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Classificazione dei linfomi

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Lezioni sui linfomi
A cura di Stefano Aldo Pileri
Dedicate ai miei Maestri Professori Antonio Maria Mancini ed
Alessandro Piccaluga
Prof. Dr. Dr. h.c. Karl Lennert
LINFOMI: NEOPLASIE LINFOIDI
• I linfomi sono al terzo posto in ordine di incidenza fra
le neoplasie al Mondo.
• Si distinguono in non-Hodgkiniani e di Hodgkin.
• I primi hanno riconosciuto nel corso degli ultimi 20
anni un aumento esponenziale della loro incidenza;
tale tendenza è destinata a mantenersi o, più
probabilmente, a subire un’ulteriore progressione nel
prossimo mezzo secolo. I secondi, invece, sono
rimasti stabili, con un tipico andamento stagionale.
• Al momento, il rapporto fra le forme non-Hodgkiniane
ed Hodgkiniane è pari ad 10/1.
MO
B
LN
T
Timo
T
Organi
periferici
Milza
Classificazione dei linfomi
Early 90s: no communication between Europe and
USA with detriment for patients and science
• Realizzata per consenso a
due meeting organizzati a:
Berlino, Aprile 1993,
Boston, Maggio 1994.
• Pubblicata su: Blood
1994, 84:1361-92.
La diagnosi di un linfoma è un processo integrato
Informazioni
cliniche
Controparte
normale
Fenotipo
DIAGNOSI
tessuto
cellule
Quadri morfologici
• Architettura
• Citologia
Citogenetica
Biologia molecolare
CD19 TC->
Campione
100
101
102
CD43 PE ->
103
104
Specifica entità
Prognosi
Bersagli terapeutici
2001
2008
10/2008
01/2009
09/2009
09/2010
15.000 copie
20.000 copie
15.000 copie
20.000 copie
Updated web-based version in 2015
Dear Steve:
We are pleased to inform you that Dr Wild agreed to your
proposals. We are now preparing documents for
the Agreement for Performance of Work (APW) with Dr
Vardiman, which will be sent to him shortly. Materials
including text, figures, tables and references will be also
ready by September 15.
With best regards,
Hiroko
(
.
).
26/139
La REAL/WHO Classification
non prevede alcuna indicazione
circa il grado di malignità.
Infatti, i criteri istologici (quali le
dimensioni cellulari), utilizzati dalle usuali
classificazioni anatomo-patologiche, non
costituiscono dei reali indicatori
prognostici.
“Linfomi a basso grado!
1,0
*
Probabilty
0,8
*
0,6
CLL
MALT
Follicular
MCL
DLBCL
Burkitt
0,4
*
0,2
0,0
0
2
4
6
Years
8
10
12
Linfomi indolenti
Corrispondono a quelle neoplasie linfoidi
la cui sopravvivenza è valutabile in anni,
indipendentemente dal fatto che siano o
meno trattate.
Longo DL. The REAL Classification of lymphoid neoplasms: one
clinician’s view. In Rosenberg S (ed): PPO Updates. Philadelphia:
Lippincott 1995; 9:1-12.
Linfomi/leucemie disseminate
leucemia linfatica cronica B/linfoma a piccoli linfociti B
immunocitoma
leucemia a tricoleucociti
linfoma splenico della zona marginale
plasmocitoma/mieloma multiplo
leucemia a linfociti ampi e granulati (T)
Linfomi extranodali
linfoma della zona marginale di tipo MALT
Linfomi nodali
linfoma follicolare
linfoma della zona marginale
Un aspetto comune a molti tipi di linfoma
indolente è la tendenza a subire una trasformazione blastica, con accelerazione del
quadro clinico.
Linfoma aggressivo
• Termine utilizzato per indicare quei tumori
linfoidi che esordiscono con una sintomatologia importante e che - non trattati - riconoscono una rapida progressione.
Longo DL. The REAL Classification of lymphoid neoplasms:
one clinician’s view. In Rosenberg S (ed): PPO Updates.
Philadelphia: Lippincott 1995; 9:1-12.
NEOPLASIE DEI LINFOCITI B
Dei precursori:
Delle cellule mature/periferiche:
NEOPLASIE DEI LINFOCITI T/NK
Dei precursori:
Delle cellule mature/periferiche:
leucemia/linfoma linfoblastico
linfoma mantellare
linfoma follicolare di III grado
linfoma a grandi cellule B, diffuso
linfoma/leucemia di Burkitt
leucemia/linfoma linfoblastico
leucemia prolinfocitica T
leucemia a cellule NK, aggressiva
leucemia/linfoma T dell’adulto (HTLV-1+)
linfoma T/NK di tipo nasale
linfoma T enteropatico
linfoma T epatosplenico
linfoma T simil-panniculitico
linfoma T, NAS
linfoma T angioimmunoblastico
linfoma a grandi cellule anaplastiche
ZINZANI (Blood, 1999)
LNH-AG ANZIANO
VNCOP-B: OS (1992-1997)
%
100
80
60
40
20
0
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
Mesi
Istituto “Seràgnoli” - Bologna
Principi di patobiologia
Electron
microscopy
Imprints
Fresh
No FNA
Wright, cytochemistry,
immunocytochemistry
Cell
cultures
Vaccine
Cryopreservation
Routine
techniques
Cell
suspensions
Immunohistochemistry,
molecular biology,
genomics, proteomics
Morphologic analysis,
immunohistochemistry,
molecular biology
FACS analysis,
cyto-genetics,
molecular biology
MALT
lymphoma
Mantle cell
Lymphoma
Lympho-plasmacytic
lymphoma
PAX-5
API2/MALT
MARGINAL
ZONE
BCL-1
VERGIN BCELLS
Primary effusion
HHV-8
GERMINAL
CENTRE
PLASMACELL
MANTLE
MEMORY BCELL
Follicular
Lymphoma
BCL-2
BCL-6
?
c-MYC
p53
Diffuse large B-cell lymphoma
p53
Burkitt’s
Lymphoma
Linfoma follicolare
CD10
Barcus ME et al. Appl Immunohistochem Molecul
Morphol 4:263-6, 2000.
Bcl-6
Flenghi L et al. Am J Pathol 148:1543-55, 1996.
Raible MD et al. Am J Clin Pathol 112:101-7, 1999.
CD20
Drug
CD20
C
Rituximab
Genetica dei Tumori
• Perchè una cellula “normale” diviene
“tumorale”?
• Perchè diverse cause (spesso
sconosciute) inducono un danno al
patrimonio genetico della cellula.
Danno al DNA
Virus, Tossici, Radiazioni
Cellula normale
Cellula Neoplastica
Incapacità di riparare il danno
Meccanismi di linfomagenesi
EZIOLOGIA
PATOGENESI
FENOTIPO
?
(~75 %)
Attivazione di
proto-oncogeni
proliferazione
patogeni
(15-20%)
immunodeficit
od autoimmunità
(~5 %)
pesticidi
(0.5-1 %)
apoptosi
Inattivazione di
geni oncosoppressori
differenziazione
Linfomi maligni e patogeni
•
•
•
•
Helicobacter pylori
Campylobacter jujeni
Clamydia psittaci
Borrelia burgdorferi
MZL (MALT) dello stomaco
IPSID
MZL (MALT) oculare
MZL (MALT) cutaneo
•
•
•
•
HCV
HBV
HHV8
EBV
MLDUS, MZL nodale e splenico,
DLBCL
PEL, malattia di Castleman,
BL, CHL, DLBCL-E, LYG, CIAL,
TLPD- C, N/K-TCL NT, PTLD,
IDLD
ATLL
• HTLV1
• HIV
Modello di linfomagenesi infezione-correlato
HTLV1
HCV
EBV
HHV-8
HP
BB
CP
CJ
R
traslocatione
Espansione linfoide poli/oligoclonale
G
L
C
G
L
G
L
Linfoma
G
L
Malattie auto-immuni e linfomagenesi
•
•
•
•
•
Sindrome di Sjögren
Tiroidite di Hashimoto
Enteropatia da ipersensibilità al glutine
Lupus erythematosus
Artrite reumatoide
Linfomi maligni e farmaci
Linfomi maligni ed età
•
•
•
•
Paediatric type FL
Paediatric type NMZL
Systemic EBV+ T-cell LPD of childhood
Hydroa vaccineforme-like lymphoma
• EBV+ DLBCL of the elderly
Linfomi maligni e sede anatomica
•
•
•
•
•
Splenic diffuse red pulp small BCL
FL of the jejunum
FL of the testis
FL of the skin (EORTC)
Primary cutaneous DLBCL, leg-type (EORTC)
• Primary cutaneous aggressive epidermotropic
CD8+ cytotoxic PTCL (EORTC)
• Primary cutaneous gamma-delta PTCL (EORTC)
• Primary cutaneous small/medium CD4 positive
PTCL (EORTC)
Meccanismi di linfomagenesi
EZIOLOGIA
PATOGENESI
FENOTIPO
?
(~75 %)
Attivazione di
proto-oncogeni
proliferazione
patogeni
(15-20%)
immunodeficit
od autoimmunità
(~5 %)
pesticidi
(0.5-1 %)
apoptosi
Inattivazione di
geni oncosoppressori
differenziazione
Fattori genetici intrinseci congeniti
Fattori genetici intrinseci acquisiti
Traslocazione di un proto-oncogene
R
C
R
proto-oncogene
C
gene Ig
Traslocazione cromosomiale
R
C
Deregolazione trascrizionale
del proto-oncogene
MBR breakpoint
Chr. 18
EX.1
EX2
Chr. 14
EX.3
JH
5’
Sense primer
Sm
3’
Cm
Anti-sense primer
mcr breakpoint
Chr. 18
EX.1
EX2
Chr. 14
EX.3
JH
5’
Sense primer
Sm
Cm
Anti-sense primer
3’
BCL-2 & LF
t(11;14) > riarrangiamento del gene BCL1 >
sovraespressione della Ciclina D1 nel linfoma mantellare
Centro germinativo
residuo
Produzione di un gene di fusione
R
C
R
C
Traslocazione cromosomiale
R
C
C
Sintesi di una proteina ibrida
Translocations and fusion
proteins involving the ALK gene
Translocation FrequencyLocalization
t(2;5)( p23 ;q35 )
70-80%
t(1;2)( q25 ;p23 )
10-20%
Cytoplasmic
t(2;3)( p23 ;q21 )
2-5%
Cytoplasmic
inv(2)( p23 ;q35 )
2-5%
Cytoplasmic
t(2;17)( p23 ;q23 )
2-5%
Cytoplasmic
t(2;19)( p23 ;q13,1 )
-
Cytoplasmic
t(2;2)( p23 ;q11-13 )?
or inv(2)( p23 ;q11-13 )?
-
Nuclear
membrane
t(X;2)( q11-12 ;p23 )
-
Membranous
Cytoplasmic/Nuclear
nucleolar
Mutazioni di geni regolatori
1
+404
2
3
4
5
BCL6 gene point mutation
6 7
8
9
10
+1144
Sovra-espressione di p53 da mutazioni puntiformi del
gene corrispondente
Eventi epigenetici
• Metilazione
• Modificazione degli istoni
, 2007
Drosha and Dicer: RNaseIII-type nucleases; DGCR8 and TRBP/PACT: co-factors;
miRISC: microRNA-induced silencing complex.
Plasticità e dinamica delle popolazioni linfoidi
Sono i linfomi entità stabili?
Trans-differenziazione di elementi linfoidi
T-LBL
Langerhans Cell
Hystiocytosis
(Feldman et al, Lancet Oncol 2005; 6: 435)
(Xie H et al Cell 2004)
The Human Genome Project
A Global Perspective in Medicine
Micro-array
Le tecniche basate sul principio dei microarray costituiscono il fronte avanzato della
ricerca bio-medica, specie in campo
oncologico.
Array: allineamento, disposizione a schiera.
Tipo di organizzazione del materiale
biologico da analizzare.
Tecnologie basate sui microarray
• DNA microarray
– Valutazione qualitativa e quantitativa
dell’espressione dello mRNA
– Valutazione dell’intero genoma su di una
singola chip
– Oligonucleotide microarray
– DNA microarray
– SNP array
– GCH array
Profilo di espressione genica
Unsupervised analysis (ordinamento gerarchico)
• Classificazione dei
campioni sulla base
delle similitudini del
profilo di espressione
genica.
BL
GC cells
FL
DLCL
N/M cells
CLL
MCL
HCL
Supervised analysis
Germinal
center
Naive
Memory
• Confronto fra
categorie
predefinite.
Supervised
Analysis
334 genes
LIMITAZIONE
La quasi totalità degli studi di profilo di espressione
genica sono stati condotti usando tessuti criopreservati
Gene expression analysis
DASL Assay Pool probe
These probes span
about 50 bases, making
it possible to profile
partially degraded RNA.
Profilo di espressione miRNA
Sequenziamento massivo del genoma
13 anni – 3 miliardi di dollari
7 giorni – 2800 Euro
Platforms
Instrument
Company
Year
Feature generation
Sequencing by synthesis
Read lenght
450 bp
Mappable
data /run
0.5Gb
454
Roche
2004
Emulsion PCR
Polymerase (pyrosequencing)
HiSeq
Illumina
2010
Bridge PCR
SOLiD
Applied
Biosystems
2007
Emulsion PCR
Accuracy
>99.5%
Polymerase (reversibile terminators)
100 bp
30-35 Gb
99.9%
Ligase (octamers)
50 bp
25-30 Gb
99.9%
Applications
Category
Application
Complete genome resequencing Mutation , SNP…. discovery in individual genomes.
Detection of human genomic variation
Targeted genomic resequencing Targeted mutation and SNP discovery. Population
genetics.
Paired-end sequencing
Discovery of inherited and acquired structural
variations
RNAseq (transcriptome seq)
Quantification of gene expression and alternative
splicing. Discovery of SNP and somatic mutations.
Discovery of structural variants.
De novo assembly
Sequencing and assembly of unknown genomes
Small RNA sequencing
miRNA profiling
Metagenomics
Discovery and characterization of complex
enviromental or human microbial communities.
ChIP seq
Genome-wide mapping of protein-DNA interactions
Epigenomics
Pattern of methylation in genomic DNA
Bioinformatic workflow
Next Generation Sequencing
Image Analysis, Sequences Extraction and Quality
Control
(CASAVA, FastQC)
Sequence Alignment
(Bowtie, BWA, Maq)
Whole Exome Sequencing
RNA Sequencing
Genotype and SNP calling
(GATK, Samtools)
Alternative Splicing
Isoforms
and Fusion Detection
(Tophat, FusionSeq, Defuse)
Structural Variants (CNV)
Detection
(RDXplorer)
Gene Expression Profile
(Cufflinks, Cuffdiff)
RNA-Seq Applications
GENE
EXPRESSION
SNPs- InDels
CHIMERIC
TRANSCRIPTS
NOVEL
ISOFORMS
ALTERNATIVE
SPLICING
NOVEL
TRANSCRIPTS
Fusion detection results
,
According to bio-informatic analysis
The coding genome of splenic marginal zone lymphoma: activation of NOTCH2 and other pathways
regulating marginal zone development.
Rossi D, Trifonov V, Fangazio M, Bruscaggin A, Rasi S, Spina V, Monti S, Vaisitti T, Arruga F, Famà R, Ciardullo C, Greco M, Cresta S, Piranda D,
Holmes A, Fabbri G, Messina M, Rinaldi A, Wang J, Agostinelli C, Piccaluga PP, Lucioni M, Tabbò F, Serra R, Franceschetti S, Deambrogi C,
Daniele G, Gattei V, Marasca R, Facchetti F, Arcaini L, Inghirami G, Bertoni F, Pileri SA, Deaglio S, Foà R, Dalla-Favera R, Pasqualucci L, Rabadan
R, and Gaidano G. J Exp. Med., E-pub ahead of print, 2012.
ALK- ALCL
8 different genetic lesions detected by RNAseq
Profilo di espressione proteica
Tecnologie basate sui microarray
Micro-array tissutale
(“tissue chip”)
• Fino a 1000 campioni diversi
sullo stessa vetrino
• Analisi in situ ad altissima resa
Kononen et al. Nat Med. 1998; 4:844-7
Dai protocolli rigidi applicati
a tutti i Pazienti alla….
“Tailored
therapy”
PTCL: overall survival
120
100
80
60
40
20
0
0
8
16
Control
24
32
40
Dauno 5mM
48
56
Imatinib 1 mM
64
72
Genes differentially expressed in PTCL/NOS and normal Tcells (training set + test set)
Training set
Test set
CD4-CD8-DR+
PDGFRa
TK inhibitors
Supervised analysis 155 genes: 91 down-regulated and 64 up-regulated
TCL subtype
cases
included in
TMA
PDGFRa
p-PDGFRa
PDGF-A
PDGF-B
PTCL/NOS
156
128/141
105/110
74/86
85/92
AITL
45
36/36
21/22
20/23
23/24
ALCL ALK+
16
16/16
10/12
13/13
9/12
ALCL ALK-
11
10/10
8/10
6/6
7/9
MF
28
28/28
28/28
5/5
7/8
EATL
5
5/5
ne§
3/3
2/2
SPTCL
1
1/1
ne
ne
0/1
TCL subtype
PDGFRβ
PTCL/NOS
4*/38
AITL
0/15
ALCL ALK+
9/9
ALCL ALK-
15/20
Imatinib reduces cell viability, by inducing cell cycle
arrest and apoptosis in PTCL/NOS primary cells
120
100
80
60
40
20
0
0
6
12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Control
Sugen 0,3 mM
Sugen 1 mM
100
90
Medium
80
70
60
G1
S
G2-M
50
40
30
Medium +
Imatinib 1 mM
20
10
0
Control
Annexin V: t48h
Imatinib
BrdUrd proliferation assay; 48 h
Conditional deletion of JunB and cJun in transgenic mice in which
the human NPM/ALK was put under the control of the murine CD4
promoter
Lymphoma
development
• Patient suffering from NPM-ALK+, JunB+, cJun+, PDGFRA+,
•
•
PDGFRB+, c-Kit- ALCL refractory to conventional first line
chemotherapy and relapsed after autologous stem cell
transplantation.
Complete clinical remission with reduced tumor markers and
normalized PDGFB levels within 10-14 days of imatinib therapy.
Patient free of ALCL since 20 months after initiation of imatinib.
La diagnosi di linfoma
Quale approccio?
• Profonda conoscenza delle singole entità
• Tecnologia multi-disciplinare
• Integrazione di tutti i dati da parte del patologo
• Keep an Open Mind
Truth is rarely pure and
never simple.
Oscar Wilde, The importance of being Earnest
A. Lincoln
Salvador
Dalì, 1975
PP Piccaluga, E Sabattini, C Agostinelli, F Bacci, F Fuligni, C Sagramoso, M Rossi,
S Righi, A Gazzola, T Sista, M Piccioli, MR Sapienza, A Laginestra, C Mannu, F
Sandri, P Artioli, G De Biase, G Da Pozzo, C Tigrini, M Monari and D Bignami
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