Biologie moléculaire des hémopathies lymphoïdes WE Hémato-bio de l’AIH 23-24 Mai 2014 Cédric PASTORET AHU Hématologie-Biologie moléculaire Laboratoire d’Hématologie, Pr FEST CHU Rennes Plan Leucémie aigue lymphoblastique – Bilan initial • Recherche des transcrits de fusions • Deletion IKZF1 (LAL B) • Marqueurs oncogénétiques (LAL T) – Maladie résiduelle – Perspectives Lymphomes B matures – – – – Clonalité Lymphome folliculaire Lymphome du Manteau Maladie de Waldenström Bilan initial LAL Myélogramme Blastes lymphoblastiques Cytochimie Peroxydase – Phénotypage Diagnostic Classification EGIL Thérapeutique: CD20+ (GRAALL-R) Suivi (Maladie résiduelle) Prise en charge des prélèvements SANG MOELLE LIQUIDES GANGLION, PEAU (LCR, Ascite, Pleural) Suspension cellulaire de CMF Ficoll ou lyse des GR (Si suspicion de SMP) Fragment Centrifugation, Lyse des GR résiduels, Lavage en PBS Conservation à -20°C ou -80°C Culot cellulaire conservé à -20°C (ADN) ou -80°C (ARN) ADN ARN Extraction par le Trizol Digestion avec la protéinase K et extraction par le NaCl 6M Extraction par la résine CHELEX si nbre GB < 10.106 Reverse transcription PCR ou QPCR PCR Recherche des transcrits de fusion au diagnostic (1) Reverse Transcription 5’ ARN 3’ + Random hexamer 5’ 3’ Random hexamer Synthèse d’un ADNc complémentaire de l’ARNm ARN + Reverse transcriptase + dNTP 5’ 3’ Elongation 5’ 3’ 3’ 5’ Reverse transcriptase ADNc + RNase H 5’ 3’ ADNc Recherche des transcrits de fusion au diagnostic (2) PCR en point final • RT-PCR quantité d’ADN – Amplification de l’ADNc par PCR – Visualisation des produits d’amplification sur gel d’agarose PCR en point final= Résultat qualitatif PCR en temps réel nombre de cycles • RT-PCR en temps réel – Quantitation du transcrit – Détection de fluorescence en cours de réaction • Utilisation de sondes Taqman • Agent intercalant Sybrgreen dénaturation hybridation élongation Recherche des transcrits de fusion au diagnostic (3) • LAL B – – – – t(12;21) t(4;11) t(1;19) t(9;22) Piu et al, Lancet 2008 TEL-AML1 25% enfants MLL-AF4 3% des enfants, 85% nourrissons <1an, 5% adultes E2A-PBX1 20% des LAL pré-B, 3% adultes BCR-ABL 3% enfants 40% adultes Recherche des transcrits de fusion au diagnostic (4) e1a2 e14a2 e13a2 Patient 3 Patient 2 Patient 1 e1a2 Gel agarose 2% Gabert et al, Leukemia 2003 Témoin - SD1 Témoin+ K562 Recherche de BCR-ABL Délétion d’IKZF1 (1) –Localisation : 7p13 –code le facteur de transcription lymphoïde IKAROS –Régulateur transcriptionnel précoce de la lignée lymphoïde –7 exons codants, plusieurs transcrits (11 isoformes) –Facteur pronostique péjoratif pour les délétions focales –Suivi de la maladie résiduelle Mulligan et al, Nature 2008 Délétion d’IKZF1 (1) CGH-array (Comparative genomic hybridization) Caye et al, hematologica 2013 Délétion d’IKZF1 (1) Technique MLPA (Multiplex ligation probes assay) Sondes gauche et droite spécifiques de la séquence génomique 1. Dénaturation de l’ADN et hybridation des sondes spécifiques 2. Ligation des sondes hybridées 3. PCR avec amorces universelles qui se fixent sur les séquences « amorces PCR» des sondes 4. Analyse de fragments (Migration des produits de PCR par électrophorèse capillaire) Eijk et al, Methods in Mol Bio, 2011 11 Exon 6 Exon 4 Exon 5 Del 4-7 IKZF1 Exon 7 Délétion d’IKZF1 (1) Délétion d’IKZF1 (1) Caye et al, hematologica 2013 Délétion d’IKZF1 (1) Deletion IKZF1 IKZF1 wt Marqueurs oncogénétique des LAL T Trinquard et al, JCO 2013 Maladie résiduelle Cytométrie en flux Recherche de marqueurs au diagnostic Abération phénotypique (asynchronisme ou expression aberrante) Maladie résiduelle Recherche des blastes identifiés au diagnostic Maladie résiduelle MRD en biologie moléculaire Ig/TCR (amorces ASO) – Détermination des réarrangements au diagnostic – Séquençage des allèles clonaux – Fabrication d’amorces spécifiques de la région jonctionnelle du clone du patient (ASO) – Quantification par RQ-PCR (Taqman) TdT TdT pre-pre-B-cell CyCD79 pre-B-cell immature B-cell mature B-cell CyCD79 pre-B-CyIg (pre-B SmIg-CD79) Smlg-CD79 Smlg-CD79 plasma cell Cylg IGL genes rearranged (in Ig+ cells) TdT pro-B-cell + I IGK genes rearranged (C deleted in most Ig cells) (CyCD79) IgH class switch may occur IGH genes rearranged (TdT) lymphoid precursor cell 'alternative' T-lymphocyte TCR-CD3 TdT prothymocyte (TdT) (CyCD3) mature thymocyte TdT TdT immature thymocyte common thymocyte CyCD3 (pre-T complex) CyCD3 (pre-T complex) (TCR-CD3) NK-cell TCRD genes rearranged TCRG1 (CyCD3) TCR-CD3 helper / inducer T-lymphocyte TCR-CD3 (TdT) mature thymocyte (CyCD3) TCR-CD3 suppressor / cytotoxic T-lymphocyte TCR-CD3 TCRD genes deleted (in most TCR+ cells) TCRG2 genes rearranged TCRB genes rearranged: D-J to V-D-J (also in many TCR+ cells) TCRA genes rearranged (in TCR+ cells) Dept. of Immunology, Erasmus MC, Rotterdam Réarrangement des IGH 5 4 3 2 1 6 66 1 2 3 4 s JH DH VH 27 C 1 2 3 4 5 6 DH JH joining VH DH-JH joining V IgH D V IgH D J J V V C C C C transcription IgL C C C C C C CD79b precursor IGH mRNA RNA splicing CD79a IgL J J translation V DJ C mature IGH mRNA junctional region Structure des gènes du TCR TCRA and TCRD gene complex (#14q11.2) V1 V2 V3 V4 V5 Vn V1 J Rec J functional V : 46 C functional J : 53 V2 D J C V3 1 2 3 1 42 3 TCRB gene complex (#7q34) V1 V2 V3 V4 V5 Vn D1 J1 C1 1 2 34 5 6 functional V: 47 D2 J2 C2 1 23 4 56 7 TCRG gene complex (#7p14) V 2 V 3 V 4 V 5 V 7 V 8 V 9 V 10 V 11 J 1 1 2 3 functional V: 6 C1 J 2 1 3 C 2 Détermination des réarrangements au diagnostic Approche multiplexe (Biomed 2) LAL B IGH : 3 PCR FR1: FR2: FR3: VH (1-6) VH (1-6) VH (1-6) JH consensus JH consensus JH consensus DHJH : 2 PCR si VH-JH négatif Ig : 2 PCR Tube A: Tube B: Vf Vkf Intron Jk1-4 + Jk5 Kde TCR : 1 PCR V (1-6)+ D2 DHJH : 2 PCR TCR : 2 PCR Tube A : VIf-V10 Tube B : V9-V11 TCR : 1 PCR V (1-6)+ D2 J1.1/2.3 - J1.3/2.3 J1.1/2.3 - J1.3/2.3 J (1-4) + D3 TCR : 3 PCR TCR : 2 PCR Tube A : VIf-V10 Tube B : V9-V11 LAL T J1.1/2.3 - J1.3/2.3 J1.1/2.3 - J1.3/2.3 J (1-4) + D3 TCR : 3 PCR si <2 marqueurs disponibles Van dongen et al, Leukemia 2003 Détermination des réarrangements au diagnostic Approche multiplexe (Biomed 2) Détermination des réarrangements au diagnostic Exemple PCR multiples TCR Approche multiplexe (Biomed 2) FAM HEX Détermination des réarrangements au diagnostic Approche multiplexe (Biomed 2) TCR PCR A Témoin neg polyclonal Vg10Jg1.3/2.3 VgIFJg1.3/2.3 Vg10Jg1.1/2.1 Patient LAL VgIFJg1.1/2.1 VgIFJg1.3/2.3 Séquençage Méthode Sanger Séquençage Vg1F Vg1,3/2,3 Définition de la jonction (IgBLAST, IMGT V-QUEST) Design de l’amorce TCR V J ASO sens sonde reverse Vg2-Jg1.3/2.3 (0/11/-10) CGTCTTCAGTACTATGACTCCTACAACTCCAAGGTTGTGTTGGAATCAGGAGTCAGTCCAGGGAAGTATTATACTTACGCA AGCACAAGGAACAACTTGAGATTGATACTGCGAAATCTAATTGAAAATGACTCTGGGGTCTATTACTGTGCCACCTGGGA CGGGCCCCCCTAAAGAAGAAACTCTTTGGCAGTGGAACAACACTTGTTGTCACAGGTAAGTATCGGAAGAATACAACAT TTCCAAGGTAATAGAGGGAAAGCAGGAAATTATTAAACTGGAATAATGTAATAATGTTTAGAAAAAAGAGGAATTGGAT GGGGATTTGATGTAGAAAAC Détermination de la MRD : Taqman • Echantillons – Dilution de l’ADN de diagnostic dans pool de cellules mononuclées de 10 donneurs sains – 10-1 à 10-5 – analyse au moins en duplicate – obtention d’une courbe standard – ADN témoin négatif – Détermination du bruit de fond – MRD en triplicate • Sensibilité – Plus grande dilution présentant un Ct < Ct du bruit de fond -1 • Zone de quantification – zone de la courbe pour laquelle la MRD peut être quantifiée de façon sûre et reproductible Détermination de la MRD : Taqman 10-1 10-2 10-3 -4 5.10 10-4 MRD LN 40 30 20 MRD positive 3.10-3 y = -1,4246Ln(x) + 22,94 R2 = 0,9806 10 0 1,E -05 1,E -04 1,E -03 1,E -02 1,E -01 1,E +00 Maladie résiduelle Maladie résiduelle MRD1 seuil à 10-4 MRD1 10-4 MRD1≥≥10-4 MRD1 <10-4 MRD1 neg Response MRD2 or no response Response MRD1 LAL B genetic+/MRD+ genetic-/MRD+ Genetic+/MRDGenetic-/MRD- Standard risk: MLL non réarrangé et IKZF1 non délété et MRD1 < 10-4 High Risk MLL réarrangé ou IKZF1 délété et/ou MRD1 < 10-4 LAL T genetic+/MRD+ genetic+/MRDgenetic-/MRD+ genetic-/MRD- Standard risk: NOTCH et/ou FBXW7 muté MRD1 < 10-4 High Risk NOTCH et FBXW7 non muté et/ou MRD1 < 10-4 Mais encore… Délétion ERG Délétion de ERG E Clappier et al, leukemia 2014, Plan Leucémie aigue lymphoblastique – Bilan initial • Recherche des transcrits de fusions • Deletion IKZF1 (LAL B) • Marqueurs oncogénétiques (LAL T) – Maladie résiduelle – Perspectives Lymphomes B matures – – – – Clonalité Lymphome folliculaire Lymphome du Manteau Maladie de Waldenström Recherche de réarrangements géniques dans les lymphomes • Les lymphomes sont caractérisés par une prolifération clonale de cellules lymphoïdes • La classification des lymphomes (OMS) Recherche de clonalité • Indications – – – – Suspicion clinique de lymphoprolifération Doute sur clonalité en anapath ou en CMF++ Lymphome T > Lymphome B Atteinte cutanée • Recherche d’un réarrangement clonal du TCR et/ou de la chaîne lourde des Ig (IGH) – Toute population tumorale est monoclonale mais un clone n’est pas toujours tumoral (clone réactionnel) • Amplification ADN par PCR, analyse sur gel de polyacrylamide ou en électrophorèse à capillaires Recherche de clonalité Recherche de clonalité IGH polyclonal (JH FAM) IGH monoclonal (JH FAM) Recherche de clonalité Complémentarité des cibles B-cell IGH IGK IGH VH-JH V-J + IGK + DH-JH + Kde MCL (~50) 100% 100% 100% T-PLL (~35) B-CLL (~60) 100% 100% 100% FCL (~110) 86% 84% MZL (~50) 87% DLBCL (~110) TOTAL (~380) malignancies T-cell TCRB TCRG TCRB malignancies V-J V-J + TCRG 100% 94% 100% T-LGL (~30) 97% 96% 100% 100% PTCL-U (~45) 98% 94% 100% 76% 91% AILT (~35) 89% 92% 95% 83% 75% 91% ALCL (~45) 74% 74% 79%* 88% 85% 97% TOTAL (~190) 91% 89% 94%*(99%) + D-J * 20% to 25 % of anaplastic large cell lymphomas do not have TCR gene rearrangements (null-ALCL) BIOMED-2 Concerted Action: BMH4-CT98-3936 BIOMED-2 Summary; JHJM van Krieken et al., submitted Réarrangement BCL2-JH • Lymphome folliculaire • CD5- CD10+/- CD44 low • prolifération des cellules du centre germinatif • Translocation t(14;18) dans 80% des LNH folliculaires – Chromosome 14 : gène de la chaîne lourde des Ig – Chromosome 18 : gène bcl2 (antiapoptotique) Surexpression de l’oncogène Bcl2 • Lymphome B diffus à grandes cellules • Translocation t(14;18) dans 40% des DLBCL • Type GC Réarrangement BCL2-JH BIOMED 3 régions de cassure PCR couvre 60% des réarrangements : - MBR (major breakpoint cluster region) : 40% - 3’MBR : 9% - mcr/5’mcr (minor breakpoint cluster region) : 11% Mise en évidence d’une hyperexpression de la cycline D1 par RT-PCR compétitive • La translocation t(11;14) entraîne une hyperexpression de la cycline D1 qui n’est normalement pas exprimée dans les lymphocytes. • Utilisable au diagnostic quand l’infiltration tumorale est suffisante (30% de cellules tumorales). Peu sensible. • Technique de RT-PCR compétitive coamplification des cyclines D1, D2 et D3 REC1 1 2 3 D1 D2 D3 Mise en évidence d’une hyperexpression de la cycline D1 par RT-PCR compétitive Blood 2005 106:4315 : 6 cas de lymphomes du manteau typiques sans hyperexpression de cycline D1 ni t(11;14) Blood 2008;111:5683 : 8 cas de lymphomes du manteau typiques (histologie et immunophénotypage) sans t(11;14) : - 2 expriment la cycline D1 selon un mécanisme indépendant de la t(11;14) - 2 expriment la cycline D2 et ont une t(2;12) - 3 expriment la cycline D3 et ont une t(6;14) (translocation retrouvée dans les MM ou autre lymphomes B matures) - 1 cas sans expression de cycline D - 2 cas (forme blastoide) ont également une translocation t(2;14), expriment la cycline E et ont une surexpression de MYCN L’absence d’hyperexpression de la cycline D1 n’exclut pas un diagnostic de lymphome du manteau Analyse du statut mutationnel dans les LLC Premiers travaux sur LLC : répertoire IGVH non muté 1994 : dans la moitié des cas de LLC, nombre variable de mutations somatiques dans les gènes IGVH 1999 : mutations somatiques dans les gènes IGVH associées à une évolution très différente de la maladie mutées non mutées Hamblin et al, Blood 1999, 94:1848 Analyse du statut mutationnel dans les LLC VH DH MwM PB-MNC tonsil ES-6 GBN-10 FR-5 VH-FR1 primers JH primer 100 - 1 bande/pic unique : séquençage direct bp 400 - 300 200 100 0 100 4500 3000 1500 0 300 200 100 0 PCR FR1-JH IGH tube A VH-FR1–JH 300 200 100 0 400 310-360 nt 200 300 400 200 300 400 200 300 400 300 400 tonsil ES-6 VH GBN-10 100 200 - 300 300 200 100 0 100 300 - 200 PB-MNC 100 800 700 600 500 - JH 200 JH FR-5 Séquençage dans les 2 sens BIOMED-2 report: Leukemia 2003; 17: 2257-2317 Analyse des séquences - Plusieurs bandes/pics : purification après excision des bandes du gel VH JH Séquençage dans les 2 sens PCR FR1-JH Analyse des séquences Excision et purification des bandes Analyse du statut mutationnel dans les LLC Cut-off = 98% homologie ! VH3-21 : mauvais pronostic quelque soit le statut mutationnel MYD88 L265P et Maladie de Waldenström Real-time AS-PCR WM MZL MM CLL MGUS IgM MGUS IgG HD Mais encore… Sakata-Yanagimoto et al, Cancer Science 2014 Recherche de mutations pour une médecine personnalisée… DLBCL ABC Yang Cancer Cell 2012; 21:723 Le nouveau meilleur ami des biologistes moléculaires en hématologie Séquençage haut débit NGS Merci de votre attention!
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