措 TMZ? 針資料海洋光合成微生物による水素生産東京農工大工学部生命工学科教授松永是 1. はじめにバイオテクノロジーを利用した水素生成法は、光合成微生物や嫌気性細菌による方法が挙げられる O 微生物を用いた水素生産技術の利点としては、化石燃料に依存しない点や、水素生成反応、が常温で、進むことからリアクタ一等の構成に特殊な材料は必要としないといった点が挙げられる O また、水素生産と同時に有用物質生産を行うことも期待できる O 特に光合成微生物を利用する方法は、太陽王ネルギーの利用が可能であるため、今後重要になっていくと思われる O 光合成微生物を利用した水素生産システムを開発する場合、淡水の供給、土地利用、及び光供給の面で、従来の農業との競合を避けたシステムが望ましいと考えられる。海洋は地球の 7割を占め、太陽エネルギーを豊富に利用できる O また、海水は生物の生育に必要な無機物を含んでいる。そこで、海洋光合成微生物を利用した水素生産システムの開発が進められている (l， 2 ) O ここでは、海洋光合成微生物を利用した水素生成を中心に解説する O 2. 水素生成能を有する光合成微生物の探索海洋には多様な微生物の存在が知られているが、その中から水素生成能を有する微生物を分離し、高水素生成株を検索することは極めて重要である O しかし、これまでのスクリーニング方法は水素生成菌を含まないサンプルに対しでも様々な培養条件を検討せねばならず、また水素生成菌が含まれているにもかかわらず、培養条件の不適合から見落としてしまう場合もある o M 12 3 4 5 6M 多様な微生物群に対し、効率の良いスクリーニングを行うためには、海洋から得られたサンプル中の水素生成菌の有無を迅速かつ簡便に判断する必要がある O 当研究室では水素生成能を有する光合成微生物の多くがニトロゲナーゼを有することに着目し、ニトロゲナーゼのサプユニットである鉄タンパクをコードする刀 jf H遺伝子を直接 PCR法により増幅し、検出することを試みた O その結果、高感度で、水素生成菌のニトロゲナーゼを検出することが可能であった(図 1)0 以上の方法は、水素生成菌の効率の良いスクリーニング法に適していると考えられる O また検出に用いる機能遺伝子を変えることにより、様々な図直接 l r ; ; 品二E L iP C R 能力を有する微生物のスクリーニング法にも応用できると考えられる O 一法水素生成菌 ( R h o 帥 a 伽叩)の菌体数: 1 :]05c e l l s，2 :1 Q4c e l l s，3 :1 03c e l l s，4 :]02 c eI ls .5 :]Ol c e l l s， 6 :]Oo c e l l s，M:マーカー 3. 光合成微生物の水素生成機構微生物による水素生成は、ヒドロゲナーゼ、及びニトロゲナーゼの 2つの酵素が関与している O ヒドロゲナーゼは、 ATPを必要としない水素生成が可能な酵素である(式 1)0 反応は可逆的であるが、水素生成に傾いているものと水素吸収に傾いているもの(吸収型ヒドロゲナーゼ)の 2種類が知られている O 生理的役割とし ω ?1>寒エネルモーンステム資料 Vol . 乙0 ，N o . 1 ，乙 1 995 ては、微生物体内の余剰還元力の水素ガスとしての排出や還元力を得るための水素ガスの利用に関与している O 一方、ニトロゲナーゼは窒素ガス存在下において窒素固定反応を行う酵素である(式 2)。ニトロゲナーゼの基質特異性は広く、 AT Pを利用して窒素やアセチレン等の 3重結合を還元するばかりでなく、これらの物質が存在しない場合、水素イオンを還元して水素を生成する(式 3。 ) =X +1I2H Xred+H+ 2+Ot 1 . . ， .+ o e - ox 2 -r ( Xは ¥ 電子伝達体式 1 ) 3 ( 式2 ) 12ATP 12(ADP+Pj) 2H++2 e -+4ATPー → H2+4ADP+4Pj 式3 ) 水素生成能を有する光合成微生物としては、緑藻、藍藻、及び光合成細菌があるが、以下にそれぞれの光合成微生物の水素生成機構やその特徴について示す。 3 . 1 緑藻緑藻は真核生物であり、藍藻や光合成細菌などの原核生物と異なる O 一般的に真核生物はニトロゲナーゼを持たないことから、緑藻による水素生成はヒドロゲナーゼによるものと考えられている O 水素生成のための電子供与体としては、光化学的に生成したデンプンなどの内部貯蔵物質による系が考えられている O 水素生成は暗所嫌気条件下で生じる (3)が、光合成により生じた貯蔵物質の消費を伴う ( 図 2)。水の光分解による水素生成を主張しているグループもあるが、まだその機構が証明されているわけではない。しかし、水素生成は明所嫌気条件下でも観察 (4)される O 酸素の発生を伴うことからすぐにヒドロゲナーゼが失活し、水素生成は見られなくなる O どちらの場合も長期間にわたる水素生成は不可能であるが、明暗サイクルにおいて断続的に水素生成を行うことは可能である前者による水素生成は、アルコールや低分子の有機酸 H20 の生成を伴うことから、緑藻と光合成細菌を組み合わせた水素生産システムの関切発が検討されている (5。 ) 明・好気条件暗・嫌気条件 O n 図2 緑藻の暗条件下における水素生成 3 . 2 藍藻藍藻はその形態から糸状性藍藻と単細胞藍藻の 2つに分類できる o また糸状性藍藻には、異型細胞 ( h e t e r o c y s t )を形成するものや異型細胞を形成しないものがあり、それぞれ異なった水素生成機構を有している O 異型細胞を形成する糸状藍藻の水素生成は、ニトロゲナーゼのによるものであ H 2 0 1+ 0 2 r t H 2 るこのような株は、好気条件下においても比較的安定な水素生成を行うことが可能である O この原因としては、ニトロゲナーゼがP S I Iを持たない異型細胞内で発現するため、酸素による阻害効果を受けにくくなっていることが考えられる(図 3)。現在、異型細胞の分化機構の解明が図3異型細胞を有する糸状性藻類による水素生成遺伝子レベルで行われている。 O また、異型細胞を持たない場合でも条件により高い水素生成能を有する株があ噌 'A qu 資料水素エネルギーシステム Vo1 .20，N o . 1 2，1995 る。海洋藍藻 O s c i J J a t o r i aS p .M i a m i B G 7は、窒素栄養制限下で培養した株を明・嫌気条件下に置くと主にニトロゲナーゼに依存した水素生成を行うことが知られている(図 4)。なお、この株の最大水素生成速度は、 0 . 2 9( μ m o l ・m g-1 ( d r yw ei g ht ).h-1 )に達している (6)o 図4 異型細胞を持たない糸状性藻類による水素生成海洋単細胞藍藻 S y n e c h o c o c c u ss pM i a m iB G0 4 3 5 1 1は、明・好気条件下で、水素生成を行うことが可能である O この株もニトロゲナーゼに依存した水素生成を行うが(図 5)これは、この株のニトロゲナーゼに何らかの防御機構が存在するためと考えられている o また、この株の向調培養を行った結果、窒素固定及び、水素生成と光合成が細胞の分裂周期の異なった時期に起こっていることが明らかになった (7， 8)o バッチ培養や連続光照射下で見られた水素生成は、常に全細胞の何割かが水素生成を行う細胞周期にあったた H20 めであると考えられる o また、この株のー . 0 ( μ m o lm g 1 ( d r y u 水素生成速度は、 2 w ei g ht ).h-1 )に達している O 明・好気条件暗・好気条件図5 単細胞藻類による水素生成 3 . 3 光合成細菌 S I . P S I Iの 2つの光化学系を経て水素を生成する藻類と異なり、光合成細菌は、 P P S I Iを持たない。このため、水の光分解により電子を得ることができないが、有機酸、糖類、アルコール類、芳香族化合物なと寺の有機物や硫化水素などの無機物を電子供与体として利用した水素生成が可能である o また、この反応はニトロゲナーゼを最終的な触媒としている(図 6)。光合成細菌による最大水素生成速度は、淡水産光合成細菌 R h o d o b a c t e rsphaeroides~ こよる 262(μ1 .m g-1 ( d r yw ei g ht )・ h -1 )といった例 9)があり、この値をモルに換算すると約 1 0 . 4( μ m o l.m g ' 1( d r y 1 - )となる o 当研究室で分離された海洋光合成細菌 R h o d o b a c t e rs p .N w ei g h t )・h K P B 1 6 0 4 7 1もこれと同レベルの水素生成能を有し、 1 0 . 4( μ m o l・m g -1 ( d r yw e i g h t ).h1 )に達して電子供与体いる o 光合成細菌の水素生成速度は、水から水素生成を行う藻類に比べ非常に高く、長時間にわたる水素生成が可能である。水素生成時に有 H2 機酸などの分解を伴うことから、水素生産と同明・嫌気条件時に排水処理を行うシステムへの応、用が期待さ図6 光合成細菌による水素生成れている O 4. 遺伝子組換えによる水素生成能の向上光合成微生物の水素生成能をさらに向上させるためには、遺伝子の組換えが必要である O 当研究室では、海洋藍藻や海洋光合成細菌のベクター系の開発や、パーテイクルガン、エレクトロポレーション、接合伝達による遺伝子導入を行ってきた (10-13)o また、これらの技術を利用して水素生成能の向上を試みている O 水素生成能を有する微生物の多くは吸収型ヒドロゲナーゼを有し、水素ガスの -32- し合るると光よい一的。にて一目るえれ一をあ替さ一成で組告一生要子報一素必伝が一一掬水が遺上一則合速製た向一山一財高作いの一一叩慌たの用度一 mm い株を速一 ω U 用異ン成 ∞∞ O OM を変ゾ生知ふと唱) 7 f g D L ) 噸鎖骨偽物たポ素生しス水微損ン成欠ラれ成い吸みゲ、 f ' J﹀にる合のトさ合おる試ロれり J K 菌い光性や製光によがドら J引一細て o活剤作洋 η に製ヒ得日一dU 成しるゼ異が海似入作型が、川寸合達い一変株たは山導の収株ま 1 し厄こ備は川てナ学損れ郎)株吸異即つゲ化欠さ wmM損、変速ト初値ベ行ロてゼ離・げ欠果い成 M約のレム3 をドい一分叩ンゼ結な生・ばべこ高テ制収ヒおナで rゾ一のく素附比、最イ L吸型にゲ室付ポナそ全水 ? とおのぷに収藻ロ究釘スゲの大台株な成。 o げ以時吸藍ド研必ンロる性最刊生 o生るいか川向、やヒ当ぱラドい活の一g 野パノ素れエ却と合菌型 o肋トヒてゼ株 m は口水わ煉川成場細収り菌も型れ一のトれ畑山る思生た成吸 H 細て収らナそ mこたよと i 資料山 F γlBO ((MZ r 。 o 1 0 20 3 0 40 50 時間 ( h ) 図7 Rh o d o b a c t e r s p .NKPB1ω471の野生株及び吸収型ヒドロゲナーゼ欠損株(M75)による水素生成の経時変化 5. 水素生産バイオリアクターシステムの開発当研究室で単離された高水素生成株であり、また新種の R h o d o b a c t e r . 属と同定された海洋光合成細菌 R h o d o b a c t e rm a r i n u s ( 1 5 )は、菌体懸濁液中に海水を添加すると速やかに凝集し、沈澱する性質を有することが明らかになったなお、この株は、既に遺伝子導入システムが開発され(l2. 13) 、 O 成長ホルモン等の有用物質生産遺伝子(l6) を発現させることに成功しているo 上記の性質を利用した海洋光合成細菌による 111 .:太陽克集克義置水素生産システムが考案 1 1 1 されている o その概略を克ファイパー一一寸，. 図 8に示す。これは、太陽光集光装置、バイオソーラーリアクタ一、及び串 A 凝集槽の 3つから成り立ファイバーっている O 一般に、光合成微生物を用いて、バイオリアクターにより連続水素生産を行う場合、細胞への光の供給方法が問題になる O 特に光合成微生物が高濃度になるにつれ、リアクター全体への仁亘書属 j バイオソ}ラー光供給は困難になる。こ 'リアクターこに示したバイオソーラ図8 海洋光合成細菌を用いたバイオソ」ラ」リアクタ」システムーリアクターは、光分散晶圃お Z 年素エネルギてシステム資料 Vo1 . 乙 U，No.1-2，1995 型ファイバーをリアクター内部に充填したもので、この問題を解決している光源としては、太陽光集光装置により集光された光の他に、人工光の利用も可能であるまた、このリアクターを利用して藻類の高密度培養に成功した例もある(1 7 .. 1 8) 。本システムは、以下に示す 3つを同時に行うことが可能である 1.排水中に含まれる有機酸、硫化物等を海洋光合成細菌を用いてリアクター内で分解し、高速水素生産を行う O 2 . 水素生成を行った菌体懸濁液に海水を添加してフロキュレーション(菌体が凝集し、沈殿する現象)による菌体の除去を行う o (排水処理) 3 . 回収した菌体の有効利用を行う本システムの利点としては、これまでの固定化菌体を利用した水素生産システムに比べ、固定化担体を使用しない点やシステムの運転に手間がかからないことなどから大量水素生産を行うのに適していると考えられるまた、本システムは、 Hコントロール等を行えば、炭酸ガスを含む空気の通気ラインの設置や凝集槽の p 藻類にも適用できると思われる O O O O O O 6. おわりに太陽エネルギーの導入により藻類は水から水素と酸素を生成し、光合成細菌は、排水中に含まれる有機物などを分解して水素生成を行う光合成微生物を利用した水素生成法は、反応が常温で行われることから、リアクターシステムの構築に特殊な材料を必要としない点で、新しいエネルギー獲得手段として非常に魅力的である特に海洋光合成微生物を用いれば、太陽光が豊富に降り注ぐ海洋で、海水を利用した水素生産を行うことが可能である今後、光合成微生物による水素生産システムを実用化させるためには、基礎研究の蓄積と共に屋外での大規模な研究を行うことが必要であると考えられる O O O O 参考文献 1 . 松永 2 . 松永是 :C 0 2・地球温暖化対策技術、シーエムシ一、(19 9 0 ) 是:生物化学工学の応用、化学工業社、(19 9 2 ) .Y a m a d a， K .H i r a t a， K .M i y a m o t o， M .K i y o h a r a : 3 . Y .M i u r a， W S t i m u l a t i o no fh y d r o g e np r o d u c t i o ni na l g a lc e l l sg r o w nu n d e rh i g hC 0 2 o l . 3 9 / 4 0， c o n c e n t r a t i o na n dl o wt e m p e r a t u r e :A p p l .B i o c h e m .B i o t e c h . ，V p . 7 5 3 7 6 ， 1( 19 9 3 ) .M a c l n n i s， E .G r e e n b a u m :T h er o l eo fc a r b o n 4 . R .M .C i n c o， ]. M d i o x i d ei nl i g h t a c t i v a t e dh y d r o g e np r o d u c t i o nb y Chlamydomonas h o t o s y n t h e s i sR e s e a r c h， V o l . 3 8， p . 2 7 3 3，( 1 9 9 3 ) reinhardtii， P .M a e d a， K .I d e h a r a， Y .I k u t a， H .N a k a m u r a :R e m o v a lo f 5 . K .Y a g i， 1 i n h i b i t i o nb ya m m o n i u mi o ni nn i t r o g e n a s e d e p e n d e n th y d r o g e ne v o l u t i o n p .s t r a i nW 1 S， o f am a r i n ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u m， Rhodopseudomonass A p pl .B i o c h e m .B i o t e c h . ，V ol .3 9 / 4 0， p .7 5 3 7 6 ， 1( 19 9 3 ) .M i t s u i :C h a r a c t e r i z a t i o na n do p t i m i z a t i o no f 6 . S .K u m a z a w a， A h y d r o g e np h o t o p r o d u c t i o nb ys a l t w a t e rb l u e g r e e na l g a e， Oscillatoria s p .M i a m iB G7，Int .] . HydrogenE n e r g y， V ol .6， p .3 3 9 3 4 8，( 19 81 ) 7 . A .M i t s u i .S .K u m a z a w a .A .T a k a h a s h i .H .I k e m o t o .S .C a o .T .A r a i : S t r a t e g yb yw h i c hn i t r o g e n f i x i n gu n i c e l l u l a rc y a n o b a c t e r i ag r o w a t u r e， V ol .3 2 3， p .7 2 0 7 2 2，( 19 8 6 ) p h o t o a u t o t r o p h i c a l l y， N 制四資料水素エネルギーシステム Vo. 120，N o . 1 2，1995 8 . A .M i t s u i， S .S u d a :A l t e r n a t i v ea n dc y c l i ca p p e a r a n c eo fH 2a n d0 2 p h o t o p r o d u c t i o na c t i v i t i e su n d e rn o n g r o w i n gc o n d i t i o n si na na e r o b i c n i t r o g e n f i x i n gu n i c e l l u l a rc y a n o b a c t e r i u mSynechococcuss p . C u rr .M i c r o b i ol . ，V ol .3 0， p .1 6，( 19 9 5 ) 9 . J . Miyake， S .K a w a m u r a :E f f i c i e n c yo fl i g h te n e r g yc o n v e r s i o nt o h y d r o g e nb yt h ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u mRhodobacters p h a e r o i d e s， I nt .J . HydrogenEnergy， Vol .1 2， N o . 3， p . 1 4 7 1 4 9 .( 19 8 7 ) 1 0 . 狂. T a k e y a m a， J .G .B u r g e s s， H .S u d o， K .S o d e， T .M a t s u n a g a :S a l i n i t y d e p e n d e n tc o p yn u m b e ri n c r e a s eo f am a r i n ec y a n o b a c t e r i a le n d o g e n o u s p l a s m i d， F E M SM i c r o b i ol .L e tt . ，V ol .9 0， p .9 5 9 8，( 19 91 ) 1 1 .K .S o d e， M .T a t a r a， H .T a k e y a m a， J .G .B u r g e s s， T .M a t s u n a g a : C o n j u g a t i v eg e n et r a n s f e ri nm a r i n ec y a n o b a c t e r i a， A p pl .M i c r o b i ol .B i o t e c h n ol . ，V ol .3 7， p .3 6 9 3 7 3，( 19 9 2 ) 1 2 .T .M a t s u n a g a， N .M a t s u n a g a， N .T s u b a k i， T .T a n a k a :D e v e l o p m e n to fa g e n ec l o n i n gs y s t e mo ft h eh y d r o g e n p r o d u c i n gm a r i n ep h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i u mRhodopsudomonass p . ， ]. B a c t e r i o l . ，V oし 1 6 8， p . 4 6 0 4 6 3， ( 19 8 6 ) 1 3 .] .G .B u r g e s s， H .S u d o， H .S o d e， T .M a t s u n a g a :E f f i c i e n tg e n e t r a n s f e ro fh i g hc o p yn u m b e rm o b i l i z a b l ep l a s m i d sc o n t a i n i n gam a r i n e Rhodobactero r i g i no fr e p l i c a t i o n， C u r r .M i c r o b i o l . ，V o l . 2 6， p .1 0 5 1 0 8，( 19 9 3 ) 1 4 .M .K e r n， W .K l i p p， J .H .K l e m m e :I n c r e a c e dn i t r o g e n a s e d e p e n d e n tH 2 p h o t o p r o d u c t i o nb yh u pm u t a n to fRhodospiriJJumrubrum ， A p p l .E n v i r o m e n t .M i c r o b i o l . ，V o l . 6 0， N o . 6， p .1 7 6 8 1 7 7 4，( 1 9 9 4 ) 1 5 .J .G .B u r g e s s， R .K a w a g u c h i， A .Y a m a d a， T .M a t s u n a g a : Rhodobacter p .n o v . an e wm a r i n eh y d r o g e np r o d u c i n gp h o t o s y n t h e t i c marinuss b a c t e r i u mw h i c hi ss e n s i t i v et oo x y g e na n ds u l p h i d e， M i c r o b i o l o g y， V ol .1 4 0， p .9 6 5 9 7 0，( 19 9 4 ) 1 6 .T .M a t s u n a g a， S .K u r i y a m a， M .M i y a k e， 1 .K a w a z o e， A .A k a s a k a， N .N a k a m u r a， K .S o d e :C l o n i n g， S e q u e n c i n g， a n de x p r e s s i o no fb o n i t o ( K a t s u o n u sp e J a m i s )g r o w t hh o r m o nc D N Ai nt h em a r i n ep h o t o s y n t h e t i c p .N K P B 0 0 2 1， ]. M a r .B i o t e c h n o l . ，V o l . 1， b a c t e r i u m， Rhodobacters p .7 3 7 7，( 19 9 3 ) 1 7 .H .T a k a n o， H .F u r u u n e， J .G .B u r g e s s， E .M a n a b e， M .H i r a n o， M .O k a z a k i， T .M a t s u n a g a :D e v e l o p m e n to f ar a p i di s o l a t i o np r o c e d u r e f o rc o c c o l i t hu l t r a f i n ep a r t i c l e sp r o d u c e db yc o c c o l i t h o p h o r i da l g a e， A p p l .B i o c h e m .B i o t e c h n o l . ，V o l . 3 9 / 4 0， p 1 5 9 1 6 7，( 19 9 3 ) .G .B u r g e s s， K .I w a m o t o， Y .M i u r a， H .T a k a n o， T .M a t s u n a g a : 1 8 .J Ano p t i c a lf i b r ep h o t o b i o r e a c t o rf o re n h a n c e -35-