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エス・クロン(S-Clone) クローニングメデューム CM-B

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** 2016 年 7 月改訂
* 2012 年 4 月改訂
生体外用研究試薬
○ 使用例
1. HATセレクション
ミエローマ細胞1に対し、脾細胞5の割合で融合した場合の
HATセレクション、クローニング用無血清培地
エス・クロン(S-Clone)
クローニングメデューム CM-B
一例を示す。
1)
本培地にHAまたはHATを加える。
HATセレクション用培地として用いるときは、ヒポキサンチン、
アミノプテリンを下記の濃度で加える。
ヒポキサンチン100μmol/L(13.6mg/L)
〔開発の経緯及び特徴〕
アミノプテリン0.4μmol/L(0.176mg/L)
エス・クロン(S‐Clone)クローニングメデュームCM‐Bは、マウス
本培地には、チミジンがあらかじめ加えられているので、更
に加える必要はないが、市販のHAT濃縮液を規定量加えて
ハイブリドーマのHATセレクション、クローニング用として開発された
も性能に差はない。
画期的な高性能の専用培地である。
2)
1. FBS(ウシ胎児血清)を全く使用しないHATセレクションとクロ
ーニングを可 能 にした。しかも、抗 体 産 生 ハイブリドーマの
になるよう本培地に懸濁させる。
3)
4)
まき込み後、1週間位は1~3日毎に培地交換を行う。
その後は可視コロニーが現れるまで、3~7日毎に培地の
2. これまで黙視されていた抗体非産生ハイブリドーマの増殖を
追加または交換を行なう。
優先的に支持するという、FBSの負の影響がないために、増殖
の弱い抗体産生ハイブリドーマの淘汰、消滅を激減させること
2)で調整した細胞浮遊液を培養プレートにまき込む。
96ウェルマイクロプレートの場合:0.05~0.1mL/ウェル
出 現 率 、増 殖 性 能 とも従 来 法 (RPMI1640+FBS)を上 回 る。
(主要文献)
融合後の細胞を、脾細胞換算1×10 6 Cells/mLの細胞密度
(培地交換は半分を吸引除去し、その分を追加してもよい。)
5)
可視コロニーを確認後、抗体スクリーニングを行う。
となり、目的のハイブリドーマに遭遇する確率が飛躍的に高く
なった。
3. 増殖性の弱いハイブリドーマに対しても強力にコロニー形成を
促す。
4. 従来法よりも低密度でHATセレクションが可能である。
(1×10 5 ~2×10 4 Cells/ウェル:96ウェルマイクロプレート
使用時)
5. フィーダーセル(支持細胞)を用いずにクローニングが可能で
ある。
6. 目的のハイブリドーマがこれまでより短期間に入手できるので、
時間や経費を大幅に節約することができる。
* 〔本質〕
1. 基礎培地
2.
クローニング
1) 抗体陽性ウェルのハイブリドーマを本培地で100Cells/mL、
10Cells/mL、5Cells/mLの3段階の密度に調整する。
2) 96ウェルマイクロプレートを横方向に使用し、1)で調整した
各密度の細胞浮遊液をウェルに0.1mLずつ加えていく。
(図参照)
イ 上から1段、2段の計24ウェルを、10Cells/0.1mL/ウェル
の条件
ロ 上から3 段、4 段、5 段の計36ウェルを、1Cells/0.1mL/
ウェルの条件
ハ 上から6 段、7 段、8 段の計36ウェルを0.5Cells/
0.1mL/ウェルの条件でまき込む。
3) 可視コロニーが確認された後、直ちにスクリーニングを行う。
(注:クローニングでは、培地の追加、交換は行わないこと。
わずかに改変したRPMI1640、ダルベッコMEM、ハムF-12の
また、コロニーの細胞数が少ない場合も、スクリーニングを行
混合成分からなる液体培地。
うこと。)
2. 添加剤
ホルモン成長因子(大腸菌または酵母組換体インスリン、トランス
フェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、2‐メルカプトエ
タノール、ハイブリドーマ増殖因子)を含むヘペス緩衝液。
3. ウシアルブミン10%溶液
4) 必要により、同様の方法で2次スクリーニングを行う。
5) 必要に応じて、上記クローニングの操作を繰り返す。
(図)ハイブリドーマのクローニングの一例
まき込み条件
ウシ血清アルブミンを 10%含む溶液。
10 cells/0.1mL/ウエル
〔使用方法〕
○ 培地の調製法
基礎培地1ビン(500mL)に添加剤1ビン(10mL)とウシアルブ
ミン10%溶液1ビン(5mL)を無菌的に加える。
1 cells/0.1mL/ウエル
0.5 cells/0.1mL/ウエル
**〔使用上又は取扱い上の注意〕
1. 本製品を使用すると融合後のコロニー形成(増殖)が速いの
で2×10 6 Cells/mL以上の細胞密度ではまき込まない。
エーディア株式会社 カスタマーサポートセンター
〒101‐0032 東京都千代田区岩本町 1‐10‐6
フリーダイヤル: 0120-921-207
(高密度でまいた場合、培地成分の消費が著しいため、コロ
ニー形成が抑制されることがある。)
2.
添加剤は、2‐メルカプトエタノール0.0005%を含む。
3.
添加剤は、濃縮液のため冷蔵保存中に沈殿を生じることが
あるので、よく攪拌して基礎培地に添加する。
4.
添加剤を加えた後の培地の濾過は避ける。細胞の種類に
よっては増殖が低下する。
5.
本製品には、抗菌剤及び抗カビ剤は含まれていない。必要
ならば、適宜抗菌剤、抗カビ剤を添加して使用する。
抗菌・抗カビ剤の使用例
抗菌剤:ゲンタマイシン(50μg/mL)
抗カビ剤:アンホテリシンB(0.25μg/mL)
6.
調製後の培地は、2~10℃保存で3カ月の安定性を認めて
いるが、できるだけ早く使用すること。
7.
廃棄する場合には、許可を受けた専門の産業廃棄物処理
業者に処理を委託すること。
(注)ご使用に際しては、「エス・クロン クローニングメデューム
CM‐B」の安全データシート(SDS)もご参照ください。下記の
ホームページよりダウンロードできます。
[URL:http://www.eidia.co.jp]
〔貯法及び有効期間〕
・2~10℃保存、冷凍を避ける。
・有効期間は、製造後1年6カ月(使用期限を外箱に表示)
〔包装内容〕
SS8000 エス・クロン クローニングメデュームCM‐B
・基礎培地
・添加剤
・ウシアルブミン10%溶液
500mL×1
10mL×1
製造販売元
5mL×1
〔主要文献〕
エスクロン資料集
〔参考文献〕
① Köhler, G. and Milstein, C., : Nature, 256, 495(1975)
② 単クローン抗体-ハイブリドーマとELISA- 講談社
③ 細胞成長因子-Growth Factors- 朝倉書店
④ 細胞成長因子partⅡ 朝倉書店
⑤ 動物細胞利用実用化マニュアル リアライズ社
〔商品情報お問い合わせ先〕
製造元
コージンバイオ株式会社
埼玉県坂戸市千代田 5-1-3
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