遺伝子改変動物 • 同種あるいは異種に由来する遺伝子を外部から人為的に導入して作成された動物を「遺伝子導入動物」あるいは「トランスジェニック動物」と呼ぶ。遺伝子改変技術 • 特定の遺伝子の機能を破壊する遺伝子ノックアウト技術やゲノム単位での遺伝子改変を行う技術に由来する動物を含む広義での名称として、「遺伝子改変動物」あるいは「形質転換動物」という呼称もある。遺伝子導入技術の利用遺伝子導入技術の利用 • 実験動物（１）農学研究 • 家畜（１）家畜の遺伝的改良（２）家畜生産物組成の改変（３）有用物質の生産－動物工場（４）バイオリアクターの開発（５）ヒト疾患モデルの開発（６）代替臓器の開発－家畜への応用のための基礎研究（２）生物学研究－遺伝子機能解析遺伝子制御領域解析（３）医学研究－病態モデル疾患モデル遺伝子治療モデルベクターの例（GFP) 歴史ニワトリβアクチンプロモータグリーンマウスアンピシリン耐性遺伝子 GFP遺伝子 1980 Gordon 初期胚前核へのプラスミドDNA顕微注入によるTG マウスの作出 1981 Gordon & Ruddle TGマウスの導入遺伝子の次世代への移行を証明 1982 Palmiterらヒト成長ホルモン遺伝子を導入してスーパーマウスを作出 1985 Brinsterらマウス遺伝子導入効率に関係する原因を解析 Hammerら中家畜（ヒツジ）で初めて遺伝子導入に成功 1989 Roschhaus ウシで初めて遺伝子導入に成功 1991 Krimperfortら体外受精技術を応用したTGウシの作出 1999 Eyestone 体外受精技術を利用したTGウシの商業的利用 1 遺伝子導入法１．初期胚前核注入法（顕微注入法）（マイクロインジェクション法）２．精子ベクター法精子にDNAを持ち込ませる３．体細胞核移植法遺伝子注入細胞との核置換法４．キメラ作成法－ES細胞の利用５．ウイルスベクター法６．トランスポゾンの利用前核期胚への遺伝子導入精子ベクター法 • 精子にDNAを持ち込ませる方法。精巣上体精子や射出精子を環状あるいは直鎖状DNAを含む培養液で培養して精子表面にDNAを付着させたり、受精培地中にDNAを浮遊させたりして、人工授精や体外受精で精子と同時に卵子内に持ち込ませる。 • 前核注入法に比べて、サイズの大きな（100kb以上）外来遺伝子分子を導入するのに適している。家畜の前核期卵への遺伝子導入家畜卵子は脂肪顆粒のため、内部を観察できない。そのため、遠心分離を行い脂肪顆粒を片寄らせてから操作を行う。体細胞核移植法 • 核移植技術を利用し、遺伝子導入細胞との核置換法により遺伝子導入個体を作成する。 • 核移植による正常個体の作成効率が低いが、ES 細胞の利用できない家畜種で有用である。 • 導入細胞は、一般体細胞を用い、導入コピー数や発現レベル解析などの解析後、最適な細胞を用いて遺伝子導入個体を作製する。 2 核移植を利用した遺伝子導入キメラ動物キメラとは２個以上の受精卵や受精卵と体細胞など、遺伝的に起源を異にした細胞集団から構成された生物個体キメラ作成（注入法）キメラ作成法を用いたトランスジェニックマウスの作出法（１）ウイルスベクターの利用 • ウイルスの感染力を利用し、ウイルス中に目的の遺伝子を組み込んで、ウイルスとともに導入する。 • ウイルスの胚への感染は、胚の状況に影響を受ける。 • 組み込むことができる遺伝子の大きさに制約がある。ウイルスベクターの比較ゲノム導入遺伝子サイズゲノムへの組み込みキメラ作成法を用いたトランスジェニックマウスの作出法（２）発現期間非増殖細胞への感染毒性レトロウイルス RNA レンチウイルス RNA アデノウイルス DNA 約8kb 約8kb 約8kb ○ ○ × 長い長い短い × ○ ○ なしなしあり 3 導入遺伝子の発現 • 組織特異的発現特定の組織で発現する遺伝子のプロモータを利用することにより、導入遺伝子を特定の組織で発現させることができる。 • 時期特異的発現個体発生の特定の時期に発現する遺伝子としてβ鎖グロビン遺伝子群などで、制御領域が解明されている。トランスポゾンを用いた遺伝子組み換えスーパーマウス（左側）ウシ成長ホルモン遺伝子組換えブタ。皮下脂肪厚が減少し赤味部分が増加している。動物工場アンチセンスDNAを導入したミニラットヒトα１アンチトリプシンを発現しているヒツジ 4 遺伝子導入 • ランダムな組み込み一般には、染色体上の任意の場所に導入される。 • 相同組換え導入された遺伝子が染色体上の塩基配列と相同性を持つ場合は、その場所で相同組換えが起こる。ランダム挿入相同組換えネオマイシン耐性遺伝子挿入用遺伝子挿入用遺伝子 Neor 細胞遺伝子 Neor 遺伝子が挿入された細胞遺伝子相同組み換え遺伝子が置換された細胞遺伝子ポジティブ・ネガティブセレクション法相同組換え体の選択ターゲティングベクターランダム挿入相同領域相同領域置換遺伝子Ｘ neo Positive marker 標的遺伝子 TK Ｘ Negative marker 相同組換え置換遺伝子変異遺伝子 Neor 細胞遺伝子 Neor ゲノムDNA ネオマイシン耐性遺伝子 neo 置換遺伝子 neo TK • ポジティブセレクション導入遺伝子が組み込まれて発現すると、薬物耐性遺伝子も発現するので、薬物添加培地で培養すると、発現細胞が生き残る。ランダム挿入されたものも、生き残ってしまう。 • ネガティブセレクション相同領域外に配置された自殺遺伝子は、相同組換え体では発現しないので生存するが、ランダム挿入では、発現して細胞は死ぬ。 5 相同組み換えポジティブ・ネガティブセレクション法形質転換動物相同組換え置換遺伝子ランダム挿入 1. neo 置換遺伝子 neo TK 1. ネオマイシン誘導体G418添加培地で培養すると、ネオマイシン耐性遺伝子(neo）発現株のみが、選択的に生き残る。（ポジティブセレクション） 2. ガンシクロビル（GCV)は、チミジンキナーゼ（TK)によって活性型に変化し、細胞毒性を持つようになるので、ランダム挿入により、TKが発現している細胞は、死滅する。（ネガティブセレクション）遺伝子導入動物 (１) トランスジェニック動物 (Transgenic animal) 特定の遺伝子を導入した動物 (２) ノックイン動物 (Knock-in animal) 特定の場所に特定の遺伝子を入れた(あるいは置換した)遺伝子を導入した動物 2. 遺伝子欠損動物ノックアウト動物 (Knock-out animal) 特定の場所の遺伝子を破壊(あるいは不活性化)した遺伝子を導入したマウスＣｒｅ／ｌｏｘＰシステム 2つのloxP配列が同方向に位置している場合、CreによりloxP 配列間の遺伝子は切り出され環状化するＷｅｂ脳科学辞典より Cre発現依存的遺伝子欠損（コンディショナルノックアウト）Ｗｅｂ脳科学辞典よりジンクフィンガーモチーフ(ＺＦＮ)法２つのZFNがセンスとアンチセンスのDNAを認識すると、 FokI２量体が形成され、DNA切断活性を発揮する。ＴＡＬＥＮ法 TALエフェクターがDNAを認識ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法 Cre発現依存的遺伝子発現Ｗｅｂ脳科学辞典より gRNAの5'末端の20塩基が標的DNAを認識。gRNAにリクルートされたCas9は、PAM配列上流の。番3と4番目の塩基の間を切断。 6