TÜRK FERTİlıTE DERGİSİ / TURKISH JOURNAL OF FERmXly PRE VE POST MENOPOZAL KADıNLARDA ANTİoKSİDAN ENZİM VE LİpİD PEROKSİDASYONU İLE KAN VE İDRARDA HİDROKSİPROLİN DÜZEYLERİNİN ARAŞTıRıLMASı Tülln SÖYLEMEZOGLU,Hakan ~ATIROGLU,Aytaç KESKİNEGE, Engin TUTKUN, ısmail H.AKINCI ÖZET Amaç: Bu çalışmada postmenopozal ve sağlıklı kadınlarda antioksidan savunma sisteminin durumu ile birlikte kan ve idrar hidro/csiprolirı düzeyleTi araştırılmıştır. Çalışmanın Yapıldığı Yer: Ankara Üniversitesi np Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Dağuın Anabilim Dalı, Ankara Üniversitesi, Adli np Enstitüsü To/csi/colojiBirimi. Materyal ve Metod: Çalışmaya, yaşları 4856 urustrıda değişen :36 hasta ve yaşları 27-:38 arasında değişen 21 sağlıklı kadın kontrol grubu dahil edilmiştir. Çalışmaya katılanlardan kan ôrrıekleri alınarak, plazmada ıııalondialdehid (MDA), eritrositlerde katalaz (CAT), supero/csid disnmtaz (SOD) ve glutalyon peroksiclaz (CSH-Px) ile kan ve idrarda hidrotcsiprolirı tayini yapılmıştır. bu ölçürnler Shiınadzu UV-1208 spekircfotometrede yürütiilmüştü,., Bulgular: Postmenopozal grupta. plazma rnalondialdehid, ve hidroksiprolin seviyeleri arılamlı biçimde yüksek olarak buiunrnuşıur. (p<O.OOl ve p<O.Ol). Postmetıopozal grupta eıtirosit katalaz ve glutatyon pero1csidaz aktiviteleri artarken (p<O.OOl her iki test Için), eritrosit superoksid disınııtaz aktivitesi ise belirgin bir şekilde azalmıştır (P<O.OOl). Ayrıca idrar h/droksiprolin düzeyleri postmenopozal grupta yükselmiştir (p<O.OOl). Sonuçlar: Bu sonuçlar göstel1nektedir ki menopozdan sonra antioksidan SaVUTlInasistemi teti/clenmektedir. Anahtar kelimeler: Htdroksiprolin menapaz, malondiaIdehid, anttaksidan enzimler. 'llırkislt Journal ojPertility2oo1: Türk Fertilite 2001; 1:67-72 GİRİş Serbest oksıjen radikallerinde ve lipid peroksıdasyonlanndakt artış. yaşlanma. ilaç toksisitesi inflamasyon ve doku travması gibi bir çok Iıyopatolojık olayda rol Ankara Ü. Adli 'np Enstitüsü SUMMARY Determination of Antioxidant Enyme Status and Hydroxyproline Levels in Pre and Postmenopausal Women Objective: In this study we investigated the stalus oj antioxidant deJense system, blood and /lrinary hydro.xyproline levels in healthy [ettuüe eontrols and poslmenopausal women. Institution: Ankara University, Faculty oj Medicine, Department oj Obstetrtcs and Cynecology, Ankara University Forensi.c Medicine Institute, Toxicology Un/I. Materials and Methods: :36 patients with aqes 48-56 and 21 healthy women with aqes 27-:38 were included in the sıudu. P/asma malarıdialdehyde (MDA), erıjiiırocte eatalose (CAT), superoxide distııutase (SOD), glutathtane peroksidase (CSH-Px) and blood and urinarı) hydroxyproline levels were measured. The Measuremenls were made spectroptıotometricaluj by Shimadzu- UV 1280. Results: The plasma ma/ondialdehyde and hydmxproline levels were signifieanily higher in the postmenapausal women thaın the control group (p<O.OOl and p<O.Ol respectively). TIıe eriirocıjte eatalase and qluiaihioııe peroxidase activities were bolhJoLllıd lo be increased in the postnıetıopauset group (p<O.OO 1 Jor both tests) while tlle eryUırocyte superoxide dismutase ucnviiy was depressed in the same group (p<O.00 1). Alsa uriTlary lıydrox!JProline levels were Illgller in the postınenapausal women than lite control group. Conclusion: Ttıese results sııggest that the anttaxidant dejense system is strongly triggered aJter the rnenopause. Key Words: HydroXljproline, menopause, malondialdehyde, anttaxidant enziyms. toksikoloji Biriıni . Ankara Ü. Tıp Fak., Kadın Ilast. ve DoğumABD. Bu çalışma TÜBITAK tarafından de steklerımiş tir. (Proje No: SBAD-AYD-IS7) 1:67-72 oynamaktadır (1). Serbest radıkaller. membran kolesterol ve yağ asttlerırıın çift bağlarına saldırarak membran lipidlerinin peroksidasyonuna yol açarlar ki, bu durum önce hücre sonra da doku hasarını SÖYLEMEZOGLU PRE ve POST MENOPOAL KADıNLARDA ANTtOKStDAN ENZIM ve LİptD PEROKStDASYONU ile KAN beraberinde getirir (2). Oksijen redüksiyonu sonucu oluşan yan ürünlerttı toksik olabilen etkileri ile mücadele edebilmek amacıyla antioksidan savunma sistemi gelişmiştir. Antioksidan savunma sistemi içinde birçok enzim. hormon (östrojen) ve vitaminler bulunmaktadır (3.4.5). Hücrelerarası maddenin ana yapı taşı olan kollajerı, süperoksid. radlkali tarafından tahrip edilir Ekstraselüler sıvılarda süperoksiddismutaz (SOD;EC 1.15.1.1). katalaz (CAT; EC L.1L.1.6) ve glutatyon peroksidaz (GPX;EC . ı ı. ı.9) alınmamıştır. Çalışmada kullanılan Sigma firmasından Çalışmaya tüm kimyasallar temin katılanlardan edilmiştir. lAsaatlik açlıktan sonra. sabah saat 8.00 ile 10.00 arasında stertl, sıtratlı vakumlu tüplere venöz kan örnekleri alınarak. santrifuj edildikten sonra. plazmalar. malondialdehid tayini için ayrılarak aynı gün çalışılmıştır. Plazmaların geri kalanı 20°C'de çalışma gününe kadar saklandıktan sonra. plazma ve eritrositler arasında kalan lökosit ve trombosıt taba- başta olmak üzere antioksidan enzim sistemlerinin aktivitelerinin düşmesı düşük kası otomatik pipetle alınıp atılmış. dibe miktarlardaki serbest radikallerin bile bu kompartrnanlarda yaygın hasar çözeltisi (PBS) çözeltisi ile yıkanarak santrifuj edilmiştir. Bu yıkama ve sarıtrifu] oluşturmasına neden olur (6). Bilindiği gibi menapozIa birlikte östrojen seviyesinde de önemli bir azalma meydana gelmektedir. işlemleri iki kez daha tekrar edildi. Son santrıfu] sonrası dıpte kalan eritrosit sedimentinden 1.0mL alınarak 1.0 mL PBS ile -~-~ ·'Y-·"-'--"~'>;"''''''···'--'-''··'·'·'' çökmüş eritrositler. fosfat tamponlu tuz Biz bu çalışmada menapozun lipid peroksi- karıştırılarak dasyorıu , antioksidan savunma sistemi üzerine etkisini ve doku yıkımının bir aktarıldı. Bu karışım bir miktar alınarak 1.6mL soğuk tridistile su ile hemoliz edile- göstergesi sayılan hidroksiprolin ilişiksi araştırıldı. rek bu herrıolızatta Ierrosıyanomethemoglobin metoduyla (6) hernoglobtn tayini yapılmıştır. Geri kalan hemolizattan ı MATERYAL ile olan VE METOD Çalışmaya Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Kliniğinde menapoz tanısı almış. tedavi görmemtş, yaşları 48-56 (ortalama±SD:5 1.8± 1.4) hasta ve yaşları arasında değişen 36 27-38 (ortalama ± SD: 34.4±2.1± arasında değişen 2 ı sağlıklı kadın kontrol grubu dahil edilmiştir. Akut veya kronik enfeksiyon. kanser. dıabet. hipertansiyon ve benzeri kronik hastalıklara ait şikayet. hikaye ve belirtileıi olanlar. serbest radikallerin oluşumunu. etkilediği bilinen ilaç kullananlar ve haftada 2 paket sigaradan fazla içenler çalışmaya 68 küçük plastik tüplere hacim alınarak kloroform/ etanol (3:5viv) çözeltisi ile' karıştınldıktan sonra 3000 rpm'de LA dakika santrtfuj edilerek üstte kalan berrak kısım enzim aktiviteleri tayini için kullanılmıştır (7). Plazma malondialdehid tayini: Yohioka ve arkadaşlarının (8) tarif ettiği. asit ortamda iki molekül tiyobarbitürik asidin (TBA) bir molekül malondialdehid MDA ile reaksiyona girerek pembe renkli bir ürün oluştunuası esasına dayanır. Oluşan bu bileşiğin absorbaıısı 535 nm'de okunarak • sonuçlar nmol/rnl plazma olarak verilir. Eritrositlerde SOD aktivitesinin tayi- Türk Fertilite 2001; 1; SÖYLEMEZOGLU PRE ve POST MENOPOAL KADıNlARDA ni:Sun ve arkadaşlannın ANrloKSIDAN (l01, tarif ettiği ksantın-ksantın oksidaz enzımatık reaksiyonu ile oluşan süperoksıt radıkallertnm, ortaında bulunan Nıtroblue Tetrazoliumu (NBT) indirgernesinin numunede bulunan SOO enzımı tarafından engellenmesi esasına dayanır. Renksiz NBT, süperaksit radıkalı ile indirgendiğinde maksimum absorbansını 560 nrn'de veren formazona dönüşür. Bu reaksiyon numunede bulunan SOO tarafından inhibe edilir ve sonuçta SOO aktivitesi ile orantılı şekilde absorbansda azalma gözlenir. Sonuçlar U/ g hemoglobın olarak verilmiştir. E:NZıMJlti.~JpID PEROKSIDASYONU ile KAN absorbansı 550 nm'de okunur. Kanda hıdroksi prolın tayini için: .Jamall ve arkadaşlarının (Lô) tartf ettiği metod kullanılmıştır. Hidroksiprolin klorarnin-T ile okside olur ve ehrlich reaktifi ile reaksıyorıa girip renkli bır: bileşik oluşturur. meydana gelen renkli bileşiğin absorbansı 550 nm'de okurıur. Absorbanslar Shimadzu rofotornetre kullanılarak uv-ı208 spektölçülmüştür. Sonuçlar student's-t testi ve Pearson korelasyon analizi yapılarak değerlendirilmiştir. SONUÇLAR Erttrosttlerde GSH-Px aktivitesinin tayi- oksitlenmesi sonucu 340 nrn'de abs orbansın azalmasının takibi esasına dayanır. Sağlıklı kontrol grubuna ve menapoz grubuna ait plazma malondıaldehıd, ıdrar hidroksiprolin düzeyleri, eritrosit katalaz, SOO, GSH-Px aktivitelerine ait sonuçlar Sonuçlar miştir. tablo l 'de verilmiştir. Bu sonuçlara göre menapoz grubunda plazma MDA, ıdrar ve ni: Wendel A'nın (l ı) tarif ettiği metod kullanılmıştır. Ortaında bulunan NADPH'nın U/g hemoglobin olarale veril- İdrarda hıdroksıprolm tayini için Rodenphant ve arkadaşlarının (12) tarif ettiği metodlar kullanılmıştır. Hidroksiprolin kloramırı-T ile okstde olur ve ehrllch reaktıfı ile reasıyona girip renkli bir bileşik oluşturur. Meydana gelen renkli bileşiğin plazma hidroksiprolin seviyeleri, eritrosit katalaz ve GSH-Px aktiviteleri belirgin bir içimde kontrol grubuna göre yükselrnışken, eritrosit SOO aktivitesi ise kontrol grubuna azalmıştır. göre anlamlı bir şekilde Eritrositlerde Katalaz aktivitesinin tayıTablo I: menopoz ve sağlıklı kontrol grubunda, plazma malondlaldehid (MDA) düzeyleri, eritrosit katalaz, sııperoksid dismutaz (SOO). glutatyon peroksiclaz (CSH-Px) aktiviteleri, ldrar ve plazma hldrokstprolln düzeyleri ve ıstatıstıksel değerlendirilmesine ait sonuçlar. Tablel: Erit Katalaz Erit SOO Erit GSN-Px Hıdrokstprolın Hıdrok sıproltn (nmol/mL) (k/gbb) (Ü/ghb) (Ü/gbb) (mg/dı (mg/24 4.45±0.50 215.64±48.01 7330±1280 8.99±0.78 0.38CH0062 6.0Ii0.47 7.64±1.71 428.04±8471 2667±960 22.6l±5.98 0.42CHO.078 9.1IiO.86 p<O.OI p<O.OOl Plazma Kontrol MDA plazma) saat ıdrar) (n=21) Menapoz Student's p p<O.OOI Turkish Journal Or p<O.OO i Fertilitıj 200/; i p<O.OOI t testi p<O.OO i 69 SÖYLEM EZOGLU PREve POSTMENOPOAL KADJNLAHDA ANTIOKSIDAN ENZIMve LIpIDPEROKSIDASYONU ile KAN ni: Lück ve arkadaşlarının (9) tarif ettiği tampon içinde bulunan H202'nin numune- bozarak kınlma eğilimi oluşturan, son derece yaygın bir hastalıktır.. normalde de bulunan kemiğln osteoklast1ar tarafından yıkılması katalaz sonucu, enziminin H202'nin sebep olduğu absorbansın ölçülmesi hesaına dayanır. hemoglobin cinsinden gelen renkli bileşiğin etkisi ile 240 nm'de azalmasının Sonuçlar k/g verilir Meydana absorbansı 550 nın'de okunur. reaksiyona girip renkli bir bileşik oluşturur. Meydana gelen renkli bileşiğin absorbansı 550 nın'de okl.ınt'r.,,-.--~----Shimadzu rofomelre kullanılarak UV-1208 spekt- ölçülmüştür Sonuçlar studerıt's-t testi ve Pearson korelasyon analizi yapılarak değerlendirilmiştir. TARTIŞMA Serbest radikaller arterosıkleroz. Inflamaluar hastalıklar, kanser ve yaşlaruna gibi birçok patolojik ve fizyolojik olaya katılmaktadırlar (ı 4, 15, ı 6). Yüksek derecede aktiviteye sahip olan bu bileşiklerin osteoblastlar tarafından yeniden oluşturulması arasında duyarlı bir denge vardır. Bu dengenin sağlanmasında İnterlökin- 1 (IL-ı), Tümör Nekroz Faktör (TNF), Tümör Büyüme Faktörü-B ve İnsülin Kanda hıdroksi prolin layini Için: .Jamall ve arkadaşlarının (13) tarif etliği metod kullanılmıştır. Hidroksiprolin kloramın-t ile okside olur ve ehrli~h reaktifi ile Asorbanslar yonu, rezorbsi- Büyüme Faktörü-ı gibi bölgesel olarak üretilen bazı maddeler de etkilidir. Osteoporozda görülen kemik kaybının kemik üretimi ile rezorbsıyorıu arasındaki dengesizltğe bağlı olduğu sanılmaktadır. Osteoporoz nedenleri arasında primer (İdiopalik) olmaıılardan sonra birinci sırada gelen menapozdur. menapozdan önceki ve sonraki birkaç yıl boyunca dengesizlik çok belirgindir ve kadınlarda bu dönemdeki kayıp %2-5 düzeylerine çıkar, kayıp hızı daha sonraki yıllarda yavaşlar. bunun yanısıra günümüzde toksik elki mekanizmalarının açıklanması yönünden en fazla üzerinde durulan serbest radikaller bağ dokusu üzerine de etkili olarak doku hasarı oluşturmaktadır (18). Hücrelerarası maddenin ana yapı taşı olan kollajen, süperoksıd radikali tarafından tahrip edilir. Ekstrasellüler etkileri, organızmada önemli role sahip antıokstdan savunma sistemi tarafından de- sıvılarda süperoksiddismutaz, katalaz ve glutatyon peroksıdaz başta olmak üzere antıokstdan enzim sistemlerinin aktivitele- netlenmektedir. C ve E vüaınini, j3-karoten gibi vitaminler ve prekürsörleri, glulatyon rinin düşmesi düşük miktarlarda reaktif oksijen türlerinin (serbest radikallerinin) ve ürik asit gibi bazı metabolttler. superoksid dısmutaz (SOO), katalaz ve glutatyon bile bu kompartmarılarda yaygın oluşturnıasına neden olur (2,5). peroksidaz (GSH-Px) gibi antioksidan enzimler, östrojen ve lürevleri antloksidan savunma sistemi içinde önemli rolü olan bileşiklerdir (3.4,5,14,15,17). Osteoporoz; kemik kütlesinde azalma ile karakteıize, kemiğin yapısal bütünlüğünü 70 hasar Östrojenin antıoksıdan savunma sistemi içinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir (17,19,20). menapozIa birlikte östrojen seviyelerinde önemli bir azalma meydana gelmektedir. Buna bağlı olarak oksijen radikallerinin organızmada oluşturduğu hasar da artmaktadır (17,19). Türk Fertilite 2001; J; SÖYLEMEZaGLU PRE ve POST MENOPOAL KADıNLARDA Bu çalışmada menapozla ANrloKsloAN birlikte lipid peroksidasyonunda önemli bir artış olduğunu saptadık (p<O.OOl).Bununla beraber antioksidan savunma sisteminde yer de ise bir azalma olduğu Yazışma Adresi: °p~oi.Dr:-'Tülln SÖYLEMEZOGLU Cell Deaiilı and Its Protedion by Catalase. J Neurosci Res. 1991; 29: 100-106. A, Hoctısteirı Chem1991; Toxicity in ihe Blood. Am J Obsteı Cyneco/ 1979; 135: 372-376. 9) Lilck H. Catalase. In: Methods in Analysis. (Bergmeyer H.U.Ed) Academic Pres Ine N.Y. and 10) Sım Y, Ober/ey L W, Li Y: A Simple Met- Y, Herbetlı B: Biologi- of Superokside Dismutase. CILLtat- hione Peroxidase, and Catalase in lood. Clin lıod jor Clinical Assay oj Superoxide Dismutase. Clin Chem 1988; 34: 497-500. 11) Wendel A: Clutathione peroxidase. 37: 1932-1937. 4)Picot I, Trtuer J M, Ntcoie A: Age Correlated Modijications tase and Cluiathine·Related Enzyme activities Clin hem 1992; 38: 66· Meth Enzym 1981; 77: 325·333. 12) Rodenphant oj Copper Zinc Superoxide Disnuı- in human Erythroeytes. and Cord Blood and London, 1965 p 855-884. gical Systems. Ann Rev Nuir 1985; 5: 365-390. cal Vaıiability in Matemal Protective Mechanism Aganist Acltivated Oxygen P.: Mechanisms and Consequences oj Lipid Peroxidation in iolo- 3) Ceumouri L, Arthur Dikimevii Ankara Tel: 319 27 34 Peroxidation 1) Kim YS, Kim SU: Oligodendıial 2) Sewenian Ankara Ü. Adli Tıp Enstitüsü, saptanmıştır KAYNAKLAR Induced by Oxygen Radicals ile KAN PEROKSIOASYONU (p<O.OOl). alan enzimlerden katalaz ve GSH-Px akvıtelerinde dikkate değer bir artış olduğu gözlemlenirken (p<O.OOl) SOO aktivitesin- ıırtn ENZIM ve J: An Easy Meihod Jor Detemıinaiion and Reliable oj Uıinary Hıjdroxııp- rollne. Clin Cm/m/ca Ada. 1984; 142: 145-148. 70. 13)Jamall IS, et aL. A Simp/e Method to Deier5) Wade C R Jacksoıı Peroxidation PC, Hıghton J: Lipid and Synovial fluid Patients with Rheumaioid and Plasma Arihıiiis. oJ Clin Chem mine nanogram 75. 14) Sauthom PA., Powis C: Free Radica/s in V F, Klee CC: btoctıeınical As- peds oj Hematology. In: Fundamentals cal Chemisiry. oJ Clini- 3th editioıı, 1987 p 803- 804. ons. Maya elin Ptoc 1988; 63: 381-389. 15) Sau/hom PA., Powis G: Free Radicals in Medicine II. Involvmen/ in Human Disease (Rev). maya elin Proc 1988; 63: 390·408. 7) Winterboum The Estimatian Medicine I. Cltemical Naiure and Biologic Reacti- tietz N. W. Ed. W.B. Saımders Company, Philadelphia. in Biological Tissues. Anal Biochem 1981; 112-70- Ada 1987; 164:254-250. 6) Fairbanks Levels oj 4-Hydroxyproline C C, Hawkins R E, Bıian C: dJ Red Cell Sııperoxide Dismuta- 16) Harman D.: Free Radicais in Aging ·(Rev). mal Cell Bioehem 1988;84:155-161. se Acitivity. J Lab Clin Med 1975; 85: 337·341. 17) Miura T, Muraoka S, Ogisa T: lnhibition 8) Yoshioka T, Kawada K Turkish Journal Of Ferlilily 2001; 1 Shimada T: Lipid ai lipid peroxiclalion by es/radiol and 2- 71 PRE ve POST MENOPOAL KADINLARDA ANTloKSIDAN HydroxyestradioL. Steroids 1996; 61: 379-383. SOYLEMEZOGLU ENZIM ve LIpID PEROKS!DASYONU ile KAN G: AnUoxidant adivily oj phyl.oestrogenic isofla- vones. Free Radic Res 1997; 26: 63-70. 18) Hergenç G., Erdogan C. Nasal Caleitonin and Oral Caleium Treatment in Post Menopaıısal Women and Urinmy Hydroxyproline Levels. Gazi Tıp Mecmuası 1995; 6: 23-26. 20) Viberi-Li J L, Ok ada s: Inhibiiorı] Estrogens on the Oxidative Hemalysis 72 M B, Mohorı A R., Poqonqo. Itıduced. by 2-amidinopropane hydrochloride a Free Radical Generator. Ada Med Okayama 19) Ruiz-Larrea E;[fed oj 1996; 50: 125-30. Tı:irk FerU/ite 2001; 1;