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C10. Determinazione cromosomica del sesso NET 2014 - e

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Determinazione cromosomica
del sesso
  Non tutti gli eucarioti superiori possiedono cromosomi sessuali
morfologicamente distinguibili (es. alcuni pesci e rettili meno
evoluti, molti tipi di piante)
Aploidia
(arrenotochia)
Non ci sono cromosomi del sesso e, in generale:
  embrioni aploidi sviluppano in  ♂
  embrioni diploidi sviluppano in  ♀
(api,alcune coccidinee)
1
  Eterogamia femminile (uccelli, alcuni rettili e pesci)
ZZ  ♂
ZW  ♀
  Rapporto Cromosomi Sesso/Autosomi (X/A)
 Drosophila  XX  ♀; XY e X0  ♂
 Caenorhabditis elegans  XX 
; X0  ♂
  Eterogamia maschile (mammiferi)
 XX  ; XY  ♂
2
Determinazione ambientale del sesso (TSD)
 Il sesso è determinato durante l embriogenesi
 Il sesso non può essere predetto solo dal genotipo dello zigote (alcuni tipi di pesci, tartarughe
e rettili).
Sesso determinato dalla temperatura che prevale durante la embriogenesi.
Per la determinazione del sesso:
⇒ in alcune specie di rettili può esserci interazione tra genotipo (GSD  Genotipic Sex
Determination) e temperatura ambientale (TSD  Temperature- dependent Sex Determination).
 Pericolo: grandi fluttuazioni ambientali (e temporalmente lunghe)
 largo eccesso di un sesso rispetto all altro.
 Strategia ottimale:
 mescolanza ambientale e genotipica della
determinazione del sesso
 gradiente ampio di risposte possibili
a fluttuazioni ambientali.
3
Metodi di determinazione del sesso
⇒ eterogamia femminile
⇒ eterogamia maschile
4
Determinazione del sesso ZZ/ZW
Cromosomi del sesso ZZ/ZW
(lepidottera, molti rettili e negli uccelli)
maschio  sesso omogametico
femmina  sesso eterogametico
Il cromosoma W, come l Y, tende ad essere piccolo e per larga parte
eterocromatico
La coppia cromosomica Z W sembra avere una regione pseudoautosomica in cui
avviene il crossing-over.
5
Lucertola australiana (ZZ/ZW)
(Pogona vitticeps ⇒bearded dragon)
♀
♂
Colorazione con DAPI
Colorazione con DAPI
Colorazione con
Cromomicina A3
6
Lucertola australiana (ZZ/ZW)
(Pogona vitticeps ⇒bearded dragon)
Metafase di ♀⇒ ZW
Green: labelled microdissected W chromosome probe
7
C. elegans
8
Drosophila
  Sxl  controlla la compensazione di dosaggio e la determinazione del sesso
  maleless (mle)+male-specific lethal (msl) -1, -2 e -3 + males absent on the first
(mof)  complesso (Msl), trascritto di 5 geni, che si lega al cromosoma X del
maschio
  MOF  acetil-trasferasi
  rox1 e rox2 ⇒ RNA non codificanti
9
Lalli et al., Sexy splicing: regulatory interplays governing sex determination from Drosophila to mammals. J Cell Science 116, 441-445
doi:10.1242/jcs.00249
Fig. 2. Regulatory cascades in
D. melanogaster and
mammalian sex determination
involve factors acting upon
pre-mRNA splicing.
In the fly SXL positively regulates
TRA expression and
down regulates MSL-2 in female flies.
TRA-TRA2 heterodimers trigger
expression of the female specific
DSXF isoform.
In the absence of SXL, males express
DSXM.
10
Compensazione del dosaggio in Homo sapiens
 
Nella femmina XX
 inattivazione di una delle due X precocemente nello sviluppo
  ♀  mosaico per X materno attivo eX paterno inattivo e viceversa
  inattivazione della X di tipo clonale
  Cromosoma X ~ 1500 geni
 ~ 5% del complemento cromosomico n
  Cromosoma Y ~ 50 - 60 geni
11
PAR  Pseudo Autosomal Region
 la regione pseudoautosomica
è molto piccola e, alla meiosi,
 c è appaiamento tra X e Y
in questa regione e
 si forma sempre un singolo chiasma
Si comporta quindi, allo stesso modo
degli autosomi.
12
XIST  X Inactive Specific Transcript
X-inactivation
Centre (XIC)
* GS1X
* MIC2
* STS XG
* KAL1 AMELX
* ZFX
+ UBE1
* SMCX/XE169X
Map of the human X
chromosome depicting
genes and their
inactivation state
* RPS4X
XIST
XIC  Xq13
  Qualunque sia il nr. di X presenti,
 embrioni con cromosoma Y si sviluppano
morfologicamente come maschi
*
*
+
*
PAR
omologhi sull’Y
NO omologo sull’Y
pseudogene X-linked
K. Davies, Nature, 349:15-16,1991.
 Differenziazione sessuale:
 processo fisiologico complesso in cui
sono coinvolti i prodotti di molti geni,
in gran parte anche autosomici
13
RNA XIST/Xist  si irradia dal suo sito di trascrizione e riveste l intero
cromosoma che diventa così inattivo (Xi).
Una volta silenziato , l identità di Xi è stabile e si mantiene clonalmente.
RNA XIST/Xist  è essenziale perché il funzionamento del locus del centro di
inattivazione dell X (Xic) induca l inattivazione della X ma,
 non è essenziale per mantenere l inattivazione della Xi.
Gene Xist
⇒ essenziale per il centro di inattivazione della X ma,
da solo  NON sufficiente
Xce
⇒ elemento di controllo della X  ha effetto su quale dei cromosomi X
rimane attivo ed è distinto da Xist, essendo localizzato al suo 3 .
RNA Tsix
⇒ elemento cis-regolativo, è una unità di trascrizione che si
sovrappone completamente ad Xist, ma nell orientamento inverso.
RNA non codificante
 regola negativamente Xist
Ha un ruolo cruciale nel dettare quale cromosoma diventerà
X attivo (Xa) e quale Xi.
14
Prior to the onset of XCI, Tsix
expression on both Xs establishes
euchromatin in the two Xist alleles
(low H3-3meK27, high H3-2meK4,
high H4 acetylation)
At the onset of XCI, the persistence of Tsix
expression maintains the euchromatic state and
ensures continued Xist silence on the Xa. On the Xi,
downregulation of Tsix results in heterochromatin
through Tsix/Xist (high H3-3meK27, lowH3-2meK4,
low H4 acetylation), which in turn enables
transcriptionalinduction of Xist.
During the maintenance phase,
the Xist chromatin inverts to
the low H3-3meK27/high
H3-2meK4/high H4 acetylation
configuration more typically
associatedwith expressed loci.
Fig 6. Before XCI, biallelic expression of Tsix maintains Tsix/Xist in a euchromatic state, as indicated by biallelic H3-K4 dimethylation
and H4 acetylation.
The euchromatic state precludes Xist transcription on both Xs.
At the onset of XCI, silencing of Tsix on one X leads to heterochromatin in Tsix/Xist in cis, as indicated by loss of H3-2meK4 and
H4 acetylation, gain of H3-3meK27, and activation of Xist.
During the establishment of Xi, Tsix RNA activates Xist DNA methylation (lollipops) to lock Xist in a silent state.
After XCI occurs, the Xist chromatin pattern inverts.
15
16
Berletch et al., Hum Genet, 130:237–245, 2011.
Genes that escape from X inactivation
To achieve a balanced gene expression dosage between males (XY) and
females (XX), mammals have evolved a compensatory mechanism to
randomly inactivate one of the female X chromosomes.
Despite this chromosome-wide silencing, a number of genes escape
X inactivation: in women about 15% of X-linked genes are bi-allelically
expressed and in mice, about 3%.
While most genes have a stable inactivation pattern, a subset of genes
exhibit tissue-specific differences in escape from X inactivation.
Escape genes appear to be protected from the repressive chromatin
modifications associated with X inactivation.
17
Berletch et al., Hum Genet, 130:237–245, 2011.
Genes that escape from X inactivation
X inactivation and escape patterns.
Before differentiation, the paternal X (Xp) and the maternal X (Xm) chromosomes are active. As cells differentiate,
random X inactivation is initiated by coating one X chromosome with Xist RNA (pink cloud). This will become the inactive X,
while the other X remains active (green chromosome). Since the process is random, either the Xp or the Xm is inactivated
in a given cell, resulting in mosaicism in females. Some genes escape X inactivation, i.e., are expressed from
both the Xi and the Xa (yellow bars) in all cells. Other genes escape from X inactivation in a subset of cells in a given tissue
18
resulting in mosaicism of escape patterns. An additional layer of variability in escape patterns results from differences
between individuals
Berletch et al., Hum Genet, 130:237–245, 2011.
Genes that escape from X inactivation
Molecular characteristics of escape and inactivated X-linked genes. This model shows that silenced regions on the inactive
X are coated with the non-coding Xist RNA (pink cloud). Nucleosomes in the inactive X territory contain histones decorated
with modifications associated with transcriptional repression and chromatin condensation, for example, H3K27me3 and
H3K9me3, as well as the variant histone macroH2A (green circles). In addition, the CpG islands at the 5’ end of inactivated
genes are methylated (solid black circles). Silenced chromatin also harbors specific DNA motifs (e.g., LINE-1 elements and
AT-rich motifs) (yellow and blue boxes, respectively) to facilitate Xist RNA binding as well as binding of specific proteins
such as SATB1. In contrast, genes that escape X inactivation are not coated with Xist, contain nucleosomes with
modifications associated with active transcription, for example, H3 and H4 acetylation and H3K4me3, and their CpG islands
are unmethylated (open circles).
Chromatin between inactivated and escape genes may be bound by the chromatin insulator CTCF preventing the spread
of
19
heterochromatin into the escape regions or, vice versa, the spread of euchromatin into the silenced regions
Differenziazione sessuale
Evento chiave che controlla lo sviluppo delle gonadi.
Il sesso è stabilito al concepimento ma il differenziamento sessuale inizia intorno
alla 5° settimana.
  caratteristiche sessuali primarie: sviluppo delle gonadi, scelta tra gonade ♀ o ♂
(genotipo);
  caratteristiche sessuali secondarie: successivo sviluppo del tratto urogenitale in
risposta agli eventi endocrini associati al tipo di gonade presente
Scoperta di:  ♀ XY
 ♂ XX
  ♀ XY  si sviluppano fenotipicamente come ♀ perché mancano di tessuto
testicolare che dirige il differenziamento sessuale ♂
 ♂ XX  hanno perso il cromosoma Y ma sviluppano i testicoli (o parte di essi),
il che può portare ad un fenotipo completamente maschile.
20
Studi su cromosomi e DNA di ♀ XY e ♂ XX
 Costruzione di mappe di mappe delezione del cromosoma Y per identificare il TDF
(Testis Determining Factor)
1987- 90  isolamento di una sequenza di DNA, evolutivamente conservata, dal
braccio p del cromosoma Y  SRY (Sex Region Y)
SRY  clonato da una regione di 35kb nota come la regione minima in grado di
determinare i testicoli.
Studi su topi transgenici:
 introduzione di un frammento di 14kb della regione
21
murina Sry  fenotipicamente ♂
SRY
 membro fondatore della famiglia SOX,
 
Tutti i membri di questa famiglia condividono un omologia per un motivo in grado di legarsi al
DNA (simile ad una HMG-dominio), che potrebbe aver un ruolo nella regolazione della
trascrizione.
 
Il dominio HMG è il solo dominio che è comune a proteine Sry di specie differenti, non solo:
tutti i geni Sox clonati, ampia famiglia di geni, codificano proteine simili a Sry solo nel loro
dominio HMG
Esistenza di ♂ XX che mancano di SRY  ipotesi:
SRY agisce come regolatore negativo di un gene (Z) che a sua volta regola in modo negativo
il “cammino” alla determinazione maschile del sesso.
 
In accordo con l’ipotesi  ♂ XX che mancano di SRY portano, insieme, delle mutazioni che
inattivano il gene Z.
In molte specie sono note mutazioni recessive che causano la reversione del sesso ♀  ♂.
La proteina WT1 (Wilm’s Tumour protein) + SRY (della famiglia delle Sox) ⇒ entrambe richieste per
il differenziamento testicolare.
Interazione in vivo tra il trascritto SRY e bersagli putativi
 non ancora conclusivi
Primi anni 90  studi su 12 ♀ XY con disgenesia gonadica
 con SRY:
 
1  mutazione (delezione di 4nt)
  11  sequenza normale
 mutazione in sequenze regolative?
 mutazione in geni bersaglio?
 mutazione in loci autosomici?
22
Sekido & Lovell-Badge, Nature. 2008 Jun 12;453(7197):930-4. doi: 10.1038/nature06944.
!
Cromosoma Y umano
agisce come un determinante dominante maschile per l’azione di un
singolo gene, Sry, ! ruolo nella determinazione del sesso è di
iniziare il differenziamento testicolare da gonadi bipotenziali
embrionali.
Sry, ! agisce “accendendo” il differenziamento delle cellule di
Sertoli da cellule precursore che, altrimenti, darebbero cellule
follicolari.
Anche il gene correlato autosomico Sox9 ,
conosciuto per mutazioni che danno perdita di
funzione in topo e uomo, è essenziale per la
differenziazione delle cellule di Sertoli.
Dati sperimentali ! la sua espressione
anormale in una gonade XX può portare al
differenziamento maschile in assenza di Sry.
23
Lalli et al., Sexy splicing: regulatory interplays governing sex determination from Drosophila to mammals. J Cell Science 116, 441-445
doi:10.1242/jcs.00249
Fig 2b. In mammals (right), WT1(+KTS)
isoforms upregulate Sry in the
developing male gonad.
Sry, in turn, negatively influences
the expression – or the function –
of an unknown Z gene, which
inhibits testis differentiation
genes. Z gene candidates are
indicated (pink box).
WT1 e SRY potrebbero avere
un ruolo simile a quello di
SXL e TRA in Drosophila
(ruolo di splicing?).
K  Lisina
T  Treonina
S  Serina
24
NRY  Non-recombinant Region of the Y
25
1976
 6 ♂ subfertili  delezioni Yq  locus AZF (Azoospermia Factor) prossimale
alla regione eterocromatica su Yq.
cromosoma Y  intorno a 50 geni (o famiglie geniche), la maggior parte espressi
nei testicoli
 non è essenziale per la vita,
 è essenziale per la determinazione del sesso in senso maschile.
Con sonde molecolari  microdelezioni in ~ 10%
di ♂ subfertili o azospermici.
La maggior parte delle delezioni:
  in tre regioni che si sovrappongono: AZFa, AZFb e AZFc .
  AZFc  la più frequentemente deleta.
  La maggior parte delle delezioni per AZFa e AZFc:
 causate da ricombinazioni tra lunghe ripetizioni dirette.
26
27
Diagrammatic illustration elucidating the location of the
FISH probes on the human Y chromosome.
Premi et al, Chromos. Res, 18:419-430, 2010
BPY Basic protein on Y
CDY Chromodomain protein on Y
CSPG4LY Chondroitin sulfate
proteoglycan 4-like, Y-linked
pseudogene 1
DAZ Deleted in azoospermia
GOLGA2LY Golgi auto antigen,
golgin subfamily a, 2-like,
Y-linked
TTY Testis specific transcripts,
Y-linked
a. The human Y chromosome
with the AZFc region
28
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