Human Natural Killer Target cell Visualization Assay

Rev. 140920
Human Natural Killer Target cell Visualization Assay (TVA™)
Cat No. NK-TCVA-5
( 5 plates)
NK-TCVA-10 (10 plates)
キット内容
操作手順

CTL-TVA™ Dye

CTL-Wash™ Medium

CTL-TEST™ Medium
そこに 1μl の NK-TVA Dye を直接加えます。アルミフォイルでチューブを

CTL-LDC™
包み、遮光します。

１．標的細胞の調整（滅菌条件下）
A)
Cell
2.5×105～1×106 個の K562 細胞※１を、1ml の CTL-TEST Medium に懸濁し、
Counting Reagent
B)
ゆっくりと混合し、37℃で 10～15 分インキュベートします。
プレート： 96 well clear,
C)
330rcf で 10 分遠心し、上清を捨てます。
Flat bottom,
D)
チューブをタッピングしてから 5ml の CTL-TEST Medium を加え、細胞を再
96 well
clear, Round bottom
懸濁します。

Adhesive Plate Sheets
E)
(C)と(D)のステップを 2 回繰り返します。

血球計算盤(アナライザー
F)
細胞を 2ml の CTL-TEST Medium に懸濁します（(A)で 1ml に懸濁した場合の
用)

比率です）
取扱説明書（英文、この文
G)
CTL-LDC ソフトウェアで細胞数を計数します（セクション 5 参照）
。
書）
H)
(F)で調製した細胞懸濁液を 330rcf、10 分遠心して上澄み液を捨て、タッ
ピングしてから(G)の結果に基づき 5×104 cells/ml になるよう CTL TEST
Medium に再懸濁します。1 プレートあたり、5ml の細胞懸濁液が必要にな
ります。
２．エフェクター細胞の調製（滅菌条件下）
A)
凍結保存 PBMC を溶解します。CTL 社の ePBMC をご利用の場合は、CTL 社の
CTL PBMC Thawing プロトコールに従って準備してください。
B)
PBMC 懸濁液を 330rcf、10 分遠心して、CTL Anti-Aggregate Wash ワーキン
グソリューションまたは CTL Wash Medium に、およそ 0.5～3×106 cells/ml
に再懸濁します※2。
C)
CTL-LDC Dye と CTL LDC ソフトウェアを利用して細胞数を計数します。セ
クション５を参照ください。
D)
細胞懸濁液を遠心して上澄み液を捨て、最終的に 5×106 cells/ml になる
ように CTL-TEST Medium に再懸濁します。
３．Target Cell Visualization Assay (TVA：滅菌条件下)
A)
200μl のエフェクター細胞（2-D で調製）を、丸底の 96 ウエルプレートの
Rev. 140920
A 行のウエルに入れます。
B)
A 行のウエルから 100μl を B 行に移し、ピペットチップを交換して 100μl の CTL-TEST メディウムを加えて数
回懸濁したのち、100μl を C 行に移します。この操作を繰り返し最終的に G 行までのウエルに、各ウエル 100
μl で、エフェクター細胞の段階希釈を調製します（Figure 1）
。
C)
H 行のウエルには、ネガティブコントロールウエルとして、CTL-TEST メディウム 100μl のみを加えます。
D)
各ウエルに、染色済みの K562 細胞（1-H で調製）を各 100μl 加えます※3。
E)
プレートにカバーをして、330rcf、5 分遠心します※4。
F)
CO2 インキュベーター内で、37℃、3～4 時間インキュベートします。
G)
細胞を再懸濁して、各ウエルから 50ul を、キット付属の平底 96 ウエルイメージングプレートの対応する位置
のウエルに移します。さらに 2 列分同じようにウエルイメージングプレートに移し、各エフェクター細胞につ
き triplicate にします(Figure 2)。
H)
プレートの側面を軽く叩いて、ウエル全体に細胞が分散するようにします※５。
I)
CTL ImmunoSpot S6 アナライザー（蛍光モデル）の NK-TVA アプリケーションソフトウェアを利用して、プレー
トのイメージングを行い、ウエル中の蛍光染色された K562 細胞数をカウントします※６。
４．ターゲット細胞（K562）の細胞数計数
A)
1-f で調製した細胞を使用します。
B)
細胞計数の直前に、細胞の入ったチューブを 2 回、転倒混和します。
C)
チューブから 15μl の細胞懸濁液を取り、キット付属の血球計算盤のチャンバー部分にゆっくりと加えます。
チャンバー部分全体に懸濁液が行きわたるように加えてください。
D)
可能であれば n=3 での計数をお勧めします。
E)
CTL Cell Counting ソフトウェア利用の場合は、アナライザーの設定を”Tumor cells”プレートタイプに選択し
てください。蛍光顕微鏡と一般の計算盤をご利用の場合は、525nm の蛍光波長検出で緑色の蛍光を出す細胞を計
数できます。
５．エフェクター細胞（PVBMC）の細胞計数
A)
2-b で調製した細胞を使用します。
B)
エフェクター細胞のサンプル数が多い場合、96 ウエルプレートを利用した細胞染色操作が便利です。丸底の 96
ウエルプレート（キット付属のプレートは使用しないでください）の各ウエルに、50μl の CTL-LDC Reagent を
測定するサンプル数だけ分注します。
C)
エフェクター細胞の入ったチューブを、細胞駅数の直前に 2 回、転倒混和します。
D)
50μl の細胞懸濁液を取り、50μl の CTL-LDC Reagent を加えます。3 回ピペッティングして混合します。
E)
混合したサンプル 15μl を取り、血球計算盤のチャンバーにゆっくり加えます。チャンバー部分全体に懸濁液
が行きわたるように加えてください。
F)
可能であれば N=3 での計数をお勧めします。
Rev. 140920
G)
CTL Cell Counting ソフトウェアを利用の場合は、アナライザーの設定を”PBMC”プレートタイプに選択してくだ
さい。蛍光顕微鏡ご利用の場合は、500nm 励起、525nm 検出で生細胞を、530nm 励起、620nm 検出で死細胞を計
数できます。
６．テクニカルチップ
※１：4 種類のエフェクター細胞に対して、約 2.5×105 cells の K562 細胞が必要です。
※２：1 ドナーにつき 1×106 cells の PBMC が必要です。そのため解凍または洗浄時の細胞ロスを見込んで、出発材
料はやや多めにご用意することをお勧めします。
※３： PBMC の段階希釈作成後は、
K562 細胞をマルチチャンネルピペットで 8 ウエルを一度に入れることができます。
※４：遠心中にカバーがはずれることの無いよう、側面でカバーをテープで固定してください。
※５：プレート側面をタッピングするときは、他のウエルにサンプルが飛び跳ね無いようご注意ください。
※６：K562 の生細胞が緑色に染色されて検出されます。ウエル壁面近くに細胞が集まっている場合は、一度アナライ
ザーからプレートを取り出し、側面をゆるくタッピングして細胞を分散させてください。
７．プレートレイアウト例

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