抗E1イオンチャネル抗体又はその結合断片

JP 2013-508443 A 2013.3.7
(57)【要約】
抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片、前記抗
体を含む薬学的組成物、処置、例えば、疼痛の処置／調
節における抗体及びそれを含む組成物の使用、並びに前
記抗体を作製及び調製するための方法。
(2)
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンチャネルのＥ１細胞外ループに結合する、抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結
合断片であって、前記イオンチャネルが疼痛の調節において機能し、前記抗体又は断片が
前記イオンチャネルを、それに結合した後、機能的に改変する、上記抗体又はその結合断
片。
【請求項２】
イオンチャネルが、Ｎａｖ１．３、１．６、１．７、１．８、及び１．９からなる群か
ら選択されるナトリウムイオンチャネルである、請求項１に記載の抗Ｅ１イオンチャネル
抗体又はその結合断片。
10
【請求項３】
抗体が、イオンチャネルのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、又はドメインＤにお
けるＥ１ループに結合する、請求項２に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断
片。
【請求項４】
抗体又は断片が抗Ｎａｖ１．７抗体又は断片である、請求項２又は請求項３に記載の抗
Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片。
【請求項５】
抗体又はその断片が、配列番号１０７∼１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列
に結合する、請求項４に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片。
20
【請求項６】
抗体又はその断片が、配列番号１３１∼１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有するＮａｖ１．３ペプチドに結合する、請求項２又は請求項３に記載の抗Ｅ１イオン
チャネル抗体又はその結合断片。
【請求項７】
抗体又はその断片が、配列番号１３５∼１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有するＮａｖ１．６ペプチドに結合する、請求項２又は請求項３に記載の抗Ｅ１イオン
チャネル抗体又はその結合断片。
【請求項８】
抗体又はその断片が、配列番号１３９∼１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列
30
を有するＮａｖ１．８ペプチドに結合する、請求項２又は請求項３に記載の抗Ｅ１イオン
チャネル抗体又はその結合断片。
【請求項９】
抗体又はその断片が、配列番号１４６∼１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有するＮａｖ１．９ペプチドに結合する、請求項２又は請求項３に記載の抗Ｅ１イオン
チャネル抗体又はその結合断片。
【請求項１０】
抗体又はその断片が、Ｋｖ２．１、Ｋｖ２．２、及びＫｖ７．ｘからなる群から選択さ
れるカリウムイオンチャネルに結合する、請求項１に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又
はその結合断片。
40
【請求項１１】
抗体又はその断片が、ＨＣＮ１及びＨＣＮ２からなる群から選択される過分極活性化型
イオンチャネルに結合する、請求項１に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断
片。
【請求項１２】
抗体又はその断片が、配列番号１５０又は１５１のアミノ酸配列を有するペプチドに結
合する、請求項１１に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片。
【請求項１３】
抗体又はその断片が、Ｃａｖ３．１、Ｃａｖ３．２、Ｃａｖ３．３、Ｃａｖ２．１、Ｃ
ａｖ２．２、及びＣａｖ２．３からなる群から選択されるカルシウムイオンチャネルに結
50
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合する、請求項１に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片。
【請求項１４】
抗体又はその断片が、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＡ１、ＡＳＩＣ１、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ３
、及びＴＲＰ４からなる群から選択される非ゲート型イオンチャネルに結合する、請求項
１に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片。
【請求項１５】
抗体が、それが特異的である関連するイオンチャネルの機能を、インビトロパッチクラ
ンプアッセイにおいて少なくとも５パーセント阻害する、請求項１から１４までのいずれ
か一項に記載の抗体又は断片。
【発明の詳細な説明】
10
【技術分野】
【０００１】
本開示は、機能的に改変する性質をもつ、イオンチャネルのＥ１部分に向けられる抗イ
オンチャネル抗体及び前記抗体の断片、前記抗体を含む薬学的組成物、処置、例えば、疼
痛の処置／調節における抗体及びそれを含む組成物の使用、並びに前記抗体を作製及び調
製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオンチャネルは、イオンの電気化学的勾配を下るイオンの流れを可能にすることによ
って、全ての生細胞の細胞膜電位を確立し、且つ制御することを助けるポア形成タンパク
20
質である。それらは、全ての生物学的細胞を囲む膜の中に存在する。ヒトゲノムは、広範
な多様性を示し、且つ分泌、筋収縮、並びに心臓組織及び神経組織における活動電位の発
生及び伝播などの多くの細胞過程に重要な役割を果たす４００を超える数のイオンチャネ
ル遺伝子を含む。
【０００３】
イオンチャネルは、いくつかのタンパク質の集合に基づいた大きな分子構造の形をとり
得る内在性膜タンパク質である。そのような「多サブユニット」集合体は、通常、膜又は
脂質二重層の平面を貫いて、水で満たされたポアの周りに密接して詰め込まれた同一又は
相同のタンパク質の配置を含む。通常αサブユニットと呼ばれる、ポア形成サブユニット
（単数又は複数）は、イオンチャネルタンパク質の活性及び細胞表面発現を制御するのを
30
助ける、膜結合型か又は細胞質性かのいずれかの補助サブユニットと会合し得る。様々な
イオンチャネルのＸ線構造が最近、解明され（Ｄｏｙｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：
６９（１９９８）；Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ４２３：３３（２００３）；Ｌｏｎｇ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０９：８９７（２００５））、ポア構造の構成が、イオンチャネ
ルファミリーメンバー間で大部分、保存されていることを示している。ゲーティング過程
と呼ばれるイオンチャネルポアの開閉は、様々な細胞過程又は生化学的過程によって引き
起こされ得る。
【０００４】
イオンチャネルタンパク質の最も大きいファミリーは、例えば、ナトリウム、カルシウ
ム、及びカリウムイオンチャネルを含む電位開口型チャネル、一過性受容器電位イオンチ
40
ャネル、過分極活性化型イオンチャネル、内向き整流性イオンチャネル、２ポアドメイン
カリウムチャネル、及び電位開口型プロトンチャネルで構成される。最後のものは、ｐＨ
感受性様式で脱分極させる。
【０００５】
内向き整流性イオンチャネルは、１５個の公式メンバー及び１個の非公式メンバーで構
成される。そのファミリーはさらに、相同性に基づいて７個のサブファミリーに細分する
ことができる。
【０００６】
現在のところ、同定されている約１０個の電位開口型カルシウムチャネルがある。
【０００７】
50
(4)
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一過性受容器電位イオンチャネルは、相同性に基づいて、以下の６個のサブファミリー
に細分される：古典的（ＴＲＰＣ）、バニロイド受容体（ＴＲＰＶ）、メラスタチン（Ｔ
ＲＰＭ）、ポリシスチン（ＴＲＰＰ）、ムコリピン（ＴＲＰＭＬ）、及びアンキリン膜貫
通タンパク質１（ＴＲＰＡ）。
【０００８】
過分極活性化型イオンチャネルは、環状ヌクレオチドｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに感受性で
あり、それが、チャネル開口の電位感受性を変化させる。これらのチャネルは、一価陽イ
オンＫ＋及びＮａ＋に対して透過性である。このファミリーの４つのメンバーがあり、そ
れらは全て、６回膜貫通型αサブユニットの四量体を形成する。これらのチャネルは過分
極状態下で開口するため、それらは、心臓、特に洞房結節において、歩調取りチャネルと
10
して機能する。
【０００９】
電位開口型及びリガンド開口型のイオンチャネルは、イオンチャネルタンパク質ファミ
リーの最も代表的なメンバーである。電位開口型イオンチャネル（例えば、カルシウムチ
ャネル、ナトリウムチャネル、及びカリウムチャネル）の活性は、細胞膜電位の変化によ
って制御されるが、リガンド開口型イオンチャネル（例えば、ＧＡＢＡ−Ａ受容体、アセ
チルコリン受容体）は、特異的な細胞内又は細胞外リガンドの結合によって制御される。
ゲーティング機構は、非常に複雑であり、様々な膜、ポア構造及び細胞質構造に関係し、
イオンチャネルのクラス間で異なる。
【００１０】
20
電位感受性イオンチャネルと呼ばれることもある、電位開口型イオンチャネルは、心臓
組織及び神経組織における細胞興奮性の基盤を与える膜貫通タンパク質のクラスである。
これらのチャネルは、細胞過分極又は細胞脱分極のいずれかにより活性化され、細胞膜電
位の制御をもたらすイオン流束を生じる。電位開口型ナトリウムチャネルは、一般的に、
活動電位の惹起に関与するが、電位開口型カリウムチャネルは、細胞膜再分極を媒介する
。様々な電位開口型イオンチャネル間の微調整された相互作用は、心臓活動電位及び神経
活動電位の形をとるのに重要である。
【００１１】
電位開口型ナトリウムチャネルの１つのクラスは、９つの異なるアイソフォーム（Ｎａ
ｖ１．１∼１．９）を含み、４つの異なるナトリウムチャネル特異的アクセサリータンパ
30
ク質が記載されている（ＳＣＮ１ｂ∼ＳＣＮ４ｂ）。それらのアイソフォームの別々の機
能活性は、様々な神経細胞型（Ｌｌｉｎａｓら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０５：１９７∼
２１３（１９８０）；Ｋｏｓｔｙｕｋら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ６：２４２３∼２
４３０（１９８１）；Ｂｏｓｓｕら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．５１：２４１∼２４
６（１９８４）１９８１；Ｇｉｌｌｙら、Ｎａｔｕｒｅ３０９：４４８∼４５０（１
９８４）；Ｆｒｅｎｃｈら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．５６：２８９∼２９４（１９
８５）；Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．５５：５２７∼５３９（１９８
６）；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８９：６０５∼６２７（１９８７）；Ａｌ
ｏｎｓｏ＆Ｌｌｉｎａｓ、１９８９；Ｇｉｌｌｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：１３６
２∼１３７４（１９８９））及び骨格筋（Ｇｏｎｏｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：２
40
５５９∼２５６４（１９８５）；Ｗｅｉｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：３６１∼３６
４（１９８６））において記載されている。Ｎａｖ１．５及びＮａｖ１．４チャネルは、
それぞれ、心臓組織及び筋肉組織に発現した主要なナトリウムチャネルアイソフォームで
あり、Ｎａｖ１．１、１．２、１．３、１．６、１．７、１．８、及び１．９は、中枢神
経系及び末梢神経系に特異的に発現している。天然の毒素である、テトロドトキシン（Ｔ
ＴＸ）を用いることによって、その毒素への親和性に基づいた、ナトリウムチャネルアイ
ソフォームの薬理学的分類を確立することが可能になった。したがって、電位開口型ナト
リウムチャネルは、ＴＴＸ抵抗性（Ｎａｖ１．５、１．８、１．９）及びＴＴＸ感受性と
して分類された。
【００１２】
50
(5)
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特定のイオンチャネルは、疼痛の調節に関連づけられている（例えば、ＰＮＡＳ２００
１年１１月６日、９８巻２３号、１３３７３∼１３３７８、及びＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ
ｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２２、２００４２４（３８）８３２∼８３６参照
）。イオンチャネルＮａｖ１．７は、神経因性疼痛などの疼痛を調節する能力があると考
えられており、それゆえに、特に興味深い、治療介入の標的である。Ｎａｖ１．８及びＮ
ａｖ１．９もまた、疼痛の調節において役割をもつと考えられる。
【００１３】
Ｎａｖ１．７は、遺伝子ＳＣＮ９Ａによってコードされる電位活性化型テトロドトキシ
ン感受性ナトリウムチャネルである。Ｎａｖ１．７の機能獲得型突然変異及び機能喪失型
突然変異の両方は、ヒトにおいて、明らかな疼痛に関連した異常を生じる。
10
【００１４】
もともと、ＳＣＮ９Ａにおける機能獲得型突然変異は、連鎖解析によって、紅痛症（又
は原発性肢端紅痛症）及び発作性極度疼痛障害（以前には、家族性直腸痛）の原因として
同定された。紅痛症は、四肢における熱及び発赤と共に灼熱痛の発作を伴うまれな常染色
体優性障害である。神経障害がなく、その他の点では健康な個体が疼痛を感じることが全
くできないことは、非常にまれな表現型である。ごく最近、Ｃｏｘら（２００６）及びＧ
ｏｌｄｂｅｒｇら（２００７）によって報告された２つの研究が、染色体２ｑ２４．３（
遺伝子ＳＣＮ９Ａを含む領域）にマッピングされる、常染色体劣性形質のような表現型を
記載している。両方の研究において、詳細な神経学的試験により、これらの人々が、鋭い
／鈍い及び熱い／冷たい刺激を区別することができるが、痛覚の全体的な欠如をもつこと
20
が明らかにされた。全員が、自分自身をかむことによって引き起こされる唇及び／又は舌
の傷を有した。全員が頻繁に挫傷及び切り傷を負い、ほとんどの人が、骨折又は髄膜炎を
経験していた。
【００１５】
このデータは、イオンチャネルＮａｖ１．７の機能喪失をもたらすＳＣＮ９Ａチャネル
病が、神経病、又は認知障害、情動障害、若しくは神経障害の非存在下における疼痛に対
する非感受性と関連しているという強力な証拠となっており、臨床的に、Ｎａｖ１．７を
疼痛関連標的として確証している。さらに、ＫＯ研究及び動物疼痛モデルから、Ｎａｖ１
．７が炎症性疼痛において主要な役割を果たしていると思われる。
【００１６】
30
図２ａは、４つのドメイン、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ（ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩ
Ｖとも呼ばれる）を含むＮａｖ１．７などのイオンチャネルの図表示である。各ドメイン
は、６つの膜貫通タンパク質ヘリックスＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６を含む
。各膜貫通タンパク質の正確なアミノ酸番号は、用いられたデータベース登録によって異
なるが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔは、Ｎａｖ１．７について以下の情
報を提供している：ドメインＡにおいて、膜貫通タンパク質Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ
５、及びＳ６は、それぞれ、アミノ酸１２２∼１４５、１５４∼１７３、１８７∼２０５
、２１２∼２３１、２４８∼２７１、及び３７９∼４０４に割り当てられる；
ドメインＢにおいて、膜貫通タンパク質Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、そ
れぞれ、アミノ酸７３９∼７６３、７７５∼７９８、８０７∼８２６、８３３∼８５２、
40
８６９∼８８９、及び９４３∼９６８に割り当てられる；
ドメインＣにおいて、膜貫通タンパク質Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、そ
れぞれ、アミノ酸１１８８∼１２１１、１２２５∼１２５０、１２５７∼１２７８、１２
８３∼１３０４、１３２４∼１３５１、及び１４３１∼１４５７に割り当てられる；
ドメインＤにおいて、膜貫通タンパク質Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、そ
れぞれ、アミノ酸１５１１∼１５３４、１５４６∼１５６９、１５７６∼１５９９、１６
１０∼１６３１、１６４７∼１６６９、及び１７３６∼１７６０に割り当てられる。
公開データベースで入手可能である、その配列のいくつかの天然のバリエーションがあり
、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔＱ１５８５８を参照されたい。
【００１７】
50
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本開示において、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、異なるアミノ酸割り当
てが与えられている場合を含む、上記の実体、又は代替のイオンチャネルにおけるそれに
対応する実体を指し、それの天然又は非天然の変種及び異なるアイソタイプにおける対応
実体が含まれる。
【００１８】
各ドメインはまた、細胞外親水性ループＥ１、Ｅ２、及びＥ３を含む。各ドメインにお
けるＥ１のアミノ酸配列は、膜貫通領域Ｓ１の後から始まり、Ｓ２で終わる。各ドメイン
におけるＥ１は、他のドメインにおけるＥ１と異なる。各ドメインにおけるＥ２のアミノ
酸配列は、膜貫通領域Ｓ３の後から始まり、Ｓ４で終わる。各ドメインにおけるＥ２は、
他のドメインにおけるＥ２と異なる。各ドメインにおけるＥ３のアミノ酸配列は、膜貫通
10
領域Ｓ５の後から始まり、Ｓ６で終わる。各ドメインにおけるＥ３もまた、他のドメイン
におけるＥ３と異なる。
【００１９】
Ｎａｖ及びＣａｖイオンチャネルは、４つのドメインＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤを含み、それ
ぞれが６つの膜貫通タンパク質ヘリックスを含むが、Ｋｖイオンチャネル、ＨＣＮイオン
チャネル、及びＴＲＰイオンチャネルなどの他のイオンチャネルは１つのドメインを含む
。Ｎａｖ及びＣａｖイオンチャネルにおける各ドメインについてのように、Ｋｖイオンチ
ャネル、ＨＣＮイオンチャネル、及びＴＲＰイオンチャネルは、上記のように、６つの膜
貫通タンパク質ヘリックスＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６、並びに３つの細胞
外親水性ループＥ１、Ｅ２、及びＥ３を含む。
20
【００２０】
Ｎａｖ１．７イオンチャネルにおいて、細胞外ループ（Ｅループ）は、図２ｃにおける
配列番号１０５の以下のアミノ酸残基である：
【表１】
30
【００２１】
Ｎａｖ１．７のいくつかのドメインにおける細胞外ループは、他のイオンチャネルに見
出される細胞外ループと類似している。
【００２２】
Ｎａｖ１．７は、末梢神経系、すなわち、侵害受容性後根神経節（ＤＲＧ）に発現して
おり、最も顕著には、侵害受容性小径ＤＲＧニューロンで発現しており、脳においてはほ
40
とんど提示されていない。Ｎａｖ１．７分布（例えば、感覚終末）及び生理機能が、それ
が、痛刺激を伝達することに主要な役割を果たす素因をつくっている。
【００２３】
末梢神経系におけるＮａｖ１．７の発現は、それを機能遮断抗体の作製のための非常に
魅力的な標的にしており、これは、副作用がなく、又は副作用を許容できるレベルまで最
小化する、疼痛についての価値のある処置への革新的なアプローチを示している。
【００２４】
神経因性疼痛は、非常によく見られる状態である。米国において、人口の０．６％から
１．５％の間、すなわち、１８０万∼４５０万人が罹患していると推定される（Ｐｕｌｌ
ａｒ及びＰａｌｍｅｒ、２００３）。毎年少なくとも１４０万人が、神経因性疼痛の３つ
50
(7)
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の主原因である、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、ヘルペス後神経障害（ＰＨＮ）、
又は三叉神経痛（ＴＮ）と診断されている。神経因性疼痛の他の原因には、脊髄損傷、多
発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。神経障害性関連慢性
背痛、変形性関節症、及び癌を有する患者を含めたならば、その総数は、少なくとも２倍
になるであろう。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、しばしば用いられるが、神
経因性疼痛の処置にはあまり効果的ではない。さらに、それらの長期使用は、重篤な胃損
傷を引き起こす可能性がある。他方、オピオイド（モルヒネ及び誘導体）の使用は、最も
重度の形態である神経因性疼痛、すなわち、癌関連神経障害に制限されている。これは、
悪心、嘔吐、呼吸抑制、便秘、及び耐性などの重篤な副作用、並びに耽溺及び乱用の可能
性が、長期処置に付随するからである。その後者のことは、他の神経障害でのオピオイド
10
の使用を妨げている（Ｄｅｌｌｅｍｉｊｎ、１９９９；Ｎａｍａｋａら、２００４）。抗
てんかん薬（ＡＥＤ）は、脳における異常な神経過剰興奮性を減弱することが知られてい
る。神経過剰興奮性が神経因性疼痛において重要な役割を果たすことを考えると、ＡＥＤ
が慢性神経因性疼痛の処置に向けられたことは理解できる（Ｒｅｎｆｒｅｙ、Ｄｏｗｎｔ
ｏｎ、及びＦｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ、２００３）。ごく最近の重要な例は、ガバペンチ
ン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ）及びプレガバリン（Ｌｙｒｉｃａ、Ｆｒａｍｐｔｏｎ及びＳｃ
ｏｔｔ、２００４）である。しかしながら、神経因性疼痛の処置のゴールドスタンダード
であるガバペンチンでさえも、せいぜい約４０％の患者において５０％、疼痛を低減する
だけである（Ｄｗｏｒｋｉｎ、２００２）。さらに、オピオイドと対照的に、ガバペンチ
ンは、癌関連神経因性疼痛の処置に用いられていない。
20
【００２５】
上記で述べたように、ヒトにおけるＮａｖ１．７の「機能喪失型」突然変異は、疼痛に
対する非感受性をもたらす（Ｃｏｘら、２００６）。さらに、ヒトにおけるＮａｖ１．７
の「機能獲得型」突然変異は、疼痛表現型の紅痛症及び発作性極度疼痛障害をもたらす（
Ｄｉｂ−Ｈａｊｊ、Ｙａｎｇ、Ｗａｘｍａｎ、２００８）。加えて、Ｎａｖ１．７を遮断
する末梢作用性小分子は、炎症性疼痛及び神経因性疼痛のラットモデルにおいて痛覚過敏
及び異痛症を逆転させる（ＭｃＧｏｗａｎら、２００９）。したがって、末梢作用性Ｎａ
ｖ１．７遮断抗体は、疼痛治療において有益であるはずである。
【００２６】
今まで、イオンチャネルの強力な化学阻害剤が同定されているが、一般的に、これらは
30
、他のイオンチャネルのアイソフォームに対する選択性が弱いことを特徴とする。生体に
おける遍在性分布を考慮すれば、これらの非選択性阻害剤は、利用が限定されている。
【００２７】
抗体は、それらの精巧な特異性により明らかに望ましいが、機能改変抗体を作製するこ
とは、１つには、最終的にクローナル抗体が治療適用に必要とされるという理由で、全く
簡単というわけではなく、その分野のいくらかの研究者は、イオンチャネルの機能の改変
をもたらすのにポリクローナル抗体が必要とされることを指摘している。Ｋｌｉｏｎｓｋ
ｙら（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＥｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ３１９巻１号、１９２∼１９８ページ）は
１９８ページにおいて以下のように述べている：
40
「ヒトＴＲＰＶ１の前ポア領域・・に対して産生されたウサギ、マウス、又は完全ヒトの
モノクローナル抗体のいずれも、チャネル活性化を遮断するのに効果的ではなかったので
、この領域における小さいエピトープに対する高親和性結合作用物質を通してチャネル立
体構造をロックすることは不可能であると我々は仮定する（Since no rabbit, mouse or
fully human monoclonal antibodies generated against the prepore region of human
TRPV1 ..were effective in blocking channel activation we hypothesise that it may
not be possible to lock the channel conformation through high-affinity binders
to small epitopes in this region）。」
【００２８】
ナトリウムチャネル、特に、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、Ｎａｖ１．９は、機能改変
50
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抗体を作製することに関して特に困難な標的であったと思われる。しかしながら、本発明
者らは、前記イオンチャネルの活性を、機能改変抗体、例えば、抗体のクローン集団を用
いて変化させ得ることを今、見出した。今まで、イオンチャネルに対する抗体が作製され
ているが、疼痛の調節に関与するイオンチャネルに対する、Ｅ１結合性機能改変抗体は開
示されていないと思われる。
【００２９】
本発明者らは、機能改変抗体が、疼痛の調節に関与するイオンチャネルのＥ１ループに
対して生産され得ることを今、確立した。そのドメインのそれぞれにおけるＥ１ループが
比較的短いアミノ酸配列であるため、これは驚くべきことである。
【発明の概要】
10
【課題を解決するための手段】
【００３０】
したがって、本発明は、抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片を提供し、前記イ
オンチャネルが疼痛の調節において機能しており、且つ前記抗体又は断片が、前記イオン
チャネルを、それに結合した後、機能的に改変する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＨＥＫ細胞におけるヒトＮａｖ１．７電流への特定のモノクローナル抗体の機能
的効果を示す図である。
【図２ａ】Ｎａｖ１．７の図表示である。
20
【図２ｂ】Ｎａｖ１．７のドメインＡ（配列番号１０１）、ドメインＢ（配列番号１０２
）、ドメインＣ（配列番号１０３）、及びドメインＤ（配列番号１０４）についてのアミ
ノ酸配列を示す図である。
【図２ｃ】Ｎａｖ１．７の完全アミノ酸配列（配列番号１０５）を示す図である。
【図３Ａ】インビトロでクローナル９８３抗Ｎａｖ１．７抗体が、電気的に誘導されるＤ
ＲＧスパイク頻度を低下させることを示す図である。
【図３Ｂ】インビトロで抗Ｎａｖ１．７モノクローナル抗体９８３が、電気的に誘導され
るＤＲＧスパイク頻度を低下させることを示す図である。
【図３Ｃ】インビトロで抗Ｎａｖ１．７モノクローナル抗体１０８０が、電気的に誘導さ
れるＤＲＧスパイク頻度を低下させることを示す図である。
30
【図３Ｄ】（ａ）ＨＥＫ細胞に発現した組換えヒトＮａｖ１．７チャネルの自動パッチク
ランプ分析を示す図である。９８３モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存
性阻害を生じる。（ｂ）ＨＥＫ細胞に発現した組換えヒトＮａｖ１．７チャネルの自動パ
ッチクランプ分析を示す図である。１０８０モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の
用量依存性阻害を生じる。
【図３Ｅ】ＨＥＫ細胞に発現した組換えラットＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクラン
プ分析を示す図である。９８３モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻
害を生じる。１０８０モノクローナル抗体は、２５μｇ／ｍｌにおいて、Ｎａｖ１．７電
流の約２６％阻害を生じる。
【図３Ｆ】９８３モノクローナル抗体によるヒトＮａｖ１．７阻害の動態を示す図である
40
。
【図３Ｇ】Ｎａｖ１．７ペプチドへの抗体９８３の特異的結合についてのＥＬＩＳＡデー
タを示す図である。
【図３Ｈ】Ｎａｖ１．７ペプチドへの抗体１０８０の特異的結合についてのＥＬＩＳＡデ
ータを示す図である。
【図４】特定の抗Ｎａｖ１．７抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】特定の抗Ｎａｖ１．７抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】特定の抗Ｎａｖ１．７抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】特定の抗Ｎａｖ１．７抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
50
(9)
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【００３２】
一態様において、本開示は、疼痛の調節に関連したイオンチャネルの活性を機能的に改
変するイオンチャネルＥ１ループ結合性実体を提供し、それには、抗体、抗体断片、タン
パク質又はタンパク質性スキャフォールド、核酸又はヌクレオチド、合成分子などの小分
子など、特に、抗体、抗体断片、タンパク質若しくはタンパク質性スキャフォールド、又
は核酸若しくはヌクレオチドが挙げられる。
【００３３】
疼痛の調節に関与及び／又は関連すると考えられるイオンチャネルには、Ｎａｖ１．３
、Ｎａｖ１．６、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、Ｎａｖ１．９、Ｃａｖ３．１、Ｃａｖ３
．２、Ｃａｖ３．３、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、Ｃａｖ２．３、Ｋｖ２．１、Ｋｖ２
10
．２、Ｋｖ７．ｘ、ＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＡ１、ＡＳＩＣ１、ＴＲＰ
Ｍ８、ＴＲＰＶ３、及びＴＲＰ４が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
一実施形態において、イオンチャネルは、Ｎａｖ１．７など、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１
．８、又はＮａｖ１．９についてのナトリウムチャネルである。免疫化に用いられるペプ
チドは、イオンチャネルの細胞外配列の少なくとも部分を含んでもよく、その細胞外配列
がＥ１ループであり、且つイオンチャネルのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、又は
Ｄドメイン由来であってもよい。好ましい実施形態において、ペプチドは、イオンチャネ
ルのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、又はＤドメイン由来のＥ１細胞外領域の少な
くとも一部を含む。さらに好ましい実施形態において、ペプチドは、イオンチャネルのＡ
20
ドメイン又はＢドメイン由来のＥ１細胞外領域の少なくとも一部を含む。好ましくは、ペ
プチドは、ＢＥ１細胞外領域の少なくとも一部を含む。
【００３５】
本発明の一実施形態において、イオンチャネルはＮａｖ１．７ではない。一実施形態に
おいて、本発明は、イオンチャネルのＥ１細胞外ループに結合する、抗Ｅ１イオンチャネ
ル抗体又はその結合断片を提供し、前記イオンチャネルが、疼痛の調節において機能して
おり、前記抗体又は断片が、前記イオンチャネルを、それに結合した後、機能的に改変し
、且つ前記イオンチャネルはＮａｖ１．７ではない。
【００３６】
一実施形態において、イオンチャネルは、カリウムイオンチャネル、Ｋｖ２．１、Ｋｖ
30
２．２、又はＫｖ７．ｘである。
【００３７】
一実施形態において、イオンチャネルは、カルシウムイオンチャネル、例えば、Ｃａｖ
３．１、Ｃａｖ３．２、Ｃａｖ３．３、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、又はＣａｖ２．３
である。
【００３８】
一実施形態において、イオンチャネルは、過分極活性化型チャネルＨＣＮ１又はＨＣＮ
２である。
【００３９】
一実施形態において、イオンチャネルは、非ゲート型イオンチャネル、例えば、ＴＲＰ
40
Ｖ１、ＴＲＰＡ１、ＡＳＩＣ１、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ３、又はＴＲＰ４である。
【００４０】
一実施形態において、処置、例えば、疼痛の調節、特に疼痛の寛解に用いるＥ１結合性
抗イオンチャネル抗体が提供される。
【００４１】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の寛解に用いるＥ１結合性抗イオンチャネル
抗体が提供される。
【００４２】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｎａｖ１．７抗体が提供される。
50
(10)
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【００４３】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｎａｖ１．８抗体が提供される。
【００４４】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｎａｖ１．９抗体が提供される。
【００４５】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＨＣＮ１抗体が提供される。
【００４６】
10
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＨＣＮ２抗体が提供される。
【００４７】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰＡ１抗体が提供される。
【００４８】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰＶ１抗体が提供される。
【００４９】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
20
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰＶ３抗体が提供される。
【００５０】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰＭ８抗体が提供される。
【００５１】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰ４抗体が提供される。
【００５２】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＡＳＩＣ１抗体が提供される。
30
【００５３】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ３．１抗体が提供される。
【００５４】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ３．２抗体が提供される。
【００５５】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ３．３抗体が提供される。
【００５６】
40
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ２．１抗体が提供される。
【００５７】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ２．２抗体が提供される。
【００５８】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグ
ループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ２．３抗体が提供される。
【００５９】
本明細書に用いられる場合の機能改変抗体は、イオンチャネルの活性を、例えば、イン
50
(11)
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ビトロ又はインビボアッセイで少なくとも１つにおいて２０％など、少なくとも５％、例
えば、１０％又は１５％、活性を低下させることによって、変化させる抗体又は（結合断
片などの）断片を指すものとする。適切なインビトロアッセイには、本明細書に記載され
ているようなパッチクランプアッセイ又は他のアッセイが挙げられる。一実施形態におい
て、機能改変抗体は、パッチクランプアッセイにより、電流の振幅を５％、１０％、１５
％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又はそれ以上のパーセント、低
下させる。
【００６０】
イオンチャネルに機能改変を与える抗体及び機能改変抗体は、本明細書において交換可
能に用いられる用語である。
10
【００６１】
一実施形態において、機能改変は、例えば、イオンチャネルのポア（孔）を遮断し、閉
鎖し、又は阻害するのに十分である。この機能改変は、任意の機構によってもたらされて
もよく、その機構には、ポアを物理的に遮断すること、例えば、ポアを遮断する、イオン
チャネルに立体構造的変化を引き起こすこと、又はイオンチャネルが非機能性状態（静止
状態又は不活化状態）をとるように誘発すること、及び／又はイオンチャネルを非機能性
状態に維持すること（アロステリック調節）が挙げられる。
【００６２】
一実施形態において、機能改変は、イオンチャネルタンパク質の細胞表面レベルを低下
させるのに十分である。この機能改変は、任意の機構によってもたらされてもよく、その
20
機構には、細胞表面における機能性イオンチャネルタンパク質の数を低下させるように導
く、イオンチャネルの抗体誘導性内部移行又はエンドサイトーシス又はサイクリングの増
加が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
イオンチャネルの機能改変について上記で提案した機構は例であり、機能改変抗体が、
イオンチャネルにおいて機能改変効果を生じ得る様式の点において限定するものではない
。
【００６４】
Ｎａｖ１．７細胞外ドメイン対他のファミリーメンバーの細胞外ドメインの配列の違い
を調べることによって、特定の関心対象の区域を同定することが可能になり、その区域は
30
、例えば、それらの配列に基づいてペプチドを作製することにより、抗体の作製に用いる
ことができる。Ｎａｖ１．７において、ドメインＡアミノ酸１４６∼１５３、ドメインＢ
アミノ酸７６４∼７７４、ドメインＣアミノ酸１２１３∼１２２４及び１２１６−１２２
４、並びにドメインＤアミノ酸１５３５∼１５４５は、特に違い／差異のある領域であり
、したがって、抗体を作製するのに特に適し得る。
【００６５】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルのドメインＡの細胞外（又は細
胞外アクセス可能）領域にＥ１ループにおいて結合する。
【００６６】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルにおけるドメインＢの細胞外（
40
又は細胞外アクセス可能）領域にＥ１ループにおいて結合する。
【００６７】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルにおけるドメインＣの細胞外（
又は細胞外アクセス可能）領域にＥ１ループにおいて結合する。
【００６８】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルにおけるドメインＤの細胞外（
又は細胞外アクセス可能）領域にＥ１ループにおいて結合する。
【００６９】
一実施形態において、本発明による抗体又は断片を、問題のイオンチャネルを機能的に
改変する他の実体、例えば、イオンチャネルのＥ３領域、例えば、ドメインＡなどのドメ
50
(12)
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インＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤのＥ３領域の部分に結合する抗体又は断片と併用して、用いても
よい。
【００７０】
一実施形態において、Ｅ１結合性抗Ｎａｖ１．７抗体が提供される。
【００７１】
抗Ｎａｖ１．７抗体は、Ｎａｖ１．７へ特異的に結合する抗体である。Ｅ１結合性抗Ｎ
ａｖ１．７抗体は、Ｎａｖ１．７へＥ１領域において特異的に結合する抗体である。
【００７２】
特異的結合とは、抗体が、関連するイオンチャネル、例えば、Ｎａｖ１．７に対して選
択性であり、それを他のイオンチャネル及びタンパク質、例えば、同じファミリーにおけ
10
る他のイオンチャネルと区別することができるという事実を指すものとする。選択的抗体
は、例えば、他のイオンチャネルからＮａｖ１．７などの関連するイオンチャネルをアフ
ィニティー精製するために用いることができるものである。
【００７３】
一実施形態において、抗Ｎａｖ１．７抗体は、哺乳類Ｎａｖ１．７、例えば、ヒトＮａ
ｖ１．７に特異的である。
【００７４】
一実施形態において、Ｅ１結合性抗イオンチャネル抗体、例えば、抗Ｎａｖ１．７抗体
は、関連するヒトイオンチャネル及び対応するラットイオンチャネルと交差反応する。
【００７５】
20
一実施形態において、機能改変抗体又は断片は、抗体のクローン集団、例えば、モノク
ローナル集団である。ポリクローナル抗体がイオンチャネルの機能改変を得るのに必要と
されることが、文献中で示唆されている。したがって、本開示が、関連するイオンチャネ
ルを機能的に改変するモノクローナル抗体を提供することは特に驚くべきことである。
【００７６】
本明細書に用いられる場合のモノクローナルとは、単細胞に由来する抗体又は断片を指
すものとし、例えば、それは、ハイブリドーマテクロノジーを用いることによる。
【００７７】
クローン集団は、同じアミノ酸配列及び特異性を含む同じ性質、特性を有する抗体又は
断片の集団を指すものとする。
30
【００７８】
一実施形態において、２つ以上、例えば、３つ又は４つの抗イオンチャネル抗体のクロ
ーン集団は混合して用いられ、その混合物は、本発明による少なくとも１つ、例えば、２
つ、３つ、又は４つの抗体を含む。
【００７９】
一実施形態において、本開示による抗体は抗体全体である。
【００８０】
一実施形態において、抗体又はその断片は、多価及び／又は二重特異性である。本明細
書で用いられる場合の多価とは、抗体又は断片の実体において複数の結合部位（例えば、
少なくとも２つの結合部位）を指すものとする。本明細書との関連における多価性実体は
40
、同じ特異性をもつ少なくとも２つの結合部位を有する。同じエピトープに結合する結合
部位を有する多価抗体は、その実体が、第１及び第２の結合部位と異なる特異性をもつ第
３の結合部位を含まない限り、二重特異性とはみなされないものとする。したがって、本
開示に用いられる場合の二重特異性は、異なる、すなわち、別個の標的抗原に結合する、
抗体又は断片における２つ以上の結合部位を必要とする。
【００８１】
各結合部位が同じ又は異なる標的抗原上の異なるエピトープに結合する、複数の結合部
位を有する実体においては、抗体又は断片の実体は、本開示の意味の範囲内において、二
重特異性とみなされるものとする。
【００８２】
50
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本明細書で用いられる場合の結合部位は、標的抗原を特異的に結合する抗体又は断片の
区域を指すものとする。重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対形成は、本明細書にお
ける結合部位の例とみなされるものとする。
【００８３】
一実施形態において、本開示による抗体断片は一価である。換言すれば、１つの結合部
位のみを有する。
【００８４】
一実施形態において、抗体は、断片、例えば、単一ドメイン抗体、一本鎖Ｆｖ、Ｆａｂ
、Ｆａｂ’、又は完全な重鎖と軽鎖の対形成である。
【００８５】
10
本発明に用いる、本開示の抗体又はその断片は、任意の種由来であり得るが、好ましく
は、モノクローナル抗体、ヒト抗体に由来し、又はヒト化断片である。本発明に用いる抗
体断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ｄ、又はＩｇＡ）又はサブクラス由来であり得、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ
、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の種から取得されてもよ
い。
【００８６】
抗体可変ドメインにおける残基は、通常、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに
より番号が付けられる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ
20
ＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅ
ｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以後、「Ｋａｂａｔら（上記）」）に示されている。この番号付け
システムは、他に指示されている場合を除き、本明細書で用いられる。
【００８７】
Ｋａｂａｔ残基呼称は、常にアミノ酸残基の直線的番号付けに直接対応するとは限らな
い。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造の、（フレームワークであろ
うと相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうと）構造コンポーネントの短縮又はそれへの挿入
に対応して、厳密なＫａｂａｔ番号付けにおいてより少ない、又は追加のアミノ酸を含む
場合がある。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、所定の抗体について、「標準」Ｋａｂ
ａｔ番号付け配列とのその抗体の配列における相同性の残基のアラインメントによって決
30
定され得る。
【００８８】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基３１∼３５（Ｃ
ＤＲ−Ｈ１）、残基５０∼６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５∼１０２（ＣＤＲ−Ｈ３
）に位置する。Ｋａｂａｔ番号付けを本明細書で用いるものとする。
【００８９】
本明細書では用いられていない、代替の番号システムは、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈ
ｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１∼９１
７（１９８７））であり、ＣＤＲ−Ｈ１に等しいループが残基２６から残基３２にわたっ
ている。「ＣＤＲ−Ｈ１」についてのＣｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔ番号付けの組み合わ
せは、例えば、残基２６∼３５を含むであろう。
【００９０】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基２４∼３４（Ｃ
ＤＲ−Ｌ１）、残基５０∼５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９∼９７（ＣＤＲ−Ｌ３）
に位置する。
【００９１】
様々なウサギ抗体についてのＣＤＲが下記に提供されている：
40
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【表２−１】
10
20
30
40
50
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【表２−２】
10
20
【００９２】
一実施形態において、本明細書における開示は、本明細書に開示された１個、２個、３
個、４個、５個、又は６個のＣＤＲ配列を含む抗体にまで及ぶ。
【００９３】
一実施形態において、本開示は、本明細書における配列（単数又は複数）由来の単一の
可変ドメイン又は１対の可変ドメインを含む抗体にまで及ぶ。
【００９４】
30
一実施形態において、重鎖の可変ドメインは、上記に掲載された表に示されている配列
を有するＣＤＲの少なくとも１つを含み、例えば、ＣＤＲがその「天然の位置」にある場
合である。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３などのＣＤＲの天然の位置は、上記
の表に示されており、例えば、配列番号４のＣＤＲについての天然の位置は、Ｈ１であり
、配列番号５のＣＤＲについての天然の位置は、Ｈ２であり、配列番号６のＣＤＲについ
ての天然の位置は、Ｈ３であるなどである。類似の解釈がまた、軽鎖配列にも適用される
。
【００９５】
一例において、本発明の抗体は重鎖を含み、その重鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｈ１、
ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも２つが上記の表に示された配列から選択さ
40
れており、例えば、ＣＤＲがそれらの天然の位置にあり、任意で、それらの天然の対形成
にある。本明細書に用いられる場合の天然の対形成とは、同じ抗体由来（すなわち、上記
の１つの表由来）のＣＤＲの対形成を指すものとする。ＣＡ１６７＿００９８３について
の天然の対形成の例は、配列番号１と２、１と３、及び２と３である。
【００９６】
一実施形態において、本発明による抗体は重鎖を含み、その可変ドメインが、以下に示
された配列：
配列番号４ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号６ＣＤＲ−Ｈ３、
50
(16)
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又は
配列番号１０ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号１１ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号１２ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号１６ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号１７ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号１８ＣＤＲ−Ｈ３、
又は、
配列番号２２ＣＤＲ−Ｈ１、
10
配列番号２３ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号２４ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号２８ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号２９ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号３０ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号３４ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号３５ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号３６ＣＤＲ−Ｈ３、
20
又は
配列番号４０ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号４１ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号４２ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号４６ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号４７ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号４８ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号５２ＣＤＲ−Ｈ１、
30
配列番号５３ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号５４ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号５８ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５９ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号６０ＣＤＲ−Ｈ３、
又はそれと少なくとも９０％、９５％、又は９８％など、少なくとも６０％、７０％、８
０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００９７】
一実施形態において、本発明による抗体は、重鎖を含み、その重鎖の可変ドメインが、
40
本明細書に開示されているような、例えば、本明細書に列挙された、可変ドメイン又は可
変ドメインコンポーネントを含む。
【００９８】
本明細書に用いられる場合の可変ドメインコンポーネントとは、ＣＤＲ及びそれらの組
み合わせ、特に本明細書で明確に開示されているようなＣＤＲ及びそれらの組み合わせを
指すものとする。
【００９９】
別の実施形態において、本発明の抗体は重鎖を含み、その重鎖の可変ドメインが、本明
細書に開示された重鎖可変領域と少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類
似性など、少なくとも６０％、７０％、８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
50
(17)
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【０１００】
本明細書に用いられる場合の「同一性」は、整列させた配列における任意の特定の位置
で、アミノ酸残基がその配列間で同一であることを示す。本明細書に用いられる場合の「
類似性」は、整列させた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基がその配列間で
類似した型であることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンの代わりに
用いられてもよい。しばしばお互いに置換することができる他のアミノ酸には以下が挙げ
られるが、それらに限定されない：
−フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパルテート及びグルタメート（酸性側鎖を有するアミノ酸）
10
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−システイン及びメチオニン（イオウ含有側鎖を有するアミノ酸）。
同一性及び類似性の程度は、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ
．ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ
．Ｗ．編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ、Ｐａｒｔ１、Ｇｒｉｆ
ｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
20
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ、Ｇ．、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
、１９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋ
ｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【０１０１】
本発明はまた、Ｅ１結合性抗イオンチャネル抗体又は断片を提供し、そのイオンチャネ
ルがインビボで疼痛の調節において役割／機能をもち、特に、前記イオンチャネルの機能
を選択的に阻害する、本明細書に記載されたイオンチャネルに向けられる抗体、例えば、
抗Ｎａｖ１．７抗体であり、前記抗体又は断片は、軽鎖ＣＤＲについて本明細書に示され
た配列（提供された表及びリストを参照）を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を
30
有し、例えば、そのＣＤＲがその「天然の位置」にある場合である。
【０１０２】
一実施形態において、本発明の抗体は軽鎖を含み、その軽鎖の可変ドメインにおけるＣ
ＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも２つが軽鎖ＣＤＲについて本
明細書に示された配列から選択されており、例えば、ＣＤＲはそれらの天然の位置にあり
、任意で、それらの天然の対形成にある。本明細書に用いられる場合の天然の対形成とは
、１つの抗体由来のＣＤＲが、同じ抗体、特に同じ抗体（すなわち、上記の１つの表由来
）の同じ鎖由来のＣＤＲと可変ドメインにおいて対形成する／同じ場所に位置するという
事実を指すものとする。
【０１０３】
40
誤解を避けるために言えば、全ての順列が含まれることは言うまでもない。
【０１０４】
一例において、本発明の抗体は軽鎖を含み、その可変ドメインが、以下に示された配列
：
配列番号１ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号３ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号７ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号８ＣＤＲ−Ｌ２及び
50
(18)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
配列番号９ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号１３ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号１４ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号１５ＣＤＲ−Ｌ３、
又は、
配列番号１９ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２０ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号２１ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
10
配列番号２５ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２６ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号２７ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号３１ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号３２ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号３３ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号３７ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号３８ＣＤＲ−Ｌ２及び
20
配列番号３９ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号４３ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号４４ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号４５ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号４９ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号５０ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号５１ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
30
配列番号５５ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号５６ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号５７ＣＤＲ−Ｌ３、
それと少なくとも９０％、９５％、又は９８％など、少なくとも６０％、７０％、８０％
の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【０１０５】
一実施形態において、本発明は軽鎖を含み、その軽鎖の可変ドメインが、例えば記載さ
れた任意の重鎖由来の、本明細書に開示されているような可変ドメイン又は可変ドメイン
コンポーネントを含む。
【０１０６】
40
別の実施形態において、本発明の抗体は軽鎖を含み、その軽鎖の可変ドメインが、本明
細書に開示された重鎖可変領域と少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類
似性など、少なくとも６０％、７０％、８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【０１０７】
一実施形態において、１対の可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメ
インが提供される。一態様において、同族の対である、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメ
インの対が提供される。
【０１０８】
本発明の抗体分子は、相補的軽鎖又は相補的重鎖をそれぞれ含む。
【０１０９】
50
(19)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
一実施形態において、重鎖及び軽鎖は、天然の対形成であり、換言すれば、例えば、本
明細書の単一の表に示されているような、同じ抗体由来である。
【０１１０】
一実施形態において、重鎖及び軽鎖は、非天然対形成を有する。
【０１１１】
本発明によって提供される１つの抗体は、図４に示された抗体９８３と本明細書で呼ば
れる。
【０１１２】
さらなる態様において、本発明はまた、本開示による抗体又はその断片をコードするヌ
クレオチド配列を提供する。
10
【０１１３】
例えば、本明細書に記載されたイオンチャネルに向けられる、ＣＤＲグラフト化（又は
ヒト化）された（本発明による）抗イオンチャネル抗体、特に、前記イオンチャネルを機
能的に改変することを特徴とする抗Ｎａｖ１．７抗体もまた本発明によって提供される。
一実施形態において、ＣＤＲグラフト化抗体分子におけるＣＤＲの１つ又は複数は、ウサ
ギ抗体９８３から取得されている。本明細書に用いられる場合、用語「ＣＤＲグラフト化
抗体分子」は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖可
変領域フレームワーク及び／又は軽鎖可変領域フレームワークへグラフト化されたドナー
抗体（例えば、本明細書に記載されているようなラット又はウサギの抗体）由来の１つ又
は複数のＣＤＲ（必要に応じて、１つ又は複数の改変ＣＤＲを含む）を含む、抗体分子を
20
指す。概説として、Ｖａｕｇｈａｎら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１
６、５３５∼５３９、１９９８を参照されたい。
【０１１４】
ＣＤＲがグラフト化される場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配
列は、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／型を考慮して用いられてもよく、それには
、ラット、ウサギ、マウス、霊長類、及びヒトのフレームワーク領域が挙げられる。好ま
しくは、本発明のＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域、及び
本明細書で言及されているようなドナー抗体由来のＣＤＲの１つ又は複数を含む可変ドメ
インを有する。したがって、可変ドメインが、ヒトアクセプターフレームワーク領域、及
び非ヒト、好ましくはラット、マウス、又はウサギのドナーＣＤＲを含む、ＣＤＲグラフ
30
ト化抗体が提供される。
【０１１５】
本発明に用いることができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、
ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔら、上記）である。例えば、Ｋ
ＯＬ及びＮＥＷＭは、重鎖に用いることができ、ＲＥＩは軽鎖に用いることができ、ＥＵ
、ＬＡＹ、及びＰＯＭは、重鎖及び軽鎖の両方に用いることができる。或いは、ヒト生殖
細胞系配列を用いてもよい；これらはｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａ
ｍ．ａｃ．ｕｋ／で入手できる。さらなる代替において、親和性成熟ヒトＶ領域配列のデ
ータベースをフレームワークとして用いてもよい。
【０１１６】
40
本発明のＣＤＲグラフト化抗体において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ
抗体由来である必要はなく、必要に応じて、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する
複合鎖を含んでもよい。
また、本発明のＣＤＲグラフト化抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗
体の配列と同じ配列を厳密に有する必要はない。例えば、通常の残基が、そのアクセプタ
ー鎖のクラス又は型についてより高い頻度で存在する残基へ変更されてもよい。或いは、
アクセプターフレームワーク領域における選択された残基が、それらがドナー抗体におい
て同じ位置に見出される残基に対応するように、変更されてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ
ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３∼３２４参照）。そのような変化は、ドナ
ー抗体の親和性を回復するための必要最低限に抑えられるべきである。変更される必要が
50
(20)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
あり得る、アクセプターフレームワーク領域における残基を選択するためのプロトコール
はＷＯ９１／０９９６７に示されている。
【０１１７】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲがもともと由来した抗体由来の残基であ
り、それは、本発明の一実施形態において、ラット、マウス、又はウサギの抗体に由来し
てもよく、必要に応じて、最終の抗体又は断片へ組み込まれ得る。
【０１１８】
一実施形態において、抗体（又はＦａｂ若しくはＦａｂ’断片などの断片）は、モノク
ローナル、完全ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体断片である。一実施形態において、抗体、
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、完全ヒト又はヒト化抗体である。
10
【０１１９】
したがって、本発明に用いる抗体は、完全長の重鎖と軽鎖を有する完全抗体分子、又は
その断片を含んでもよく、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一
ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲＶドメインなど）、ｓｃＦｖ、二価、
三価、又は四価抗体、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性
抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよいが、それらに限定されな
い（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅ
ｃｈ．２３（９）：１１２６∼１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒ
ｕｇＤｅｓｉｇｎＲｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ２（３）、２０９∼２１７参照）
。これらの抗体断片を作製及び製造するための方法は当技術分野においてよく知られてい
20
る（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌＭｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５∼１８１参照）。本発明に用いる他の抗体断片に
は、国際公開特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及び
ＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ断片及びＦａｂ’断片が挙げられる。多
価抗体は、複数の特異性を含んでもよいし、単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９
２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５参照）。
【０１２０】
一例において、本発明に用いる抗体は、ラクダ又はラマなどのラクダ科の動物由来であ
ってもよい。ラクダ科の動物は、重鎖抗体と呼ばれる、軽鎖を欠く機能クラスの抗体を有
する（Ｈａｍｅｒｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、４４６∼４４８；Ｍｕｙｌｄ
30
ｅｒｍａｎｓら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６、２３０∼２
３５）。これらの重鎖抗体の抗原結合部位は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨＨ）によって提
供される３つの超可変ループ（Ｈ１∼Ｈ３）のみに限定される。ＶＨＨの最初の結晶構造
により、Ｈ１ループ及びＨ２ループが、通常の抗体について定義された既知のカノニカル
構造クラスに制限されないことが明らかになった（Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅら、２０００、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３００、８３∼９１）。ＶＨＨのＨ３ループは、通常の抗体のそ
れらより平均して長い（Ｎｇｕｙｅｎら、２００１、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９、
２６１∼２９６）。ヒトコブラクダ重鎖抗体の大部分は、それらが産生されている酵素の
活性部位への結合を優先する（Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら、１９９８、ＥＭＢＯＪ、１７、
３５１２∼３５２０）。ある場合においては、Ｈ３ループは、残存するパラトープから突
40
出し、ニワトリ卵白リゾチームの活性部位に挿入することが示された（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ
ら、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３、８０３∼８１１、及びＤｅＧｅ
ｎｓｔら、２００６、ＰＮＡＳ、１０３、１２、４５８６∼４５９１、及びＷＯ９７０４
９８０５）。
【０１２１】
これらのループを他のスキャフォールドにおいてディスプレイし、ＣＤＲライブラリー
をそれらのスキャフォールドにおいて作製し得ることが示唆されている（例えば、ＷＯ０
３０５０５３１及びＷＯ９７０４９８０５参照）。
一例において、本発明に用いる抗体は、サメなどの軟骨魚由来であってもよい。軟骨魚（
サメ、ガンギエイ、エイ、及びキメラ）は、ＩｇＮＡＲとして知られた異型免疫グロブリ
50
(21)
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ンアイソタイプを有する。ＩｇＮＡＲは、軽鎖と会合していないＨ鎖ホモ二量体である。
各Ｈ鎖は、１つの可変ドメイン及び５つの定常ドメインを有する。ＩｇＮＡＲＶドメイ
ン（又はＶ−ＮＡＲドメイン）は、２つの密接に関係したサブタイプ、Ｉ及びＩＩへの分
類を可能にするいくつかの非カノニカルシステインを有する。タイプＩＩＶ領域は、Ｃ
ＤＲ１及びＣＤＲ３に追加のシステインを有し、そのシステインは、ラクダ科の動物のＶ
ＨＨドメインに観察されるものと類似した、ドメイン拘束ジスルフィド結合を形成すると
提唱されている。その上、ＣＤＲ３は、ラクダ科の動物のＶＨＨと類似して、より伸長し
た立体構造をとり、抗体フレームワークから突出しているであろう。実際、上記のＶＨＨ
ドメインのように、特定のＩｇＮＡＲＣＤＲ３残基もまた、ニワトリ卵白リゾチーム活
性部位において結合する能力があることが実証されている（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄら、２０
10
０４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５、１７７０∼１７７３）。
【０１２２】
ＶＨＨドメイン及びＩｇＮＡＲＶドメインを作製する方法の例は、例えば、Ｌａｕｗ
ｅｒｅｙｓら、１９９８、ＥＭＢＯＪ．１９９８、１７（１３）、３５１２∼２０；Ｌ
ｉｕら、２００７、ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７、７８；Ｓａｅｒｅｎｓら、２
００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（５）、５１９６５∼７２に記載されている
。
【０１２３】
本発明に用いる抗体には、任意の適切なクラス、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＧ、若しくはＩｇＭ、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４などのサ
20
ブクラスの抗体全体、及びそれらの機能活性断片若しくは誘導体が挙げられ、それらは、
モノクローナル抗体、クローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、又はキメラ抗体であ
り得るが、それらに限定されない。
【０１２４】
一実施形態において、本開示による抗体又はその特定の断片に用いられる定常領域は、
ハイブリッド定常領域又は突然変異型定常領域である。ハイブリッド定常領域は、２つ以
上の別個の定常領域、例えば、２つ以上の別個のヒト定常領域由来の部分又はドメインを
含む。
【０１２５】
ハイブリッド定常領域の例として、米国特許出願公開第２００７／００４１９７２号に
30
開示されたものが挙げられ、それにおいては、少なくともＣＨ１及びヒンジ領域が１つ又
は複数のＩｇＧ２抗体に由来し、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部が１つ又は複数
のＩｇＧ４ＣＨ２及びＣＨ３領域に由来する。エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｉｍｕｍａ
ｂ）（ＡｌｅｘｉｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ハイブリッド定常領域を
含む発作性夜間血色素尿症についてのヒト化抗ヒトＣ５モノクローナル抗体である。それ
は、ＩｇＧ２由来のＣＨ１及びヒンジと、ＩｇＧ４由来のＣＨ２及びＣＨ３ドメインとの
ハイブリッド鎖を有する。それはＦｃγＲに結合しないし、補体も活性化しない。それは
また、低い免疫原性を有する（１９６人の患者のたった３人（３％）に検出される抗エク
リズマブ抗体の低力価）。
【０１２６】
40
ＷＯ２００８／０９０９５８は、ＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒンジ、及びＣＨ２、並びに
ＩｇＧ３由来ＣＨ３ドメインの鎖を含む特定のハイブリッド定常領域を開示する。そのハ
イブリッドは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３抗体のＣＤＣ活性より高いＣＤＣ活性を有し、Ｉｇ
Ｇ１と等価のプロテインＡ結合活性を有する。
【０１２７】
さらなるハイブリッド定常領域は、Ｔａｏら（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎのグループ）
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１７３１０２５∼１０２８、１９９１に開示されている。この論
文は、全てのクラスからの多数のＩｇＧドメイン交換を含むが、重要なハイブリッドはｇ
１ｇ４及びｇ４ｇ１であり、それぞれ、ＣＨ２ドメインにおいて連結している。ＩｇＧ（
１−１−１／４−４）は、ＩｇＧ１と対照的に、補体を活性化することが全くできない。
50
(22)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
しかしながら、ＩｇＧ（４−４−４／１−１）は、ＩｇＧ４と比較して有意な活性を示し
たが、ＩｇＧ１と比較してわずかに損なわれていた。重要な違いは、ヒンジであると思わ
れ、多くの論文が、その後に、ヒンジは補体活性化を調節するが、媒介しないことを実証
している。
【０１２８】
Ｔａｏら（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎのグループ）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１７８６６
１∼６６７、１９９３は、補体活性化におけるアイソタイプ特異的違いを決定するヒトＩ
ｇＧの構造的特徴を開示している。ＩｇＧ４におけるＳｅｒ３３１（ＣＨ２）は、Ｃ１ｑ
結合及び補体活性化を妨げる。ＩｇＧ４及びＩｇＧ（１−１−１／４−４）におけるＳｅ
ｒ３３１のＰｒｏへの突然変異誘発は、結合及び活性化を可能にするが、ＩｇＧ１のそれ
10
より低いレベルである。興味深いことには、ＩｇＧ１におけるＰ３３１Ｓは結合を可能に
するが、活性化を可能にしない。
【０１２９】
Ｚｕｃｋｅｒら、ＣａｎｃＲｅｓ５８３９０５∼３９０８１９９８は、複数の
ドメインがインビボでの半減期に寄与していることを実証するために、組み替えた定常領
域エクソンを有するキメラヒト−マウスＩｇＧ抗体を用いている。特に、この論文は、Ｉ
ｇＧ（１−１−１／４−４）ハイブリッドなどの半減期を調べている。ＳＣＩＤマウスに
おいて、ＩｇＧ（１−１−１／４−４）は、ＩｇＧ４より有意に長いが、ＩｇＧ１よりわ
ずかに短い半減期を有する。ＩｇＧ（４−４−４／１−１）は最も長い半減期を有する。
【０１３０】
20
突然変異型定常領域の例には、ヒトＣＴＬＡ−４とＩｇＧ１ヒンジ−Ｆｃとの融合体で
あるＡｂａｔａｃｅｐｔに用いられたものが挙げられる。そのヒンジは、ＣＰＰＣからＳ
ＰＰＳへ変化していた。後者はＯ−ｇｌｙである。突然変異型定常領域は、ＡＤＣＣ又は
ＣＤＣを媒介せず、低い免疫原性を有する（３％の発生率）。
【０１３１】
そのヒンジは、補体活性化において役割をもつ可能性があると考えられる。結晶学的研
究から推定される機能的ヒンジは、ＩｇＧ１の２１６から２３７まで及び、
【化１】
30
の
、それぞれからなる。一実施形態において、本開示による抗体又は断片は機能的ヒンジを
含む。
【０１３２】
40
定常領域への突然変異／改変は、例えば、安定性の増加を生じ得、例えば、米国特許出
願公開第２００４／０１９１２６５は、ＩｇＧ１ヒンジの突然変異誘発を開示しており、
その突然変異誘発は、ヒトＩｇＧ１の位置２３３∼２３９又は２４９におけるヒンジ領域
に１つ又は複数のアミノ酸改変を導入することによってＩｇＧの安定性を増加させた。こ
れは、１週間５５℃まで加熱した際、分解を低下させた。
【０１３３】
或いは、上流ヒンジ部（ヒトＩｇＧ１残基２２６∼２４３、並びに他のＩｇＧサブタイ
プ及び／若しくは他の種由来の免疫グロブリンにおける対応する残基）並びに／又は隣接
ＣＨ１及び／若しくはＣＨ２配列（ヒトＩｇＧ１残基２４９、並びに他のＩｇＧサブタイ
プ及び／若しくは他の種由来の免疫グロブリンにおける対応する残基）における不安定性
50
(23)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
アミノ酸（例えば、ヒスチジン又はスレオニン）又は反応性アミノ酸（例えば、リシン又
はグルタミン酸）に点突然変異を起こすことによって、改変をもたらしてもよい。
【０１３４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａ
ｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５∼４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ、１９８３、４、７２
）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ」、７７∼９６ページ、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）などの当技術分野において知られた任意の方法によ
って調製されてもよい。
10
【０１３５】
本発明に用いる抗体はまた、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３（１５）、７８４３∼７８４８、ＷＯ９２／
０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８、及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載され
た方法による、特定の抗体の生産のために選択された単一のリンパ球から生じた免疫グロ
ブリン可変領域ｃＤＮＡをクローン化及び発現することによる単一リンパ球抗体方法を用
いて作製されてもよい。
【０１３６】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト免
疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（
20
例えば、米国特許第５，５８５，０８９号参照）。
【０１３７】
本発明に用いる抗体はまた、当技術分野において知られた様々なファージディスプレイ
方法を用いて作製することができ、その方法には、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、４１∼５０；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、１７７∼１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ
ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、９５２∼９５８；Ｐｅｒｓｉｃら
、Ｇｅｎｅ、１９９７１８７、９∼１８；及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓｉ
ｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、１９１∼２８０；ＷＯ９０／０２８０９；
ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１
30
２３６；ＷＯ９５／１５９８２；及びＷＯ９５／２０４０１；並びに米国特許第５，６９
８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１
７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第
５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８
０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号；及び第５，９６９，
１０８号により開示されたものが挙げられる。また、トランスジェニックマウス、又は他
の哺乳類を含む他の生物体を、ヒト化抗体を作製するために用いてもよい。
【０１３８】
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び（存在する場合）定常領域が、全
てヒト起源であり、又は必ずしも同じ抗体由来であるとは限らないが、ヒト起源の配列と
40
実質的に同一である。完全ヒト抗体の例として、例えば、上記のファージディスプレイ方
法により作製された抗体、及び例えば、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、米国特許第５，５４５
，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国
特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０
，４２９号、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１、及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１に一般論として記載
されているような、マウス免疫グロブリン可変領域遺伝子及び／又は定常領域遺伝子がそ
れらのヒト対応物によって置き換えられているマウスによって産生された抗体を挙げるこ
とができる。
【０１３９】
本発明に用いる抗体又は断片は、任意の適切な酵素切断及び／又は消化技術を用いて、
50
(24)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
例えば、ペプシンでの処理により、任意の抗体全体、特にモノクローナル抗体全体から得
ることができる。
【０１４０】
或いは、又は加えて、抗体の出発物質を、抗体可変領域及び／又は定常領域をコードす
るＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術を用いることによって調製してもよい
。標準分子生物学技術を、必要に応じて、アミノ酸又はドメインを改変、付加、又は除去
するために用いてもよい。可変領域又は定常領域へのいかなる変更もなお、本明細書に用
いられる場合の用語「可変」領域及び「定常」領域に含まれる。
【０１４１】
論じられているように、抗体断片「出発物質」は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、
10
ハムスター、サメ、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の種から取得されてもよい
。抗体断片の部分は、１つより多い種から取得されてもよく、例えば、抗体断片はキメラ
であってもよい。一例において、定常領域が１つの種由来であり、可変領域が別の種由来
である。抗体断片出発物質はまた改変されていてもよい。別の例において、抗体断片の可
変領域は、組換えＤＮＡ操作技術を用いて作製されていてもよい。そのような操作された
バージョンには、天然抗体のアミノ酸配列における、又はそれらへの挿入、欠失、又は変
化によって天然抗体可変領域から生じたものが挙げられる。この型の具体的な例には、少
なくとも１つのＣＤＲ、並びに任意で、１つの抗体由来の１つ又は複数のフレームワーク
アミノ酸、及び第２の抗体由来の可変領域ドメインの残部を含む、操作された可変領域ド
メインが挙げられる。これらの抗体断片を作製及び製造するための方法は、当技術分野に
20
おいてよく知られている（例えば、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｃａ
ｂｉｌｌｙら、米国特許第６，３３１，４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５
５１；Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９
８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３；Ｒｉｅｃｈｍ
ａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２４２、４２３；Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ
、ＷＯ９１／０９９６７；ＭｏｕｎｔａｉｎａｎｄＡｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１∼１４２；Ｖｅｒｍａら、１９９
８、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、２１６、１
６５∼１８１参照）。
30
【０１４２】
したがって、一実施形態において、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ
、ＩｇＧ、又はＩｇＭドメインであり得る。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、とりわ
け、抗体分子が治療的使用を意図されており、且つ抗体エフェクター機能が必要とされる
場合、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３のアイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを用いてもよ
い。或いは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを、抗体分子が治療目的を意図され、且
つ抗体エフェクター機能が必要とされない場合、用いてもよい。これらの定常領域ドメイ
ンの配列変種もまた用い得ることは認識されているであろう。例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５∼１０８に記
載されているように、位置２４１におけるセリンがプロリンへ変化しているＩｇＧ４分子
40
を用いてもよい。抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることもまた、当業者によって理解さ
れているであろう。これらの修飾の型及び程度は、抗体を発現するために用いられる宿主
細胞系及び培養条件に依存することが多い。そのような修飾には、グリコシル化、メチオ
ニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパルテート異性化、及びアスパラギン脱アミドに
おけるバリエーションを挙げることができる。よくある修飾は、（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ７０５：１２９∼１３４、１
９９５に記載されているような）カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩
基性残基（リシン又はアルギニンなど）の喪失である。
【０１４３】
一実施形態において、抗体又は断片の軽鎖は、κか又はλのいずれかのＣＬドメインを
50
(25)
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含む。
【０１４４】
本明細書で用いられる場合の用語「抗体」又は断片はまた、生体適合性フレームワーク
構造へ組み込まれた１つ又は複数のＣＤＲを含む結合作用物質も含み得る。一例において
、生体適合性フレームワーク構造は、局在的表面領域において抗原に結合する１つ又は複
数のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）をディスプレイすることができる、
立体構造的に安定な構造支持体、又はフレームワーク、又はスキャフォールドを形成する
のに十分であるポリペプチド又はその部分を含む。そのような構造は、天然のポリペプチ
ド又はポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であり得、又は天然のポリペプチド又
は折り畳みに対して、アミノ酸の付加、欠失、又は置換などの１つ又は複数の改変を有し
10
得る。これらのスキャフォールドは、ヒト、他の哺乳類、他の脊椎動物、無脊椎動物、植
物、細菌、又はウイルスなどの任意の種（又は１つより多い種）のポリペプチド由来であ
り得る。
【０１４５】
典型的には、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパ
ク質スキャフォールド又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン
、リポカリン、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｉｎ）、チトクロー
ムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメイ
ン、及びテンダミスタット（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）に基づいたものを用いてもよい（
例えば、Ｎｙｇｒｅｎ及びＵｈｌｅｎ、１９９７、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉ
20
ｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ、７、４６３∼４６９参照）。
【０１４６】
一実施形態において、抗体又は断片の総電荷は中性である。
【０１４７】
一実施形態において、抗体又は断片の総電荷は負である。
【０１４８】
一実施形態において、抗体又は断片の総電荷は正である。
【０１４９】
一実施形態において、ＣＤＲは、代替型のスキャフォールド、例えば、フィブロネクチ
ン又はアクチン結合性リピートへグラフト化又は操作されてもよい。
30
【０１５０】
一実施形態において、抗体又は断片は、ポリマー、毒物又はそれにコンジュゲートした
化学阻害剤などの生体毒素を含む毒素などのエフェクター分子を含む。
【０１５１】
生体毒素及び毒物は、細胞シグナル伝達の遮断剤などの天然の調節剤である。本発明に
よる抗体又は断片にコンジュゲートした場合、それらは、抗体により提供される選択性を
維持しながら、イオンチャネルへの機能的効果を増強するために用いることができる。例
えば、タランチュラコモリグモ毒ペプチドＰｒｏＴｘＩＩは、Ｎａｖ１．７を選択的に阻
害することが示されており、例えば、ＭｏｌＰｈａｒｍａｃｏｌ７４：１４７６∼１
４８４、２００８を参照されたい。一実施形態において、毒素は、ボツリヌス毒素、例え
40
ば、ボツリヌス毒素Ａである。他の毒素には、テトロドトキシン及びサキシトキシンが挙
げられる。
【０１５２】
一実施形態において、抗体又は断片はアプタマーにコンジュゲートされている。アプタ
マーは、二次構造及び三次構造をとり、且つ結合して、タンパク質活性を調節することが
できる一本鎖オリゴヌクレオチド配列である。そのような構造の抗体へのコンジュゲーシ
ョンにより、イオンチャネルの標的特異的調節がもたらされる（直接的効果）。
【０１５３】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルの合成化学阻害剤などの化学阻
害剤にコンジュゲートされている。化学阻害剤の例には、以下の式（Ｉ）の化合物が挙げ
50
(26)
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られる：
【化２】
10
式中、ｎは０又は１である；
ｍは０又は１である；
ｐは０又は１である；
ＹはＣＨ、Ｎ、又はＮＯである；
Ｘは酸素又はイオウである；
Ｗは酸素、Ｈ２、又はＦ２である；
ＡはＮ又はＣ（Ｒ２）である；
ＧはＮ又はＣ（Ｒ３）である；
ＤはＮ又はＣ（Ｒ４）である；
ただし、Ａ、Ｇ、及びＤのうちの１個以下が窒素であるが、Ｙ、Ａ、Ｇ、及びＤのうちの
20
少なくとも１つが窒素又はＮＯである；
Ｒ１が水素又はＣ１∼Ｃ４アルキルである；
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、非依存的に、水素、ハロゲン、Ｃ１∼Ｃ４アルキル、Ｃ２∼Ｃ
４アルケニル、Ｃ２∼Ｃ４アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ＯＨ、ＯＣ１∼Ｃ４
アルキル、ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＦ３、−ＯＳＯ２ＣＦ３
２
３
３
４
であり、又はＲ
とＲ
、若しくはＲ
とＲ
がそれぞれ一緒になって、０個から２個の
間の窒素原子を含み、且つ以下の置換基のうちの１∼２つで置換された、ＡとＧ、又はＧ
とＤをそれぞれ共有する別の６員芳香環又はヘテロ芳香環を形成し得る：非依存的に、水
素、ハロゲン、Ｃ１∼Ｃ４アルキル、Ｃ２∼Ｃ４アルケニル、Ｃ２∼Ｃ４アルキニル、ア
リール、ヘテロアリール、ＯＨ、ＯＣ１∼Ｃ４アルキル、ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ、−ＮＯ２
５
、−ＮＲ
５
30
６
Ｒ
、−ＣＦ３、−ＯＳＯ２ＣＦ３；
Ｒ
６
及びＲ
は、非依存的に、水素、Ｃ１∼Ｃ４アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ７、Ｃ（Ｏ）ＮＨ
８
Ｒ
、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、ＳＯ２Ｒ１０であり、又は一緒になって、（ＣＨ２）ｊＱ（ＣＨ
１１
、又は結合である；ｊは２∼７である；
２）ｋであり得る（式中、ＱはＯ、Ｓ、ＮＲ
７
８
９
１０
ｋは０∼２である；Ｒ、Ｒ、Ｒ、Ｒ
、及びＲ１１は非依存的に、Ｃ１∼Ｃ４ア
ルキル、アリール、若しくはヘテロアリール、又はそれらの鏡像異性体であり、それらの
薬学的に許容される塩はニコチン性アセチルコリン受容体の強力なリガンドである）。
ＥＰ０９９６６２２を参照されたい。
【０１５４】
ＢｉｏｏｒｇＭｅｄＣｈｅｍ（２００３）１１：２０９９∼１１３．ＲＡＨｉｌ
ｌ、ＳＲｕｄｒａ、ＢＰｅｎｇ、ＤＳＲｏａｎｅ、ＪＫＢｏｕｎｄｓ、Ｙｇ、
ＡＡｄｌｏｏ、ＴＬｕは、阻害剤として特定のヒドロキシル置換型スルホニル尿素を
開示している。
【０１５５】
４，４−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）は、陰
イオン輸送阻害剤として用いられている。
【０１５６】
以下もまた、Ｎａｖ１．７の化学阻害剤である：
40
(27)
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【表３】
10
20
【０１５７】
上記表に２と名付けられた化合物、Ｎ−［（Ｒ）−１−（Ｒ）−７−クロロ−１−イソ
プロピル−２−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン−
３−イルカルバモイル）−２−（２−フルオロフェニル）−エチル］−４−フルオロ−２
−トリフルオロメチル−ベンズアミドは、ＭｃＧｏｗａｎら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａａ
ｎｄＡｎａｌｇｅｓｉａ１０９巻、３号、２００９年９月（題が「末梢作用性Ｎａｖ
１．７ナトリウムチャネル遮断剤は、炎症性疼痛及び神経因性疼痛のラットモデルにおい
て痛覚過敏及び異痛症を逆転させる（ＡＰｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙＡｃｔｉｎｇＮ
ａｖ１．７ＳｏｄｉｕｍＣｈａｎｎｅｌＢｌｏｃｋｅｒＲｅｖｅｒｓｅｓＨｙ
ｐｅｒａｌｇｅｓｉａａｎｄＡｌｌｏｄｙｎｉａｏｎＲａｔＭｏｄｅｌｓｏ
30
ｆＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄＮｅｕｒｏｐａｔｈｉｃＰａｉｎ）」である
）による論文で論じられている。
【０１５８】
Ｔａｒｎａｗａら（２００７）（「中枢神経系疾患の処置のための電位開口型ナトリウ
ムチャネルの遮断剤（Ｂｌｏｃｋｅｒｓｏｆｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄｓｏｄｉ
ｕｍｃｈａｎｎｅｌｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃｅｎｔｒａｌ
ｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｄｉｓｅａｓｅｓ）」、ＲｅｃｅｎｔＰａｔｅｎｔ
ｓｏｎＣＮＳＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ、２：５７）は、最近のナトリウムチ
ャネル遮断剤の医薬品化学を概説した。リドカイン、メキシレチン、カルバマゼピン、フ
ェニトイン、ラモトリギンなどのいくつかの古い薬物、及びラコサミド、オキシカルバゼ
ピン、クロベネチン、ラルフィナミドなどの新しく開発された薬物は、動物モデルにおい
て様々な型の慢性疼痛の処置に効果的であることが証明されているナトリウムチャネル遮
断剤であり、それらの一部は、臨床的にも用いられている。電位開口型ナトリウムチャネ
ルの化学調節剤のいくつかの他の例は下記に列挙されている：
40
(28)
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【化３】
10
図（１５ａ）．Ｍｅｒｃｋによって特許取得された、芳香環及びヘテロ芳香環の組み合わ
せをもつ化合物
【化４】
20
30
図（１６）．Ａｔｋｉｎｓｏｎによって特許取得された、ビアリールカルボキサミド化合
物
【化５】
40
図（１７）．Ｅｈｒｉｎｇによって特許取得された、芳香環及びヘテロ芳香環の組み合わ
せをもつ化合物
(29)
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【化６】
10
図（１８ｂ）．Ｖｅｒｔｅｘによって特許取得された、組み合わされた芳香環及びヘテロ
芳香環を有する化合物
【化７】
20
図（１９）．Ｉｏｎｉｘによって特許取得された、組み合わされた芳香環及びヘテロ芳香
環を有する化合物
電位開口型ナトリウムチャネルの化学調節剤を記載する他の参考文献：Ａｎｇｅｒら（２
００１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４（２）：１１５；Ｈｏｙｔら（２００７）、Ｂｉ
ｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７：６１７２；Ｙａｎｇら（２００４）、Ｊ
．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：１５４７；Ｂｅｎｅｓら（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ
．４２：２５８２
30
米国特許第７４５６１８７号は、以下の式の特定のカリウムチャネル阻害剤を開示する：
【化８】
40
式中、Ｒ１は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、又はアルキルである；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、ニトロ、−ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ４Ｒ５、又はハロである；
Ｒ３はＨ、ＮＲ４Ｒ５、ＮＣ（Ｏ）Ｒ８、ハロ、トリフルオロメチル、アルキル、ニトリ
ル、又はアルコキシである；
Ｒ４及びＲ５は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリー
ル、若しくはシクロアルキルであってもよい；又はＲ４及びＲ５は一緒になって、飽和、
非飽和、若しくは部分的飽和の４∼７員環を形成してもよく、ただし、前記環は任意で、
Ｎ、Ｏ、若しくはＳから選択された１つ若しくは複数のさらなるヘテロ原子を含んでもよ
50
(30)
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い；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ６である；
Ｒ６は、Ｈ又はアルキルである；
Ｒ７は、水素、メチル、又はエチルである；
Ｒ８は、メチル又はエチルである；
Ｌは、（ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは１、２、又は３である）である；及び
Ｙは、アリール、複素環基、アルキル、アルケニル、若しくはシクロアルキル、又はその
薬学的に許容される塩である。
【０１５９】
ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃａｎｄＭｅｄｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒ
10
ｓ１９巻、第１１刷、２００９年６月１日、３０６３∼３０６６ページは、以下の式の
特定の阻害剤を開示している：
【化９】
20
より具体的には：
【化１０】
30
(31)
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【化１１】
10
20
30
40
【０１６０】
一実施形態において、抗体又は断片にコンジュゲートした実体は、その分子の全体的電
荷を変化させる。
【０１６１】
本明細書で用いられる場合のエフェクター分子という用語は、例えば、抗悪性腫瘍剤、
薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然
のポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその断片、放射性核種、
50
(32)
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特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子、並びに、蛍光化合物又
はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光測定法によって検出され得る化合物などのレポーター群を含
む。
【０１６２】
エフェクター分子の例には、細胞毒、又は細胞にとって有害である（例えば、細胞を殺
す）任意の作用物質を含む細胞毒性物質を挙げることができる。例として、コンブレタス
タチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンギス
タチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアスタリン、タキソール、サイト
カラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド
、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノ
10
ルビシン、ジヒドロキシアンタラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アク
チノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テト
ラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似
体又は相同体が挙げられる。
【０１６３】
エフェクター分子にはまた、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプト
プリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アル
キル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムス
チン（ＢＳＮＵ）、及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、
ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジ
20
アミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノル
ビシン（以前はダウノマイシン）、及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノ
マイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイ
シン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン、又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（
例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を挙げ得るが、それらに限定されない。
【０１６４】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カ
リホルニウム２５２、イリジウム１９２、及びタングステン１８８／レニウム１８８など
のキレート放射性核種；又は非限定的に、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻
害剤、タキソイド、及びスラミンなどの薬物を挙げ得る。
30
【０１６５】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が挙げられる。関心対象
となる酵素には、タンパク質分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トラ
ンスフェラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。関心対象となるタンパク質、ポ
リペプチド、及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス
外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６６】
他のエフェクター分子には、例えば、診断に有用な検出可能な物質を挙げ得る。検出可
能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放
射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影用）、及び非放射性常磁性金属
40
イオンが挙げられる。一般的には、診断法として用いる、抗体にコンジュゲートすること
ができる金属イオンについて米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵
素には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族には、ストレ
プトアビジン、アビジン、及びビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質には、ウンベリフ
ェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロト
リアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、及びフィコエリトリンが挙げられる；
適切な発光物質には、ルミノールが挙げられる；適切な生物発光物質には、ルシフェラー
ゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；並びに適切な放射性核種には、１２５
Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが挙げられる。
50
(33)
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【０１６７】
別の例において、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を増加させ、及び／
又は抗体の免疫原性を低下させ、及び／又は上皮性関門を渡っての免疫系への抗体の送達
を増強することができる。この型の適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブ
ミン、アルブミン結合タンパク質、又はＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものな
どのアルブミン結合化合物が挙げられる。
【０１６８】
エフェクター分子がポリマーである場合、一般的には、それは、合成ポリマーであって
も天然ポリマーであってもよく、例えば、任意で置換される直鎖若しくは分岐鎖のポリア
ルキレン、ポリアルケニレン、若しくはポリオキシアルキレンのポリマー、又は分岐型若
10
しくは非分岐型多糖、例えば、ホモ多糖若しくはヘテロ多糖であり得る。
【０１６９】
上記の合成ポリマー上に存在し得る具体的な任意の置換基には、１つ又は複数のヒドロ
キシ基、メチル基、又はメトキシ基が挙げられる。
【０１７０】
合成ポリマーの具体的な例として、任意で置換される直鎖又は分岐鎖のポリ（プロピレ
ングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、メトキシポリ（エチレ
ングリコール）などの任意で置換されるポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙
げられる。
【０１７１】
20
適切なポリマーには、ポリ（エチレングリコール）、又は特に、メトキシポリ（エチレ
ングリコール）などのポリアルキレンポリマー又はその誘導体、特に、約１５０００Ｄａ
から約４００００Ｄａまでの範囲の分子量を有するものが挙げられる。
【０１７２】
ポリマーのサイズは、必要に応じて変わり得るが、一般的に、５００Ｄａから５０００
０Ｄａまで、例えば、２００００Ｄａから４００００Ｄａまでなど、５０００Ｄａから４
００００Ｄａまでの平均分子量範囲にある。ポリマーサイズは、特に、その製造物の意図
される使用、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在化する能力、又は循環半減期を延ばす
能力に基づいて選択され得る（概説として、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅ
ｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１∼５４５参照）。した
30
がって、例えば、その製造物が、例えば腫瘍の処置に用いるために、循環を出て、組織に
浸透するように意図される場合、低分子量ポリマー、例えば、約５０００Ｄａの分子量を
もつポリマーを用いることが有利であり得る。その製造物が循環内に留まる適用について
、より高分子量のポリマー、例えば、２００００Ｄａから４００００Ｄａまでの範囲の分
子量を有するポリマーを用いることが有利であり得る。
【０１７３】
一実施形態において、用いられるＰＥＧは、例えば、ＥｎｚｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌｓによって供給される、遊離可能ＰＥＧである。
【０１７４】
一例において、本発明に用いる抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に
40
付着している。１つの特定の例において、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子が、抗体断
片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊
離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を通して付着
していてもよい。そのようなアミノ酸は、抗体断片内に天然で存在していてもよいし、組
換えＤＮＡ方法を用いて断片へと操作されていてもよい（例えば、米国特許第５，２１９
，９９６号；第５，６６７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１参照）。一例において、本
発明の抗体分子は、修飾Ｆａｂ断片であり、その修飾は、エフェクター分子の付着を可能
にする１つ又は複数のアミノ酸の、その重鎖のＣ末端への付加である。適切には、付加の
アミノ酸は、エフェクター分子が付着し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾ヒ
ンジ領域を形成する。２個以上のＰＥＧ分子を付着させるために複数の部位を用いること
50
(34)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
ができる。
【０１７５】
一実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、１つ又は２つのＰＥＧ分子でＰＥＧ化さ
れる。
【０１７６】
一実施形態において、ＰＥＧ分子は、軽鎖内のシステイン１７１に連結しており、例え
ば、参照により本明細書に組み入れられたＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい。
【０１７７】
一実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、表面アクセス可能なシステインを通して
ＰＥＧ化されている。
10
【０１７８】
適切には、ＰＥＧ分子は、融合タンパク質に位置する少なくとも１つのシステイン残基
のチオール基を通して共有結合している。融合タンパク質に付着した各ポリマー分子は、
タンパク質内に位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合し得る。共有結合は、一
般的に、ジスルフィド結合、又は、特に、イオウ−炭素結合である。チオール基が付着点
として用いられる場合、適切に活性化されたＰＥＧ分子、例えば、マレイミドなどのチオ
ール選択性誘導体及びシステイン誘導体が用いられ得る。活性化ＰＥＧ分子は、上記のよ
うな分子を含むポリマー融合タンパク質の調製における出発物質として用いることができ
る。活性化ＰＥＧ分子は、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミ
ド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドなどのチオール反
20
応基を含む任意のポリマーであり得る。そのような出発物質は、商業的に（例えば、Ｎｅ
ｋｔａｒ（以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓＩｎｃ．）、Ｈｕｎｔｓｖ
ｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）入手することができ、又は通常の化学的手順を用いて市販
の出発物質から調製することができる。具体的なＰＥＧ分子として、２０Ｋメトキシ−Ｐ
ＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ（以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ）；ＲａｐｐＰｏｌｙｍｅ
ｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ（以前
はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ）から入手可能）が挙げられる。
【０１７９】
ＰＥＧ分子などのエフェクター分子は、アルデヒド糖を通して、又はより一般的には、
抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任
30
意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を通し
ての方法を含む、いくつかの異なる方法によって、抗体に付着し得る。エフェクター分子
の付着部位は、ランダムでも部位特異的でもあり得る。
【０１８０】
ランダム付着は、リシンなどのアミノ酸を通して達成される場合が多く、これは結果と
して、リシンの位置に依存して抗体断片全体にわたるいくつかの部位に付着している、Ｐ
ＥＧ分子などのエフェクター分子を生じる。これは一部の場合では成功しているが、付着
した、ＰＥＧ分子などのエフェクター分子の正確な位置及び数を制御することができず、
これは、例えば、付着しているのがあまりにも少なすぎる場合には、活性の損失、及び／
又は、例えば、それらが抗原結合部位に干渉する場合には、親和性の損失をもたらし得る
40
（Ｃｈａｐｍａｎ２００２ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖ
ｉｅｗｓ、５４、５３１∼５４５）。結果として、ＰＥＧ分子などのエフェクター分子の
制御された部位特異的付着が通常、好まれる方法である。
【０１８１】
ＰＥＧ分子などのエフェクター分子の部位特異的付着は、最も一般的には、システイン
残基への付着によって達成され、そのような残基が抗体断片において比較的まれであるか
らである。抗体ヒンジは、これらがシステイン残基を含み、且つ抗原結合に関与する可能
性が高い融合タンパク質の他の領域から離れていることから、部位特異的付着のためによ
く用いられる領域である。適切なヒンジは、断片内に天然で存在してもよいし、組換えＤ
ＮＡ技術を用いて作製してもよい（例えば、米国特許第５，６７７，４２５号；ＷＯ９８
50
(35)
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／２５９７１；Ｌｅｏｎｇら、２００１Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６、１０６∼１１９；Ｃ
ｈａｐｍａｎら、１９９９ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７、７８０
∼７８３参照）。或いは、又は加えて、部位特異的システインはまた、例えば、エフェク
ター分子付着のための表面露出システイン（単数又は複数）を生じるように、抗体断片へ
操作されてもよい（米国特許第５，２１９，９９６号）。
【０１８２】
したがって、一実施形態において、ＰＥＧ分子は表面露出システインに付着している。
【０１８３】
本明細書に用いられる場合の表面露出システイン（遊離システイン）とは、そのタンパ
ク質が「天然の」折り畳まれた立体構造をとる場合、ＰＥＧ分子などのエフェクター分子
10
をそれにコンジュゲートさせるのにアクセス可能であるシステインを指すものとする。こ
の型の遊離システインを操作する方法の例はまた、米国特許第７，５２１，５４１号に提
供されている。
【０１８４】
具体的な天然のポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン
、又はそれらの誘導体が挙げられる。
【０１８５】
本明細書で用いられる場合の「誘導体」とは、反応性誘導体、例えば、マレイミドなど
のチオール選択性反応基を含むものとする。反応基は、直接的に、又はリンカーセグメン
トを通して、ポリマーに連結し得る。そのような基の残基は、場合によっては、融合タン
20
パク質とポリマーとの間の連結基としてその製造物の一部を形成することは認識されてい
るであろう。
【０１８６】
本発明はまた、本明細書に記載された抗体、又はその重鎖若しくは軽鎖のその断片をコ
ードする単離されたＤＮＡを提供する。
【０１８７】
さらなる態様において、前記ＤＮＡを含むベクターが提供される。
【０１８８】
ベクターが構築され得る一般的な方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は、
当業者によく知られている。この関連において、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
30
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（
編）、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ及びＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって制作されたＭａｎｉａｔｉｓＭ
ａｎｕａｌが参照される。
【０１８９】
さらなる態様において、前記ベクター及び／又はＤＮＡを含む宿主細胞が提供される。
【０１９０】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系が、本発明の融合タンパク質分子をコードするＤＮ
Ａ配列の発現に用いることができる。細菌系、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系、及び
他の微生物系を用いてもよいし、真核生物、例えば、哺乳類の宿主細胞発現系もまた用い
40
ることができる。適切な哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、又はハイブリド
ーマ細胞が挙げられる。
【０１９１】
本発明はまた、本発明による抗体又はその断片を生産するための方法であって、本発明
のベクター（及び／又はＤＮＡ）を含む宿主細胞を、抗体又はその断片をコードするＤＮ
Ａからのタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で培養する段階、及びそれを単離
する段階を含む、方法を提供する。
【０１９２】
重鎖及び軽鎖の両方を含む産物の生産のために、細胞系を、軽鎖ポリペプチドをコード
する第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターである、２つのベ
50
(36)
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クターでトランスフェクションしてもよい。或いは、単一のベクターを用いてもよく、そ
のベクターは、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
【０１９３】
一態様において、配列が、疼痛の調節に関与するイオンチャネル、例えば、Ｎａｖ１．
７のＥ１細胞外領域由来である、ペプチドを用いて抗体を作製する方法が提供される。そ
のようなペプチドは、ポリクローナル抗体を生産するための免疫化プロトコール、及び／
又は特定の抗イオンチャネル抗体、例えば、抗Ｎａｖ１．７抗体を選択するためのスクリ
ーニング若しくはパニングプロトコールの両方において、用いられる。一実施形態は、他
のイオンチャネル及びそのアイソフォームと最大限の相違点がある、前述の細胞外領域の
別々の配列に対応するペプチドを用いる。
10
【０１９４】
ヒトタンパク質ＳＣＮ９Ａ（アクセッション番号Ｑ１５８５８）としてＳｗｉｓｓＰ
ｒｏｔデータベースに寄託されたＮａｖ１．７配列のアミノ酸配列番号付けに基づいて、
これらの配列は、以下の通りである：
ドメインＡアミノ酸１４６∼１５３、
ドメインＢアミノ酸７６４∼７７４、
ドメインＣアミノ酸１２１６∼１２２４、及び
ドメインＤアミノ酸１５３５∼１５４５は、特別な違い／差異がある領域であり、したが
って、抗体を作製するのに特に適している。
【０１９５】
20
選択されるペプチドは、通常の線状ペプチドでも環状ペプチドでもよく、上記配列由来
の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含み得る。どちらの場合においても、ペプチドは
、担体タンパク質又はレポーター群の高分子担体への次のコンジュゲーションに用いられ
る単一の官能基を含むように設計される。前記官能基は、システイン残基の側鎖チオール
、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸の側鎖カルボキシル、又はＮ末端アミノ基若しく
はリシン側鎖残基の一級アミンであり得る。
【０１９６】
前記官能基を有するアミノ酸残基は、天然Ｎａｖ１．７配列に対応してもよいし、天然
Ｎａｖ１．７配列への追加であってもよい。Ｎａｖ１．７ペプチド配列におけるこの残基
の位置は、配列のいずれかの末端にあってもよいし、任意の内部の位置にあってもよい。
一実施形態において、ペプチドは、例えば、以下の配列のいずれかを含む線状ペプチドで
あり、そのペプチドが由来する、Ｎａｖ１．７のドメインＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤが括弧内に
示されている。そのペプチド内で下線の引かれているシステインは、イオンチャネルにお
ける非天然のシステイン残基である。以下のペプチド内のシステイン残基は、担体タンパ
ク質を付着するために用いられ得る。
30
(37)
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【化１２】
10
【０１９７】
これらの配列は、Ｎ末端か又はＣ末端のいずれかで、例えば、Ｎαアセチル基又はアミ
ド基で、それぞれキャッピングされていてもよい。
20
【０１９８】
他のＮａｖ１．７配列には、以下が挙げられる。
【化１３】
【０１９９】
30
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮ
ａｖ１．７ペプチドは、配列番号１０７∼１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有する。さらなる実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いら
れるＮａｖ１．７ペプチドは、配列番号１０７、１０８、１１０∼１１２、１１４∼１１
６、及び１１９∼１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０２００】
他のイオンチャネルのＥ１ループ由来の免疫原は、同様に調製することができ、したが
って、例えば、それぞれの免疫原は、例えば、下記の太字で示された、少なくとも４個の
連続したアミノ酸残基、及びＮ末端及び／又はＣ末端のいずれかでの追加の残基を示され
ているような配列順序で含む。この場合もやはり、選択されたペプチドは、Ｎ末端におい
40
てＮ−アセチルなどの官能基によって、及び／又はＣ末端においてアミドなどの官能基に
よってキャッピングされてもよい。ペプチドは、線状ペプチドとして合成されてもよいし
、環状ペプチドとして合成されてもよい。いずれの場合においても、ペプチドは、異種タ
ンパク質などの高分子担体への共有結合性付着のための単一の固有官能基を含むように設
計される。
【０２０１】
ペプチドがアスパルテート、グルタメート、又はリシン残基を含まず、且つＮ末端がキ
ャッピングされている場合には、固有の官能基は、アミド化学作用による担体への結合の
ために直接、誘導体化され得るＣ末端カルボン酸であり得る。
【０２０２】
50
(38)
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ペプチドがリシン残基を含まない場合には、固有の官能基は、マレイミドなどのさらな
る反応基を導入するように誘導体化することができるＮ末端アミノ基であり得る。
【０２０３】
ペプチドが単一のシステイン残基を含む場合には、その側鎖チオールが、マレイミド化
学作用により担体へ結合することができる固有の官能基であり得る。
【０２０４】
いずれかの末端における追加の残基（天然か又は非天然のいずれかのアミノ酸）、例え
ば、システインによって固有の官能基を組み入れて、特異的な結合を可能にしてもよい。
【０２０５】
特定のイオンチャネル由来の配列の例は下記に列挙されており、ペプチドが由来するド
10
メインＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤは、各ペプチドについてその配列の前に表されている：
【化１４】
20
【０２０６】
したがって、一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられ
るＮａｖ１．３ペプチドは、配列番号１３１∼１３４からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有する。
【化１５】
30
【０２０７】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮ
ａｖ１．６ペプチドは、配列番号１３５∼１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有する。
【化１６】
40
50
(39)
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【０２０８】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮ
ａｖ１．８ペプチドは、配列番号１３９∼１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有する。
【化１７】
10
【０２０９】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮ
ａｖ１．９ペプチドは、配列番号１４６∼１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有する。
【化１８】
20
【０２１０】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＨ
ＣＮ１又はＨＣＮ２ペプチドは、配列番号１５０又は１５１のアミノ酸配列を有する。
【０２１１】
一態様において、環状ペプチドを用いる抗体を作製する方法が提供される。
【０２１２】
30
本明細書で用いられる場合の環状ペプチドとは、アミノ酸の配列が、ジスルフィド結合
などの結合によって連結され、それにより、識別可能な出発点及び／又は終了点をもたな
いループ又は円を形成するペプチドである。環状ペプチドは、非限定的に、以下などの様
々な手段によって対応する線状ペプチドから形成することができる：ペプチド結合を形成
する、Ｃ末端カルボキシル基のＮ末端αアミノ基へのライゲーション；或いは、（アスパ
ラギン酸又はグルタミン酸残基の）側鎖カルボキシル基をリシンの側鎖アミノ基若しくは
Ｎ末端αアミノ基へライゲーションさせてもよいし、又はＣ末端カルボキシル基をリシン
の側鎖アミノ基へライゲーションさせてもよい；線状配列において少なくとも３個の残基
分、お互いに分離した２個のシステイン残基の側鎖チオール間でのジスルフィド結合の形
成。線状配列における重複の区域に「環完成結合」を形成することが望ましい場合がある
40
。本明細書に用いられる場合の重複の区域とは、配列に存在する２個以上のアミノ酸の反
復があるところを指すものとする。したがって、本明細書に用いられる場合の重複の配列
とは、配列中にいくらかの共通性があるところ、例えば、３個又は４個のアミノ酸など、
少なくとも２個のアミノ酸が、２つの分離した位置での配列において同じ順序で位置して
いるところを指すものとする。これらの重複の領域は、整列させて、１つの位置における
アミノ酸が第２の位置における対応するアミノ酸に取って代わって環化ペプチドを形成す
るように、ライゲーションすることができる。
【０２１３】
したがって、一実施形態において、ペプチドは、アミド結合を形成することによって環
化される。一実施形態において、ペプチドは、ジスルフィド結合を形成することによって
50
(40)
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環化される。
【０２１４】
一実施形態において、配列は、線状配列における重複の領域でライゲーションされる。
【０２１５】
環状ペプチドは、当技術分野において知られた任意の適切な方法を用いて合成され得る
。一実施形態において、環状ペプチドは、アミノ酸側鎖の反応を防ぐために保護基を用い
（Ｂａｒｌｏｓ，Ｋ．；Ｇａｔｏｓ，Ｄ．；Ｋｕｔｓｏｇｉａｎｎｉ，Ｓ．；Ｐａｐａｐ
ｈｏｔｉｏｕ，Ｇ．；Ｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．；Ｔｓｅｇｅｎｉｄｉｓ，Ｔ．Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｐｅｐｔ．ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．１９９１、３８巻、６刷５６２∼５６８ページ
）、続いて、環化し、保護基を除去することによって（ＫｅｓｓｌｅｒＨら、１９８９
10
、ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｉｄｅｄＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ、４６１∼４８４ページ；Ｄ
ｅｋｋｅｒＭら、１９９０、Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓｅａｒｃｈ、３５、２８７∼
３００ページ；ＧｕｒｒａｔｈＭ．ら、１９９２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２
１０、９１１∼９２１；ＩｚｕｍｉｙａＮ．ら、１９８１、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、
２０、１７８５∼１７９１；ＢｒａｄｙＳ．Ｆ．ら、１９８３、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ
ＥｉｇｈｔｈＡｍｅｒｉｃａｎＰｅｐｔｉｄｅＳｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｖ．Ｊ．Ｈ
ｒｕｂｙ及びＤ．Ｈ．Ｒｉｃｋ編、１２７∼１３０ページ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ；ＨｅＪ．Ｘ．ら、１９
９４、Ｌｅｔｔ．ＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉ．、１、２５∼３０）、合成される。
20
【０２１６】
驚くべきことに、機能改変抗体は、例えば、たった５個、６個、７個、８個、９個、１
０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、又は１９個
のアミノ酸を含む、非常に短い環状ペプチド配列を用いて作製することができる。これは
、ペプチドを環化することによって与えられる強剛性により得る。
【０２１７】
一実施形態において、Ｎａｖ１．７由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸の断片を
含む環化ペプチドは、例えば、以下から選択され、そのペプチドが由来する、ドメインＡ
、Ｂ、Ｃ、又はＤ及び細胞外ループＥ１、Ｅ２、又はＥ３が括弧内に示されている：
【化１９】
30
【０２１８】
一実施形態において、Ｎａｖ１．７由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸の断片、
及び、例えば、担体への付着のための１個の追加のシステイン残基を含む環状ペプチドは
、以下から選択され、ペプチドが由来するドメインＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤ、及び細胞外ルー
40
プＥ１、Ｅ２、又はＥ３が括弧内に表されている：
【化２０】
【０２１９】
50
(41)
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したがって、本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに
用いられるＮａｖ１．７環状ペプチドは、配列番号１２３∼１３０からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有する。
【０２２０】
宿主動物において抗イオンチャネル抗体を生産することを目的として免疫原を調製する
ために、各ペプチドは、担体タンパク質への共有結合性コンジュゲーションを必要とする
。担体タンパク質は、宿主種に対するそれの「外来性」に基づいて選択される；したがっ
て、ウサギ又は齧歯類の免疫化について、適切な担体タンパク質の例は、キーホールリン
ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、及びウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）である。上記ペプチドのそれぞれは、線状か環状かに関わらず、上記タンパク質
10
のそれぞれの１つへシステインチオールを通してコンジュゲートすることができ、後者の
リシン側鎖アミノ基が、マレイミド官能基で共有結合性に修飾されて、それぞれ、以下を
生じている：
・ＫＬＨ−マレイミド
・オボアルブミン−マレイミド、又は
・ＢＳＡ−マレイミド
【０２２１】
本開示は、上記で列挙された担体のそれぞれと別々にコンジュゲーションした本明細書
に記載されたペプチドのそれぞれを明確に構想しており、すなわち、宿主を免疫するため
の４５個の異なる分子が具体的に提供されており、例えば、
【化２１】
20
又は
【化２２】
30
である。したがって、配列番号１０７∼１５１から選択されるアミノ酸配列を有するペプ
チドのいずれも、上記で列挙された担体タンパク質のそれぞれとコンジュゲートすること
ができる。
【０２２２】
上記のように、担体タンパク質は、システイン残基などの固有の官能基を通してコンジ
ュゲートすることができる。しかしながら、ペプチドを担体タンパク質へコンジュゲート
するためにシステイン残基の代わりにいかなる代替の天然又は非天然の残基を用いてもよ
い。システインの代わりに用いられ得る非天然の残基の例は、ホモシステイン残基であり
40
、それは、側鎖に追加のメチレン基をさらに含むシステインの相同体である。したがって
、システイン残基を含む、配列番号１０７∼１５１から選択されるアミノ酸配列を有する
ペプチドのいずれも、ホモシステイン残基などの担体タンパク質へのコンジュゲーション
のための代替の適切な天然又は非天然の残基で、システイン残基を置き換えるように改変
されてもよい。
【０２２３】
本開示はまた、本明細書に開示された新規のペプチド及びそれを含む組成物まで及ぶ。
【０２２４】
一般的に、０．００１ｍｇから１ｍｇの間の各ペプチド−担体タンパク質が、宿主動物
あたりの各免疫化用量に必要とされる。
50
(42)
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【０２２５】
機能改変抗体を生産するのに適した代替の免疫原には以下が挙げられる：関連する完全
長ヒトイオンチャネル、例えばＮａｖ１．７、個々のサブドメイン及びサブドメインの切
断型を含むその切断型；発現を助け、又は細胞外ループを免疫系に提示するために他の膜
貫通タンパク質の領域へ融合したイオンチャネルの領域を有するキメラ分子、及びイオン
チャネルの領域を所望の立体構造に拘束するためのイオンチャネルの突然変異型。
【０２２６】
これらの免疫原を、直接的細胞免疫化又は免疫化用のタンパク質の精製のために、哺乳
類細胞において発現させてもよい。
【０２２７】
10
これらの免疫原を、免疫化用のタンパク質の精製のために、大腸菌又は無細胞発現系に
発現させてもよい。
【０２２８】
精製されたタンパク質を、免疫化のために脂質小胞又はミセルへ組み込んでもよい。
【０２２９】
これらのイオンチャネルバージョンはまた、免疫化のためのリポ粒子として作製されて
もよい。
【０２３０】
加えて、上記免疫原のいずれも、機能改変抗体を同定するためのスクリーニングツール
として利用することができる。
20
【０２３１】
したがって、一態様において、例えば、少なくとも１つのイオンチャネルＥ１ペプチド
−担体タンパク質コンジュゲートで、又は同じ担体タンパク質に別々にコンジュゲートさ
れたいくつかの異なるペプチド（ここで、少なくとも１つはＥ１である）で、若しくは同
じ担体タンパク質にコンジュゲートされた混合物として、免疫することにより、宿主に抗
体を作製する方法が提供される。
【０２３２】
一実施形態において、方法は、１回、２回、３回、４回、又は５回の免疫化を含む。
【０２３３】
一実施形態において、方法は、それぞれのコンジュゲートペプチド（単数又は複数）で
30
の、２回又は３回など、少なくとも２回の免疫化を含む。
【０２３４】
一実施形態において、２回目の免疫化は、ペプチド（単数又は複数）は共通しているが
、担体タンパク質が１回目の免疫化に用いられた担体タンパク質と異なっている、異なる
コンジュゲートを用いる。
【０２３５】
したがって、一実施形態において、３回目の免疫化は、ペプチド（単数又は複数）は１
回目及び２回目の免疫化のそれと共通しているが、担体タンパク質が１回目及び／又は２
回目の免疫化に用いられたそれと異なっている、異なるコンジュゲートを用いる。担体タ
ンパク質に対する望ましくない抗体特異性は、このようにして最小限にすることができる
40
。
【０２３６】
連続的免疫化のための適切な担体タンパク質組み合わせには、任意の順序でのＫＬＨ及
びオボアルブミン及びＢＳＡが挙げられる。
【０２３７】
担体を変えることは、ペプチドへの応答を最適化することにおいて有利であり得る。
【０２３８】
各免疫化はまた、一般的に、免疫応答を刺激するためにアジュバントの投与を含む。適
切なアジュバントとして、フロイント完全又は不完全アジュバント、並びに、ミョウバン
、ＱＳ２１、ＭＰＬ、及び／又はＣＰＧを含むアジュバントが挙げられる。
50
(43)
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【０２３９】
方法は、抗体又は抗体産生細胞を宿主から分離する段階をさらに含んでもよい。
【０２４０】
一実施形態において、宿主は、マウス若しくはラットなどの齧歯類、ラクダ、ラマ、ブ
タ、イヌ、霊長類、サメ、又はウサギ、特にウサギである。
【０２４１】
前述のペプチドはまた、レポーター群にコンジュゲートされていてもよい。レポーター
群は、例えば、ビオチン、蛍光群、若しくは酵素タグ、又は抗イオンチャネル抗体の検出
若しくは単離を可能にする任意の群であり得る。レポーター群−ペプチドコンジュゲート
は、生じたポリクローナル血清及びモノクローナル抗体をスクリーニングするために用い
10
ることができる。例えば、スクリーニングＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジンコーティン
グ化マイクロウェル及び捕獲されるビオチン化ペプチドを含み得る。これに対する免疫血
清の滴定により、ペプチド特異的抗体の表面への結合を生じ、その抗体が、次に、第４の
抗種（抗ウサギなど）ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ層によって明らかにすることができる。
【０２４２】
レポーター群−ペプチドコンジュゲートはまた、ファージパニングなどのライブラリー
に基づいた技術による様式のように、特異的イオンチャネル抗体を単離するために用いる
こともできる。
【０２４３】
方法はまた、例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を提供するために、
20
さらなる精製段階を含んでもよい。
【０２４４】
方法はまた、前記免疫化に由来する組換えクローン抗体を作製する段階を含んでもよい
。
【０２４５】
クローン抗体が組換え的に調製することができる前に、可変領域などの部分、又は抗体
の全部を、クローン化及び／又は配列決定することが必要になる場合がある。
【０２４６】
本開示はまた、本明細書の方法から取得可能な、又は取得された抗体産生細胞及び抗体
まで及ぶ。
30
【０２４７】
本開示はまた、本明細書の方法を用いて取得可能な、又は取得された抗体又は適切な抗
体断片まで及ぶ。
【０２４８】
本開示はまた、本明細書における抗体又は断片を含む薬学的組成物を含む。
【０２４９】
薬学的組成物は、適切には、治療的有効量の本発明の抗体を含む。用語「治療的有効量
」は、本明細書で用いられる場合、標的にされた疾患若しくは状態を処置し、寛解させ、
若しくは予防するのに、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すのに、必要とさ
れる治療剤の量を指す。いずれの抗体についても、治療的有効量は、最初に、細胞培養ア
40
ッセイにおいてか又は動物モデル、通常には、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、若しくは霊
長類においてかのいずれかで推定することができる。動物モデルをまた、適切な濃度範囲
及び投与経路を決定するために用いてもよい。その後、そのような情報は、ヒトにおける
有用な用量及び投与経路を決定するために用いることができる。
【０２５０】
ヒト対象についての正確な治療的有効量は、病状の重症度、対象の一般的な健康状態、
対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与時間及び投与頻度、合剤（単数又は複数）、反
応感度、及び治療に対する許容度／応答に依存する。この量は、日常的実験により決定す
ることができ、臨床医の判断の範囲内である。一般的に、治療的有効量は、０．０１ｍｇ
／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ∼２０ｍｇ／ｋｇである。薬
50
(44)
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学的組成物は、便利には、用量あたりの本発明の活性物質の所定量を含む単位用量の形で
提供されてもよい。
【０２５１】
組成物を、患者へ個々に投与してもよいし、他の作用物質、薬物、又はホルモンと（例
えば、同時に、逐次的に、又は別々に）併用して投与してもよい。
【０２５２】
本発明の抗体又は断片が投与される用量は、処置される状態の性質、疾患の程度及び／
又は存在する症状に、並びに抗体又は断片が予防的に用いられることになっているのか、
又は既存の状態を処置するために用いられることになっているのかに依存する。
【０２５３】
10
投薬頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続時間に依存する。抗体分子が短い半
減期（例えば、２∼１０時間）を有する場合には、１日に１回又は複数回、投薬する必要
があり得る。或いは、抗体分子が長い半減期（例えば、２∼１５日）を有する場合には、
１日に１回、１週間に１回、又はさらに１カ月ごと若しくは２カ月ごとに１回、投薬する
ことが必要なだけであり得る。
【０２５４】
薬学的に許容される担体はそれ自体、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を
誘導すべきではなく、且つ毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペ
プチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共
重合体、及び不活性ウイルス粒子などの大きく、ゆっくりと代謝される高分子であり得る
20
。
【０２５５】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩などの
鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩などの有機酸の塩を
用いることができる。
【０２５６】
治療組成物における薬学的に許容される担体は、追加として、水、生理食塩水、グリセ
ロール、及びエタノールなどの液体を含んでもよい。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤、又
はｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在してもよい。そのような担体
は、薬学的組成物によって、患者の経口摂取用の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、
30
ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液として製剤化することが可能になる。
【０２５７】
投与のための適切な形には、非経口投与に適した形、例えば、注射又は注入、例えば、
ボーラス注射又は持続注入によるものが挙げられる。製造物が注射又は注入用である場合
、それは、油性又は水性の媒体における懸濁液、溶液、又は乳濁液の形をとることができ
、懸濁剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。或いは
、抗体分子は、適切な滅菌液体と共に用いる前の、再構成するための乾燥した形であって
もよい。
【０２５８】
いったん製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接、投与することができる。処
40
置される対象は動物であり得る。しかしながら、１つ又は複数の実施形態において、組成
物は、ヒト対象への投与に適応している。
【０２５９】
適切には、本開示による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値
に類似せず、例えば、製剤のｐＨが７であるならば、８∼９又はそれより上のｐＩが適当
であり得る。理論に縛られるつもりはないが、これは最終的に、安定性が向上した最終製
剤を提供することができ、例えば、抗体又は断片は溶解した状態のままである。
【０２６０】
本発明の薬学的組成物は、いくつの経路によって投与されてもよく、その経路には、経
口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ
50
(45)
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）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮
下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、腟内、又は直腸内の経路が挙げられるが、それ
らに限定されない。皮下噴射器もまた、本発明の薬学的組成物を投与するのに用いてもよ
い。典型的には、治療組成物を、溶液か又は懸濁液かのいずれかの注射剤として調製して
もよい。注射前の液体媒体における溶液又は懸濁液に適した固形にもまた調製してもよい
。
【０２６１】
組成物の直接的送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、若しくは筋肉内への注射、
又は組織の間質腔へ送達される注射によって達成される。組成物はまた、病変へ投与する
ことができる。投薬処置は、単回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでもよい
10
。
【０２６２】
組成物中の活性成分はタンパク質分子であることは認識されているであろう。したがっ
て、それは、胃腸管内で分解されやすい。したがって、組成物が胃腸管を用いる経路によ
って投与されることになっている場合には、組成物は、抗体を分解から保護するが、いっ
たんそれが胃腸管から吸収されたならば、抗体を放出する作用物質を含むことが必要であ
ろう。
【０２６３】
薬学的に許容される担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ
20
、Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手できる。
【０２６４】
一実施形態において、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０２６５】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、噴霧ガスを含む計量エアロゾル、又は
噴霧ガスを含まない吸入可能な溶液が挙げられる。活性物質を含む本開示による吸入可能
な粉末は、前述の活性物質だけからなってもよいし、生理的に許容される賦形剤との前述
の活性物質の混合物からなってもよい。
【０２６６】
これらの吸入可能な粉末には、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（
30
例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキス
トラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩
（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらのお互いとの混合物が挙げら
れる。適切には、単糖又は二糖が用いられ、特に、水和物の形でのラクトース又はグルコ
ースが用いられるが、それらに限らない。
【０２６７】
肺沈着のための粒子は、１∼９ミクロン、例えば、０．１μｍから５μｍまで、特に１
μｍから５μｍまでなど、１０ミクロン未満の粒子サイズを必要とする。（抗体又は断片
などの）活性成分の粒子サイズは最も重要である。
【０２６８】
40
吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができる噴霧ガスは当技術分野にお
いて知られている。適切な噴霧ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、又はイソブタンなど
の炭化水素、並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、若しくはシク
ロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の中から選択される。前
述の噴霧ガスは、単独で用いてもよいし、それらの混合物として用いてもよい。
【０２６９】
特に適切な噴霧ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、及びＴＧ２２７の中から
選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。前述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１
３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３
，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにそれらの混合物は特に適している。
50
(46)
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【０２７０】
噴霧ガス含有吸入可能エアロゾルはまた、共溶媒、安定化剤、表面活性物質（界面活性
剤）、抗酸化剤、潤滑剤などの他の成分、及びｐＨを調整するための手段を含んでもよい
。これらの成分の全ては当技術分野において知られている。
【０２７１】
本発明による噴霧ガス含有吸入可能エアロゾルは、５重量％までの活性物質を含んでも
よい。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２∼５重量％、０．０１∼３重量％
、０．０１５∼２重量％、０．１∼２重量％、０．５∼２重量％、又は０．５∼１重量％
の活性成分を含む。
【０２７２】
10
或いは、肺への局所投与はまた、例えば、ネブライザー、例えば、コンプレッサーに接
続したネブライザー（例えば、ＰａｒｉＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＥｑｕｉｐｍｅｎｔ
，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ製のＰａｒｉＭａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレ
ッサーに接続したＰａｒｉＬＣ−ＪｅｔＰｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）などの
装置を用いる、溶液又は懸濁液の製剤の投与によってもよい。
【０２７３】
本発明の抗体又は断片は、溶媒中に分散して、例えば、溶液又は懸濁液の形で、送達す
ることができる。それは、適切な生理的溶液、例えば、生理食塩水、又は他の薬理学的に
許容される溶媒若しくは緩衝溶液中に懸濁することができる。当技術分野において知られ
た緩衝溶液は、約４．０∼５．０のｐＨに達するように、１ｍｌの水あたり０．０５ｍｇ
20
∼０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ∼９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５
ｍｇ∼０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ∼０．３０ｍｇの無水クエン酸、及
び０．４５ｍｇ∼０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含み得る。懸濁液は、例えば、凍
結乾燥した抗体を用いることができる。
【０２７４】
治療用の懸濁液又は溶液の製剤はまた、１つ又は複数の賦形剤を含むことができる。賦
形剤は、当技術分野においてよく知られており、それらには、緩衝剤（例えば、クエン酸
緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、及び重炭酸緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール
、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化
ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる
30
。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア内にカプセル化することが
できる。製剤は、一般的に、滅菌製造方法を用いて実質的に滅菌した形で提供される。
【０２７５】
これは、当業者によく知られた方法による、製剤に用いられる緩衝溶媒／溶液の濾過、
滅菌緩衝溶媒／溶液中での抗体の無菌的懸濁、及び滅菌容器への製剤の分配による生産及
び滅菌を含み得る。
【０２７６】
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルに包んでパッケージングされた単一用
量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供されてもよい。
各バイアルは、ある体積、例えば、２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中の単位用量を含む。
40
【０２７７】
本開示の融合タンパク質分子は、噴霧による送達に適していると考えられる。
【０２７８】
本開示の抗体及び断片は、疼痛、例えば、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、帯状疱
疹後神経障害（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）を含む神経因性疼痛を処置するのに適
し得る。神経因性疼痛の他の原因には、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、
及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。慢性背痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、神
経障害関連性疼痛の発生を生じる場合があり、したがって、本開示による抗体又は断片で
の処置に適している可能性がある。
【０２７９】
50
(47)
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一実施形態において、本発明による抗体又は断片は、体性痛、内臓痛、神経因性疼痛、
侵害受容性疼痛、急性疼痛、慢性疼痛、突出痛、及び／又は炎症性疼痛を含む疼痛の処置
又は予防に適している。
【０２８０】
一実施形態において、本発明による抗体又は断片は、以下の疼痛の型の１つ又は複数の
処置又は予防に適している：異痛症、有痛性知覚脱失、狭心痛、突出痛、複合性局所性疼
痛症候群Ｉ型、複合性局所性疼痛症候群ＩＩ型、痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）
、痛覚異常鋭敏（ｈｙｐｅｒｐａｔｈｉａ）、特発性疼痛、悪性疼痛、錯感覚、幻肢痛、
心因性疼痛。
【０２８１】
10
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、喘息、喘息における気道過敏、例
えば喘息における、慢性咳嗽、及び／又は慢性閉塞性気道の処置に有用である。
【０２８２】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、炎症、変形性関節症、関節リウマ
チ、及び／又はそれらのいずれかに伴う疼痛の処置に有用である。
【０２８３】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、急性損傷、例えば、裂傷、切創、
火傷、銃弾による負傷、及び／又は榴散弾による負傷などの創傷に伴う疼痛の処置に有用
である。
【０２８４】
20
論じられているように、本開示による抗体又は断片は、急性疼痛及び慢性疼痛、神経因
性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背痛、並びに疾患及び変性症に伴う疼痛などの疼痛の
処置に有用である可能性が高い。
【０２８５】
疼痛は、１つ又は複数の原因から生じ得、その原因として、末梢性神経障害、中枢性神
経障害、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼、圧迫神経根障害、腰部脊椎管狭窄
、坐骨神経圧迫、脊髄根圧迫、肋間神経痛、圧迫神経根障害、及び神経根性腰痛などの神
経圧迫又は絞扼性症候群、脊髄根破壊、背痛、神経炎、自己免疫疾患、術後痛、歯痛、直
接的外傷、炎症、ＨＩＶ感染、天然痘感染、ヘルペス感染、毒物曝露、浸潤癌、化学療法
、放射線療法、ホルモン治療、異物、火傷、先天性欠損、幻肢痛、関節リウマチ、変形性
30
関節症、骨折の疼痛、痛風の疼痛、線維筋痛、多発性硬化症、下痢に伴う疼痛、過敏性腸
症候群、偏頭痛、脳炎、糖尿病、慢性アルコール症、甲状腺機能低下、尿毒症、並びにビ
タミン欠乏が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、本開示による抗体又は
断片は、上記適応症の１つ又は複数の症状の処置又は寛解に有用であり得る。
【０２８６】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、イオンチャネル阻害剤についてス
クリーニングするためのアッセイにおける標準として用いられる。
【０２８７】
本明細書の関連において含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）とは、含むこと（ｉｎｃｌ
ｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。
40
【０２８８】
理論的には、本発明の適切な実施形態が組み合わせられ得る。
【０２８９】
特定の特徴／要素を含むように実施形態が記載されている。本開示はまた、前記特徴／
要素からなる、又は本質的にそれらからなる別々の実施形態まで及ぶ。
【０２９０】
本発明はさらに、以下の実施例において、ただ例証として記載され、添付の図を参照す
る：
【実施例】
【０２９１】
50
(48)
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Ｎａｖ１．７の治療抗体の作製／選択
ペプチドは、ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈＬｔｄ．、Ｆａｒ
ｅｈａｍ、Ｕ．Ｋ．によって供給され、線状ペプチドを、Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＳｈｅｐ
ｐａｒｄ（１９８９）ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
：ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈＯｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓの方法によるＦｍｏｃ固相ペプチド化学によって合成した。Ｎ末端からＣ末
端への環状ペプチドについては、コンピュータ支援薬物設計、方法、及び適用、Ｔ．Ｊ．
Ｐｅｒｕｎ及びＣ．Ｌ．Ｐｒｏｂｓｔ編、４６１∼４８４ページ、ＭａｒｃｅｌＤｅｋ
ｋｅｒ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ；ＴｏｎｉｏｌｏＣ．、１９９０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．
ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．、３５、２８７∼３００；ＧｕｒｒａｔｈＭ．ら、１９９２
10
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１０、９１１∼９２１；ＩｚｕｍｉｙａＮ．ら、
１９８１、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０、１７８５∼１７９１；ＢｒａｄｙＳ．Ｆ．
ら、１９８３、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ、Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＥｉｇｈｔｈＡｍｅｒｉｃａｎＰｅｐｔｉｄ
ｅＳｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂｙ及びＤ．Ｈ．Ｒｉｃｋ編、１２７∼１３０
ページ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ
ｉｎｏｉｓ；ＨｅＪ．Ｘ．ら、１９９４、Ｌｅｔｔ．ＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉ．、１、
２５∼３０において、Ｂａｒｌｏｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ
．１９９１の方法により側鎖保護ペプチドとして合成し、環化を液相中で実施し、続いて
、ＫｅｓｓｌｅｒＨら、１９８９の方法により側鎖を脱保護した。
20
【０２９２】
ＫＬＨ、ＯＶＡ、又はＢＳＡのいずれかにコンジュゲートしたヒトＮａｖ１．７ペプチ
ドの組み合わせでウサギを免役した（表１）。５回の皮下免疫化（ＫＬＨ、ＯＶＡ、ＢＳ
Ａ、ＫＬＨ、ＯＶＡ）後、動物を屠殺し、ＰＢＭＣ、脾臓、及び骨髄を採取した。血清を
、ヒトビオチン化ペプチドへの結合についてＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【表４】
30
40
【０２９３】
表は、免疫されるウサギ番号、免疫化のために用いられるペプチド組み合わせ、及びペ
プチド配列を示す。Ｂ１１は、ドメインＢにおけるループＥ１由来のペプチドである。Ｃ
１１はドメインＣにおけるループＥ１由来のペプチドである。Ｄ１１はドメインＤにおけ
るループＥ１由来のペプチドである。
【０２９４】
Ｔｉｃｋｌｅら、２００９（ＪＡＬＡ、１４巻、５号、３０３∼３０７ページ）に記載
された方法を実質的に用いてＳＬＡＭを実施した。簡単に述べれば、ウサギ脾細胞又はＰ
ＢＭＣを用いてＳＬＡＭ培養物を設定し、上清を、まず、ＦＭＡＴにおけるビーズに基づ
50
(49)
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いたアッセイにおいてビオチン化ペプチドに結合する能力についてスクリーニングした。
これは、ストレプトアビジンビーズ（ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に結合し
たビオチン化ヒトペプチドを用い、ヤギ抗ウサギＦｃ−Ｃｙ５コンジュゲート（Ｊａｃｋ
ｓｏｎｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて結合を明らかにする均一系アッセイで
あった。その後、このスクリーニングから陽性であったものを、非特異的抗体を同定する
陰性スクリーニングに供した。これは、ペプチドを有しないストレプトアビジンビーズ又
は無関係のペプチドを有するストレプトアビジンビーズを用い、ヤギ抗ウサギＦｃ−Ｃｙ
５コンジュゲート（ＪａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）との結合を明らか
にして、ペプチド特異的結合体を同定した。
【０２９５】
10
１０個のＳＬＡＭ実験から、いくつかのＢ１１特異的、Ｃ１１特異的、及びＤ１１特異
的抗体含有ウェルが、上記のスクリーニングを用いて同定された。
【０２９６】
いくつかのこれらのウェルからの、蛍光焦点方法による単一Ｂ細胞単離、及びその後の
可変領域遺伝子のクローニングにより、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ後、重鎖及び軽鎖の可変
領域遺伝子対がうまく得られた。これらのＶ領域遺伝子をウサギＩｇＧ１完全長抗体とし
てクローン化し、ＨＥＫ２９３一過性発現系において再発現させた。
【０２９７】
クローン化されたＶ領域の配列分析により、抗ヒトＢ１１特異的のいくつかの固有のフ
ァミリーの存在が明らかにされた（下記の表２参照）。これらの抗体のＤＮＡ配列及びア
20
ミノ酸配列は、図に示されている。抗体を一過性ＣＨＯ系において発現させ、その後、精
製して、インビトロ及びインビボでのさらなる特徴づけを可能にした。
【表５】
30
【０２９８】
図４∼７は、抗Ｎａｖ１．７抗体についての配列を示す。その抗体が由来する免疫され
たウサギ及びそれらのペプチド特異性が詳述されている。
40
【０２９９】
抗体試験のためのｈＮａｖ１．７記録についての手順
溶液及び抗体操作
細胞外溶液は以下を含んだ（ｍＭ）：１３０ＮａＣｌ、４ＫＣｌ、１．５ＣａＣ
ｌ２、１ＭｇＣｌ２、３０グルコース、１０ＨＥＰＥＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅでｐ
Ｈ７．４、及び３００∼３０５ｍモル浸透圧）。細胞内溶液は以下を含み（ｍＭ）：５ＮａＣｌ、１１５ＣｓＦ、２０ＣｓＣｌ、１１０ＨＥＰＥＳ、１０ＥＧＴＡ遊離
酸（ＣｓＯＨでｐＨ７．２、及び２９０∼２９５ｍモル浸透圧）、それを新鮮な状態にす
るか、又は凍結させるかのいずれかにした。細胞外溶液及び細胞内溶液を使用前に濾過し
た。抗体を、９６ウェルポリプロピレン化合物プレート（Ｓａｒｓｔｅｄ、＃８３．１８
50
(50)
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３５．５００）への移動前に、細胞外溶液中に直接、希釈し、新鮮な状態で（１５分以内
で）調製した。選択的ペプチドを用いる実験について、等濃度での抗体及びペプチドを、
パッチクランプ実験の前に４℃で少なくとも３０分間、プレインキュベートした。
【０３００】
細胞調製
ヒトＮａｖ１．７チャネル（ＩＸ型電位開口型ナトリウムチャネルαサブユニット）を
安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ、カタログ＃ＣＹＬ３０１１）から購入した。１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ、＃ＤＥ１
４−８０２Ｆ）、１％ペニシリン＋ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、ＤＥ１７−６０３
Ｅ）、１％非必須アミノ酸（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ１３−１１４Ｅ）、及び４００μｇ／ｍｌ
10
Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ、＃１０１３１−０２７）を含む、グルタミン含有標準培地ＤＭ
ＥＭ−Ｆ１２を用いて、コラーゲンＩ型でコーティングされたＴ−７５（ＢＤＢｉｏＣ
ｏａｔ（商標）ＣｏｌｌａｇｅｎＩＣｅｌｌｗａｒｅ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎ
ｓｏｎＬａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、＃３５６４８５）フラスコ内で細胞を
培養した。細胞を、１５，０００細胞／ｃｍ２の密度又は８，０００細胞／ｃｍ２の密度
でそれぞれ、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）７０００Ａ（Ａｘｏｎｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔ、ＭＤＳＡｎａｌｙｔｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの新しい一員）で
用いる前に２日間又は３日間、プレーティングした。細胞コンフルエンスは９０％を超え
ることはなかった。実験の当日、細胞を、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｓｉｇｍａ、Ａ７０８９）を
用いて収集した。簡単に述べれば、細胞を、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢ
20
Ｓ（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１２−５１６Ｆ）中で２回、洗浄し、１：４の希釈のＡｃｃｕｍ
ａｘ溶液を加え、３７℃で１．５∼２分間、インキュベートした。１０％ＦＢＳを含む、
１５ｍＭＨＥＰＥＳ及びＬ−グルタミン含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１
２−７１９Ｆ）（回復培地）を加えて、Ａｃｃｕｍａｘ消化を終息させた。続いて、細胞
を、５０ｍｌのファルコンチューブ内で１，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、ペレッ
トを１０ｍｌの回復培地中に再懸濁する。細胞を数え（ＣｏｕｌｔｅｒＺ２）、約１０万
細胞／ｍｌで懸濁し、室温で最低９０分間、１５ｍｌのスクリューキャップ式チューブへ
移した。その後、細胞を１，０００ｒｐｍで６０秒間、遠心分離した。ペレットを１，０
００μｌの細胞外溶液中に穏やかに再懸濁し、１，０００ｒｍｐで３０秒間、２度目の遠
心分離を行った。ペレットを１５０μＬの細胞外溶液中に再懸濁し、すぐに、Ｐａｔｃｈ
30
Ｘｐｒｅｓｓ（登録商標）で試験した。
【０３０１】
ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）手順
ＡＶＩＶＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＳｅａｌＣｈｉｐ１６（商標）電極アレイ（Ａ
ｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ、ＣＡから購入）を、Ｐａｔｃ
ｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）システムのホルダー内に手で置き、細胞のアプライについて
は、自動調製された。細胞内溶液を各チャンバーの下部へ注入し、細胞外溶液を、１６個
のノズルの洗浄装置を通してチャンバーの上部へ灌流した。この時間中、穴に細胞片がな
い状態を保つために、圧力制御装置で、細胞内側からの陽圧（＋１０ｍｍＨｇ）を維持し
た。細胞は、各ウェルに（１０Ｋ∼３０Ｋ細胞を含む）４μｌが加えられる前に、統合Ｃ
40
ａｖｒｏピペッティングロボットによって粉砕された。
【０３０２】
ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）ｈＮａｖ１．７アッセイ
１０秒後、圧力を＋４ｍｍＨｇから−３０ｍｍＨｇへ切り換え、１６個の穴（電極）の
それぞれに懸濁細胞を引き寄せた。ギガオームシールが得られ、且つ２０秒間、検証され
るまで、３６秒ごとに１．６ｍｍＨｇ／秒の速度で−１ｍｍＨｇから−３５ｍｍＨｇへの
陰圧ランプを繰り返すことによってシール形成が達成された。−８０ｍＶのピペット電位
で７．５ｍｍＨｇ／秒の速度での−４０ｍｍＨｇから−１５０ｍｍＨｇへの陰圧のランプ
増加を用いて穴を覆う膜のパッチを破ることによってホールセルアクセスが達成された。
ホールセル記録後、細胞を、細胞外溶液で６６秒間、洗浄して、ウェルにおける過剰な細
50
(51)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
胞を除去した。細胞を５分間、透析させておき、その間、アクセス抵抗をモニターした。
ホールセル試運転時点から実験の終了まで、電位プロトコール間、細胞を−８０ｍＶで保
持した。１０秒間隔で２０ミリ秒間、−８０ｍＶから０ｍＶへの脱分極ステップによって
誘発されるナトリウム電流への抗体効力を評価するために時間経過プロトコールを適用し
た。各試行が始まる前にホールセル補償が自動的になされ、電気的アクセス抵抗（Ｒａ）
が６５％、補正された。−８０ｍＶを保持しながら、Ｐ／Ｎリーク減算プロトコール（Ｎ
＝４）を用いて線形リーク減算をオンラインで実施した。
安定化期間後（最高１０分まで）、陰性対照溶液（細胞外溶液）を５分間、アプライし、
続いて、抗体を２回、投与した。ウェルへの同じ濃度の化合物の２回の添加の間の間隔は
、約１１秒であった。抗体溶液（４５μＬ）を、持続的に吸引しながら、望ましい濃度で
10
、オンラインで加えた（３０μＬ／秒）。抗体への１８分間の曝露中、連続的に電流をモ
ニターした。
【０３０３】
データ解析
以下の場合には、細胞を分析しなかった：
（１）膜抵抗が最初、２００Ｍオーム未満であった、
（２）電流振幅＜２００ｐＡ、
（３）アクセス抵抗が２０Ｍオーム以下、及び
（４）陰性対照添加後、実質的な安定化電流がない。
電流振幅を、ＤａｔａＸｐｒｅｓｓ２ソフトウェア（Ａｘｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
20
）を用いて測定し、ランダウン電流補正を、線形又は指数フィッティング法により、洗浄
時間後の最後の１０∼１５個のデータ点、及び陰性対照添加後の最後の１０∼１５個のデ
ータ点に関連した測定に実施した。
抗体添加の前の平均電流補正振幅により電流を標準化した。１８分間の抗体アプライ後の
残留応答によって電流阻害を推定した。データは下記の表３に示されている。
表３：
【表６】
30
40
【０３０４】
図１
図１は、特定のペプチドの存在下又は非存在下における、ＨＥＫ細胞に発現したヒトＮ
ａｖ１．７電流への選択された抗体（２５μｇ／ｍｌ）の機能的効果を示す。Ｎａｖ１．
７電流は、反復刺激プロトコールを用いる自動パッチクランプにより記録され、データは
50
(52)
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、最後の刺激後の標準化Ｎａｖ１．７電流として提示される。選択された抗体を、特定の
ペプチド（２５μｇ／ｍｌ）の存在下、４℃で３０分間、インキュベートし、その後、Ｎ
ａｖ１．７電流記録のためにＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓシステムへ移した。ペプチドの存在
は、系統的に、抗体の阻害効果を逆転させ、したがって、Ｎａｖ１．７電流の阻害が、抗
体のＮａｖ１．７細胞外ループとの特異的な相互作用によって媒介されることを示してい
る。
【０３０５】
図３Ｄ（ａ）
ＨＥＫ細胞に発現した組換えヒトＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析。９
８３モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。データ点は、
10
抗体の存在下における反復電位ステッププロトコールの適用後の標準化ピーク電流振幅（
エンドポイント）を表す。
【０３０６】
図３Ｄ（ｂ）
ＨＥＫ細胞に発現した組換えヒトＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析。１
０８０モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。データ点は
、抗体の存在下における反復電位ステッププロトコールの適用後の標準化ピーク電流振幅
（エンドポイント）を表す。
【０３０７】
図３Ｅ
20
ＨＥＫ細胞に発現した組換えラットＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析。
９８３モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。１０８０モ
ノクローナル抗体は、２５μｇ／ｍｌにおいてＮａｖ１．７電流の約２６％阻害を生じる
。データ点は、抗体の存在下における反復電位ステッププロトコールの適用後の標準化ピ
ーク電流振幅（エンドポイント）を表す。
【０３０８】
図３Ｆ
９８３モノクローナル抗体によるヒトＮａｖ１．７阻害の動態。組換えヒトＮａｖ１．
７チャネルを発現するＨＥＫ細胞を、電位ステッププロトコールを用いて０．１Ｈｚで約
２０分間、刺激する。データ点は、１０秒ごとに記録されたＮａｖ１．７チャネルの標準
30
化ピーク電流振幅（ランダウン補正済み）を表す。Ｎａｖ１．７電流は、抗体（２５μｇ
／ｍｌ）の存在下で低下するが、０．１Ｈｚでのチャネルの反復活性化が維持される場合
だけである。プロトコールの終了時点（及び抗体のインキュベーション後）でのみのＮａ
ｖ１．７チャネルの刺激は、Ｎａｖ１．７電流の阻害を生じない。データは、９８３モノ
クローナル抗体による特異的阻害が、Ｎａｖ１．７チャネルタンパク質の反復活性化（チ
ャネルサイクリング）を必要とすることを示唆している。
【０３０９】
後根神経節インビトロ試験
初代培養調製
生後１日から３日の間の１∼２匹の野生型ラットの子から後根神経節を単離した。神経
40
節を、切開後、ＰＢＳ中で洗浄し、すぐに、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ２６７４）を含むＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１２−６０４Ｆ）
溶液中へ置き、酵素消化のために３７℃で約４５分間、インキュベートした。コラゲナー
ゼ溶液を除去し、１０％ウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ、＃ＤＥ１４８０２Ｆ）、０．５ｍＭ
のＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１７−６０５Ｅ）、１％のペニシリン／ストレプ
トマイシン（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１７−６０３Ｅ）、及び２０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子
（ＮＧＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したＤＭＥＭと交換した。その後、神経節を機
械的に粉砕し、１０００ｇで５分間、遠心分離し、同じ培地中に再懸濁した。分離された
細胞を数え、５０μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ）及び３０μｇ／ｍｌのラ
ミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプレコーティングされたカバーガラス上で１００，０
50
(53)
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００∼１２０，０００細胞／ｍｌの懸濁液まで希釈し、使える状態になるまで、３７℃、
５％ＣＯ２で、インキュベートした。
【０３１０】
初代培養電気生理学
調製から２日間以内のインビトロでの培養（ＤＩＶ）後、分離したＤＲＧを、使用のた
めに採取した。ＩｋｅｇａｍｉＩＣＤ−４２ＢＣＣＤカメラを有するＯｌｙｍｐｕｓ
ＢＸ５０ＷＩ正立顕微鏡で細胞を可視化した。５ｋｈｚデジタルサンプリングを用いて
、電気生理学的記録が得られ、Ａｘｏｐａｔｃｈ１Ｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉ
ｃｅｓ）増幅器において３ｄＢ、３ｋｈｚ周波数でフィルターにかけられ、Ｄｉｇｉｄａ
ｔａ１３２２Ａアナログ−デジタルコンバータ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ
10
）を用いてデジタル信号へ変換された。ｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて、全ての記録が得られ、続いて、Ｃｌａｍｐｆｉｔ１０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）において解析された。Ｓｕｔｔｅｒｐ−
９７水平ピペットプーラーでホウケイ酸ガラスピペットから記録電極を引き抜いて、４．
５∼６ＭΩの最終抵抗にし、以下を含む（ｍＭ）内部溶液で満たした：１４０Ｋ−メタン
スルホネート、５ＮａＣｌ、１ＣａＣｌ２、２ＭｇＣｌ２、１１ＥＧＴＡ、１０
ＨＥＰＥＳ、２Ｍｇ−ＡＴＰ、及び１Ｌｉ−ＧＴＰ；ｐＨをＴｒｉｓ−ｂａｓｅで
７．２に調整し、重量オスモル濃度をスクロースで３１０ｍＯｓｍに調整した。バス溶液
は以下を含んだ（ｍＭ）：１３０ＮａＣｌ、２５グルコース、１０ＨＥＰＥＳ、４
ＫＣｌ、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１．２５ＮａＰＯ４；ｐＨをＮａＯＨで
20
７．３５に調整し、重量オスモル濃度をスクロースで３１０ｍＯｓｍに調整した。液間電
位は、１４．２ｍＶであると計算され、全ての報告された電位は、補償するように補正さ
れている。
電位クランプモードにおける陽圧の解除及び手動吸引による密封（＞１ＧΩ）の形成後、
容量性電流を補償し、コマンド電位を−７０ｍＶに設定した。細胞膜を破り、細胞が細胞
内溶液を５分間、透析するようにさせた。透析後、ホールセルパラメータを記録した。ホ
ールセルキャパシタンスが＞３５ｐＦであり、又は電極抵抗の３倍未満の安定したアクセ
ス抵抗が達成され得ない場合には、細胞を棄却した。増幅器を電流クランプモードへ切り
換え、静止膜電位を記録した。その後、活動電位（ＡＰ）又は一続きのＡＰを誘発するこ
とを意図された、一連の１．５秒の持続時間の、増加性振幅の脱分極電流ステップを細胞
30
に注入した。最大−３５ｍＶへの脱分極後の単一のステップ中、１つより多いＡＰを誘起
することができなかった細胞を棄却した。
その後、細胞を対照溶液か又は抗体溶液かのいずれかで、記録チャンバーを十分満たすよ
うに、９０秒間、記録される細胞上へ直接的に高速バス灌流を行うことにより、処理し、
その記録チャンバーが十分満たされた時点で、灌流と吸引の両方を停止した。前の一連の
脱分極電流ステップを、４０分間にわたって、２分間隔で、典型的には、個々のステップ
間に１．５秒の遅延を入れて、繰り返し与え、膜再分極を可能にした。たまに、静止膜電
位（ＲＭＰ）が、実験経過中、−６５ｍＶの一定ＲＭＰを維持するために調整されている
場合には、定電流を注入した。実験経過中、ＲＭＰがプラス方向かマイナス方向かのいず
れかに２０％より多く偏向し、又は保持電流が１００ｐＡより多く変化した細胞を、棄却
40
した。各ステップについての個々の保持電流及び注入電流、加えて、実験経過中、変化し
たいかなる電気生理学的パラメータも、各細胞について個々に書き留めた。
【０３１１】
データ解析
各脱分極ステップについて活動電位（ＡＰ）を手作業で数え、誘発ＡＰの総数を各時点
について合計した。ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２００３において、各時点におけ
るＡＰの数を、時間＝０における誘発ＡＰの数に対して標準化し、ＧｒａｐｈｐａｄＰ
ｒｉｓｍ５．０ソフトウェアを用いて時間の関数としてプロットした。それぞれのプロ
ットされたデータ点は、特定化された実験条件下での全ての記録された細胞の平均値を表
し、誤差バーは計算された標準誤差を表す。
50
(54)
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図３Ａ：処理前（時間＝０）及び処理後（時間＝３０分目）の代表的なＤＲＧニューロン
からの誘発活動電位の電流クランプトレース。
時間＝２分目での抗体投与後、媒体又は対照抗体で処理された対照と比較した電位。
図３Ｂ：抗体９８３（２５μｇ／ｍｌ）は、時間＝２分目での抗体投与後、媒体又は対照
抗体で処理された対照と比較して、誘発活動電位の数を有意に低下させた。
【０３１２】
図３Ｃ：培養ラット後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおける活動電位誘起に関する電
気生理学（電流クランプ記録）研究。２５μｇ／ｍｌの用量での１０８０モノクローナル
抗体は、ＤＲＧニューロンの電気的に誘導されるスパイク頻度を低下させる。データ点は
、抗体適用前の時間０において観察された最初の頻度と比較した、標準化スパイク頻度を
10
表す。
【表７】
20
30
【０３１３】
ペプチド結合ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ９６ウェルプレートを、カーボネートコーティング緩衝液中５ｕｇ／ｍｌスト
40
レプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ０１６−０００−１１４）の１００ｕｌ／ウェルにお
いて４℃で一晩、コーティングした。プレートを、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、洗浄し、
室温で１時間、２００ｕｌ／ウェルのブロッキング溶液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を加えた
。プレートを、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、洗浄し、室温で１時間、１００ｕｌ／ウェル
の５ｕｇ／ｍｌビオチン化ペプチドを加えた。プレートを、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、
洗浄し、室温で１時間、１００ｕｌ／ウェルの抗体を加えた（プレートに沿って、１０ｕ
ｇ／ｍｌから始まり、ブロッキング溶液中３．１６倍系列で希釈していく）。プレートを
、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、洗浄し、室温で１時間、１００ｕｌ／ｍｌのヤギ抗ウサギ
ＦｃＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ１１１−０３６−０４６）を加えた。プレートを、ＰＢ
Ｓ／ツイーン中で４回、洗浄し、１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テ
50
(55)
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トラメチルベンジジン）溶液を加えた。５０ｕｌ／ウェルのＮａＦを加えて、反応を停止
させ、吸光度を６３０ｎｍで読み取った。
図３Ｇは、抗体９８３の様々な環状Ｎａｖイオンチャネルペプチド表４への結合について
のＥＬＩＳＡデータを示す。
図３Ｈは、抗体１０８０の様々な環状Ｎａｖイオンチャネルペプチド表４への結合につい
てのＥＬＩＳＡデータを示す。
両方の場合における特異的結合は、Ｂ１１．７ペプチドについてのみ観察され、その他の
Ｎａｖイオンチャネル由来の等価のループへの結合は観察されなかった。
(56)
【図１】
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(57)
【図２ａ】
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(58)
【図２ｂ】
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(59)
【図２ｃ】
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(60)
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
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(61)
【図３Ｃ】
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(62)
【図３Ｄ】
JP 2013-508443 A 2013.3.7
(63)
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
JP 2013-508443 A 2013.3.7
(64)
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
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(65)
【図４−１】
JP 2013-508443 A 2013.3.7
(66)
【図４−２】
JP 2013-508443 A 2013.3.7
(67)
【図５】
JP 2013-508443 A 2013.3.7
(68)
【図６−１】
JP 2013-508443 A 2013.3.7
(69)
【図６−２】
JP 2013-508443 A 2013.3.7
(70)
【図７】
【配列表】
2013508443000001.app
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(71)
JP 2013-508443 A 2013.3.7
【国際調査報告】
10
20
30
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(72)
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10
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10
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フロントページの続き
(81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,T
M),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,R
S,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,
BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,I
D,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO
,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,
ZA,ZM,ZW
10
(72)発明者ミラー、カレンマルグリート
ベルギー国、ブリュッセル、アレードラルシェルシュ６０、ユセベファルマソシエテ
アノニム
(72)発明者デライク、マルクロジャー
ベルギー国、ブリュッセル、アレードラルシェルシュ６０、ユセベファルマソシエテ
アノニム
(72)発明者ウォルフ、クリスチャンギルバートジェイ．
ベルギー国、ブリュッセル、アレードラルシェルシュ６０、ユセベファルマソシエテ
アノニム
(72)発明者ローソン、アラステアデイビッドグリフィス
イギリス国、スラウバークシャー、バスロード２０８、ユセベセルテック
(72)発明者フィニー、ヘレンマーガレット
イギリス国、スラウバークシャー、バスロード２０８、ユセベセルテック
(72)発明者ベイカー、テレンスセワード
イギリス国、スラウバークシャー、バスロード２０８、ユセベセルテック
Ｆターム(参考) 4B024 AA01 BA53 CA02 DA02 EA04 GA11
4H045 AA11 BA09 CA42 DA76 EA21 FA74
20

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