KLÝNÝK ÇALIÞMA 01 Beta-Talasemi Hastalarýnda MLPA Yöntemi Ýle HBA Mutasyonlarýnýn Saptanmasý HBA Mutations Detected By MLPA In Beta-Thalassemia Patients 1 1 2 2 Yrd.Doç.Dr. Hüseyin ONAY Uzm.Dr. Aslýhan EKMEKÇÝ 1 Dr. Esra ATAMAN 1 Dr. Mehmet AKGÜL 1 Dr. Ali VAHABÝ 2 Prof.Dr. Yeþim AYDINOK 3 Doç.Dr. Canan VERGÝN 1,2 Prof.Dr. Ferda ÖZKINAY Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Genetik AD Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Çocuk Saðlýðý ve Hastalýklarý AD 3 Dr.Behçet UZ Çocuk Hastanesi Hematoloji Onkoloji Birimi Gaziantep Týp Dergisi 2009;15(1):01-04. GÝRÝÞ Özet Talasemi sendromlarý insanlarda en sýk gözlenen monogenik hastalýklardýr b-talasemi major ülkemizde gözlenen en önemli halk saðlýðý problemlerinden birisidir. HBA (alfa globin), UGT1 (bilirübin metabolizmasý), HFE (demir metabolizmasý) genlerindeki mutasyonlar gibi genetik düzenleyici faktörler hastalýðýn aðýrlýðýnýn belirlenmesinde önemli role sahiptir. HBA genindeki delesyon ya da duplikasyonlar btalasemi major hastalarýndaki a-zincir birikiminin miktarýný belirlemektedir. HBA geni 16. Kromozom üzerinde lokalizedir ve gende gözlenen mutasyonlarý büyük oranda delesyon ve duplikasyonlar oluþturmaktadýr. Multiple ligation dependent probe amplification (MLPA) tekniði, delesyon ve duplikasyonlarýn sýk olarak gözlendiði genetik hastalýklarýn tanýsýnda kullanýlabilen yeni, basit ve hýzlý bir yöntemdir. Bu çalýþmada 24 adet prob ile HBA genindeki delesyon ya da duplikasyonlarý saptayabilen ticari bir kit kullanýlmýþtýr. Bu çalýþmada bölümümüzde b-talasemi major hastalýðý tanýsý almýþ 19 hastada HBA genindeki mutasyonlar MLPA yöntemi ile araþtýrýlmýþtýr. On dokuz hastanýn 2 sinde (%10.5) HBA geninde delesyon saptanmýþtýr. Hastalarýn bir tanesinde delesyon HBA2 geni HBA1P arasýnda, diðerinde HBA1 ile HBA2 genleri arasýnda saptanmýþtýr. Bu sonuç b-talasemi major hastalarý arasýnda HBA gen mutasyonlarýn nadir olmadýðýný göstermektedir. Ayrýca MLPA tekniðinin bu kompleks gen dizisindeki mutasyonlarýn araþtýrýlmasýnda uygun bir teknik olduðu da görülmüþtür. Anahtar Kelimeler: b-talasemi, MLPA, HBA Abstract Thalassemia syndromes are the most common monogenic disorders in humans and b-thalassemia major is one of the most important public health problems in Turkey. Many genetic factors play roles in modifying the disease severity such as mutations in the alpha globin gene (HBA), UGT1 gene (bilirubin metabolism) or HFE gene (iron metabolism). Deletions or duplications in HBA gene determine the accumulation of a chain in b-thalassemia major patients. The human alpha globin gene cluster is located on chromosome 16 and deletions or duplications are the most important mutations. Multiple ligation dependent probe amplification (MLPA) technique is a simple and rapid technique and used in many genetic disorders in which deletions and duplications are common. In this study we used a commercial MLPA kit for detecting alpha globin gene mutations. The kit contains 24 different probes in the HBA region. In this study we aimed to investigate the incidence of alpha globin gene mutations using MLPA technique in 19 b-thalassemia major patients which were diagnosed in our department.Alpha globin gene deletions were detected in 2 out of 19 (10.5%) b-thalassemia major patients. In one of the patients the deletion was located between the HBA2 gene and HBA1P gene. The deletion detected in the other patient was located between the HBA1 gene and HBA2 gene. This result suggests that alpha globin gene mutations in b-thalassemia major patients are not rare. MLPA technique is suitable to investigate the mutations in this complex gene cluster. Key words: b-talasemi, MLPA, HBA Talasemiler, hemoglobinde bulunan globin zincirlerindeki hatalý üretime baðlý olarak ortaya çýkan kalýtsal anemi sendromlarýdýr. Talasemi sendromlarý, etkilenen globin zincirinin tipine göre isimlendirilmektedir. Eriþkinlerde en önemli hemoglobin tipi Hemoglobin A dýr ve dolaþýmdaki hemoglobinin %95 ini oluþturur (1). Hemoglobin A nýn 2a ve 2b zincirinin bir araya gelmesiyle oluþan tetramerik bir organizasyonu vardýr. En sýk gözlenen talasemi tipleri alfa talasemi ve beta talasemidir. Alfa talasemi a-globin zinciri üretiminde azalma ya da tamamen kaybolma ile karakterizedir (2). a-globin zincirini kodlayan HBA geni 16. kromozom üzerinde, b globin zincirini kodlayan HBB geni ise 11. kromozom üzerinde lokalizedir (3). Normal eriþkinlerde a-globin genleri 4 kopya olarak bulunur. Her DNA zinciri üzerinde birer kopya a1 ve a2 genleri cis durumda bulunur. a-globin gen dizisinde gözlenen mutasyonlarýn %80-90 kadarýný delesyonlar oluþturmaktadýr (Þekil 1). Daha nadir olarak da nokta mutasyonlarý gözlenmektedir. Alfa talasemi hastalýðýnýn klinik aðýrlýðýný kaç gen kopyasýnýn mutasyona uðradýðý belirlemektedir. Ayný kromozom üzerindeki bir (a+ talasemi) ya da iki (cis durumda a0 talasemi) gen kopyasýnýn kaybý ya da her iki kromozom üzerindeki birer gen kopyasýnýn kaybý (trans durumda homozigot a+ talasemi) genellikle klinik bulgu vermez; çünkü saðlam gen kopyalarýndan yeterli a-globin zinciri üretimi saðlanabilir (1). Üç gen kopyasýnýn kaybolduðu durum Hemoglobin H hastalýðý olarak isimlendirilir ve talasemi intermedia tablosu gösterir. Bu kiþilerde orta düzeyde anemi, splenomegali ve alyuvarlarda belirgin hipokromi ve mikrositoz bulunur (1). Yrd.Doç.Dr. Hüseyin ONAY, Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Genetik AD Adres: Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbý Genetik AD 35100 Bornova ÝZMÝR Tel: 0232 390 39 62 / 76577 Fax: 0232 390 39 71 E-mail:[email protected] Gaziantep Týp Dergisi /Yýl 2009 / Cilt 15 / Sayý 1 Onay ve ark. 02 Þekil 1. 16p13.3 bölgesine lokalize a-globin gen dizisi ve sýk gözlenen mutasyonlarýn þematik gösterimi (4). Dört gen kopyasýnýn mutasyona uðradýðý durumda ise Hemoglobin Barts a baðlý hidrops fetalis tablosu gözlenir. Bu, in utero dönemde ciddi anemi ile seyreden ve gestasyonun son dönemlerinde ya da doðumdan hemen sonra ölümle sonuçlanan aðýr bir tablodur (1). Beta talasemi hastalýðý ise HBB genindeki mutasyonlar sonucu ortaya çýkan ve en sýk gözlenen tek gen hastalýklarýndan bir tanesidir. Genetik olarak alfa talasemi kadar karýþýk olmamasýna raðmen b-globin gen dizisinin karmaþýklýðý nedeniyle bazý tablolarý aydýnlatmak ileri testler ve tecrübe gerektirmektedir. Ayrýca beta talasemi hastalýðýndaki önemli problemlerden bir tanesi de hastalýðýn aðýrlýðýný belirleyen genetik düzenleyici faktörlerdir (5). Bu faktörler arasýnda elbette en önemlisi HBB geninde hastalýða yol açan mutasyonun lokalizasyonu ve mutasyonun tipidir. HBB genindeki mutasyonlarýn birçoðu için oldukça saðlam genotip-fenotip iliþkisi kurulmuþ durumdadýr. Ýkinci önemli düzenleyici faktör ise a-globin gen kopya sayýsýdýr. Çünkü beta talasemi hastalarýnda kliniðin ortaya çýkmasýndaki önemli nedenlerden bir tanesi de fazla a-globin in dokularda birikimidir. Bu nedenle a-globin kopya sayýsýnýn azlýðý (delesyonlar ve mutasyonlar) ya da fazlalýðý (gen triplikasyonu ya da kuadriplikasyonu) beta talasemi hastalýðýnýn klinik seyrini etkilemektedir. Biz bu çalýþmada beta talasemi major tanýsý almýþ hastalarda a-globin gen mutasyonlarýný araþtýrmayý ve bu mutasyonlarýn hastalýðýn kliniði üzerine etkilerini araþtýrmayý amaçladýk. Bu çalýþmaya 2007 ve 2008 yýllarýnda Ege Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Genetik AD nda beta talasemi major tanýsý almýþ 19 olgu dahil edilmiþtir. Prenatal tanýda beta talasemi major saptanan olgular çalýmaya dahil edilmemiþtir. Eðer ailede birden fazla beta talasemi majorlü birey varsa, sadece bir tanesi çalýþmaya dahil edilmiþtir. HBA genindeki mutasyon ve delesyonlarý araþtýrmak için Multiple Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA) yöntemi kullanýlmýþtýr. Bu amaçla MRC Holland firmasýnýn HBA kiti kullanýlmýþtýr. Bu kit HBA geni üzerindeki 24 bölgeye spesifik prob içermektedir ve bu bölgelerdeki delesyonlarý saptayabilmektedir. MLPA yöntemi hastalýðýn meydana gelmesinde gendeki delesyo nlarýn önemli olduðu birçok hastalýkta son yýllarda yoðun olarak kullanýlan ucuz ve etkili bir yöntemdir. Yöntem kýsaca flöresan iþaretli üniversal problar eklenmiþ dizilerin, eðer eþleniði olduðu DNA da delesyon yoksa amplifiye olmasýna ve bunun genetik analizörle tepitine dayanýr. Üniversal primerler kullanýldýðý için bir PCR ile 45 kadar bölgenin ayný anda çoðaltýlýp, bu bölgelerde delesyon olup olmadýðýnýn araþtýrýlmasý mümkündür. Þekil 2. MLPA-HBA kitinde görülmesi beklenen normal pikler. Gaziantep Týp Dergisi / Yýl 2009 / Cilt 15 / Sayý 1 Onay ve ark. 03 Normal kiþilerde HBA MLPA kiti Þekil 2 deki paterni vermektedir. Buradaki her pik HBA geni üzerinde çoðaltýlan bir bölgeye karþýlýk gelmektedir (Þekil 2). Genetik analizörde yürütülen örneklerden elde edilen datalar ücretsiz Coffalyser (http://www.mlpa.com/coffalyser/) yazýlýmý ile analiz edilmektedir. BULGULAR Bu çalýþmada bölümümüzde b-talasemi major hastalýðý tanýsý almýþ 19 hastada HBA genindeki mutasyonlar MLPA yöntemi ile araþtýrýlmýþtýr. On dokuz hastanýn 2 sinde (%10.5) HBA geninde delesyon saptanmýþtýr. Hastalarýn bir tanesinde (22 nolu hasta) delesyon HBA2 geni HBA1P arasýnda (2 bölgede), diðerinde (15 nolu hasta) HBA1 ile HBA2 (3 bölgede) genleri arasýnda saptanmýþtýr (Þekil 3). TARTIÞMA Talasemi sendromlarý insanlarda en sýk gözlenen monogenik hastalýklardýr b-talasemi major ülkemizde gözlenen en önemli halk saðlýðý problemlerinden birisidir. b-talasemi major genetiði en iyi aydýnlatýlmýþ hastalýklardan bir tanesidir. Neredeyse bilinen bütün mutasyonlarýn genotip-fenotip korelasyonu saðlanmýþ durumdadýr. Bu bilgiler sayesinde hem oluþacak klinik tablonun aðýrlýðý saptanabilmekte hem de prenatal tanýda gebelik terminasyonu konusunda saðlýklý kararlar verilebilmektedir. Hastalýðýn klinik ve genetiði bu kadar iyi bilinmesine raðmen son yýllarda hastalýðýn kliniðini deðiþtirebilen bazý genetik düzenleyiciler önem kazanmýþtýr. Hastalýðýn kliniðini belirleyen faktörlerden elbette en önemlisi HBB geninde saptanan mutasyonun yeri ve tipidir. Ýkinci önemli faktör de HBA geninde meydana gelen mutasyonlar sonucu a-globin gen kopya sayýsýnda artma ya da azalmadýr. Ekstra a-globin gen kopya sayýlarý (aaa/, aaaa ile sonuçlanan gen triplikasyon ya da kuadriplikasyonlarý nadir deðildir ve hastalýk tablosunu olumsuz yönde etkiler. Tam tersi þekilde a-globin sentezini azaltan durumlarda hastalýk kliniði daha hafif seyretmektedir (5). Bunun yanýnda b-globin zinciri ile birleþemeyen a-globin lerin g-globin ile birleþip fetal hemoglobin (HbF) oluþturmasý da hastalýðýn kliniðini hafifletebilmektedir. Bu nedenle gglobin sentezini arttýran 3 QTL (Quantitave Trait Loci) (Xmn1-Gg, HMIP ve BCL11A) HbF sentezini arttýrarak klinik üzerine olumlu etki yapmaktadýr (6). Bunlarýn dýþýnda globin zincir üretimini etkilemeden hastalýkta gözlenen komplikasyonlarýn aðýrlýðýný belirleyen ikincil genetik düzenleyiciler de bulunmaktadýr. UGT1 (bilirübin metabolizmasý), HFE (demir metabolizmasý); VDR, COL1A1, COL1A2, TGFB1 (kemik metabolizmasý); HLA grubu (enfeksiyonlara yatkýnlýk) genlerindeki mutasyonlar ya da polimorfizmler de hastalýðýn aðýrlýðý üzerinde önemli etkiye sahiptir.HBA gen mutasyonlarýnýn, beta talasemi hastalarýndaki modifiye edici etkisine dair literatürde çok fazla çalýþma bulunmamaktadýr. Han ve ark. ile Cai ve ark. larýnýn yaptýklarý iki çalýþmada da beta talasemi heterozigotlarýnda HBA mutasyonlarý araþtýrýlmýþtýr (7,8). Kanavakis ve ark. yayýnladýklarý bir olguda aðýr HBB mutasyonlarý taþýyan bir olguda yný zamanda bulunan HbH hastalýðý nedeniyle kliniðin daha hafif seyrettiði belirtilmektedir (9). Bunun dýþýnda da tek tek olgular ile HBA mutasyonlarýnýn beta talasemi majorlü olgulardaki etkisi gösterilmiþtir. Biz çalýþmamýzda hem alfa talasemi gibi genetik olarak çalýþýlmasý zor bir hasta grubunda MLPA yöntemini kullandýk hem de önemli bir hasta grubunda alfa talasemi mutasyon sýklýðýný saptamaya çalýþtýk. Ýki prob bölgesinde delesyon saptanan 22 nolu hasta IVS 2.745 (CG) /Codon 8/9 (+G) mutasyonlarýný taþýmaktadýr. Üç prob bölgesinde delesyon saptanan 15 nolu hasta ise homozigot IVS 1.110(GA) mutasyonu taþýmaktadýr ve erken hastalýk baþlangýcý olan bu olgunun senelik 10-12 transfüzyon ihtiyacý bulunmaktadýr. Sonuç olarak saptanan küçük delesyonlarýn hastalarýn kliniði üzerinde bir etkisi olmadýðý görülmüþtür. Bu durumun büyük ihtimalle delesyonlarýn, genler arasýndaki bölgelere denk gelmesi nedeniyle, a-globin gen kopya sayýsýný deðiþtirememesine baðlý olduðu düþünülmektedir. Þekil 3. Saptanan delesyonlarýn þematik gösterimi. Gaziantep Týp Dergisi / Yýl 2009 / Cilt 15 / Sayý 1 Onay ve ark. 04 KAYNAKLAR 1. Leung WC, Leung KY, Lau ET, Tang MH, Chan V, Alphathalassaemia. Semin Fetal Neonatal Med. 2008;13:215222. 2. Puehringer H, Najmabadi H, Law HY, Krugluger W, Viprakasit V, Pissard S, et al. Validation of a reversehybridization StripAssay for the simultaneous analysis of common alpha-thalassemia point mutations and deletions. Clin Chem Lab Med. 2007;45(5):605-10. 3. Apak H. Hemoglobinopatiler ve Talasemiler. Anemiler Sempozyumu, 19-20 Nisan 2001, Ýstanbul, s. 149-162 4. Harteveld CL, Voskamp A, Phylipsen M, Akkermans N, den Dunnen JT, White SJ, et al. Nine unknown rearrangements in 16p13.3 and 11p15.4 causing alphaand beta-thalassaemia characterised by high resolution multiplex ligation-dependent probe amplification. J Med Genet. 2005;42:922-931. 5.Thein SL. Genetic modifiers of the bhaemoglobinopathies. Br J Haematol. 2008;141:357366. 6. Menzel S, Garner C, Gut I, Matsuda F, Yamaguchi M, Heath S, et al. A QTL influencing F cell production maps to a gene encoding a zinc-finger protein on chromosome 2p15. Nat Genet. 2007;39:11971199. 7. Han J, Zeng R, Hu B, The prevalence of betathalassemia heterozygotes compound alpha-thalassemia in Guangdong district. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2001;22:514-516. 8. Cai YL, Zheng YM, Tang MZ, Li J, Li SW, Molecular detection and haematological analysis of heterozygotes in beta-thalassemia combining deletional alphathalassemia. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2007;15(1):195-197. 9. Kanavakis E, Traeger-Synodinos J, Lafioniatis S, Lazaropoulou C, Liakopoulou T, Paleologos G, et al. A rare example that coinheritance of a severe form of betathalassemia and alpha-thalassemia interact in a "synergistic" manner to balance the phenotype of classic thalassemic syndromes. Blood Cells Mol Dis. 2004;32:319324. Gaziantep Týp Dergisi / Yýl 2009 / Cilt 15 / Sayý 1
© Copyright 2024 Paperzz
