耐熱性エステル加水分解酵素 SNSM-87

耐熱性エステル加水分解酵素 SNSM-87
産生微生物（由来）
佐賀（S）、長崎（N）県境の土壌（Soil）から分離された中温菌
（Mesophile）である Klebsiella oxytoca（> 50 °C では生育不
能）
工業化する上での特徴
至適温度 65 °C で、70 °C でも活性を維持
既知の加水分解酵素と乏しい相同性（めずらしい酵素）
組換え大腸菌での大量生産に成功
K. oxytoca
E. coli JM 105
pBluescript SK (+)
Hydrolase
pKK 223-3
× 600
① SNSM-87 応用例
CO2Me SNSM-87（3g/L)
S
NH
3.0 M
(575 g/L)
S
60 °
C
NH
CO2Me
S
NaOMe
CO2H
NH
(t-BuO2C)2O
CO2H
S
N
CO2But
99.4% ee
(24%)
① SNSM-87 応用例
CO2Me
NaOMe
SNSM-87
CO2H
CO2Me
99.5% ee
(36%)
卯津羅淳子、卯津羅健作、三枝待子、神山俊治、橘佳永「新規エステル分解酵素Aおよびその製法」、特許第3093039号
野本史樹、佐古田昭子、卯津羅健作「エステル分解酵素遺伝子およびそれを用いるエステル分解酵素の製法」、特開平9-275982
Chikusa, Y.; Hirayama, Y.; Ikunaka, M.; Inoue, T.; Kamiyama, S.; Moriwaki, M.; Nishimoto, Y.; Nomoto, F.; Ogawa, K.; Ohno, T.; Otsuka, K.; Sakota, A. K.; Shirasaka, N.;
Uzura, A.; Uzura, K. There’s No Industrial Biocatalyst Like Hydrolase: Development of Scalable Enantioselective Processes Using Hydrolytic enzymes. Org. Process Res.
Dev.2003, 7, 289–296.
Ikunaka, M.; Matsumoto, J.; Nishimoto, Y. A Concise Synthesis of (2S,3S)- BocAHPBA and (R)-BocDMTA, Chiral Building Blocks for Peptide-mimetic HIV Protease Inhibitors.
Tetrahedron: Asymmetry 2002, 13, 1201–1208.
② 耐熱性、有機溶剤耐性プロテアーゼ T-164
（Bacillus brevis 由来)
1 M aq NaOH
T-164
MeO2C
CO2Me
MeO2C
HO2C
CO2Me
236 g / L
(1.0 M)
CO2H
99% ee
(38%)
1 M aq NaOH
MeO2C
HO2C
CO2H
CO2H
99% ee
(28%)
② 耐熱性、有機溶剤耐性プロテアーゼ T-164
（Bacillus brevis 由来)
O
t-Bu
O
t-Bu
T-164
N
O
O
N
O
O
O
O
99% ee
(45%)
大塚耕太郎、白坂直輝「熱安定性耐溶媒性エステル分解酵素」、特開平10-248561
光学活性な1-（4-ｔ-ブチルフェニル-5-オキソ-3-ピロリジンカルボン酸および／またはその鏡像対掌体エステルの製造方法」、特開平11-113594
Chikusa, Y.; Hirayama, Y.; Ikunaka, M.; Inoue, T.; Kamiyama, S.; Moriwaki, M.; Nishimoto, Y.; Nomoto, F.; Ogawa, K.; Ohno, T.; Otsuka, K.; Sakota, A. K.; Shirasaka,
N.; Uzura, A.; Uzura, K. There’s No Industrial Biocatalyst Like Hydrolase: Development of Scalable Enantioselective Processes Using Hydrolytic enzymes. Org. Process
Res. Dev.2003, 7, 289–296.
③ かさ高いエステルの加水分解酵素 KM-109
（Acinetobacter calcoaceticus由来
calcoaceticus由来）
由来）
O
R
O
NO2
O
O
1
O
2
O
～他のリパーゼとの活性比較～
由来
Candida rugosa
Pseudomonas sp
Candida antarctica
KM109
基質1に対する相対活性
基質
（R=CH3を100とする）
基質2に対する
基質
反応性
R = n-C5H11
R = Ph
153
689
313
132
0
11
-
1,800
12,000
+
④ 酵母で作るウサギの酵素 RLE
微生物由来酵素ではできない加水分解反応を触媒
機能的にブタ肝臓エステラーゼ(PLE)と高い相同性
酵母へのウサギ遺伝子組換えにより大量生産に成功
アニマルフリー：ウイルス感染リスク、宗教的問題を回避
RLE
O
H
N
CO2Et
O
CO2Et
O
H
N
CO2Et
O
CO2H
90% ee (83%)
（特許）
西本幸史、生中雅也「ウサギ肝臓由来のエステラーゼを発現する微生物およびそれを用いたウサギ肝臓由来のエステラーゼの製造方法」、
特開2004-180681
⑤ リパーゼによる光学活性ベンジルグリシジルエーテル
O
Serratia lipase
O
CO2H
Cl
OCH2Ph
2 M NaOH
O
OCH2Ph
99% ee (45%)
(S)-OBG (> 98% ee)
O
O
CO2H
OCH2Ph
O
Cl
Bacillus lipase
O
Cl
CO2H
OCH2Ph
2 M NaOH
O
OCH2Ph
98% ee (37%)
(R)-OBG (98% ee)
（特許）
大塚耕太郎、山本千絵、梅里知子、神山俊治「光学活性グリセロール誘導体の製法」、特開平9-140394
野本史樹、野田秀夫、福田秀樹「光学活性体の製造方法」、特開2004-194559
⑥ 固定化エポキシドハイドロラーゼ BEH
（Bacillus sutilis 由来)
有機合成では困難な３級アルコールを理論収率100％で生成可能な
酵素を、遺伝子操作による大量発現、及び固定化に成功
H2O
Ph
O
O
Ph
(S)-エポキシド 1
BEH
O
OH
OH
(R)-diol 2 87% ee, ( >90%)
200 g/L
Ph
O
O
H+
(R)-エポキシド
Ph
O
O
H2O
山口仁美、生中雅也「光学活性な化合物の製造方法」、特願２００４－３４９３７６
山口仁美、白坂直輝、生中雅也「バチルス・サチルス由来のエポキシドハイドロラーゼを発現する微生物およびそれを用いたエポキシドハイドロラーゼの
製造方法」、特願２００４－３４９３７７
⑦ ヒドリド還元とは立体選択性が逆の微生物還元
Galactomyces geotrichum
(75.4% conv / 20 h)
O
60 g/L
NADH + H+
NAD+ (10-3 equiv)
高基質濃度
cis:trans
> 99:1
OH
触媒量
i-PrOH
(4 equiv)
Acetone
CO2Me
CO2Me
（特許）
野本史樹、奥田佳朗「微生物による立体選択的還元を用いたシスおよびトランス４-置換シクロヘキサノールの製造方法」、
特願2003-315247
（論文）
Ikunaka, M.; Moriya, N.; Nomoto, F.; Ohsako, A.; Okuda, Y.; Suenaga, H. The Highly Selective Equatorial Hydride Delivery by
Biocatalysis: Chemoenzymatic Synthesis of trans-2-(4-Propylcyclohexyl)-1,3-propanediol via cis-4-Propyl- cyclohexanol. Org. Process
Res. Dev. 2004, 8, 389–395.
⑧ 水酸化酵素を利用した７-ヒドロキシインドールの調整
有機合成法
SO3H
SO3H
70℃
℃
HO3S
OH
HO3S
OH
N
NO2
Bn
OH
OH
130℃
℃
O
NO2
NO2
NNHCONH2
NO2
NO2
O
O
Bn
70℃
℃
Bn
OH
7 Step、高温、
高温、有機溶媒
7-Hydroxyindole
バイオ法
バイオ法
Acinetobacter cells
25℃
℃
N
H 1 Step、室温、
室温、水系
OH
N
H
N
H

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