LC-MSの原理と使い方エムエス・ソリューションズ㈱ LC/MSとは     液体クロマトグラフィーと質量分析法を接続した機器分析法 Liquid Chromatography – Mass Spectrometryの略語分析手法を表す略語装置を表す略語はLC-MSを推奨類似用語と意味  Liquid Chromatography（Mass Spectrometry）方法、学問  Liquid Chromatograph（ Mass Spectrometer）装置  Liquid Chromatogram（Mass Spectrum）チャート  Liquid Chromatographer（ Mass Spectrometrist）人 LC/MSで何ができるか？  LCによる混合物の分離＋MSによる検出    LC分離：不揮発性、熱不安定性、高分子物質が対象 MS検出  定性目的：マススペクトルによる物質同定、MS/MS測定による構造推定⇔MSの高選択性  定量目的：選択イオン検出法（SIM）、選択反応検出法（SRM or MRM）⇔MSの高感度、高選択性 GC（GC/MS）   GC分離：揮発性、熱安定性物質が対象 MS検出：ライブラリーサーチによる同定、SIM, SRMを用いた定量分析 LC/MSでできないこと   イオン化しない物質の分析イオン化し難い物質の高感度分析（イオン化し易くする方法はある（誘導体化やイオン化助剤の添加など）） MSは高感度な分析装置 UVよりもレスポンスの低い物質は沢山ある MS装置の構成分離装置イオン源（API）（LC）大気圧インターフェイス分析部低真空中真空検出部制御部高真空 LC-MSの構成分離装置イオン源（GC）（EI）大気圧分析部高真空 GC-MSの構成検出部制御部 LC(GC)/MSで得られるデータ強度 Total Ion Current (TIC) Chromatogram 時間 Extracted Ion Chromatogram m/z Mass Spectra (Scan) Selected Ion Monitoring (SIM) （測定法） SIM Chromatogram イオン源の種類と原理 LC-MSインターフェイス（イオン源）の種類役割：試料のイオン化       エレクトロスプレー（ESI）大気圧化学イオン化（APCI）大気圧光イオン化（APPI）サーモスプレー（TSP）パーティクルビーム（PB）フローFAB 大気圧イオン化真空中イオン化 ESIの構造と原理 N2 LC溶出液スプレイヤー高電界による静電噴霧 → 帯電液滴の生成 → 加熱・脱溶媒 → イオン蒸発高電圧リングレンズ (1～2 kV) 脱溶媒室適する移動相流量： 0.2 mL/min イオンガイドイオンが生成する位置オリフィス（コーン，キャピラリ）ロータリーポンプターボ分子ポンプ ESIにおける液滴生成テイラーコーンキャピラリー液体の流れ -+ + + + + + + + + + - + + + + + + + + - -- - 帯電液滴 +++ + ++++ + + + + 対向電極 ESIにおけるイオン生成大気圧中レイリー・リミット加熱 + + + 帯電液滴 + + + + + + + + + + + + + + + + + 脱溶媒 + + + + + クーロン反発 [M1+Na]+ [M1 +H]+ [M2+2H]2+ + ++ + + 液滴の分裂 [M3+2H]2+ イオンエバポレーション MS ESIのイオン化帯電液滴からのイオン生成モデル電荷残留モデル + + + + 液滴の分裂を繰り返すイオン蒸発モデル + + + + + + + + + + + + + 液滴表面からのイオン蒸発 APCIの構造と原理 N2 LC溶出液スプレイヤー気化管リングレンズ高圧ガスによる噴霧 → 加熱・気化 → コロナ放電 → 溶媒分子イオンの生成 → 溶媒イオンと試料分子の衝突 → 試料イオン生成イオンが生成イオンガイドする位置適する移動相流量： 1 mL/min 放電電極高電圧 (3～5 kV) オリフィス（コーン，キャピラリ）ロータリーポンプターボ分子ポンプ APPIの構造と原理 N2 LC溶出液スプレイヤー気化管リングレンズ高圧ガスによる噴霧 → 加熱・気化 → 光子エネルギーによる試料分子の直接イオン化試料分子のイオン化電圧が光子のエネルギー（10 eV）より低い場合のみイオンが生成する位置イオンガイド UVランプ適する移動相流量： 0.2 mL/min オリフィス（コーン，キャピラリ）ロータリーポンプターボ分子ポンプ LC/MSで得られるイオン種  基本的に溶媒とのプロトン授受でイオンが生成する。   正イオン検出：[M+H]+、負イオン検出：[M-H]（呼び方：プロトン化分子、脱プロトン化分子）その他、溶媒中の不純物や溶媒分子の付加イオンが生成し易い。  [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+H+Sol]+, [M+Cl]-など ☆ LC/MSで用いられているイオン化法は、イオン化のエネルギーが低いので、フラグメントイオンは殆ど生成しない。分子量 APCIとESIの使い分け 100,000 アミノ酸、ペプチド、たんぱく質核酸、DNA 糖類医薬品代謝物脂質（リン脂質、糖脂質） 10,000 金属錯体 ESI など 1,000 APCI 低極性中極性分析対象物質の極性高極性分子量 APCIとESIの使い分け 100,000 ステロイド脂肪酸（エステル）ポリフェノール脂質（トリグリセリド）アミノ酸 10,000 糖類（低分子量）など ESI 1,000 APCI 低極性中極性分析対象物質の極性高極性質量分離部（分析計）の種類と原理分析部について   分析部（質量分離部）には幾つかの種類があるため、その機能や特徴を理解し、分析目的に応じた種類を選択することが重要である。分析目的に合わない分析部を採用している LC/MSでは、満足するデータが得られない可能性が高い。質量分離部（分析計）の種類役割：イオンをm/z 値に応じて分離  四重極（Q）、三連四重極（QqQ）イオントラップ（IT）飛行時間（TOF）  磁場型（Sector）     フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（FTICR）、電場型FT ハイブリッドタンデム(MS/MS)  Q-TOF, IT-TOF, Qトラップ, Q-FTICR 四重極質量分析計 (Q-MS) ロッドの印加電圧 ±（Vdc+Vac・cosωt） Vdc ：直流電圧 Vac ：高周波交流電圧周期的にポールの極性を変えることにより、イオンはｚ軸上を振動しながら進む m/z=k（Vac/r02f2） Vac ：高周波交流電圧［V］ r0 ：ｚ軸と電極の距離［mm］ f ：高周波数［MHz］直流電圧と高周波電圧の比が一定となるように電圧を変化させる。 L 定分解能モード定⊿mモード m3の安定振動領域化学同人これならわかるマススペクトロメトリーより抜粋直流電圧と高周波電圧の比を連続走査⇒スキャン測定、マススペクトル：定性直流電圧と高周波電圧の比を段階的に変化⇒SIM測定、SIMクロマトグラム：定量三連四重極質量分析計 (QqQ-MS) MS2 MS1 M1 イオン M2 M3 M2 CID m1,m2,m3 イオン源特定イオンを選択イオンの分解 m1 m2 m3 検出器生成イオンの分離・検出イオントラップ質量分析計 (IT-MS) エンドキャップ電極アース電位高周波電圧を印加リング電極エンドキャップ電極イオンは振動しながら電極内部の空間に留まる。 m/z=kVac Va ：高周波交流電圧［V］高周波電圧のみを変化させることで、振動が不安定になったイオンがエンドキャップ電極の出口から外に飛び出す。化学同人これならわかるマススペクトロメトリーより抜粋飛行時間質量分析計 m/z の大きなイオン m/z の小さなイオンイオン源 (TOF-MS) 自由飛行領域（L）加速電圧イオン検出器強度 m/z マススペクトルリニア型TOF-MSの原理 TOF MSの原理  全てのイオンは同じ運動エネルギーで飛行する 1 ( M  mu )  v 2  q  e  V 2 M: イオンの質量 [u] mu: 原子質量単位 (1.6605 x 10-27 [kg/u]) v: イオンの飛行速度 [m/s] q: イオンの価数 e: 単位電荷 (1.602 x 10-19 [C]) V: 加速電圧 [V]  飛行時間はイオンの m/z の平方根に反比例 L q tof   M V Vreflector E リフレクタ 0V 第１自由空間第２自由空間イオン源検出器リフレクトロン型TOF-MSの原理は同じm/z のイオン直交加速(oa)技術 oa: orthogonal acceleration Focal Plane 2 (Spatial) Reflectron (Ion Mirror) Detector Field Free Region Vpush(+) 0 Push-out Plate Vpull(-) G1G2 Ion Source G4 G3 Orthogonal Focal Plane 1 Accelerator (Spatial) Vbeam(+) vY  Vflight_tube(-) vX tan = (vY/vX) = ((-Vflight_tube + 1/2 Vpush) / Vbeam)1/2 Vreflectron(+) 磁場型質量分析計 (Sector-MS) 磁場逆配置質量分析計電場電場磁場正配置質量分析計磁場に入射するイオンは磁界に垂直の方向に力が働くイオンの流れに相当フレミングの左手の法則目的別LC-MS  主に定性分析に使われる装置     FT-ICRMS, LTQ-Orbitrap, Q-TOFMS ⇒高分解能タンデム質量分析計（R ≧ 30,000）・プロテオミクス n MS/MS, MS , 精密質量情報・未知成分の構造推定など Exactive, 高分解能TOFMS ⇒高分解能質量分析計（R ≧ 60,000）精密質量情報 Iontrap 代謝物の構造確認など ⇒タンデム質量分析計（低分解能）, MSn 主に定量分析に使われる装置  QqQ, QqLIT（QTRAP） SRMによる高選択的定量 MS/MS可能な装置    トリプルQMS 4-Sector MS ハイブリッド    Tandem in Space Q-TOF, Qqリニアトラップ, QOrbitrap イオントラップ FT-ICR Tandem in Time