創薬 No Standard Like a Gold Standard 肝生物学製品およびサービス CellzDirect_J_6th.indd 1 10.6.18 10:51:10 AM 創薬 薬物代謝および安全性のための肝生物学製品 初代培養肝細胞、肝細胞画分といった生理学的に意義のあるin vivo 系は、異物代謝、薬物相互作用、細胞毒性に関 する以下の研究項目をはじめ、in vivo アプリケーションに関するさまざまな研究項目に取り組むために用いるこ とができます。 → CYP 450阻害および酵素誘導 → 代謝プロファイリングおよび安定性 → トランスポーターアプリケーション 弊社は、生理学的に意義のある結果が得られる業界最高の肝製品をお届けできるよう努めており、お客様は化合物 について的確な判断を下すことができます。私達はお客様を支援する肝科学者のチームであり、製品とサービスに よって IND申請や NDA申請を支援し、酵素誘導、CYP阻害、肝輸送等の代謝に関する研究分野の発展を支援します。 私達はお客様に適切なツールと技術サポートをお届けすることを目指しております。 in vitro 肝細胞製品を完備: → 凍結初代培養肝細胞 → 新鮮初代培養肝細胞(米国および欧州) → 肝ミクロソーム → 肝 S9フラクションおよびサイトゾル → 培地 弊社は、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、非ヒト霊長類、マスから分離した肝細胞および細胞画分を取り揃え ているほか、他の動物種についてもご相談に応じております。製品は特定の研究アプリケーションについて適格性 を評価しており、プールドドナー品またはシングルドナー品が大多数を占め、その多くが複数の実験や拠点での実 験に好都合な大容量ロットです。 2 CellzDirect_J_6th.indd 2 10.6.18 10:51:11 AM GIBCO®品質̶プロセスの始めから終りまで in vitro ADMEスクリーニングや開発サービスの受託も実施している企業の肝研究者として、私達は高品質、信頼 性の高い供給プロセス、厳格な評価法の重要性を十分に理解しております。弊社は以下を実現しております。 → 堅固かつ広範な組織調達ネットワーク → 入念に洗練された分離手法 → 厳格な品質管理基準 → 科学研究および開発の継続 → 技術サポートを担う肝製品専門技術者 www.invitrogen.com/hepatocytes でも製品の詳細をご覧いただけます。 3 CellzDirect_J_6th.indd 3 10.6.18 10:51:12 AM 創薬 アプリケーション一覧 アプリケーション 目的 FDAガイダンス * 接着型肝細胞 あり +++ 創薬研究(ADME、DMPK、毒性学) 酵素誘導 化合物の肝酵素誘導能の有無を決定する 酵素阻害 化合物の肝酵素阻害能の有無を決定する あり 肝毒性 化合物およびその代謝物の肝毒性の有無を決定する あり 代謝プロファイリング 化合物の代謝に関与する酵素を決定する 代謝安定性 代謝酵素存在下で化合物の消失を測定する リアクションフェノタイピング (代謝同定) +++ あり あり ++ 代謝酵素曝露時に生じる化合物の代謝物を同定する あり ++ トランスポーター取り込み 化合物の肝トランスポーター取り込み阻害能または誘導能の 有無を決定する なし +++ トランスポーター 排出 化合物の肝基底トランスポーター排出阻害能または誘導能の 有無を決定する なし +++ 他の研究アプリケーション(R&D、毒性学、環境安全) 環境生物濃縮 薬物または化学薬品のヒトおよび魚での生物濃縮を評価する なし +++ 肝疾患研究 肝臓疾患について理解を深める なし +++ siRNA、基礎研究 疾患に対する遺伝子抑制の効果を明らかにする なし +++ * Drug Interaction Studies-Study Design, Data Analysis, and Implications for Dosing and Labeling, Draft Guidance for Industry, 米国 FDA, 2006年9月 4 CellzDirect_J_6th.indd 4 10.6.18 10:51:12 AM 浮遊型肝細胞 肝ミクロソーム 肝 S9フラクション その他 製品 → HMCPIS and HMCPIT, GIBCO® Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Induction Qualified Also available: Fresh plateable human hepatocytes → Cryopreserved and fresh plateable animal hepatocytes → ++ → HMMCPL, GIBCO® Human Pooled Microsomes Also available: → Cryopreserved suspension hepatocytes +++ +++ → HMCPMS and HMCPML, GIBCO® Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Metabolism Qualified Also available: → Fresh and cryopreserved human and animal hepatocytes +++ + → HMMCPL, GIBCO® Human Pooled Microsomes Also available: → Animal microsomes → Human and animal, fresh and cryopreserved hepatocytes → Human and animal S9 + → HMMCPL, GIBCO® Human Pooled Microsomes Also available: → Animal microsomes → Human and animal, fresh and cryopreserved hepatocytes → Human and animal S9 +++ +++ +++ 組換え CYP450 酵素 +++ → HMMCSD, GIBCO® Human Microsomes, Single Donor Also available: → VIVID® recombinant CYP450s → HMCSTS and HMCSTL, GIBCO® Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Transporter Qualified Also available: → Human plateable hepatocytes, transporter qualified → Animal hepatocytes +++ ABC Vesicles、 ABC Membranes → HMCPTS and HMCPTL, GIBCO® Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified Also available: → GenoMembrane™ ABC inside-out vesicles and membranes → Animal plateable hepatocytes → TRS9PL, GIBCO® Fish (Rainbow Trout) S9 Fractions ++ +++ Also available: → Animal and human, fresh and cryopreserved hepatocytes → HMCS3S and HMCS3L, GIBCO® Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, +++ ++ Metabolism Qualified, Pooled Donors Also available: → Animal and human, fresh and cryopreserved, hepatocytes → Animal and human microsomes → HMCPTS or HMCPTL, GIBCO® Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, → Transporter Qualified Also available: → Human fresh plateable hepatocytes → Animal cryopreserved plateable hepatocytes 5 CellzDirect_J_6th.indd 5 10.6.18 10:51:12 AM 創薬 GIBCO®ヒトおよび動物凍結肝細胞 → アプリケーション適格性試験̶接着率、単層集密度(図2) 、典 型的な誘導剤による fold induction、トランスポーター取り込 肝臓から分離された初代培養肝細胞は、代謝、薬物相互作用、肝毒性、 トランスポーターのin vitro 評価に有効なツールです。Invitrogen の 肝細胞分離担当者は、細胞の健康状態を適切に保つための手法に習 みおよび排出、in situ 固有クリアランス → その他の特性データ̶遺伝子型同定、最適播種密度(図3と4) 、 生存率の安定性、ドナーに関する統計情報 熟しています。そのため、GIBCO®肝細胞は高い生存率、in vivo に近 い酵素発現レベルを示すほか、プレート接着型細胞として出荷され たものは極性化および細胞間接着に役立つ高い集密度を示します 単層完全性の欠如 ( 「不健康な」形態) 理想的な単層完全性 ( 「健康な」形態) (図1)。 → 豊富なロット → 高い生存率 → 第 I相および第 II相薬物代謝酵素の活性を評価 → 複数の大容量ロットをご用意̶複数の拠点での長期試験に最適 → 集密度が低い(70%未満)* → 集密度が高い(90%超) → 細胞間接着に乏しい → 細胞間接着が良好 → 細胞質が粒状 → 細胞質が透明 → 明らかな細胞伸展 → 3次元組織 (例 線維芽細胞様) → 立方状の細胞構造 → 細胞が重度に平坦化 → 毛細胆管の形成 → 毛細胆管が欠如 *注:不健康な単層はコンフルエンスを示すことができますが、細胞の伸展と平坦化によっ て完全性が損なわれています。 図1̶サンドイッチ培養5日後のコンフルエントかつ健康なヒト肝細胞。集密度が 高く(90%超) 、毛細胆管が観察可能であることは、このロットが代謝実験、誘導 実験、トランスポーター取り込み実験に適していることを示しています。 図2̶それぞれ別のドナーの組織から分離したヒト凍結肝細胞を数日間培養した 場合の(A)単層の完全性が損なわれている画像(B)および単層の完全性が理想 的な画像の代表例 特性決定と品質管理 → 顕微鏡写真によって細胞形態の10項目を確認̶細胞膜の完全 性、細胞内小器官サイズ、脂肪滴の存在、 核のサイズおよび形態、 サイトゾルの透明性、細胞形、細胞片の量、細胞排泄物、細胞間 接着(接着型細胞のみ)、毛細胆管網の再建(接着型細胞のみ) → 代謝活性試験̶ECOD、7-HCG、7-HCS;ヒト肝細胞は以下を含 みます̶CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP2E1、CYP3A、FMO 6 CellzDirect_J_6th.indd 6 10.6.18 10:51:12 AM 浮遊型肝細胞による トランスポーター取り込みの測定 トランスポーター用浮遊型凍結肝細胞は肝取り込み試験に適して います。通常、この試験では比較的短時間(多くの場合15秒∼ 3分) のインキュベーション後に細胞内における基質の出現率を測定しま す。弊社のトランスポーター用ロット(浮遊型および接着型)はす べて、タウロコール酸、ジゴキシン、エストラジオール -17β-グル クロニド(E2-17G)を基質として、NTCP、OATP1B3、および OATP トランスポーター経路の活性について機能試験を行なっているほ か、第 I相および第 II相代謝の活性についても機能試験を行なって 図3̶播種密度の効果。播種密度によって誘導応答が異なります。ここでは最適 播種密度に近いほうが RIF に対する応答が優れています。 います。毛細胆管網は化合物5-(6)-カルボキシ -2’ , 7’ -ジクロロフル オレセインジアセテート(CDFDA)を使って蛍光顕微鏡で可視化し ています。CDFDA は、MRP2トランスポータータンパク質の基質で あり、培養によって細胞が極性化し、毛細胆管が形成される3 ∼ 4 日間で毛細胆管に蓄積されます(図5)。凍結前と凍結後のトランス ポーター取り込みのデータを比較したところ結果がほぼ同じであっ たことから、浮遊型肝細胞のトランスポーター遺伝子発現は凍結に よって変化しないことがわかります(図6)。 注:B-CLEAR®試験については、弊社の B-CLEAR® Hepatic Transport Kit をご覧ください。 GIBCO® ヒト凍結肝細胞(トランスポーター用)は B-CLEAR®試薬に対する適応性が評価さ れておらず、本製品の購入によって B-CLEAR®技術を実用化する権利が譲渡されることは ありません 図4̶播種密度と単層のコンフルエンスとの一般的な関係。ヒト肝細胞の場合、 最大コンフルエンスが得られる24ウェルプレートの最適播種密度は0.7 ∼ 0.9× 106細胞 /mL です。 GIBCO®ヒト凍結肝細胞 (トランスポーター用) → 機能的な膜受容体とトランスポーターを含有 → 効率的なトランスポーター取り込みおよび基底排出(プレート 培養)実験に好都合 図5̶5-(6)-カルボキシ -2’ , 7’ -ジクロロフルオレセイン(CDF)の蓄積を示す機能 的な毛細胆管網の可視化 → 厳格な出荷規格(米国出荷時) :生存率80%以上、集密度80% 以上(プレート培養細胞) 7 CellzDirect_J_6th.indd 7 10.6.18 10:51:14 AM 創薬 ウェルのコラーゲンコートプレートで培養し、トリプリケートで 溶媒(0.1% DMSO)、オメプラゾール(OMP) 、フェノバルビタール (PB)、リファンピシン(RIF)を投与して72時間放置します。一度単 層を洗浄した後に、基質のフェナセチン、ブプロピオン、テストス テロンを加えてインキュベートし、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A の活 性をそれぞれ決定します(表1、図7)。誘導された活性と溶媒で処理 した場合の活性との比で特異的活性の fold induction を示します。 図6̶凍結前と凍結後の浮遊型ヒト肝細胞の活性の比較。同じロットのヒト肝細胞を使っ て分離後2時間と凍結後にトランスポーター取り込みに関する機能試験を行ないました。 両条件の2つの基質(A)タウロコール酸ナトリウムと(B)ジゴキシンの平均蓄積値はほぼ 同じでした。 処理後48時間に TaqMan® qRT-PCR分析によって mRNA量も測定し ます。 GIBCO®ヒト肝細胞(誘導用) → CYP1A2、CYP2B6および CYP3A誘導について適格性を評価済み → 生存率80%以上、集密度80%以上(プレート培養細胞の場合、 米国出荷時) → 最小特異的活性: ・CYP1A2の誘導10倍以上 ・CYP2B6の誘導5倍以上 ・CYP3A4の誘導3倍以上 in vitro 酵素誘導モニタリング実験に 用いるロットの適格性について 評価するための酵素誘導アッセイ 図7̶ CYP3A の fold induction について試験した GIBCO®ヒト凍結肝細胞。典型的 な誘導剤に応答させて GIBCO®ヒト凍結肝細胞を試験し、アプリケーションに対 する適否を明らかにします。この例では、CYP3A の fold induction(バーの上に 弊社の誘導用肝細胞は、典型的な誘導剤に応答させた場合の特異的 示されている数値)が計算されており、肝細胞の各ロット固有のばらつきが示さ 活性と mRNAレベルの試験をパスしています。ヒト凍結肝細胞は24 れています。 表1̶GIBCO®接着型ヒト凍結肝細胞(誘導用)の CYP450活性を評価するためのプローブ基質 酵素 誘導剤 誘導剤濃度 基質 基質濃度 インキュベーション 時間 マーカー代謝物 CYP1A2 omeprazole 50 μM phenacetin 100 μM 15 min acetaminophen CYP2B6 phenobarbital 1000 μM bupropion 500 μM 20 min hydroxybupropion CYP3A rifampicin 10 μM testosterone 200 μM 14 min 6β -hydroxytestosterone 8 CellzDirect_J_6th.indd 8 10.6.18 10:51:14 AM GIBCO®ヒト凍結肝細胞 (プレート培養代謝用) → 代謝回転の低い化合物の固有クリアランス(CLint)の評価に有用 → ミダゾラム、トルブタミド、デキストロメトルファンの CLint に 基づいて適格性を評価済み プレート培養代謝用ヒト肝細胞の 代謝アッセイ条件 弊社のプレート培養代謝用肝細胞は、CYP450の典型的な基質であ るミダゾラム、トルブタミド、デキストロメトルファンを用いてそ れぞれ CYP3A4、CYP2C9 、CYP2D6の酵素機能をテストしています (図8) 。48ウェルのコラーゲンコートプレートに肝細胞を接着させ た後に、血清不含 Williams Medium E を用いてデュプリケートでイ ンキュベートし、氷冷したアセトニトリルを使って表2に示した時 図8̶プレート培養代謝(固有クリアランス)について適格性を評価済みのヒト 凍結肝細胞。CLint(μL/1×106細胞 /分)の結果は、ミダゾラムが14.6、トルブタ ミドが1.34、デキストロメトルファンが7.20でした。 GIBCO®ヒト凍結肝細胞プールド品および シングルドナー品(代謝用) → CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP3A、ECOD、7-HCG および7-HCS活性を評価(表3) 点で反応を停止させます。ウェルの中身を -70° C で保存した後に分 → バッチサイズが500バイアルを超える高品質のプールドロット 析します。親化合物の消失を LC-MS/MS でモニターし、直線回帰に → CYP2D6活性の低いヒト(low CYP2D6 metabolizer)をはじめ とする特殊ロットをご用意 よって固有クリアランス値を決定します。 弊社の浮遊型ヒト凍結肝細胞プールド品およびシングルドナー 表2̶プレート培養したヒト凍結肝細胞の CLint のインキュベーション条件 品は、代謝プロファイリング、代謝安定性といった代謝試験に最 適です。肝組織調達および肝細胞分離をリードするメーカーとし 基質 濃度 インキュベーション 時間 Midazolam 0.50 μ M 0, 1, 2, 4, 6, 8 hr Tolbutamide 1.00 μ M 0, 4, 6, 8, 18, 24 hr Dextromethorphan 1.00 μ M 0, 1, 2, 4, 6, 8 hr て、Invitrogen はシングルドナーロットおよびプールドロットの最 大の品揃えを誇ります(図9)。弊社のプールドロットは平均的な CYP450活性をもつ正常なドナーから調製しているため、複数のド ナーを用いる必要がある実験に好都合です。 図9̶浮遊代謝アプリケーションについて適格性を評価済みのヒト肝細胞 9 CellzDirect_J_6th.indd 9 10.6.18 10:51:15 AM 創薬 表3̶GIBCO®浮遊型ヒト凍結肝細胞の代謝能を測定するためのテスト条件 酵素 基質 濃度 インキュベーション時間 マーカー代謝物 CYP1A2 phenacetin 100 μM 15 min acetaminophen CYP2B6 bupropion 500 μM 20 min hydroxybupropion CYP2C8 paclitaxel 20 μM 45 min 6α-hydroxypaclitaxel CYP2C9 diclofenac 25 μM 15 min 4'-hydroxydiclofenac CYP2C19 (S)-mephenytoin 250 μM 30 min 4'-hydroxymephenytoin CYP2D6 detromethorphan 15 μM 15 min dextrorphan CYP3A4 testosterone 200 μM 14 min 6β-hydroxytestosterone Phase I and II 7-ethoxycoumarin 100 μM 30 min 7-HCG, 7-HCS, 7-HC * * 7-hydroxycoumarin glucuronide, 7-hydroxycoumarin sulfate and 7-hydroxycoumarin 表4̶接着型ヒト凍結肝細胞トラブルシューティングガイド 問題 解凍後の細胞生存率が低い 考えられる原因 → 解凍手法が不適切 → 解凍培地が最適ではない アドバイス → 解凍、播種および計数について、Invitrogen の詳細なプロトコー ルを見直す → 計数時の肝細胞の取り扱いが荒い → 細胞を37° C、2分未満で解凍する → 計数手法が不適切 → 解凍に CHRM® Medium を使って凍結保護剤を除去する → 計数または播種前の細胞の放置時間が長す ぎる → ワイドボアピペットチップを使用し、穏やかに混合する → 計数前に細胞混合物が均一であることを確認する → 4本の格子線のうち2本の格子線上の細胞を計数する → ロードする前に細胞をトリパンブルー混合液中に1分間以上放 置しない → 計数後速やかに細胞を播種する 細胞収量が想定していたよ → 解凍手法が不適切 り低い → 解凍培地が最適ではない → 遠心速度が不適切 → 解凍、播種および計数ついて、Invitrogen の詳細なプロトコール を見直す → 細胞を37° C、2分未満で解凍する → 計数時の肝細胞の取り扱いが荒い → 解凍に CHRM® Medium を使って凍結保護剤を除去する → 計数手法が不適切 → 室温、100× g で10分間遠心する → ワイドボアピペットチップを使用し、穏やかに混合する → 計数前に細胞混合物が均一であることを確認する → 4本の格子線のうち2本の格子線上の細胞を計数する → ロードする前に細胞をトリパンブルー混合液中に1分間以上放置 しない 接着率が低い → 細胞の接着時間が不十分 → 基質の品質が悪い → 肝細胞のロットが接着型ではない → Invitrogen が提供するロット別特性評価仕様書の写真と培養細胞 とを比較する → Geltrex™を重層する前に、時間をおいて接着率が増加するかどう かを確認する → GIBCO®Collagen I Coated Plate を使用する → 解凍、播種および計数について、Invitrogen の詳細なプロトコー ルを見直す → ロットの規格を調べて接着用であることを確認する 10 CellzDirect_J_6th.indd 10 10.6.18 10:51:15 AM 表4̶接着型ヒト凍結肝細胞トラブルシューティングガイド(続き) 問題 単層の集密度が不十分 考えられる原因 → 播種密度が低すぎる → 播種時の肝細胞の分散が不十分 → ウェルフォーマットに用いている播種量が 不適切 → 接着率が低い(上記参照) アドバイス → Invitrogen が提供するロット別特性評価仕様書で適切な播種密 度を確認する → インキュベーション前に顕微鏡で細胞を観察し、播種が適切か を調べる → インキュベーター内でプレートを8の字または前後にゆっくり 動かして細胞を均一に分散させる → 播種量についてInvitrogen の文献または技術サポートを参照する 単層が完全性に欠ける (単層上に細胞塊または細胞 片の集合) → 播種密度が高すぎる → 播種時の細胞の分散が不十分 → ウェルフォーマットに不適な播種量 → Invitrogen が提供するロット別特性評価仕様書で適切な播種密度 を確認する → インキュベーション前に顕微鏡で細胞を観察し、播種が適切かを 調べる → インキュベーター内でプレートを8の字または前後にゆっくり動 かして細胞を均一に分散させる → Geltrex™を重層する前にプレートを揺り動かし、細胞単層を洗う → 播種量についてInvitrogen の文献または技術サポートを参照する 膜の完全性または立方状の → 肝細胞のロットが接着型ではない → ロットの規格を調べて接着用であることを確認する 細胞形態が失われている → 培地が最適ではない → GIBCO® Plating and Incubation Supplement Packs を添加した → 細胞の培養期間が長すぎる GIBCO® Williams Medium E を使用する → Invitrogen の播種プロトコールを参照する → 通常、接着型ヒト凍結肝細胞は6日以上培養しないでください 毛細胆管の形成が不十分 → 肝細胞のロットがトランスポーター用ではない → ロットの規格を調べてトランスポーター用であることを確認する → 培地が最適ではない → GIBCO® Plating and Incubation Supplement Packs を添加した → 毛細胆管の形成時間が不十分 GIBCO® Williams Medium E を使用する → Invitrogen の播種プロトコールを参照する → 通常、毛細胆管網の形成には4 ∼ 5日以上の培養期間が必要です 予期しない誘導結果 → 単層集密度が不十分(上記参照) → 単層が完全性に欠ける(上記参照) → Invitrogen が提供するロット別特性評価仕様書の結果と得られた 結果とを比較する → ポジティブコントロールが不適切 → Invitrogen の酵素誘導プロトコールを参照する → ポジティブコントロールの濃度が不適切 → ポジティブコントロールが適切であることを確認する 細胞の集合、細胞片、細胞 → 被験化合物の毒性 → 処理した細胞と未処理の細胞の形態を比較する の壊死を示す単層の穴が → 培地が最適ではない → Invitrogen の播種プロトコールを参照する みられる → 肝細胞のロットが接着型ではない → ロットの規格を調べて接着用であることを確認する → 細胞の培養期間が長すぎる → 通常、接着型ヒト凍結肝細胞は6日以上培養しないでください 11 CellzDirect_J_6th.indd 11 10.6.18 10:51:16 AM 創薬 GIBCO®接着型および浮遊型動物凍結肝細胞 → 毒性学に利用される主要な動物種の接着型ロットまたは浮遊型ロットをご用意 → 第 I相および第 II相酵素の活性を評価 弊社の動物凍結肝細胞はヒト凍結肝細胞と同じ丁寧な分離・凍結保存手法で調製されています。Invitrogen ではマウス、ラット、イヌ、ウサギ、 非ヒト霊長類から定期的に肝細胞を分離しているほか、ご依頼に応じて他の動物種の肝細胞も分離いたします。第 I相および第 II相酵素活性の 評価法の対象は ECOD、7-HCG、7-HCS です。弊社では経時的な細胞形態、接着率、単層集密度(接着型細胞)、生存率安定性も厳密にモニター しています。 表5̶凍結肝細胞の解凍および播種に関する一般的なガイドライン Human Rat Mouse Dog Monkey 肝細胞のサイズ 20 μm 30 μm 50 μm 20 μm 8-10 μm 遠心条件 100 x g 10 min 55 x g 3 min 55 x g 3 min 76 x g 6 min 76 x g 6 min 播種密度 0.7̶0.9 x 106 total cells/mL 0.7̶0.9 x 106 total cells/mL 0.3̶0.5 x 106 total cells/mL 0.7̶0.9 x 106 total cells/mL 0.9̶1.1 x 106 total cells/mL 培養後72時間 12 CellzDirect_J_6th.indd 12 10.6.18 10:51:16 AM 細胞培養試薬 CHRM® Medium Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium(CHRM®)は、細胞 の凍結保存後に生肝細胞の回収率を改善するとともに、凍結保護剤 を除去するために独自に処方されたものです。CHRM® を適切に使 用すると、 使用しない場合よりも得られる肝細胞の健康状態が良く、 生細胞率が一貫して高いことが実証されています(図10)。CHRM Hepatocyte Maintenance Supplement Pack Hepatocyte Maintenance Supplement Pack は、デ キ サ メ タ ゾ ン、ペニシリン‐ストレプトマイシンのカクテル溶液、ITS+(イ ン ス リ ン、ト ラ ン ス フ ェ リ ン、セ レ ン 錯 体、BSA、リ ノ ー ル 酸)、 GlutaMAX™、HEPES が含まれており、浮遊培養またはプレート培 養で肝細胞をインキュベートするため、最大500 mL のフェノール レッド不含 Williams Medium E または別の適切な 基礎培地に添加 します。 の使い方は簡単です。1本のバイアルに入った肝細胞を解凍して、 CHRM® が入ったコニカルチューブに入れ、短時間遠心して、培地を 捨て、沈渣の細胞を穏やかに再分散するのみです。 Geltrex™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Geltrex™ Matrix は、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘍細胞間の境 界を形成する特殊な細胞外基質の連続シートから精製した可溶型の 増殖因子低減(RGF)基底膜抽出物(BME)です。Geltrex™ Matrix の主 成分は、ラミニン、IV型コラーゲン、エンタクチン、ヘパリン硫酸プ ロテオグリカンであり、三次元(3D)培養試験の基盤を提供します。 Collagen I, Rat Tail for Cell Culture コラーゲンは、細胞培養に最もよく使用されている細胞外基質 (ECM)タンパク質であり、細胞の接着や分化を促します。5 mg/ mL Collagen I溶液のほか、Collagen I をコートした6ウェルプレー ト、24ウェルプレート、96ウェルプレートも肝細胞実験向けにご用 図10̶凍結保存後の肝細胞生存率の改善効果について CHRM® と DMEM とを比較 したもの。データはヒト凍結肝細胞の個々のロットの126件の試験を平均したも 意しています。 のです。 その他の肝生物学研究用製品 Williams Medium E Invitrogen は、CYP450代謝試験用製品を多数取り揃えております。 LC - M S / M S 分析を行なう肝細胞研究にはフェノールレッド不含 → CYP450 Baculosomes® Reagents̶ 特 異 的 な ヒ ト P450酵 素 Williams Medium E のご使用をお勧めします。 およびウサギ NADPH-P450レダクターゼを発現する組換え バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞から調製したミクロ Hepatocyte Plating Supplement Pack ソームです。分析可能なアイソザイムは CYP1A2、CYP2C9、 Hepatocyte Plating Supplement Pack は、適格性評価済みのウシ胎 CYP2C19 、CYP2D6 、CYP3A4 、CYP3A5 です。Baculosomes® 児血清、デキサメタゾン、ペニシリン‐ストレプトマイシンのカク Reagents は VIVID®基質を併用して蛍光検出を行なうこともで テル溶液、ウシインスリン、GlutaMAX™、HEPES が含まれており、 きます。 新鮮肝細胞または凍結肝細胞を播種するため、最大500 mL のフェ → LanthaScreen™ Nuclear Receptor Assays ̶ TR-FRET PXR ノールレッド不含 Williams Medium E または別の適切な 基本培地 Competitive Binding Assay と CAR Co-activator Assay が 含 ま に添加します。 れています。 → TaqMan® Drug Metabolism(DME)Assays̶ 種 々 の 薬 物 代 謝酵素をコードする220種類の遺伝子多型を検出するための 2,600種類を超える独自のアッセイです。 13 CellzDirect_J_6th.indd 13 10.6.18 10:51:16 AM 創薬 ヒトおよび動物凍結肝細胞の 解凍・播種プロトコール 8. 肝細胞をマルチウェルプレートに移し、分散させます。ただし、 回旋はさせないでください。 24ウェルプレートの場合: 準 備 す る も の: 重 層を行なう場合は、ロ ッ ト の 濃 度 と 技 術 的 な → ヒト肝細胞、500 μ L、Product Characterization Sheet に 参 考 事 項 に つ い て Geltrex™ Reduced Growth Factor Basement 応じた密度 Membrane Matrix(カタログ番号12760-021)の仕様書をご参照 → イヌおよびラット肝細胞、500 μ L、ウェルあたり3.5 ∼ 4.5 ください。Geltrex™ Matrix は、使用前に氷上で3 ∼ 4時間解凍する ×105細胞 か、または4° C で一晩解凍した後に、氷冷しておきます。 → マウス肝細胞、500 μL、ウェルあたり1.5 ∼ 2.5×105細胞 初代培養肝細胞を取り扱う際には、一般的な安全対策を講じ、適切 → 非ヒト霊長類肝細胞、500 μ L、ウェルあたり4.5 ∼ 5.5× な安全キャビネットをご使用ください。 105細胞 9. 解凍、遠心、再懸濁 1. CHRM® Medium と Plating Medium ( GIBCO® Hepatocyte Plating Supplement Pack, (Serum-Containing) を添加した Williams Medium E)を15分間温めて37° C にします。 2. 凍結肝細胞を37 ° C のウォーターバスに約2分間浸して解凍し ます。 3. フード内で70%アルコールによりバイアルを消毒し、注ぐか、 またはワイドボアピペットチップを使って肝細胞を CHRM® 37° C で4 ∼ 6時間インキュベートします。 10. プレートの培地を撹拌して吸引します。 11. 重 層 を 行 な う 場 合 は、GIBCO® Hepatocyte Maintenance Supplement Pack, (Serum-Free) を含有する Williams Medium E で氷冷した GIBCO® Geltrex™ Matrix を0.35 mg/mL の最終濃度 に希釈して、4° C の Geltrex™ Matrix混合物を調製します。 12. 4 ° C の Geltrex™ を 重 層 す る か、ま た は37 ° C の Incubation Medium を添加してプレートを一晩インキュベートした後に 使用します。 Medium に移します。 4. 室温で遠心します: → ヒト肝細胞、100× g で10分間 → イヌおよび非ヒト霊長類肝細胞、76× g で6分間 → ラットおよびマウス肝細胞、55× g で3分間 5. 注意深く吸引を行ない、適量の Plating Medium(通常は1× 106細胞あたり1 mL)を添加します。 計数、播種およびインキュベート 6. 細胞生存率と収量を決定します(詳細は肝細胞計数手順をご参 照ください)。細胞を浮遊させて使用する場合は以下には進み ません(図11)。 7. Plating Medium で播種密度に希釈します: → ヒ ト 肝 細 胞 ̶Product Characterization Sheet参 照(通 常 0.7 ∼ 0.9×106全細胞 /mL). → イヌおよびラット肝細胞、0.7 ∼ 0.9×106全細胞 /mL → マウス肝細胞、0.3 ∼ 0.5×106全細胞 /mL → 非ヒト霊長類肝細胞、0.9 ∼ 1.1×106全細胞 /mL 図11̶浮遊培養肝細胞とプレート培養肝細胞のセットアップ 14 CellzDirect_J_6th.indd 14 10.6.18 10:51:17 AM トリパンブルー色素排除試験法による 初代培養肝細胞の計数プロトコール 肝細胞の計数 7. 血球計算盤の4区画の生細胞(透明または黄色)と死細胞(青色) を速やかに計数します。その際は、各区画の2本の区画線上の 注:初代培養肝細胞を取り扱う際には、一般的な安全対策を行い、適 細胞数を含めて計数します(図12)。トリパンブルーへの曝露 切な安全キャビネットをご使用ください。凍結肝細胞を解凍し、凍結 が長くなると細胞が壊死するおそれがあるため、計数は速やか 保護剤を除去する手順は播種プロトコールに記載されています。 細胞計数用バイアルの準備 1. 1.5 mL のマイクロ遠心チューブに200 μL のバッファー(PBS またはこれに類する溶液)と50 μL の0.4%トリパンブルー染 に行ってください。 計算 8. を目的の最終細胞濃度に希釈する場合は、添加済みの新たな 色液を加えて混合します。細胞の計数に用いる1.5 mL のバイ アル(細胞計数用バイアル)にこのトリパンブルー希釈液を50 μL加えます。 2. 肝細胞浮遊液を計数用バイアルに加える前に、肝細胞浮遊液が 入ったチューブを穏やかに数回転倒混和して溶液を均一にし ます。細胞を正確に計数するにはこのステップがきわめて重要 です。 3. ワイドボアチップで50 μL の肝細胞浮遊液を測り取り、細胞計 全肝細胞数のほか、肝細胞の生存率を求めます。肝細胞混合物 Plating Medium またはこれと同等の培地を使用します。 9. 生細胞率=(生細胞数/全細胞数)×100 10. 生細胞の収量=1区画あたりの生細胞の平均数(全生細胞数÷ 4)×10,000×2×最終細胞浮遊液の全量(mL) 11. 全細胞密度(細胞数 /mL)=1区画当たりの生細胞+死細胞の 平均数×10,000×2。ここで、10,000 は 1 区画の体積(0.1 μL) の換算係数であり、2は細胞希釈倍率です。 数用バイアルに注入して肝細胞浮遊液を採取します。この際に チップを洗浄しないでください。これによって細胞浮遊液は2 倍に希釈されます。 4. 計数用バイアルを穏やかにたたいて混ぜます。細胞が壊死して 正確な生存率が決定できなくなるため、激しい振盪や撹拌は避 けてください。 血球計算盤の準備 5. 計数用バイアルを1分静置し、これを穏やかにたたいて再度混 合した後に、ピペットで10 μL の混合液を血球計算盤の片側の V 字型の溝にゆっくり移します。毛管作用によって細胞浮遊液 が血球計算盤に吸い込まれます。 6. 図12̶血球計算盤の細胞の計数。細胞とトリパンブルーとの混合液を血球計算盤 の片側にロードし、全4区画(B の円)の細胞数を計数します。区画線上の細胞を 計数する際には、2本の区画線上の細胞数を計数し、残りの2本の区画線上の細胞 数は計数しません。たとえば図 C の場合、上と左の区画線上にある細胞(緑の点) は計数しますが、下と右の区画線上にある細胞(赤の点)は計数しません。 計数前に、顕微鏡下で4区画を素早く調べて細胞が均等に分布 していることを確かめます。血球計算盤に細胞が均等に分布し ていない場合や泡が入っている場合はやり直します。 15 CellzDirect_J_6th.indd 15 10.6.18 10:51:17 AM 創薬 Ordering Information 製品名 サイズ カタログ番号 Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified* 4–8 million viable cells HMCPTS Human cryopreserved plateable hepatocytes (Each lot's certificate of analysis has an exact cell count.) Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified* 9–12 million viable cells HMCPTL Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Induction Qualified 4–8 million viable cells HMCPIS Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Induction Qualified 9–12 million viable cells HMCPIL Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Metabolism Qualified 4–8 million viable cells HMCPMS Human Cryopreserved Plateable Hepatocytes, Metabolism Qualified 9–12 million viable cells HMCPML Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Transporter Qualified* 4–8 million viable cells HMCSTS Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Transporter Qualified* Human cryopreserved suspension hepatocytes 9–12 million viable cells HMCSTL Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Metabolism Qualified, Male 4–8 million viable cells HMCS1S Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Metabolism Qualified, Male 9–12 million viable cells HMCS1L Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Metabolism Qualified, Female 4–8 million viable cells HMCS2S Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Metabolism Qualified, Female 9–12 million viable cells HMCS2L Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Metabolism Qualified, Pooled Donors 4–8 million viable cells HMCS3S Human Cryopreserved Suspension Hepatocytes, Metabolism Qualified, Pooled Donors 9–12 million viable cells HMCS3L Animal suspension and plateable cryopreserved hepatocytes (Please inquire for minipig, guinea, and other custom species.) Dog (Beagle) Cryopreserved Hepatocytes, Male 4–8 million viable cells Dog (Beagle) Cryopreserved Hepatocytes, Female 4–8 million viable cells DGCS20 Dog (Beagle) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Male 4–8 million viable cells DGCP10 Dog (Beagle) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Female 4–8 million viable cells DGCP20 Fish (Rainbow Trout) Cryopreserved Hepatocytes, Male 4–8 million viable cells TRCS10 Fish (Rainbow Trout) Cryopreserved Hepatocytes, Female 4–8 million viable cells TRCS20 Fish (Rainbow Trout) Cryopreserved Hepatocytes, Mixed Gender 4–8 million viable cells TRCS30 Monkey (Cynomolgus) Cryopreserved Hepatocytes, Male 4–8 million viable cells MKCS10 Monkey (Cynomolgus) Cryopreserved Hepatocytes, Female 4–8 million viable cells MKCS20 Monkey (Cynomolgus) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Male 4–8 million viable cells MKCP10 Monkey (Cynomolgus) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Female 4–8 million viable cells MKCP20 Mouse (CD-1) Cryopreserved Hepatocytes, Male 4–8 million viable cells MSCS10 Mouse (CD-1) Cryopreserved Hepatocytes, Female 4–8 million viable cells MSCS20 Mouse (CD-1) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Male 4–8 million viable cells MSCP10 Mouse (CD-1) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Female 4–8 million viable cells MSCP20 Rabbit (New Zealand White) Cryopreserved Hepatocytes, Male 4–8 million viable cells RBCS10 Rabbit (New Zealand White) Cryopreserved Hepatocytes, Female 4–8 million viable cells RBCS20 Rabbit (New Zealand White) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Male 4–8 million viable cells RBCP10 Rabbit (New Zealand White) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Female 4–8 million viable cells RBCP20 Rat (Sprague-Dawley) Cryopreserved Hepatocytes, Male 4–8 million viable cells RTCS10 DGCS10 * 注:GIBCO® Human Cryopreserved Hepatocytes, Transporter Qualified(ヒト凍結肝細胞,トランスポーター用)は B-CLEAR®試薬に対する適応性が評価されておらず、本製品の購入 によって B-CLEAR®技術を実用化する権利が譲渡されることはありません。 16 CellzDirect_J_6th.indd 16 10.6.18 10:51:17 AM Ordering Information, continued 製品名 サイズ カタログ番号 Rat (Sprague-Dawley) Cryopreserved Hepatocytes, Female 4–8 million viable cells RTCS20 Rat (Sprague-Dawley) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Male 4–8 million viable cells RTCP10 Rat (Sprague-Dawley) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Female 4–8 million viable cells RTCP20 Cryopreserved Hepatocytes Recovery Medium (CHRM®) 50 mL CM7000 Williams’Medium E (1x, no phenol red) 500 mL A12176-01 Hepatocyte Thawing and Plating Supplement Pack (Serum-containing) 1 kit for 500 mL medium CM3000 Hepatocyte Maintenance Supplement Pack (Serum-free) 1 kit for 500 mL medium CM4000 50 mL CM9000 Collagen I, Coated Plates, 6-well 1 x 5 plates A11428-01 Collagen I, Coated Plates, 24-well 1 x 5 plates A11428-02 Collagen I, Coated Plates, 96-well 1 x 5 plates A11428-03 Collagen I, Bovine, 5 mg/mL 10 mL A10644-01 Collagen I, Rat Tail, 5 mg/mL 20 mL A10483-01 Geltrex ™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix 5 mL 12760-021 Media and reagents for hepatocyte culture Cryopreserved Hepatocytes Plating Medium (CHPM) 17 CellzDirect_J_6th.indd 17 10.6.18 10:51:18 AM 創薬 GIBCO®新鮮肝細胞 GIBCO®動物新鮮肝細胞(北米のみ) → 毎週複数回の分離を実施 → 業界最大級の調達ネットワークによる確実な供給 → 厳格な出荷規格:生存率80%以上、集密度80%以上(プレート 培養細胞) → 直ちに使用可能̶お客様の指定に合わせてプレート培養したも のまたは浮遊培養液をお届け ヒト初代培養肝細胞は、適切な培養条件下ではin vivo の肝臓と同様 な代謝、誘導および阻害を示します。ヒト新鮮肝細胞は、治療薬候 補化合物の代謝安定性、代謝プロファイル、肝毒性の可能性、代謝 酵素の阻害能または誘導能、肝トランスポーターの試験に利用しま す。in vitro の最適な結果を得るには、初代培養肝細胞を注意深く分 離して、細胞の薬物代謝酵素、トランスポーターおよび機能を保つ 必要があります。弊社の肝細胞分離担当者は、細胞の最適な健康状 態が確保される適切な手法に習熟しています。そのため、弊社の新 鮮肝細胞は高い生細胞率、高い集密度(図13)、in vivo に近い酵素 発現レベルを示します。 → お客様が実験を計画しやすいよう日程を公表 弊社は毒性学に利用される主要な動物種の肝細胞を取り揃えている ほか、個別のさまざまなご依頼にも対応いたします。お客様の研究 に好都合であるよう、毎週分離を行なっております。動物肝細胞の 分離日程については、www.invitrogen.com/hepatocytes をご覧く ださい。常にご用意している動物種は以下の通りです。 → ラット(Sprague-Dawley) → マウス(CD-1) → イヌ(ビーグル) → 非ヒト霊長類(カニクイザル) 弊社のフォーマットは柔軟です̶肝細胞浮遊培養液をご注文いた だくこともできれば、播種を依頼いただくこともできます。細胞 をプレート培養して最大集密度に増殖させるほか(表6と7) 、オプ ションで Geltrex™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix を重層し、さらにin vivo に近い環境をお作りします。 → 6ウェルプレート → 12ウェルプレート → 24ウェルプレート → 48ウェルプレート → 96ウェルプレート → 浮遊培養 GIBCO®ヒト新鮮肝細胞(北欧、欧州のみ) → 北米と欧州で提供可能 → 毎週調製(通常) 図13̶播種後2日のヒト 新鮮肝細胞。密接な細胞間接着、明瞭な核、サイトゾルの透明性 から細胞の形態が良好であることがわかります。 → Rapid Alert™メールで通知 Invitrogen では、生体ドナーの外科手術を実施している病院のネッ トワークのほか、臓器が移植に不適合と判断された死体ドナーから 肝組織を調達しています。通常は1週間に1回以上の組織提供があり ます。このような大規模な調達ネットワークを利用することによっ て、健康なヒト肝細胞を安定供給し、お客様の試験の特定の要件に 合う組織の提供を常にお知らせすることができます。GIBCO®新鮮 肝細胞の販売対象地域は表8をご覧ください。 ※日本国内では新鮮肝細胞の販売はしておりません。 18 CellzDirect_J_6th.indd 18 10.6.18 10:51:18 AM Rapid Alert™通知(北欧、欧州のみ) Rapid Alert™メールは、近日発売予定のヒト新鮮初代培養肝細胞の情報を直ちにお知らせします。Rapid Alert™メールが届いた場合に、肝細胞 が必要であれば弊社までご注文ください。Rapid Alert™メールの内容は以下の通りです。 → ドナー統計情報の概要(性別、年齢、人種、BMI、飲酒歴、薬物歴、投薬歴) → ご注文可能なプレートフォーマットおよび浮遊フォーマット → 肝細胞の発送日 → ご注文またはお問い合わせ先の電話番号とメールアドレス Rapid Alert™のご登録は、www.invitrogen.com/hepacocytes のオンラインフォームをご利用ください。 ※日本国内では新鮮肝細胞の販売はしておりません。 表6̶プレート1枚あたりの GIBCO®新鮮肝細胞の数(×106全細胞) 表8̶GIBCO®新鮮ヒト肝細胞および新鮮動物肝細胞の販売地域 Format Human Rat Mouse Dog Monkey Region Human Animal 6-well plate 9.0 9.0 4.8 9.0 12.0 Americas Yes Yes 12-well plate 8.1 8.1 4.3 8.1 10.8 Asia-Pacific No No 24-well plate 7.3 7.3 3.9 7.3 9.7 Europe Yes Coming Soon 48-well plate 6.6 6.6 3.5 6.6 8.7 Middle East & Africa Not Yet Not Yet 96-well plate 5.9 5.9 3.1 5.9 7.9 表7̶GIBCO®新鮮肝細胞の GIBCO®Collagen I, Coated Plates への播種密度(ウェルあたりの全細胞数) Format Well volume Human Rat Mouse Dog Monkey 6-well plate 2 mL 1.5 x 106 1.5 x 106 8.0 x 105 1.5 x 106 2.0 x 106 12-well plate 1 mL 6.7 x 105 6.7 x 105 3.6 x 105 6.7 x 105 9.0 x 105 24-well plate 500 μ L 3.0 x 105 3.0 x 105 1.6 x 105 3.0 x 105 4.0 x 105 48-well plate 250 μ L 1.4 x 105 1.4 x 105 7.3 x 104 1.4 x 105 1.8 x 105 96-well plate 125 μ L 6.1 x 104 6.1 x 104 3.3 x 104 6.1 x 104 8.0 x 104 T75 flask 9 mL 12 x 106 12 x 106 N/A 12 x 106 12 x 106 19 CellzDirect_J_6th.indd 19 10.6.18 10:51:18 AM 創薬 Ordering Information 製品名 サイズ カタログ番号 Human Fresh Hepatocytes, Suspension 15 million cells HMFS01 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes, Suspension 15 million cells DGFS01 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes, Suspension 15 million cells MKFS01 Monkey (Rhesus) Fresh Hepatocytes, Suspension 15 million cells RHFS01 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes, Suspension 15 million cells MSFS01 Mouse (Balb/C) Fresh Hepatocytes, Suspension 15 million cells BCFS01 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes, Suspension 15 million cells RTFS01 Human Fresh Hepatocytes 1 x 6-well plate HMFN06 Human Fresh Hepatocytes 1 x12-well plate HMFN12 Human Fresh Hepatocytes 1 x 24-well plate HMFN24 Human Fresh Hepatocytes 1 x 48-well plate HMFN48 Human Fresh Hepatocytes 1 x 96-well plate HMFN96 Human Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 6-well plate HMFY06 Human Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 12-well plate HMFY12 Human Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 24-well plate HMFY24 Human Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 48-well plate HMFY48 Human Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 96-well plate HMFY96 1 x T75 flask HMFN75 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes 1 x 6-well plate DGFN06 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes 1 x 12-well plate DGFN12 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes 1 x 24-well plate DGFN24 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes 1 x 48-well plate DGFN48 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes 1 x 96-well plate DGFN96 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes, with Matrigel ™ Overlay 1 x 6-well plate DGFY06 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes, with Matrigel ™ Overlay 1 x 12-well plate DGFY12 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes, with Matrigel ™ Overlay 1 x 24-well plate DGFY24 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes, with Matrigel ™ Overlay 1 x 48-well plate DGFY48 Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes, with Matrigel ™ Overlay 1 x 96-well plate DGFY96 1 x T75 flask DGFN75 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes 1 x 6-well plate MKFN06 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes 1 x 12-well plate MKFN12 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes 1 x 24-well plate MKFN24 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes 1 x 48-well plate MKFN48 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes 1 x 96-well plate MKFN96 Human and animal fresh suspension hepatocytes (There is a minimum order of 15 million cells.) Human and animal fresh plated hepatocytes Human Fresh Hepatocytes Dog (Beagle) Fresh Hepatocytes ※北米および欧州(一部、北米のみ)のみの取扱いになります。日本国内では新鮮肝細胞の販売はしておりません。 20 CellzDirect_J_6th.indd 20 10.6.18 10:51:18 AM Ordering Information, continued 製品名 サイズ カタログ番号 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 6-well plate MKFY06 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 12-well plate MKFY12 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 24-well plate MKFY24 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 48-well plate MKFY48 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 96-well plate MKFY96 1 x T75 flask MKFN75 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes 1 x 6-well plate MSFN06 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes 1 x 12-well plate MSFN12 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes 1 x 24-well plate MSFN24 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes 1 x 48-well plate MSFN48 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes 1 x 96-well plate MSFN96 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 6-well plate MSFY06 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 12-well plate MSFY12 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 24-well plate MSFY24 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 48-well plate MSFY48 Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 96-well plate MSFY96 1 x T75 flask MSFN75 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes 1 x 6-well plate RTFN06 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes 1 x 12-well plate RTFN12 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes 1 x 24-well plate RTFN24 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes 1 x 48-well plate RTFN48 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes 1 x 96-well plate RTFN96 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 6-well plate RTFY06 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 12-well plate RTFY12 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 24-well plate RTFY24 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 48-well plate RTFY48 Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes, with Geltrex ™ Overlay 1 x 96-well plate RTFY96 1 x T75 flask RTFN75 Monkey (Cynomolgus) Fresh Hepatocytes Mouse (CD-1) Fresh Hepatocytes Rat (Sprague-Dawley) Fresh Hepatocytes ※北米および欧州(一部、北米のみ)のみの取扱いになります。日本国内では新鮮肝細胞の販売はしておりません。 21 CellzDirect_J_6th.indd 21 10.6.18 10:51:19 AM 創薬 GIBCO®肝ミクロソーム → 再現性のある長期試験向けの大容量のプールドロット ヒトおよび動物肝ミクロソームの 解凍・インキュベーションプロトコール → 年齢、BMI、高 CYP3A4または高 CYP2D6に基づく特殊なヒト 1. 被験物質を溶媒に溶かして100倍のストック溶液を調製します。 2. ミクロソームを氷上でゆっくりと解凍します。 3. 以下を混合して全量198 μ L とします。 プール → S9、サイトゾルをはじめとする他の細胞画分もご用意 肝小胞体由来の細胞画分には、医薬品候補のin vitro 代謝の評価に用 → 183 μ L の100 mMバッファー いられる種々の代謝酵素が含まれており(表9)、次の種々の実験に → 10 μ L の20 mM NADPH(最終濃度1 mM) 適しています。 → 5 μ L のミクロソーム(最終タンパク質濃度0.5 mg/mL) → チトクロム P450阻害試験 4. → 代謝安定性 3. の混合物を5分間ウォーターバスに浸してプレインキュベー トします。 → チトクロム P450フェノタイピング 5. → 代謝物の特性決定 100倍の被験物質ストック溶液を2 μ L添加して反応を開始し ます。 Invitrogen は、ヒトをはじめとする毒性学に用いられるさまざまな 6. 穏やかに撹拌しながら37° C で最大60分間インキュベートします。 種の肝細胞画分をご提供しています。各製品にはドナーの平均的 7. 有機溶媒(酢酸エチル等)を200 μ L添加して反応を停止させ な典型的プールが含まれています。ヒトミクロソームのプールは、 ます。 GLP基準に従い、FDA の推奨する基質を使用して主要なチトクロム 8. さらに25 μ L の内部標準を添加します。 P450活性と一部の第 II相酵素の特性(Km および Vmax)が完全に決定 9. サンプルをボルテックスした後に約3000 rpm で5分間遠心し されています(表10および11)。 ます。 10. 有機層を清潔なプレートに移して蒸発乾固させます。 表9̶肝細胞画分に存在する代謝酵素 Metabolic enzymes 11. 移動相を溶媒としてサンプルを調製し、生じた代謝物を LC- Liver microsomes Aldehyde oxidase Liver S9 fractions Liver cytosol X X Cytochromes P450 (CYP) X X Flavin monooxygenases (FMO) X X MS/MS で分析します。 表10̶GIBCO®ヒト肝ミクロソーム(50ドナープール)の任意ロットのキネティッ クパラメーター Glutathione transferase (GST) X Isoform Metabolite Km ( μM) Vmax (nmol/ min/mg) Monamine oxidase (MAO) X CYP1A2 Acetaminophen 78 0.73 Sulfurotransferases (SULT) X CYP2A6 7-Hydroxycoumarin 1.1 0.53 CYP2B6 Hydroxybupropion 64 0.29 CYP2C8 6α-Hydroxypaclitaxel 5.5 0.15 以下の種の細胞画分ご用意しています。 CYP2C9 Hydroxytolbutamide 220 0.19 → ヒト(シングルドナー、特殊プール、ポピュレーションプール) CYP2C19 4'-Hydroxymephenytoin 34 0.031 → ラット(Sprague-Dawley) CYP2D6 Dextrophan 3.2 0.13 → マウス(CD-1) CYP2E1 6-Hydroxychlorzoxazone 70 1.4 → イヌ(ビーグル) CYP3A4 6β-Hydroxytestosterone 19 4.0 CYP3A4 1'-Hydroxymidazolam 1.6 1.1 Uridine glucuronide transferase (UGT) X → 非ヒト霊長類(カニクイザル) X X → 魚(ニジマス) 22 CellzDirect_J_6th.indd 22 10.6.18 10:51:19 AM 表11̶GIBCO®ヒト肝ミクロソームを使って試験したチトクロム P450および第 II相酵素 モニターした酵素 マーカー 基質 インキュベーション(分) タンパク質濃度(mg/mL) 代謝物 CYP1A1/2 Phenacetin 30 0.1 Acetaminophen CYP2A6 Coumarin 5 0.025 7-Hydroxycoumarin CYP2B6 Bupropion 20 0.25 Hydroxybupropion CYP2C8 Paclitaxel 10 0.075 6α-Hydroxypaclitaxel CYP2C9 Tolbutamide 20 0.1 Hydroxytolbutamide CYP2C19 (S) Mephenytoin 30 0.1 4'-Hydroxymephenytoin CYP2D6 Dextromethorphan 15 0.2 Dextrorphan CYP2E1 Chlorzoxazone 20 0.1 6-Hydroxychlorzoxazone CYP3A4/5 Midazolam 4 0.025 1'-Hydroxymidazolam CYP3A4/5 Testosterone 7 0.05 6β-Hydroxytestosterone CYP4A11 Lauric acid 15 0.2 12-Hydroxydecanoic acid FMO Methyl p-tolylsulfide 15 0.05 Methyl p-tolylsulfoxide UGT 7-Hydroxycoumarin 30 0.2 7-Hydroxycoumarin glucuronide 23 CellzDirect_J_6th.indd 23 10.6.18 10:51:19 AM 創薬 Ordering Information 製品名 サイズ カタログ番号 Human Microsomes, 50 Donors 0.5 mL HMMCPL Human Microsomes, Pooled Male Donors 0.5 mL HMMCPM Human Microsomes, Pooled Female Donors, 20 mg/mL 0.5 mL HMMCPF Human Microsomes, Single Donor 0.5 mL HMMCSD Human Microsomes, Pediatric Donors 0.5 mL HMMCPE Human Microsomes, Low Activity Donors 0.5 mL HMMCLO Human Microsomes, Obese Donors 0.5 mL HMMCOB Human Microsomes, Morbidly Obese Donors 0.5 mL HMMCMO Human Microsomes, Overweight Donors 0.5 mL HMMCOW Human Microsomes, Ideal Weight Donors 0.5 mL HMMCIW Human Microsomes, Over 75 Years Old Donors 0.5 mL HMMC75 Human Microsomes, 18-39 Years Old Donors 0.5 mL HMMC18 Human Microsomes, 40-60 Years Old Donors 0.5 mL HMMC40 Human Microsomes, High 3A4 Activity Donors 0.5 mL HMMC3A Human Microsomes, High 2D6 Activity Donors 0.5 mL HMMC2D Dog (Beagle) Microsomes 0.5 mL DGMCPL Monkey (Cynomolgus) Microsomes 0.5 mL MKMCPL Monkey (Rhesus) Microsomes 0.5 mL RHMCPL Mouse (Balb/C) Microsomes 0.5 mL BCMCPL Mouse (CD-1) Microsomes 0.5 mL MSMCPL Rat (Sprague-Dawley) Microsomes 0.5 mL RTMCPL Mouse (CD-1) Control for Induced Microsomes, Corn Oil Vehicle 0.5 mL MSMCVC Mouse (CD-1) Microsomes, Induced with 3-Methylcholanthrene 0.5 mL MSMCMC Mouse (CD-1) Microsomes, Induced with Phenobarbital 0.5 mL MSMCPB Mouse (CD-1) Microsomes, Induced with Pregnenolone-16 Carbonitrile 0.5 mL MSMCPC Mouse (CD-1) Microsomes, Induced with Clorfibrate 0.5 mL MSMCCL Fish (Rainbow Trout) Microsomes, Male 0.5 mL TRMC01 Fish (Rainbow Trout) Microsomes, Female 0.5 mL TRMC02 Human and animal liver microsomes, 20 mg/mL 24 CellzDirect_J_6th.indd 24 10.6.18 10:51:19 AM Ordering Information, continued 製品名 サイズ カタログ番号 Human S9 Fractions, Pooled 1.0 mL HMS9PL Human S9 Fractions, Single Donor 1.0 mL HMS9SD Dog (Beagle) S9 Fractions 1.0 mL DGS9PL Fish (Rainbow Trout) S9 Fractions 1.0 mL TRS9PL Monkey (Cynomolgus) S9 Fractions 1.0 mL MKS9PL Monkey (Rhesus) S9 Fractions 1.0 mL RHS9PL Mouse (Balb/C) S9 Fractions 1.0 mL BCS9PL Mouse (CD-1) S9 Fractions 1.0 mL MSS9PL Rat (Sprague-Dawley) S9 Fractions 1.0 mL RTS9PL Human Cytosol, Pooled 1.0 mL HMCYPL Human Cytosol, Single Donor 1.0 mL HMCYSD Dog (Beagle) Cytosol 1.0 mL DGCYPL Monkey (Cynomolgus) Cytosol 1.0 mL MKCYPL Monkey (Rhesus) Cytosol 1.0 mL RHCYPL Mouse (CD-1) Cytosol 1.0 mL MSCYPL Mouse (Balb/C) Cytosol 1.0 mL BCCYPL Rat (Sprague-Dawley) Cytosol 1.0 mL RTCYPL Human and animal S9 fractions, 20 mg/mL Human and animal cytosol, 20 mg/mL 25 CellzDirect_J_6th.indd 25 10.6.18 10:51:19 AM 創薬 凍結肝細胞の輸送と保管 ミクロソームと他の肝細胞画分の輸送と保管 凍結肝細胞は、ノースカロライナ州 Durham(北米のご注文) 、英国 肝ミクロソーム、S9フラクション、サイトゾルは、ノースカロライ の Inchinnan(EU のご注文)または他の流通センター(アジア太平 ナ州 Durham またはメリーランド州 Frederick(北米のご注文)、英 洋のご注文)から FOB Origin(出荷地渡し)の輸送条件で輸送いた 国の Inchinnan(EU のご注文)、または他の流通センター(アジア します。肝細胞は、液体窒素の気相に入れて発送いたします。輸送 太平洋のご注文)から FOB Origin(出荷地渡し)の輸送条件で輸送 用デュワーの返却手順の説明書が各荷物に入っております。 いたします。肝細胞画分は、荷物が税関を通過しなければならない 場合を除いてドライアイス詰めで発送し、通関の必要がある場合は 凍結肝細胞は受け取り次第、研究室の凍結保存用デュワーまたは ドライシッパーに入れて発送いたします。肝細胞画分は受け取り次 -135° C のフリーザーに移してください。温度上昇による肝細胞生存 第、直ちに -80° C のフリーザーに移しかえる必要があります。 率または細胞収量の低下を防ぐため、バイアルを移す作業は可能な 限り短時間(1分未満)で行なってください。使用するまでの間、肝細 胞のバイアルは液体窒素の気相中(-130° C 以下)で保管します。 更なる情報は 肝製品のプロトコル 新鮮肝細胞の輸送と保管 新鮮肝細胞はノースカロライナ州 Durham(北米のご注文)または 英国の Warington(EU のご注文)から FOB Origin(出荷地渡し)の 輸送条件で輸送いたします。浮遊型新鮮細胞は低温の保存溶液に入 れて急送/民間運送業者経由で発送し、可能な限り迅速にお届けし ます。プレート培養肝細胞は、播種後1 ∼ 2日目に急送/民間運送 プロトコルについては www.invitrogen.com/hepatocytes をご覧く ださい。 → トリパンブルー色素排除試験法による初代培養肝細胞の計数 → 浮遊型肝細胞による代謝安定性 → プレート培養肝細胞による代謝安定性 → プレート培養肝細胞による誘導能 業者経由で発送いたします。これは細胞の良好な健康状態を確保し、 CYP450レベルを安定させることを目的としています。 浮遊状態の新鮮肝細胞は受け取り次第、直ちに取扱説明書に従って 4° C で遠心する必要があります。プレート培養肝細胞は速やかに箱 から取り出して、輸送用培地を新鮮な培地と置き換えます。輸送時 に使用される保存用培地は低温に維持するためのものであり、細胞 の温度が8° C を超えるとこの培地は細胞に毒性を及ぼし始めます。 実験前に細胞を一晩順応させることをお勧めします。 ※日本での輸送、デュワー返却手順などについては、お取扱い販売店へお問い合わせください。 26 CellzDirect_J_6th.indd 26 10.6.18 10:51:20 AM Invitrogen の肝 トランスポーター関連サービス 化合物とトランスポーターとの相互作用を評価する際のお手伝いは Invitrogen にお任せください。弊社は、トランスポーター用肝細胞、膜小胞、 キット、サービスを取り揃えており、お客様の研究を拡張し、結果を迅速に提供することによって、化合物の生体利用率およびクリアランスの ほか、薬物間相互作用および毒性予測研究のお手伝いをいたします。 →理解に役立つ独特のin vitro モデル ○ 取り込みおよび排出を評価するためのトランスポーター用肝細胞 ○ transporter vesicles および membranes ○ 単独のトランスポーターをトランスフェクトした細胞株 ○ B-CLEAR®胆汁排泄系 →以下に関するバリデーション済みのサービス ○ P糖タンパク質(P-pg)の基質および阻害剤候補 ○ 取り込みおよび排出トランスポーターの解明 ○ 初代培養肝細胞の取り込み、排出および胆汁排泄(B-CLEAR®技術) トランスポーターサービスに関するお問い合わせについては、以下の窓口までご連絡ください。 ○サービスラボ TEL:03-5753-3006 FAX:03-5753-3007 E-mail:[email protected] 弊社ホームページ www.invitrogen.com/ADMEservices または www.invitrogen.com/hepatocytes もご覧ください。 27 CellzDirect_J_6th.indd 27 10.6.18 10:51:20 AM 創薬 B-CLEAR®肝輸送サービス B-CLEAR® System のしくみ B-CLEAR® System は、コラーゲンサンドイッチ培養された肝細胞の 毛細胆管を緩衝液から隔てている密着結合の完全性を調節すること によって機能します。Ca2+存在下で維持されている密着結合は Ca2+ 作用、胆汁うっ滞性の全体像を明らかにします。このin vitro 法は、 種々の前臨床動物に関するin vivo 予測を最適化するには優れたプ ラットフォームであるため、一般試験としてお勧めします。ただし、 B-CLEAR®サービスでは、トランスポーターを介する薬物相互作用 に関与している可能性のある取り込みまたは排出トランスポーター は同定されません。 非存在下では破壊されます(図15)。密着結合破壊後の胆汁排泄は LC/MS/MS または液体シンチレーション計測によって測定すること ができます。このアッセイは、6ウェルまたは24ウェルフォーマッ トでサンドイッチ培養された弊社の高品質なラット、イヌまたはヒ ト新鮮初代培養肝細胞を使って実施することができます。 in vitro B-CLEAR®肝輸送テストの結果 → 肝胆汁排泄クリアランス、BEI % → 肝臓における取り込み → 胆汁酸塩輸送阻害(オプション) B-CLEAR® Hepatic Transport Kit では、再現性が高くばらつきの少 ないデータが得られ、ラットおよびヒトモデルのin vitro 胆汁排泄と 表12―Invitrogen™ in vitro B-CLEAR®サービスの典型的なテストデザイン in vivo 胆汁排泄との間に良好な相関が認められています(図16)。 → 肝トランスポーターを介した薬物相互作用の可能性を評価 パラメーター 方法 → 創薬の初期段階に胆汁うっ滞性化合物の候補を特定 マトリックス 接着型初代培養肝細胞 動物種 ヒト、ラット、イヌ 被験物質濃度 先行インキュベーション試験で最適化した 1 種類の濃度 タイムポイント 先行インキュベーション試験で最適化した 1 つの時点 反復試験 開発試験は 3 回の反復試験を実施 コントロール ポジティブコントロールはタウロコール酸。受動拡散を確 → 医薬品候補の絞り込み → 臨床的解釈の補強 特許取得済みの B-CLEAR®技術は唯一の胆汁排泄予測モデルであり、 肝トランスポーターを切り離さずに、系全体として評価することが できるため、同じ動物種のin vitro とin vivo との間に高い相関を示 します(図16) 。B-CLEAR®技術を用いると、肝トランスポーターを 認するため同時に 4℃でインキュベートした肝細胞。 LC-MS/MS または液体シンチレーション計測 分析 介する薬物相互作用の可能性について化合物を評価することがで き、複数の医薬品候補を評価している場合は、化合物を絞り込む一 できる唯一の系でもあります。 分析を成功させるには不可欠なものとして、弊社では B-CLEAR®試験 に必ず GIBCO®接着型新鮮肝細胞を使用しています。この細胞は、サ ンドイッチ培養系で広範かつ機能的な毛細胆管網を形成し、主要な 蓄積(pmol/mg) 助になります。B-CLEAR®技術は代謝産物の輸送を評価することが 取り込みおよび排出トランスポーターの発現と機能を維持しています。 B-CLEAR®サービス FAQ 濃度(μM) B-CLEAR® 肝輸送サービスを利用するにはどの時期が適していま すか。 図14―B-CLEAR®アッセイで測定された新鮮肝細胞サンドイッチ培養系の d8-タ ウロコール酸の濃度依存性の蓄積 B-CLEAR® 試験は、特許取得済みの肝細胞サンドイッチ培養技術を 使って、化合物の取り込み、排出、胆汁排泄クリアランス、薬物相互 B-CLEAR® は Qualyst,Inc. の登録商標です。Invitrogen は北米で B-CLEAR®製品およびサービスを提供する許可を受けています。Invitrogen は北米以外の お客様には B-CLEAR®技術をご提供することができません。 28 CellzDirect_J_6th.indd 28 10.6.18 10:51:20 AM B-CLEAR® Plus Buffer B-CLEAR® Minus Buffer 毛細胆管の密着結合の形成 毛細胆管の密着結合の破壊 肝細胞 被験化合物 毛細胆管 図15―B-CLEAR®技術では、肝細胞の密着結合を調節することによって化合物の 胆汁排泄クリアランスを予測します。(A)Plus Buffer(Ca2+含有)存在下では毛 細胆管の密着結合が維持されるため、被験化合物が肝細胞と毛細胆管に輸送され ます。 (B)Minus Buffer(Ca2+非含有)存在下では毛細胆管の密着結合が破壊され、 毛細胆管の中身が流出します。Plus Buffer条件と Minus Buffer条件との間の被験 化合物の濃度差は胆汁排泄クリアランスの量に相当します。 ヒト in vivo 胆汁排泄クリアランス (ml/min/kg) ラット in vivo 胆汁排泄クリアランス (ml/min/kg) ヒト in vitro 胆汁排泄クリアランス(ml/min/kg) ラット in vitro 胆汁排泄クリアランス(ml/min/kg) 図16―B-CLEAR®アッセイでは、in vitro 胆汁排泄クリアランスとin vitro 胆汁排泄 クリアランスとの間に良好な相関が得られます。(青)新鮮ラット初代培養肝細 胞を用いて B-CLEAR®法を行ったところin vitro とin vivo との間の R 二乗値は0.99 でした。 (緑)新鮮ヒト初代培養肝細胞を用いて同じ B-CLEAR®アッセイを行った 場合も、in vitro とin vivo との間に正の相関が得られました。 参考1―健康な初代培養肝細胞は機能的な毛細胆管網を形成します。(A)サンド イッチ培養したヒト初代培養肝細胞の位相差顕微鏡像(10×)。細胞周辺の明る い部分が毛細胆管網です。 (B)同じヒト初代培養肝細胞の蛍光像。機能している 毛細胆管網への5,(6)-カルボキシ -2',7'-ジクロロフルオレセイン(CDF)の蓄積が みられます。 29 CellzDirect_J_6th.indd 29 10.6.18 10:51:20 AM 創薬 Invitrogen in vitroトランスポーターサービス in vitro P-gp輸送サービス → 薬物間相互作用の予測および解明 → MDR1-MDCK細胞系モデルに関する豊富な経験 → 肝トランスポーターの基質の同定 → 開発および FDA申請に利用可能な品質のプロトコル → 胆汁排泄クリアランスおよび肝暴露の予測 排出トランスポーターである P糖タンパク質(P-pg)の広範な基質 Invitrogen は肝組織調達、細胞分離、ADMEサービスのトップ企業 特異性は薬物間相互作用の土台となり、このタンパク質の阻害また です。弊社は、今後のトランスポーター研究の方向性を示す世界を は誘導を引き起こして化合物の生体利用率および動態を変化させ リードする科学者をはじめ、ADME研究および肝生物学を専門とす る原因になります。このため、FDA は以下に示すように、化合物が る十数名の PhDレベルの科学者を擁しています。 P-pg の基質および阻害剤の候補となる可能性を評価することを推 奨しています。 弊社は、取り込み、排出、胆汁排泄を検討するための以下のさまざ まなトランスポーターサービスをご提供しています。 → 開発および FDA申請に利用できる品質の P糖タンパク質(P-gp) テスト → 排出トランスポーターを検討するためのトランスフェクトされ た反転膜小胞 → 肝−胆汁内動態を確認するための B-CLEAR®サービス 「トランスポーターによる相互作用に関する報告が増加している… 種々のトランスポーターのうち、P-gp は最も解明が進んでおり、 創薬段階の評価項目として適していると考えられる。」出典 Draft Guidance for Industry, Drug Interaction Studies―Study Design, Data Analysis, and Implications for Dosing and Labeling, FDA, 2006. → 適格性を評価済みの GIBCO®初代培養肝細胞を用いたトランス ポーターを介する取り込み → 細 胞 系 サ ー ビ ス:BCRP、OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、 OCT2、OAT1 および OAT3(2010年サービス開始) Invitrogen は、細胞培養の専門知識を活かし、極性を生じたコンフ ルエントなヒト MDR1トランスフェクト MDCK細胞の単層を用い て、2006年の FDAドラフトガイダンスに沿った双方向透過性アッ セイを実施することにより、P-gp を検討します。この方法では、頂 Invitrogen in vitro 輸送サービスの内容 端側(A)と基底側(B)のコンパートメントを分けるフィルターイ → 経験豊富なトランスポーター研究者による専門的なアドバイス ンサートに極性化した MDR1-MDCK細胞(コントロールとして野生 → 包括的かつ詳細なご提案 型 MDCK )を培養することによって、A→ B方向(能動的な取り込 → 進捗状況の定期的な報告 み)または B→ A方向(能動的な排出)の被験化合物の流れが検討で → カスタマイズされたプログラム きるようにします。個々の試験を実施して、トランスポーターの基 → 一括窓口 質および阻害剤候補となる可能性を評価し、透過性を計算します (図 17 ∼ 19、表13と表14)。 in vitro P-gp輸送試験の結果 → 被験物質の透過性 → P-gp輸送の基質および阻害剤候補 → 見かけの透過係数の測定(オプション) 30 CellzDirect_J_6th.indd 30 10.6.18 10:51:21 AM MDCK-MDR1細胞モデルには Caco-2細胞と比較して in vitro P-gpサービス FAQ 利点がありますか。 化合物が P-gp の基質であるかどうかはどのようにして 判定するのですか。 排出比 PB→ A / PA→ B の計算値が2を超えた場合に化合物が P-gp の基 質であると判断します。弊社の手法と排出比の計算の概要は2006 年の FDA の「Draft Guidance for Industry, Drug Interaction Studies ―Study Design, Data Analysis, and Implications for Dosing and Labeling」に沿っています。 あ り ま す。ヒ ト MDR1を ト ラ ン ス フ ェ ク ト し た Madin Darby Canine Kidney(MDCK)細胞は、他のヒト薬物トランスポーターに よる干渉が一切ないか、またはほとんどないことが保証されていま す。一方、Caco-2細胞は、P-pg のほか、複数のヒトトランスポーター を発現しているヒト上皮細胞系です。Caco-2細胞を用いて P-pg の 特異性を明確に示すのは、トランスポーター特異的な阻害剤を用い た場合でも厄介です。このほか、MDCK細胞は培養時間が短く、密 着結合を伴って迅速かつ明確に極性が生じます。 1 2 被験物質 [3H]-Digoxin 頂端側コンパートメント 頂端側コンパートメント MDR1 をトランスフェクト した MDCK 細胞 基底側コンパートメント 細孔フィルター MDR1 をトランスフェクト した MDCK 細胞 細孔フィルター 基底側コンパートメント 図17―P-gp の基質および阻害剤候補を判定する双方向試験。頂端側 (A)と基底側(B)のコンパートメントを分けるフィルターインサートに極性化した MDR1-MDCK細胞(コ ントロールとして野生型 MDCK)を培養することによって、A→ B方向(能動的な取り込み)または B→ A方向(能動的な排出)の被験化合物の流れが検討できるようにします。 排出比 略図1は LC-MS/MS分析による基質アッセイを示し、略図2は液体シンチレーション計測分析による阻害アッセイを示しています。 図18―A→ B方向および B→ A方向の見かけの透過性。3枚の24ウェル Transwell® 阻害剤濃度(nM) プ レ ー ト に MDR1-MDCK細 胞 を7日 間 培 養 し、14C-カ フ ェ イ ン(高 透 過 性 マ ー カー) 、14C-マンニトール(単層の完全性に関する試験)または3H-ジゴキシン(ポ ジティブコントロール基質)存在下で60分間インキュベートしました。頂端側か ら基底側(A→ B)と基底側から頂端側(B→ A)の双方向の見かけの透過性(Papp) 図19―P-gp の排出輸送の阻害。ヒト MDR1をトランスフェクトした MDCK細胞 を計算しました。 は P-gp輸送の阻害を示します。ベラパミル存在下の3H-ジゴキシンの排出比。 31 CellzDirect_J_6th.indd 31 10.6.18 10:51:21 AM 創薬 表13―基質候補を評価するための Invitrogen™ in vitro P-gp輸送サービスの典型 的なテストデザイン パラメーター 方法 マトリックス ヒト MDR1 をトランスフェクトした MDCK 細胞(Caco-2 細胞株はオプション) 被験物質濃度 開発試験の場合は通常 Cmax の 0.1 ×、1 ×、10 × の 3 種類の 濃度、スクリーニング試験の場合は 1 種類の濃度 時点 開発試験の場合はゼロ以外の 4 つの時点、スクリーニング in vitro transporter vesicle および membraneサービス → 排出トランスポーターの機序に関する試験を実施するための優 れたモデル 反転膜小胞輸送試験は、数種類の化合物を同時にスクリーニングし て、排出トランスポーターの基質および阻害剤候補を評価するた 試験の場合は 1 つの時点 めの効率的な方法です(図20)。Invitrogen の Vesicular Transport 反復試験 開発試験およびスクリーニング試験は 3 回の反復試験を実施 Assay(膜小胞輸送アッセイ)は、種々の動物種の主要な ABCトラ コントロール ポジティブコントロールには既知の阻害剤としてベラパミ ンスポーターを対象にしています(表15)。弊社の試験では、50% ル、既知の基質としてジゴキシンを使用し、ネガティブコ ントロールには野生型 MDCK 細胞を使用 分析 液体シンチレーション計測または LC-MS/MS 表14―阻害剤候補を評価するための Invitrogen™ in vitro P-gp輸送サービスの典 型的なテストデザイン パラメーター 方法 マトリックス ヒト MDR1 をトランスフェクトした MDCK 細胞(Caco-2 を超える阻害が観察された場合に IC50値を算出し、適宜 Km を測定 します(図21)。 transporter vesicle および membrane試験の結果 → 排出トランスポーターの基質および阻害剤候補を評価 → 適宜 IC50および Km を測定 細胞系はオプション) 開発試験の場合は Cmax の 0.1× から 10 × の間の 7 種類の 濃度、スクリーニング試験の場合は 2 種類の濃度 時点 30 分間のプレインキュベーション後に、60 分間のインキュ ベーション 反復試験 開発試験およびスクリーニング試験は 3 回の反復試験を実施 コントロール ポジティブコントロールには既知の阻害剤としてベラパミ タウロコール酸 取り込み(pmol/mg/min) 被験物質濃度 ル、既知の基質としてジゴキシンを使用し、ネガティブコ ントロールには野生型 MDCK 細胞を使用 分析 液体シンチレーション計測または LC-MS/MS シクロスポリン A(μ M) 図20―Vesicle Transport Assay(膜 小 胞 輸 送 ア ッ セ イ)で の BSEP排 出 の 阻 害。 BSEP依存性の3Hタウロコール酸輸送はシクロスポリン A によって阻害されます。 表15―反転膜小胞を用いる Invitrogen™ in vitro 膜小胞アッセイサービスの典型 パラメーター 方法 マトリックス BSEP、BCRP、MRP1、MRP2、MRP3、MRP4、MRP8 といっ た特定の ABC 輸送タンパク質をトランスフェクトした Sf9 細胞から調製した反転膜小胞 動物種 ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル 被験物質濃度 既知である場合は、臨床的に意義がある Cmax 値を挟む複数 取り込み(pmol/mg/min) 的なテストデザイン 基質の取り込み の濃度 反復試験 2 回の反復試験を実施 コントロール Mock をトランスフェクトした膜小胞と AMP コントロール 図21―Vesicle Transport Assay(膜小胞輸送アッセイ)による Km測定の代表例。 分析 蛍光検出、液体シンチレーション計測または LC-MS/MS BSEP依存性の3Hタウロコール酸輸送。 タウロコール酸(μ M) 32 CellzDirect_J_6th.indd 32 10.6.18 10:51:22 AM 発現遺伝子解析サービス トランスポーター細胞系分析サービス → Quantitative Nuclease Protection Assay(qNPA™)は選択した → 単独のトランスポーターをトランスフェクトした細胞系 遺伝子を同時に解析することが可能 → 主要な肝および腎トランスポーターを過剰発現したヒト細胞系 → お客様の研究目的に応じてカスタマイズ → 正確かつ有用な解釈を行うための独自のインフォマティクスソ フトウェア Invitrogen では、取り込みトランスポーター OATP1B1、OATP1B3、 OATP2B1、OCT2、OAT1または OAT3を過剰発現した個々の細胞系 を用いるトランスポーター細胞系分析のサービスを間もなく開始す 化合物がヒトの肝機能にどのような影響を及ぼすか研究する際に る予定です。このサービスによって、化合物が主要な取り込みトラ は、肝細胞を基盤とする Invitrogen の遺伝子発現サービスをご利用 ンスポーターに及ぼす影響を評価することができます。 ください。弊社は、チトクロム P450、第 II相代謝、内在性代謝、肝 トランスポーターをはじめとする毒性学的および薬理学的に重要な 14種類のターゲット遺伝子の mRNAレベルを同時にモニターして、 さまざまな濃度または時点で化合物が初代培養肝細胞の代謝、細胞 シグナリング、輸送、細胞へのストレスに、及ぼす影響を測定しま mRNA の相対量 す(図22) 。 図 22 ― qNPA™ 技術のマルチプレックスなアプローチにより、ヒト肝細胞の複 雑な遺伝子調節を測定できます。化学的用量反応曲線は、ケノデオキシコール 酸( CDCA )が ABCB11( BSEP )と UGT1A1 を 誘 導 し、SLCO1B1 と HMGCS2 の 発現量を減少させることを示しています。肝細胞は胆汁酸の濃度上昇を感知 すると、その濃度上昇に応じて自身の潜在的な排出能と抱合能を亢進させ、取 り込み能とコレステロール産生を低下させます。 33 CellzDirect_J_6th.indd 33 10.6.18 10:51:22 AM 創薬 薬物代謝と安全性を試験するための Invitrogen の製品とサービス → 代謝安定性に関する重要な情報を取得 → 薬物代謝酵素との重要な相互作用を発見 → リード化合物の安全性プロファイルを決定 新たな化学製剤および生物製剤候補の薬理学的、毒性学的、代謝的、薬物動態学的特性に関する情報を得ることは、 創薬および製剤開発の初期段階において重要です。弊社は、精製酵素、P450ミクロソーム、様々なアッセイ用ツール などのバリデーション済みツールやサービスを多数提供しており、リード化合物の代謝安定性、薬物代謝酵素との 相互作用、安全性プロファイルについて必要な情報を得るためのお手伝いをいたします。 34 CellzDirect_J_6th.indd 34 10.6.18 10:51:22 AM 薬物代謝酵素とアッセイ系 薬物代謝酵素(DME)は主に肝臓に局在する様々な酵素群です。薬 スクリーニングフォーマットに最適です。CP450 BACULOSOMES® 剤、環境汚染物質、ステロイドやプロスタグランジンなどの内因性 試薬を Vivid®ハイスループットアッセイ系に用いて得られたデータ 化合物などの広範な生体異物の代謝を担っています。薬物代謝酵素 は LC-UV系のデータとよく相関することが、YP3A4アイソザイムを およびその基質の構造 - 活性相関は、薬理学、毒性学、基礎酵素学に 用いた試験で示されています(図23)。 関係する重要な研究分野となっています。薬剤開発が臨床段階で失 敗する主な原因は薬物動態が悪いことであるため、創薬プロセスの 早い段階から代謝研究を取り入れようという試みが多くなされてい ます。Invitrogen は、このような取り組みを促進するために組換え -2 log IC50 for Vivid® assay 薬物代謝酵素およびアッセイ系を提供しています。これらを使用す れば、代謝プロファイルについて様々な化合物のスクリーニング行 なうことが可能です。 ハイスループットスクリーニング系に適した P450酵素 -3 -4 P450 BACULOSOMES®試薬は、ヒト P450アイソザイムの cDNA と これを補足するウサギ NADPH-P450還元酵素の遺伝子を導入した 組換えバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞から調製したミクロ BOMR 0.77 0.77 -5 一致性を示す直線 -6 -7 -8 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 log IC50 for LC-UV assay も優れています。その理由として、1種類の P450だけを発現するた 単一のアイソザイムを解析することが挙げられます。チトクロム R2 0.93 0.89 -9 P450 BACULOSOMES®試薬は、ヒト肝臓ミクロソーム(HLM)より め、他の P450(または別のクラスの DME)による代謝を回避して、 Substrate BOMCC BOMFC DBOMF 図23―BACULOSOMES®試薬を用いた CYP3A4の Vivid®アッセイと LC-UV系アッ セイとの高い相関性。4種類の異なる Vivid®基質を用いて12種類の既知の CYP3A4 阻害薬に対する IC50値を得たのち、CYP3A4 BACULOSOMES®試薬による伝統的な テストステロン6βヒドロキシル化 LC-UVアッセイを用いて得られた値と比較し ました。Vivid®アッセイは、LC-UVアッセイの結果を十分に予測することができま した。 ソームです。 大部分の化合物において、P450 BACULOSOMES®試薬で得られた代 謝および阻害プロファイルに基づく化合物の順位は、HLM で得られ た順位ときわめて類似しています。しかし、P450 BACULOSOMES® 試薬の大部分の基質に対する活性や代謝速度は、HLM で調製した場 合よりも顕著に高くなります。これは、P450 BACULOSOMES®試薬 を使用したアッセイでは、ダイナミックレンジが広く感度が高いた めです。大部分のプローブ基質との反応において酵素活性と再現性 が高いことから、P450 BACULOSOMES®試薬は、ハイスループット P450 BACULOSOMES® 試薬の詳細は www.invitrogen.com/baculosome をご覧ください。 35 CellzDirect_J_6th.indd 35 10.6.18 10:51:23 AM 創薬 新規リード化合物の選定を迅速化 A Vivid®CYP450 Screening Kit は、創 薬 プ ロ セ ス の 初 期 に P450-薬 R1 物相互作用について化合物を迅速にスクリーニングし、構造活性 R2 R1' R2' 相関(SAR)予測モデリング用のデータを得ることができます。 Vivid®CYP450 Screening Kit は、創薬における新規化合物の迅速な ブロックされた色素 遊離した色素 (蛍光なし) (強い蛍光) 選定に必要な高いパフォーマンス、スループット、信頼性を提供し ます。これらのアッセイ系の特徴は、以下のとおりです。 B ステップ 1 → 簡単かつ均質―3ステップの「mix-and-read」フォーマットで、 試験化合物を ウェルに添加 反応停止試薬が不要です ステップ2 P450、NADPH、 ステップ3 NADP+、Vivid® 再生システム を添加 基質を添加 蛍光シグナル 読み取り 阻害なし (強い蛍光) → 迅速かつ柔軟―キネティックモードとエンドポイントモードが ) あり、室温でも37℃でもアッセイ可能です → 高精度―シグナル - バックグラウンド比が高く、Z ’ -factor が優 れています 阻害あり (蛍光なし) → 小規模化可能―アッセイは、96、384、1536ウェルプレートの いずれを用いても実施できます Vivid® 基質はブロックされた色素であり、酸化的開裂が起こるまで ほとんど蛍光を発しません(図24A)。2つの開裂可能部位のどちら かで切断されると、強い蛍光を発する代謝産物が生じます。P450阻 図24―Vivid®スクリーニングアッセイ。A. Vivid®基質は、P450酵素活性により開 裂すると蛍光を発します。B. 簡単な3ステッププロトコルを用いて、P450活性阻 害能について試験化合物を試験します。試験化合物を P450と Vivid®基質を含有す る反応液に添加し、得られた蛍光の強さから P450活性阻害の程度がわかります。 害物質は、蛍光代謝産物の産生阻害能により同定することができま す。3ステップの Vivid®スクリーニングアッセイ(図24B)は、簡単 な「mix-and-read」プロトコルであり、キネティックモードでの反 応には反応停止試薬を必要としません。 Vivid®キ ッ ト と そ の 基 質 は、様 々 な P450ア イ ソ ザ イ ム に 対 応 し て い ま す(表16)。各 キ ッ ト に は、ア イ ソ ザ イ ム 特 異 的 な P450 BACULOSOMES®試薬、Vivid®基質、NADPH再生システムが含まれ ています。切断した Vivid® 基質の励起および蛍光波長は可視領域で あり、NADPH または大部分の試験化合物からの蛍光干渉はほとん どありません。 Vivid®キットとその基質の詳細は、www.invitrogen.com/vivid をご覧ください。 36 CellzDirect_J_6th.indd 36 10.6.18 10:51:23 AM 表16―お客さまのニーズにあった Vivid®基質をお選びください 構造 O O O O 基質名 分子量 アイソザイム 互換性 蛍光色 励起/蛍光 * (nm) Vivid® BOMR Substrate 333.3 CYP3A4 Red 530/585 O O O N Vivid® OOMR Substrate 355.4 Invitrogen の組換えヒト P450は、大腸菌 を 用 い て 作 製 さ れ て い ま す。各 P450は N O 精製チトクロム P450酵素と 関連製品による 柔軟な最適化 大腸菌で最適に発現できるようにその N CYP2C9 Red 530/585 末端が修飾されていますが、こうした修 飾が基質特異性に大きな影響を及ぼすこ Vivid® DBOMF Substrate O O O O O O 572.6 CYP3A4 CYP3A5 Green 485/530 素を使用する利点としては、ミクロソー O O O ムサンプルや組織サンプルに共通して O O CO2H O O O O CN O O O O CN O O CF3 452.5 CYP2C9 Green 485/530 見られる干渉活性がないことや、P450、 NADPH-P450還元酵素、チトクロム b5の Vivid® BOMCC Substrate 307.3 Vivid® EOMCC Substrate 245.2 350.3 成分比を特定のアプリケーション用に最 CYP3A4 CYP3A5 CYP2C9 CYP2B6 Blue CYP2D6 CYP1A2 CYP2C19 CYP2E1 Blue CYP3A4 CYP3A5 CYP2B6 Cyan 409/460 適化できることが挙げられます。P450還 元酵素は、電子を NADPH から様々なチト クロム P450アイソザイムへと移します。 409/460 Invitrogen のヒト NADPH-P450還元酵素 は、ヒト P450還元酵素の cDNA を含むバ キュロウイルスに感染した昆虫細胞から 400/502 作製されています。チトクロム b5は膜結 合ヘムタンパク質であり、一部の P450ア O O Vivid® BOMF Substrate Vivid® BOMFC Substrate O O とはありません。精製チトクロム P450酵 O CF3 O Vivid® MOBFC Substrate 350.3 CYP2D6 Cyan *最大励起および蛍光の概算値 400/502 イソフォームの触媒効率を向上させます。 Invitrogen のヒトチトクロム b5は、大腸 菌で過剰発現させ、精製したものです。 これら製品の詳細は www.invitrogen.com/drugmetabolism をご覧ください。 37 CellzDirect_J_6th.indd 37 10.6.18 10:51:23 AM 創薬 生細胞測定における CYP1A1誘導の モニタリング GeneBLAzer® CYP1A1-bla LS-180細胞系を用いれば、β-ラクタマー ゼレポーター遺伝子を介して CYP1A1誘導の測定が可能です(図 25)。β-ラクタマーゼ(bla )遺伝子を CYP1A1プロモーター下流に 挿入し、CYP1A1トランス活性化の測定に用いています。TCDD およ び3-メチルコラントレンなどのリガンドが細胞質のアリル炭化水素 受容体(AhR)に結合し、AhR-リガンド複合体は核へ移行し、ここで AhR核内輸送体(Arnt)とヘテロダイマーを形成します。次にこの 複合体は CYP1A1の生体異物応答配列(XRE)に結合し、CYP1A1発 現を亢進させます。さらに詳しく知りたい場合は、www.invitrogen. com/cyp1a1cells をご覧ください。 10 TCDD EC50 = 0.2 nM 9 3-methylcholanthrene EC50 = 0.3 µM 8 7 反応比 6 5 4 3 2 1 0 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 log[CYP1A1 誘導物質](M) 図25―CYP1A1-bla LS180アッセイにおける CYP1A1誘導物質の用量反応 細胞を様々な濃度の3-メチルコラントレンまたは2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-pジオキシン(TCDD)で16時間処理したのちβ-ラクタマーゼ活性を測定しました。 38 CellzDirect_J_6th.indd 38 10.6.18 10:51:23 AM 弊社の迅速かつ信頼性の 高い P450プロファイリング サービスなら ボトルネックを克服 Invitrogen の P450 Profiling Service では、リード化合物の阻害プロ ファイルを低コストかつタイムリーに決定することにより、創薬で 表17―CYP3A4の IC50値(μM) Testosterone 6β-OH Assay 化合物 Vivid® BOMCC Assay Vivid® DBOMF Assay ケトコナゾール 0.04 0.1 0.02 ミフェプリストン 0.5 1.2 3 ニフェジピン 3 0.7 0.3 オメプラゾール 20 20 30 キニジン 11 20 30 サキナビル 2 2 3 スルファフェナゾール 500 テストステロン K m = 30 ベラパミル 1.0 200 400 activation 45 3 9 直面するボトルネックを克服します。弊社のサービスでは以下を実 120 → データを2週間以内で提供 100 → アッセイおよびデータ解析の厳格な品質管理 → 競争力のある価格、信頼性、開かれたビジネスモデル P450 Profiling Ser vice は、 定 評 の あ る 弊 社 の P450 BACULOSOMES®試薬および精度の高い Vivid®アッセイ系を使用し ます。試験化合物の P450酵素群(1A2、2C9、2C19、2D6、3A4)に 対する化合物の阻害プロファイルを迅速に得ることができます。ま 制御活性(%) 現します。 80 60 40 20 0 –20 -4 -3 -2 -1 0 1 た、IC50の測定は、試験化合物の10点滴定法により、2回反復して行 Isozyme/ substrate pair IC50 (µM) Literature values (µM) います。 1A2 EOMCC 2C9 BOMF 65 3.2 22–49 8–42 2C19 EOMCC 2D6 EOMCC 3A4 BOMCC 5.1 7.6 0.13 4–27 NA 0.02–0.3 3A4DBOMF 0.016 0.02–0.3 厳密なバリデーションプロセスにより、最高品質のデータを得るこ 2 3 log[ケトコナゾール](μM) とが可能です。各データポイントで対照ウェルも測定し、自家蛍光 をもつ化合物による干渉を検出します。厳密な品質管理プロトコル により、仕様に適合しない結果があれば、自動的にアッセイがくり 返し行われます。各 P450酵素の IC50値は、プレートごとに標準阻害 物質と比較して決定されるため、データの妥当性が実証されます。 図4は、サ ン プ ル 阻 害 物 質 で あ る ケ ト コ ナ ゾ ー ル が P450酵 素 群 を阻害する様子を示すデータです。表16は、CYP3A4に対する数 個 の リ ガ ン ド の 力 価 の 順 位 を 示 し て い ま す。Invitrogen が P450 BACULOSOMES®試薬を用いて実施した Vivid®アッセイとテストス テロン6β-ヒドロキシル化アッセイとの間に優れた相関が認められ ることがこの表から示されます。 39 CellzDirect_J_6th.indd 39 10.6.18 10:51:24 AM ライフテクノロジーズジャパン株式会社 販売店 本社 〒104-0032 東京都中央区八丁堀 4-5-4 ■ ■ ■ ■ ■ コールセンター ― テクニカルサービス ― カスタマーサービス ― カスタムプライマーについて ― 営業部 ― 0120-650591 (携帯からでもご利用いただけます) TEL : 03-5730-6511 FAX : 03-5566-6502 TEL : 03-5730-6509 FAX : 03-5730-6519 TEL : 03-5753-3003 FAX : 03-5753-3004 TEL : 03-5730-6502 FAX : 03-5730-6518 大阪営業所 〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28 TEL : 06-6339-8165 FAX : 06-6339-8138 研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。記載の社名および製品名は弊社または 各社の商標または登録商標です。 © Copyright 2010, Life Technologies Japan Ltd. All rights reserved. CellzDirect_J_6th.indd 40 このパンフレットの専用番号は 2010-27-CC です。 100618B 10.6.18 10:51:24 AM
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