1-ニトロベンジルアデニン位置異'性体による
ヒトデ卵成熟誘起作用の解析
三田雅敏実吉峯郎*1畜藤美帆*]吉国通庸*2長漬嘉孝撫2
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M・MlTA,M.Saneyoshi*'M.SahD｡'M.Yoshikuni*2andY.Nagahamao2
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Asに『加apectin"もra.l-(p-Nitrobenzyl)adeninewasfoundtoinduceoocytematuration.Althoughl-(on
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cortices・TheresultobtainedindicatethattheregiospecificstructureoftheN'sitemaybeimportantfor
activationofthe1-MAreceptors.
緒 言
塩基の誘導体であることから活性部位との結合性など
ヒトデ卵成熟誘起物質(MIS)が1-メチルアデニン
相互作用について極めて興味深い。これまで、アゴニ
(1-MA)であることは故金谷晴夫博士ら1．2)によって明
ストの特徴として1-MA関連物質による研究からアデ
らかにされている。1-MAは神経から分泌されるペプ
ニン環のN位に置換基が存在すること、NP，NP位に
チド性ホルモン、生殖巣刺激物質GSSの刺激をうけた
おいて水素結合能が要求されることからN7,N'位に置
漁胞細胞により合成される。ヒトデ未成熟卵は第一減
換基が導入されていないこと、分子全体としては生理
数分裂前期で休止しており、その特徴として大きな卵
活性条件下で正の電荷を有すること、置換基の特性と
核胞(GV)を持っている。1-MA処理後、未成熟卵は減
数分裂を再開し､卵核胞の崩壊(GVBD)を引き起こし、
る7．91。さらに、アルキル置換基において鎖長がのびる
成熟する'<,1-MAを直接卵母細胞にインジェク卜し
ても卵成熟が誘起されないこと4)から、1-MA受容体は
有する1−ペンジルアデニン(1-BA)は天然のMISであ
して疎水性を有することなどが必要と考えられてい
に従ってアゴニスト活性が低下するが、ベンジル基を
卵母細胞膜表面に存在することが考えられ、実際確か
る1-MAとほぼ同様の活性を持っていること3)が示さ
められている3.61.1-MA受容体については、1-MA自身
れている。そこで、今回1-MA受容体の性質を理解す
が単に低分子であるばかりでなく、糖などを含まない
るために1-BAをリード化合物として､そのベンゼン環
*l帝京科学大学
*2岡崎国立共同研究機構基礎生物学研究所
−13−
上にニトロ基やメトキシ基を導入した化合物を合成
し、ヒトデ卵成熟誘起作用に対する影響を調べた。
3．卵成熟誘起作用
イトマキヒトデ卵母細胞を用いて各アナログの卵成
実験方法
熟誘起作用および1-MA(0.1uM)との桔抗作用につい
て調べた。卵成熟の判定は試験液でのインキュベー
1．実験動物
シヨン開始1時間後､卵核胞崩壊(GVBD)の確認で行っ
日本各地から繁殖期にあるイトマキヒトデ(Asに,加a
pec吻脆厩)を採集し､実験に用いた。
た
。
4．1-MA受容体との結合実験
2．試薬
今回用いた1-MAアナログをFig.1に示した。1-MA
(1)はシグマ社から購入した。1-BA(2)、l-(o-ニトロ
ベンジル）アデニン(l-oNBA)(3)、l-(m-ニトロベン
ジル）アデニン(l-/nNBA)(4)、HP-ニトロベンジル）
アデニン(l-pNBA)(5)、l-(2,4-ジニトロベンジル）ア
デニン(l-dNBA)(6)、HP-メトキシベンジル）アデニ
ン(l-pMtBA)(7)はデオキシアデノシンを出発材料と
して、N'位をニトロ臭化ベンジル等で置換反応さ
せ、最終的に糖を酸加水分解して合成した。1-
[methyPH】メチルアデニン(PH]1-MA)(3.11TBq/mmol,
37MBq/ml)はアマシヤムの合成サービスに依頼した。
PHll-MAとの結合実験には卵母細胞をCa*←欠如海
水で脱ゼリーした後、低張液処理し、さらに27ケージ
の針穴を通すことで得られるコルテックスを用いた。
コルテックス(20m-3皿個)はPHI1-MAおよび各アナ
ログと20℃、30分間インキュベートした後、放射活性
を測定した｡非特異的結合量は[methoxyl-'^C]メトキシ
イヌリンから算出し、各々の特異的結合量はアナログ
が存在しない場合を'㈹％として求めた。
実験結果
Fig.1には、今回用いたN'置換アデニンの櫛造式を
示した。これらN圃換アデニンのうち、これまで知
られているl-MA(l)、1-BA(2)以外に、新たに1pNBA(5)においてイトマキヒトデ卵母細胞に対する
卵成熟誘起作用が認められた(Table1,Fig.2)。一方、
"
我
》
1-pNBAの位置異性体である1-oNBA(3)^1-/77NBA
｡
鯉
か
“
》
(4)には、卵成熟誘起作用はなく、むしろ1-MAに対し
て卵成熟作用を阻害するアンタゴニストとしての作用
が認められた(Table2,Fig.3)。また、ベンゼン環にニ
旧)1．いNH…唾yD…､”(1つNBA）
トロ基を2つ持つ1-dNBA(6)やニトロ基の代わりにメ
Crxo
"
｣
参
へ
戦
》
トキシ基を持つl-pMtBA(7)にはアゴニスト(Table1)
およびアンタゴニスト(Table2)、どちらの作用も見出
側1や“軸鷺晦撞−0…､顕(1．釦BA）
されなかった。
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Fig.1.Structuresofthe1-MAanalogsusedinthis
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Fig.2.Dose-responsecurvefortheeffectof1-MA
anditsagonistsonoocytematurationinthe
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測詩in1§鱗)(蓉密鞍にBio嚇制
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mean±SEMoffourdifferentexperiments.
ECsovaluesaregiveninTable1.
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3
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￨浮穿撫撫鵡撫噛猟
concentrationof0．1nM.Valuesarethe
mean±SEMoffourdifferentexperiments.
ICsovaluesaregiveninTable2.
Table2Effectof1-benzyladeninederivativeson
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て、受容体に対する[-'HI1-MAとの競合実験を行っ
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次に、これらi-MAに対してアゴニストまたはアン
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魂
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P 室 Q や ’ ふ
た。実験には、イトマキヒトデ卵母細胞より調整され
たコルテツクス(Fig.4)を用いた。l-pNBA(5)、IoNBA(3)およびl-;/iNBA(4)、いずれも￨'HJ1-MAのコ
ルテックスヘの結合に対して非放射活性のi-MA同様
Fig.4.Corticesisolatedfromfull-grownprophasearrestedoocytesofthestarfishAsお伽a
pec伽"eﾉ白.Barshows10^m.
pNBA(5)は卵成熟誘起作用、すなわち1-MAのアゴニ
ストとして作用したのに対して、ニトロ基がオルト位
に競合することが示された(Fig.5)。
やメタ位についたl-oNBA(3)、l-;nNBA(4)では1-MA
考 察
とが示された。特に、1-NBAの位置異‘性体からは興味
に対してアンタゴニストとして作用したことである。
これら3つの異‘性体は、ベンジル基にニトロが付くこ
とでどれも同程度の電子吸引'性の‘性質を持つことが考
えられる。アデニンのN'位に対する電子吸引‘性の‘性質
深い知見が得られた。バラ位にニトロ基を持つ1-
は重要である。なぜなら、分子的にニトロ基とほぼ同
今回､合成した5種類のN'置換アデニンからI-MA受
容体との結合にはv位の立体的位置関係が重要なこ
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要 約
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Fig.5.CompetitionbetweenPH]1-MAandits
analogsforthhebindingtoreceptorsin
oocytecortiesfromstarfishA.pec伽"bノヨ．
Oocytecorticeswereincubatedat20℃for
30minwithamixtureof0.1/^M[3H]1-MA
and0､1mMunlabeledanalogs.Thespecific
bindingof[3H]1-MAintheabsenceof
unlabeledanalogswasfakedas100%.
Valuesarethemean±SEMoftriplicate
determinationsofarepresentativeexperiments.
十分発育したヒトデの卵母細胞は第一減数分裂前期
で休止しており、そのままでは受精し、正常に発生す
ることはない。これら未成熟卵の減数分裂の再開には
卵漁胞細胞で生産される卵成熟誘起物質、1-メチルア
デニン(1-MA)の刺激を必要とする。これまで1-MAは
卵母細胞膜表面にある受容体に作用することが考えら
れている。本研究は卵成熟誘起機構における1-MAと
その受容体との相互作用を明らかにする目的で、1-ベ
ンジルアデニン(1-BA)が1-MAに匹敵する卵成熟誘起
作用をもつことに注目し、ニトロベンジルアデニンな
どのN'置換誘導体を新たに設計・合成し、1-MA受容
体との相互作用について解析した。1-ニトロベンジル
じ大きさのメトキシ基を持つl-pMtBA(7)はアゴニス
アデニン(I-NBA)の位置異性体のうち1-pNBAにはア
トにもアンタゴニストにもならなかったが、これはメ
トキシ基がN'位にむしろ電子供与体として作用する
ためだと考えられるからである。それでは、なぜバラ
位とその他ではその作用が異なるかというと、やはり
受容体タンパクとの立体的配置によるものだと考えら
ゴニストとしての作用がみられたのに対して1-oNBA
^1-niNBAにはアンタゴニストの作用がみられた。こ
のことから､受容体タンパク質との相互作用にはN'置
換基の立体的位置関係が重要と考えられる。
謝 辞
れる。1-NBA位置異‘性体がいずれもPH]1-MAのコル
テックスヘの結合に対･して競合することから、受容体
タンパク質に何らかの影響を与えていることは確かで
ある。すなわち、N'位に対して電子吸引性の置換基が
受容体との相互作用に重要だとしても立体的障害があ
れば、アゴニストとしての作用は弱くなり、むしろプ
リン環に近いオルト位やメタ位のニトロ基は受容体タ
ンパクとの結合に支障を来たし、1-MAのアンタゴニ
ストとして作用してしまう可能性があると思われる
(Fig.6)。このことはニトロ基を持つにもかかわらず生
理活′性のみられなかった1-dNBA(6)にも当てはまるだ
本研究を行うにあたってご指導、ご協力をいただい
た早稲田大学教授安増郁夫博士に心から感謝いたしま
す。一連の研究に用いたヒトデの採集に協力いただい
た東北大学理学部附属浅虫臨海実験所、お茶の水女子
大学理学部附属館山臨海実験所のスタッフの皆様にお
礼を申し上げます。本研究は文部省科学研究費補助金
(09640797)から研究助成を得て行いました。
引用文献
1)Kanalani,H.:Int.Rev.Cylol.,35,253-298(1973)
ろう。今回の結果は、将来の1-MA受容体に対する光
親和性ラベルが可能な標識化合物の設計、合成に有益
2)Kanalani,H..Shirai,H､,Nakanishi,K.,andKurokawa,
であると思われる。
3)Meijer,L､.andGuerrier,P.:Int.Rev・Cytol.,86,129-
T,:Nature.221,273-274(1969)
−16−
195(1984)
4)Kanalani,H.,andHiramoto,Y.:Exp・CellRes.,61,280284(1970)
5)Yoshikuni,M.,Ishikawa,K.,Isobe,M.,Goto,T.,and
Nagahama,Y.:Proc.Natl･Acad・Sci.USA,85,18741877(1988)
6)Tadenuma,H.,Takahashi,K.,Chiba,K.,Hoshi,M.,
andKatada,T.:Biochem・Biophys.Res･Commun.,186,
114-121(1992)
7)Kanatani,H.,andShirai,H,:Develop.Growth&
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8)Monsees,T,Meijer,L､,andJastorff,B.:Eur.J.
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9)Mornet,R､,Leonard,N.J.,Theiler,J.B.,andDoree,M､：
J.Chem.Soc.PerkinTrans.I,879-885(1984)
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