4th JBF Symposium, DG‐3 DGオープンディスカッション: DGオ プンディスカッション: トピック3 (Ligand binding assay) ック ( g g y) 宮 和弘1，中村 隆広2，細木 淳3， 上田 哲也4，清水 浩之5，相馬 雅子6，田頭 瑞加7 ((中外製薬1，新日本科学2，協和発酵キリン3，三菱化学メディ エンス4，東レリサーチセンター5，第一三共6，旭化成ファーマ7) 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 1 4th JBF Symposium, DG‐3 要旨 現在，種々の疾患に対して抗体医薬をはじめとするバイオ医薬品 在 疾患 抗体 薬 バ 薬 が開発されており，それらの薬物濃度測定にはもっぱらLigand binding assay (LBA) が使用されている また 薬効や安全性の指 binding assay (LBA) が使用されている。また，薬効や安全性の指 標となる各種バイオマーカー測定でもLBAが使用されることが多 い。現在，LBAによるバイオアナリシス分析法バリデーションガイド ラインの作成が進んでいるが，ガイドラインの作成に当たっては， 薬事上の要求水準及び海外ガイドラインとの整合性を確保すると とも ともに，国内の現状を反映するものでなければならないと考えられ 内 状を 映するも な ればならな と考 られ る。そして，そのためにはLBAによるバイオアナリシスの標準的手 法を調査し 必要最低限の部分については議論をまとめて定型化 法を調査し，必要最低限の部分については議論をまとめて定型化 に資する国内学会又は業界団体等の存在が必要である。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 2 4th JBF Symposium, DG‐3 要旨（つづき） さらに，LBAにおいても日々新しい分析装置・ケミストリーが利用可 さらに にお も 新し 分析装置 ケ トリ が利用可 能となっているが，個々の研究者や一企業でそれら全ての評価を おこなうのはハードルが高い おこなうのはハ ドルが高い。以上の観点から，LBAのバイオアナ 以上の観点から LBAのバイオアナ リシスについて個々の企業の壁を越えて科学的な議論を行う場が 待ち望まれていた。 これまで，LBAによるバイオアナリシスに関して会社の垣根を越え て情報共有・議論する場はほとんどなかったが，2013年からJBFで ディスカッショングループが設けられ，LBAを一つのトピックとして活 動を継続している。本トピックでは，LBAを実施している各社の考え 方 LBA実施方法の共通点 相違点を挙げることを当面の目標とし 方・LBA実施方法の共通点・相違点を挙げることを当面の目標とし てLBAに関するアンケートを実施した。本発表ではこのアンケート の概要を紹介し LBAによる測定の標準的手法のありかたや信頼 の概要を紹介し，LBAによる測定の標準的手法のありかたや信頼 性確保について議論の一助としたい。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 3 4th JBF Symposium, DG‐3 DG 3の経過 DG‐3の経過 • 2012年12月： 年 DG開始のアナウンス 始 ウ • 2012年12月： HTサポーターからLBAの専門性を HTサポ タ からLBAの専門性を 有する方にDGへの参加依頼。 • 2013年1月： 年 月 7名で開始。LBAの実態調査のため 名で開始 の実態調査のため アンケートを計画し，作成を始めた。 • 2013年3月： アンケート発出 • 2013年5月： 2013年5月 アンケート集計開始 アンケ ト集計開始 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 4 4th JBF Symposium, DG‐3 アンケートの項目 1. 2 2. 3. 4 4. 5. 6 6. 7. 8 8. 本アンケートは合計87項目の質問に回答を頂いた。全項目をおお 本 ケ トは合計 項目 質問に回答を頂 た 全項目をおお まかに分類すると以下のようになる。本ポスターではそのうち8項 目について発表します。 目について発表します Background LBA全般 Regression方法 多重測定のCVの取り扱い Matrixのとりあつかい 測定方法の軽微な変更のとりあつかい 内因性物質測定のQC調製 標準品のロット変更の取り扱い 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 5 4th JBF Symposium, DG‐3 アンケートの項目 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. QC濃度，繰り返し回数，Total 濃度 繰り返し回数 error パラレリズム ADAの感度算出の必要性 感度算 性 カットポイント算出方法 ADAの段階的アプローチについて ADAのガイドラインの必要性 ADAのポジコンの取り扱い 標識試薬のロット変更，安定性等 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 6 4th JBF Symposium, DG‐3 本日の内容 1. 2 2. 3. 4. 5 5. 6. 7. 8 8. Background 標準品のロット変更の取り扱い QC濃度，繰り返し回数，Total error パラレリズム 重要試薬のロット変更 重要試薬の安定性等 免疫原性測定の段階的アプローチ Regression方法 多重測定の取り扱い Regression方法，多重測定の取り扱い 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 7 4th JBF Symposium, DG‐3 1. BACKGROUND 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 8 4th JBF Symposium, DG‐3 1 Background 1. Background • 方法 – アンケート作成 • DGメンバーで以下の項目を含むアンケートを作成し，JBFサ 員 ポーター，GBC HTメンバー及びJBF運営委員に回答依頼した。 • アンケートには，LBAによるバイオアナリシスを実施するうえ で疑問を持ったり調査したいと感じている事項，EMAガイド ラインやwhite paperの記載と国内の実施状況があっている か調査したい事項を含めた。 • アンケート項目はPK/TK測定だけではなく，LBAを使用する免 疫原性測定やバイオマーカー測定も含めた 疫原性測定やバイオマーカー測定も含めた。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 9 4th JBF Symposium, DG‐3 1 Background 1. Background – 集計 • 回答は電子メールで受け付け，電子ファイルのファイル名を コード化し，回答者が特定できない形式でDGメンバーに再 配信した。 信 。 • DGメンバーが分担して回答を集計した。ファイル名のコード 化を担当者はファイルの本文は閲覧せず 集計にも関与し 化を担当者はファイルの本文は閲覧せず，集計にも関与し ないこととした。 • なお なお，複数回答を許容しているので，集計結果の合計が回 複数回答を許容しているので 集計結果の合計が回 答数を超えるものもある。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 10 4th JBF Symposium, DG‐3 1 Background 1. Background • 回答の概要 – 2013年4月1日から5月12日までに27件の回答を頂いた。 年 月 ら 月 ま 件 回答を頂 た。 – 回答者の所属では国内製薬会社が半数を占めた。また1/3が 受託測定会社であった。 受託測定会社であった – 回答者の担当範囲では，非臨床測定と臨床測定がほぼ半々 であ た また LBAの実測定担当者と外部委託担当の割合も であった。また，LBAの実測定担当者と外部委託担当の割合も ほぼ半々であった。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 11 4th JBF Symposium, DG‐3 1 Background 1. Background 担当範囲 所属 外資製薬会社 その他 / 1/27 2/27 LBAの経験 その他 1/39 その他 2/34 CRO 9/27 15/27 18/39 臨床測定 外部委託担当 20/39 非臨床測定 14/34 18/34 施設内で実施 国内製薬会社 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 12 4th JBF Symposium, DG‐3 2.標準品のロット変更の取り扱い 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 13 4th JBF Symposium, DG‐3 2 標準品のロット変更の取り扱い 2. 背景 医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法（リガンド結 合法）のバリデーションに関するガイドライン JBF 案において標 準物質（標準品）の項には、 ・「定量分析に使用される標準物質は，ロット内及びロット間の 均質性が保証されたものでなければならない．」 ・「定量分析に使用される標準物質は，TK 試験の被験物質又 「定量分析に使用される標準物質は TK 試験の被験物質又 は臨床試験の治験薬と同等でなければならない．」 と解説され、本アンケートでは現時点での各社の実施状況を調 と解説され 本アンケ トでは現時点での各社の実施状況を調 査した。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 14 4th JBF Symposium, DG‐3 2 標準品のロット変更の取り扱い 2. 結果 ・アンケート結果では「ロット間差はない」という考えと「ロット間差 を確認する と う回答が ぼ半 を確認する」という回答がほぼ半々であった。 あ た ・また、それに伴い、投与する薬物（標準品）のロットと定量用の 標準品の 標準品のロットを揃えるという回答と「特に気にしない」という回答 トを揃えるという回答と「特に気にしない という回答 もほぼ半々であった。 なお、それぞれの試験により対応がケースバイケースということ なお それぞれの試験により対応がケ スバイケ スということ が多かった。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 15 4th JBF Symposium, DG‐3 2 標準品のロット変更の取り扱い 2.標準品のロット変更の取り扱い ロット間差を確認 ト間差を確認 しますか？ 確認する 11/20 2 Aug 2013 投与する薬物と定量 用標準品のロットは同 じにしていますか？ 9/20 / ロット間差はない 特 気 特に気にしない な 13/25 12/25 ロットを揃える 16 http://bioanalysisforum.jp/ 16 4th JBF Symposium, DG‐3 3. QC濃度，繰り返し回数，Total error 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 17 4th JBF Symposium, DG‐3 3 QC濃度 繰り返し回数 Total error 3. QC濃度，繰り返し回数，Total error • 3.1 QC濃度，繰り返し回数 濃度 繰 数 – 背景 • EMAガイドラインのLBAにおいては，Low，Middle，High QC の具体的な濃度設定の記載がなく（ただし，LowはLLOQの3 倍未満との記載あり），測定内の繰り返し数の記載もない。 そこで，QCの濃度設定，繰り返し数について調査した。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 18 4th JBF Symposium, DG‐3 3 QC濃度 繰り返し回数 Total error 3. QC濃度，繰り返し回数，Total error • 3.1 QC濃度，繰り返し回数 濃度 繰り返 回数 – QC濃度の結果 Low QCと LLOQの High QCの 2倍未満 幾何平均 その他 1/27 2/27 15/27 LLOQの 3倍付近 1/24 9/27 Low QC 2 Aug 2013 2/24 ULOQの その他 ULOQの ½程度 80%程度 1/24 2/24 2/24 その他 19/24 21/24 LLOQの 2倍付近 Middle QC LLOQと ULOQの 幾何平均 http://bioanalysisforum.jp/ ULOQの 75%程度 High QC 19 4th JBF Symposium, DG‐3 3 QC濃度 繰り返し回数 Total error 3. QC濃度，繰り返し回数，Total error • 3.1 QC濃度，繰り返し回数 3 1 QC濃度 繰り返し回数 – 繰り返し数の結果 n=6 3/13 n=5 n=3 6/13 バッチ数 バ 数 n=6 7/13 バッチ数 バ 数 n=3 6/13 4/13 測定内 測定間 一部，海外施設では分散分析を用いる場合もある。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 20 4th JBF Symposium, DG‐3 3 QC濃度 繰り返し回数 Total error 3. QC濃度，繰り返し回数，Total error • 3.2 Total error – 背景 • EMAガイドラインのLBAにおいては，真度及び精度の評価に 加えて，total errorも評価すべきと記載されている。一方， LC‐MS/MSにおいては，total errorに関する記載はない。一 般的にLBAでは，LC‐MS/MSと比較してばらつきの程度が大 きいため のような記載があるのかもしれない そ で きいため，このような記載があるのかもしれない。そこで， total errorの使用の有無を調査するとともに，その必要性の 有無を考え方とあわせて調査した。 有無を考え方とあわせて調査した 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 21 4th JBF Symposium, DG‐3 3 QC濃度 繰り返し回数 Total error 3. QC濃度，繰り返し回数，Total error • 3.2 Total 3 2 T t l error – 結果 使わない 14/23 Total errorを 使うか使わないか 使う 考えない 9/23 14/20 考える 6/20 Total errorを 必要と考えるか 考えないか 必要性はないと考えているにも関わらず， 使っている傾向も読み取れる。 やはり，EMAガイドラインの影響は大きいと推測される。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 22 4th JBF Symposium, DG‐3 4.パラレリズム（平行性） 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 23 4th JBF Symposium, DG‐3 4 パラレリズム（平行性） 4.パラレリズム（平行性） − 背景 • 「 EMA Guideline（2011） 」には 7.1.1.10. Parallelism の記載が 7 1 1 10 Parallelism の記載が ある。しかし、｢ 医薬品開発における生体試料中薬物濃度分 析法（リガンド結合法）のバリデーションに関するガイドライン JBF 案及び解説（2013.06.10 版）｣ においては妥当性の評価 項目にはなっていない。現時点では、ガイドラインに記載する かの結論が得られな ため 本 かの結論が得られないため、本アンケートで基本的な考え方 ケ ト 基本的な考え方 と実施状況を調査した。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 24 4th JBF Symposium, DG‐3 4 パラレリズム（平行性） 4.パラレリズム（平行性） パラレリズムを実施していますか パラレリズムを実施していますか？ − 結果 実施している その他 • 約20％（5/23）がパラレリ ズムを ｢実施している｣ 実施している｣ も しくは ｢実試料で希釈直線 性に問題があった場合に 確認している｣ と回答して いる。 4/23 3/23 2/23 14/23 実試料で希釈 直線性に問題 があった場合 に確認している 実施していない 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 25 4th JBF Symposium, DG‐3 4 パラレリズム（平行性） 4.パラレリズム（平行性） − 結果 • パラレリズムの評価の必要性について は約40％（7/18）が必要であると回答し ている。具体的な実施ケース ｢希釈直 線性やADA産生に懸念がある場合｣ 線 産 あ 場 ｣を あげる回答がある一方、 ｢EMA Guideline に記載されているから実施す る という回答もあった。 る｣ という回答もあ た • 実施の必要性なしとする理由としては、 ｢希釈直線性 選択性および ISR が十分 ｢希釈直線性、選択性および に確認されていれば問題にならないと 思われる｣ との回答があげられた。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ パラレリズムの評価は必 要と考えていますか？ Yes 7/18 N No 11/18 26 4th JBF Symposium, DG‐3 5.重要試薬のロット変更 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 27 4th JBF Symposium, DG‐3 5 重要試薬のロット変更 5.重要試薬のロット変更 – 背景 • 重要試薬はその品質により分析結果に直接影響すると考 えられる試薬 ある えられる試薬である。LBAでは，測定対象物質を直接認識し は 測定対象物質を直接認識 て結合するものが重要試薬であり、特に抗体類（抗体の標 識体含む）が該当する。 識体含む）が該当する • 常に同一のものを使用できることが望ましいが，長期にわ たって使用していくうちに 使用期限切れや枯渇によりロット たって使用していくうちに，使用期限切れや枯渇によりロット 変更が余儀なくされる。その際に必要な対応について調査 した。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 28 4th JBF Symposium, DG‐3 5 重要試薬のロット変更 5.重要試薬のロット変更 – 結果 標識試薬ロット変更時の対応 • 標識試薬のロット変更あるいは再 製造した場合には ほとんどの施 製造した場合には，ほとんどの施 設で検量線・QCを確認しており，そ れに加えて1/3程度の施設では選 択性も確認していた。 • 選択性を確認する必要があるのは 標識前の抗体が異なる場合との 回答もあった。 • 検量線・QCに加えてHook効果を見 る、新旧抗体での反応性を直接比 較（吸光度など）するとの回答もあ った。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 1.検量線・QC＋ 選択性の確認 6/21 2.検量線・ 検量線 QCの確認 3/21 12/21 3.その他 ・もとの抗体が同じ場合は2.，もとの抗体も 異なる場合は1.＋α ・新旧抗体での反応性を直接比較（吸光度 等）し 同程度であることを確認 等）し、同程度であることを確認 ・切り替えの経験なし 29 4th JBF Symposium, DG‐3 6.重要試薬の安定性 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 30 4th JBF Symposium, DG‐3 6 重要試薬の安定性 6.重要試薬の安定性 • 5 標識試薬のロット変更 標識試薬 変 – 背景 • 重要試薬はその品質により分析結果に直接影響すると考 えられる試薬である。LBAでは、測定対象物質を直接認識し て結合するものが重要試薬であり、特に抗体類（抗体の標 識体含む）が該当する。 • 重要試薬の品質や安定性の評価に一般的な方法がないた め れらの評価方法などに いて調査した め，これらの評価方法などについて調査した。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 31 4th JBF Symposium, DG‐3 6 重要試薬の安定性 6.重要試薬の安定性 – 結果 • 重要試薬の安定性の評価は、検量線やQC試料が評価基準 内であることで評価しているところが多く 使用期限を設定し 内であることで評価しているところが多く、使用期限を設定し て、定期的に真度精度等を調べているところもある。 その他 使用期限を設定し，CMC 的な品質評価を行う。 使用期限を設定し，定期的 使用期限を設定し 定期的 に真度精度等を確認する。 2 Aug 2013 2/24 1/24 5/24 16/24 http://bioanalysisforum.jp/ 使用期限は設定しない。 測定が評価基準に入って いれば使用可能 いれば使用可能。 32 4th JBF Symposium, DG‐3 6 重要試薬の安定性 6.重要試薬の安定性 – 結果 • 使用期限が切れたものは使用しないところが多いが、使用 期限が切れても検量線やQC試料が評価基準内であれば、 期限が切れても検量線やQC試料が評価基準内であれば 継続して使用しているところもある。 その他 2/22 使用期限の切れた ものでも使用する。 5/22 15/22 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 使用期限の切れた ものは使用しない。 33 4th JBF Symposium, DG‐3 6 重要試薬の安定性 6.重要試薬の安定性 – 結果： 重要試薬の使用期限が切れた場合の対応 【継続使用】 ・測定値への影響の程度を確認の上、継続使用とする。 測定値への影響の程度を確認の上 継続使用とする ・検量線・QCを確認し、定量系として使用可能かどうかを確認する。 ・レスポンスを確認し、必要に応じて希釈倍率を変更する。 【場合により、継続使用】 ・使用期限切れでも、測定が評価基準に入っていれば継続使用可能とする。 ・使用期限の切れたものは使用しない。ただし 使用期限の切れたものは使用しない。ただし、必要に応じて測定等を実施し、 必要に応じて測定等を実施し 使用期限を延長する場合もある。 ・試薬のLot間差、入手困難性によっては、期限が切れても使用する場合もある。 【継続使用しない/再購入】 ・使用期限が切れたものは使用しない。 ・新たなに購入し，検量線・QCの確認を行う。 ・できるだけ同じLotを購入する。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 34 4th JBF Symposium, DG‐3 6 重要試薬の安定性 6.重要試薬の安定性 – 結果 • 重要試薬のCOAを作成しているところがあるが、半数以上の 施設 施設でCOAは作成しないが何らかの資料を作成している。 作成 な 何 資料を作成 る。 COAの項目には濃度は必ず入っているが、これ以外の項目 には違いがみられた。 COAを作成している。 その他 4/21 今後は必要と思う（1 件）。 作成していない（3件） 5/21 12/21 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ COAは無いが，何ら かの資料を作成する。 35 4th JBF Symposium, DG‐3 6 重要試薬の安定性 6.重要試薬の安定性 – 結果 • 重要試薬のリテストについては、意見に差がみられた。 ・数ヶ月 数 月 ・半年，１年，以降年１回 ・半年～1年 半年 年 ・１年 ・3年 年 ・１年程度が感覚的に望ましい ・実施していないが実施するなら１年程度 ・測定が評価基準に入っていればOK ・実施なし 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 36 4th JBF Symposium, DG‐3 7. ADA（抗薬物抗体）評価の 段階的アプローチ 階的 プ 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 37 4th JBF Symposium, DG‐3 7 ADA評価の段階的アプローチ 7. ADA評価の段階的アプローチ – 背景 • バイオ医薬品では バイオ医薬品では、しばしば抗薬物抗体（Anti‐Drug しばしば抗薬物抗体（Anti Drug Antibody: ADA）産生が認められ、各極の規制当局からも評 価するよう求められて る。抗薬物抗体の評価では 価するよう求められている。抗薬物抗体の評価ではTiter（抗 （抗 体価）の算出や中和活性の確認、Isotypingなど段階的アプ ローチが取られるが、医薬品開発の各段階において、どの 分析法を用意、組み合わせて評価すべきなのか標準的な 基準はない。本アンケートでは抗薬物抗体測定に関して分 析法の開発時期や種類について基本的な考え方を調査し た。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 38 4th JBF Symposium, DG‐3 7 ADA評価の段階的アプローチ 7. ADA評価の段階的アプローチ • 7.1 中和抗体分析法 中和抗体分析法 – 結果 • 開発時期: 「開発段階に応じて用意」という回答が約半数（ 8/18）であり、開発ステージに応じて分析法を準備している 傾向がみられた 「適応疾患に応じて用意」（2/18） 「常に 傾向がみられた。「適応疾患に応じて用意」（2/18）、「常に 用意」（3/18）は少数で、分析法を用意しないとの回答も約 25% （5/18）あった。 • 分析法フォーマット: 「培養細胞を用いた分析法」 （11/13）を 用いた経験があるとの回答が大半であった。一方、「vivoを 用いた分析法」を構築した経験があるという回答は無かった （0/13） 。 非臨床では用意しない、との回答もあった。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 39 4th JBF Symposium, DG‐3 7 ADA評価の段階的アプローチ 7. ADA評価の段階的アプローチ • 7.2 Titerの算出、 算 Isotyping & IgE測定系 定系 – 結果 • TiTer…「通常算出する」、「プロトコルにより算出する」という 回答が全体の約90%（17/19）を占め、評価されている場合 場 が多いことが伺えた。 • Isotyping & IgE測定系…いずれについても「分析法を用意し ない」という回答が大半であった。「適応疾患に応じて用意 する」「開発段階に応じて用意する」という回答が10-25%見 られたが 「常に分析法を用意する」という回答は無かった られたが、「常に分析法を用意する」という回答は無かった。 いずれの項目も非臨床では用意しない、との回答もあった。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 40 4th JBF Symposium, DG‐3 7 ADA評価の段階的アプローチ 7. ADA評価の段階的アプローチ 中和抗体分析法 Isotyping 常に用意 用意しない 適応疾患に応じて 5/18 8/18 開発ステージに 応じて 2 Aug 2013 適応疾患に応じて 適応疾患に応じて 2/17 3/18 2/18 IgE分析法 11/17 3/17 4/17 10/17 用意しない 用意しない 開発ステージに 応じて http://bioanalysisforum.jp/ 4/17 開発ステージに 応じて 41 4th JBF Symposium, DG‐3 8. REGRESSION方法，多重測定の解析 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 42 4th JBF Symposium, DG‐3 8 Regression方法 多重測定の解析 8. Regression方法，多重測定の解析 • 8.1 Regression方法 方法 – 背景 • LBAは濃度とinstrument responseの関係が非線形なので， regression手法が検量線のcurve fitや再現性に影響すると g 考えられる。よってregressionの方法を調査した。またアルゴ リズムがソフトウエアによって異なるので，使用ソフトについ ても調査した。 ても調査した 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 43 4th JBF Symposium, DG‐3 8 Regression方法 多重測定の解析 8. Regression方法，多重測定の解析 • 8.1 Regression方法 方法 – 結果 • Regression formulaは4パラメーターを選択するという回答が 3/4以上を占めた。その他としては5‐パラメーター，ログロジ ステック，直線回帰という回答があった。 が • 検量線のfittingをするソフトウエアについては，使用するも のを固定している。 のを固定している • ソフトウエアについては半数以上が何らかの形でSoftMaxを 使用していた R 使用していた。RegressionにLIMSを使用するという回答も数 i にLIMSを使用するという回答も数 件あった。また，各機器の付属のソフトでデータ取得後， Softmaxでregressionをおこなうという回答も数件あった。ECL を使用する場合はDiscovery workbenchを使用している。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 44 4th JBF Symposium, DG‐3 8 Regression方法 多重測定の解析 8. Regression方法，多重測定の解析 • 8.2 多重測定の解析 多重 定 解析 – 背景 • 一般的に，LBAではLC‐MS/MS等の機器分析と比較してばら つきの程度が大きいとされている。そのため測定結果の正 確性を確保するためにプレート上の2ウェル以上を使用して 1試料の分析を実施することが多い。通常，1試料のウェル 間のばら きが大きい場合には その試料の分析結果を不 間のばらつきが大きい場合には，その試料の分析結果を不 採用として再測定を行う。現状ではLBAにおける複数ウェル のばらつきの採用基準は各社のSOP等で規定しており 標 のばらつきの採用基準は各社のSOP等で規定しており，標 準的な基準は無い。したがって， 1試料の多重測定におけ る採用基準の考え方を調査した。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 45 4th JBF Symposium, DG‐3 8 Regression方法 多重測定の解析 8. Regression方法，多重測定の解析 • 8 8.2 多重測定の解析 2 多重測定の解析 – 結果 • 全ての回答で「多重測定時の採用基準を設定する」としており，「設定しない」と 回答 多 測定時 採用 準を設定す 」 り， 設定 」 いう回答は無かった。 • 基準としては，「CV<20%」とする回答が半数以上を占めた。 「CV<15%，25%， 30%」という回答もみられた。 」 う回答も 。 • それ以外に，以下の基準を用いているという回答もあった。 – （|A－B| / mean*100）<30% ，(A‐Mean)/Mean <30% or 20% • 測定範囲の上限・下限付近ではより大きいばらつきを許容するという回答があ った。 • 多重測定は2ウェルを使用することが多いが，2値でCVを算出することについて は「数学的にはSD値が意味をなさないが バラツキの目安としては有用」とする は「数学的にはSD値が意味をなさないが，バラツキの目安としては有用」とする 回答が多数であった。 • サンプル量が限られている場合は多重測定をしない (single assay)，また，バラツ キが大きい場合やキットで指定されている場合には3重測定 (triplicate) を実施 (t i li t ) を実施 するという回答もあった。 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 46 4th JBF Symposium, DG‐3 8 Regression方法 多重測定の解析 8. Regression方法，多重測定の解析 検量線式 多重測定の解析 その他 その他 6/27 12/28 16/28 21/27 CV<20% 2 Aug 2013 http://bioanalysisforum.jp/ 4-パラメーター 47
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