N FREQUENZA % Maschi 106 32 30.2 Femmine 106 74 69.8 <25 Normale 105 3 2.9 25-30 Sovrappeso 105 36 34.3 ≥30 Obeso 105 66 62.9 Attuali fumatori 106 13 12.3 Ex fumatori 106 40 37.7 Non fumatori 106 53 50.0 COME SI ISOLANO LE MICROVESCICOLE? Plasma EDTA (2X1.5ml) - Centrifuga a 4°C 1000g X 15min 2000g X 15min 3000g X 15 min Ultracentrifuga a 4°C: 110000g X 75 min Risospeso in PBS Pellet ultracentrifugato di MV Immunofenotipizzazione Conta Dimensione Estrazione miRNA (doppio filtrato 0.1µm) IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE Parametri fisici :informazioni sul volume cellulare e densità/complessità delle MV. Parametri biologici: con uso di anticorpi coniugati a fluorocromi che emettono fluorescenza Anticorpi (Abs) MV da PIASTRINE : CD61 MV da NEUTROFILI: CD66 MV da MONOCITI: CD14 RISULTATI: MV E TIPI CELLULARI Sottopopolazione variabile MV indipendente Exp(β) (95% CI) Δ% p-value MV CD66 + (conta/µl) Neutrofili (migliaia/dl) 1.11 1.00; 1.24 11 0.054 MV CD14 + (conta/µl) Monociti (migliaia/ml) 1.55 0.49; 4.90 55 0.455 MV CD61 + (conta/µl) Piastrine (migliaia/ml) 1.00 1.00; 1.01 0.4 0.022 Modelli di regressione univariati RISULTATI: FUMO E MV Sottopopolazione MV MV CD66+ (conta/µl) MV CD14+ (conta/µl) MV CD61+ (conta/µl) Fumatori Exp(β) (95% CI) Δ% p-value Ex vs Attuali 0.83 0.51; 1.33 -17.4 0.424 Non vs Attuali 0.59 0.37; 0.93 -41.5 0.023 Ex vs Attuali 0.68 0.38; 1.24 -31.6 0.207 Non vs Attuali 0.55 0.31; 0.97 -45.2 0.041 Ex vs Attuali 0.82 0.41; 1.61 -18.2 0.558 Non vs Attuali 0.74 0.38; 1.43 -26.1 0.363 Modelli di regressione multivariati aggiustati per età, sesso e BMI DISCUSSIONE • I nostri risultati hanno mostrato come il fumo di sigaretta possa indurre modificazioni nel rilascio di microvescicole plasmatiche. • In particolare, la condizione di non fumatore rispetto a quella di fumatore mostra un minor rilascio di MV da neutrofili e monociti. • Tali studi verranno ampliati mediante una complementare analisi di espressione dei miRNA contenuti nelle MV. IN PROGRESS • Analisi del profiling di espressione dei miRNA contenuti nelle MV di tutti i soggetti del progetto SPHERE (N=1000) attraverso la metodica dell’Openarray (QuantStudio™ 12K Flex -Real-Time PCR System). • Valutazione dell’associazione tra l’espressione dei miRNA e l’esposizione al particolato atmosferico (PM10) e ai metalli ad esso associati.
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