カラムの内径を細くする～セミミクロカラムへの移行

LC Technical Report
Vol.16
2014年01号
カラムの内径を細くする～セミミクロカラムへの移行～
カラムには様々なサイズがあります。一般的なHPLCでは、内径4.6 mmのカラムが用いられます。内径の細いカラムを用いると、省溶媒化
や高感度化ができるため、内径3 mm以下のカラムの使用も増えてきています。ここでは、汎用カラムの内径4.6 mmからカラムの内径を
細くしたときの、利点と欠点、注意点を説明します。
Keywords カラム内径　カラム径　セミミクロカラム　流速　線速度　感度
試料負荷量注入量
カラムの内径を細くする
カラムには様々なサイズがありますが、内径によって以下のように分
類できます(JIS K0124:2011より引用)。
内径
10 mm以上、50 mm未満
3 mm以上、10 mm未満
1 mm以上、3 mm未満
1 mm未満
名称
セミ分取カラム
汎用カラム
セミミクロカラム
ミクロカラム
4.6 mm I.D.
内径を細くすると、最適な移動相流速が小さくなります。
Fig.1は、同じLCシステムで移動相流速と理論段相当高さの関
係を示したものです。理論段相当高さは、1理論段数に相当する
カラム長さで、その値が小さいほど、カラム効率が良くなります。
Rs(3,4)=1.077
Flow rate: 1.0 mL/min
3.0 mm I.D.
Rs(3,4)=1.074
Flow rate: 0.4 mL/min
2.1 mm I.D.
Rs(3,4)=1.073
Flow rate: 0.2 mL/min
20
1.5 mm I.D.
18
理論段相当高さ(μm)
Area(5)=6490000
Area(5)=660000
■ 内径を細くしたときの利点　～溶媒の削減～
1
2
2
4
6
Time (min)
―
―
―
―
14
12
10
4.6
3.0
2.1
1.5
mm
mm
mm
mm
I.D.
I.D.
I.D.
I.D.
0
1.0
(mL/min)
1.5
8
Rs(3,4)=1.068
10
■ 内径を細くしたときの利点　～感度の向上、試料量の節約～
2.0
[Analytical conditions (Fig.1)]
Sample: Naphthalene (in CH3CN)
Fig.1 移動相流速と理論段相当高さの関係
Table 1　カラム内径と移動相流速
最適流速
5
Fig.2 移動相線速度を同じにしたときの分離度の比較
[Analytical conditions (Fig.1, Fig.2)]
Column: L-column2 ODS, 3 μm; Column size: 150 mm L.
Mobile phase: CH3CN/H2O (60/40)
Temp.: 40℃; Detection: UV 254 nm; Inj.vol. 1μL
System: Nexera (Shimadzu Co.) セミミクロ仕様
内径(mm) 断面積(ｍm2)
4
[Analytical conditions]
Sample: 1. Uracil; 2. Benzene; 3. Toluene; 4. Impurity; 5. Naphthalene
(in CH3CN)
最適流量
範囲
0.5
3
←
Flow rate: 0.1 mL/min
16
8
0
最適流速は、内径の断面積に比例します(Table 1)。
内径を細くして、最適流速で分析することで、分析からカラム洗浄
や移動相置換を含めた、一連の溶媒使用量が削減できます。
Fig.2は異なる内径の最適流速で分析したクロマトグラムです。異
なる内径の最適流速は、ほぼ同じ線速度(1 mm/sec)になりま
す。移動相線速度が等しければ、保持時間や分離度はほとんど
変わりません。
溶媒削減率※1
4.6
16.61
1.0 mL/min
―
3.0
7.07
0.4 mL/min
60%削減
2.1
3.46
0.2 mL/min
80%削減
1.5
1.77
0.1 mL/min
90%削減
内径を細くすると、感度が高くなります。Fig.2の試料溶媒や注入
量の影響が出ない分析条件において、同じ試料量では、内径
1.5 mmは4.6 mmの約10倍のピーク面積が得られました。
内径の断面積に応じて試料量は少なくできるので、試料量が制
限される分析ではセミミクロカラムが有効です。
カラム内径
10 μL 4.6 mm
10 μL 1.5 mm
試料量
1/10
1 μL
1.5 mm
Fig.3　内径とピーク感度の違い(イメージ)
※1　内径4.6 mmの移動相に用いる溶媒使用量を100%とする
■ 内径を細くしたときの欠点　～試料濃度と注入量の制限～
内径を細くすると、試料負荷量が小さくなります。
Fig.4は、試料濃度と理論段数の維持率の関係をプロットしまし
た。試料負荷量を超えると理論段数は急激に低下します。この
分析条件では、内径2.1 mmの試料負荷量は4.6 mmの約
1/5になりました。
― 4.6 mm I.D.
Flow rate: 1.0 mL/min
65
＊4.6 ｍｍ I.D.
50 μg, 100 μg
Inj.vol: 5 μL
― 3.0 mm I.D.
Flow rate: 0.4 mL/min
40
― 2.1 mm I.D.
20
― 1.5 mm I.D.
Flow rate: 0.1 mL/min
0.1
1
10
Injection mass (μg)
100
1000
[Analytical conditions (Fig.4, Fig.5, Fig.6)]
Column: L-column2 ODS, 3 μm; Column size: 150 mm L.
Mobile phase: CH3CN/20 mM H3PO4 in H2O (50/50)
Temp.: 40℃; Detection: UV 280 nm;
System: Nexera (Shimadzu Co.) セミミクロ仕様
[Analytical conditions (Fig.4)]
Inj.vol: 1 μL (in Mobile phase)
Sample: n-Propyl p-Hydroxybenzoic Acid
Fig.4 試料濃度と理論段数の関係※2
4.6 mm I.D.
2.1 mm I.D.
Flow rate: 1.0 mL/min
Flow rate: 0.2 mL/min
N(4)=47%
50 μg
N(4)=58%
N(4)=94%
10 μg
0
N(4)=96%
10 μg
1
2
3
2
4
Time (min)
N(4)=97%
4
0.1 μg
6
N(4)=79%
5 μL
1
1 μL
2
3
N(4)=100%
4
2
4
Time (min)
1
1 μL
6
0
2
3
N(4)=100%
4
2
4
Time (min)
6
[Analytical conditions]
Inj.mass: 0.5 μg (in Mobile phase)
Sample: 1. 4-Hydroxybenzoic Acid; 2. Methyl p-Hydroxybenzoic Acid;
3. Ethyl p-Hydroxybenzoic Acid; 4. n-Propyl p-Hydroxybenzoic Acid
Fig.6 注入量とピーク形状の比較※3
■ 内径を細くしたときの注意点
Flow rate: 0.2 mL/min
0
0.01
Flow rate: 0.2 mL/min
5 μL
0
1
2
3
L-column シリーズのカラムは、高度な充填技術により均一に充
填しています。理論上、カラムの内径にかかわらず、理論段相当
高さは同じです。しかしFig.1のように、同じLCシステムで比較した
場合、内径が細いほど、カラム効率が低くなってしまいます。これは
カラム容積に対して、フィルターや配管などの試料拡散の要因とな
るデッドボリュームの割合が大きくなるからです。そのため内径を細く
したときは、デッドボリュームを少なくする工夫をします。また内径の
細い方が、最適流速の範囲が狭いことも分かります。このため、低
流速での送液ポンプの正確性が再現性に影響します。さらにセミ
ミクロカラムは試料注入量が少ないため、注入の正確性も重要な
ポイントです。
システムの最適化は、「LC Technical report Vol.08　移動
相使用量の削減」も併せてご覧ください。
■ 参考　カラム圧力
移動相線速度が同じならば、カラム圧力は同じですが、LCシステ
ムの配管の影響があるため、理論値と異なることがあります。
N(4)=100%
2
4
Time (min)
4
6
[Analytical conditions]
Inj.vol: 1 μL (in Mobile phase)
Sample: 1. 4-Hydroxybenzoic Acid; 2. Methyl p-Hydroxybenzoic Acid;
3. Ethyl p-Hydroxybenzoic Acid; 4. n-Propyl p-Hydroxybenzoic Acid
25
カラム圧力(MPa)
理論段数の維持率(%)
80
2.1 mm I.D.
Flow rate: 1.0 mL/min
0
100
0.1 μg
4.6 mm I.D.
20
15
5
Fig.5 試料濃度とピーク形状の比較※2
試料負荷量を超えるとピークが歪みます(Fig.5)。不純物分析な
ど、主成分が高濃度の場合、主成分と不純物の分離度が不十
分になる場合があるので、試料濃度には注意が必要です。
内径を細くすると、注入量の影響を受け、ピーク形状が悪くなるこ
とがあります(Fig.6)。注入量はなるべく少なくします。
―
―
―
―
10
0
0
0.5
1.5
2.1
3.0
4.6
1.0
(mL/min)
mm
mm
mm
mm
1.5
I.D.
I.D.
I.D.
I.D.
2.0
[Analytical conditions]
Column: L-column2 ODS, 3 μm; Column size: 150 mm L.
Mobile phase: CH3CN/H2O (60/40); Temp.: 40℃
System: Nexera (Shimadzu Co.) セミミクロ仕様
Fig.7 移動相流速とカラム圧力の関係
※2　0.02 μgを注入したときの理論段数を100%とする
※3　1 μLを注入したときの理論段数を100%とする
リーフレット内容に関してのお問合せは、東京事業所クロマト技術部又は最寄りの代理店までご連絡ください。
http://www.cerij.or.jp
ISO
9001
GC用カラム及び
HPLC用カラムの
設計・開発、製造及び供給
東京事業所クロマト技術部
e-mail [email protected]
TEL 0480-37-2601 FAX 0480-37-2521
〒345-0043 埼玉県北葛飾郡杉戸町下高野1600番地
無断転載禁止　2014/04

Download Report