1 Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344/9. Ders 29.05.2014 Prof.Dr. Dilek AK ÖRNEKLERİN SAKLANMASI VE DİĞER KONULAR 2 Örneklerin Saklanması Analizi yapan kişiden, örnek içinde ne ve ne kadar olduğunu söylemesi beklenir. Analizcinin ölçüm öncesi numune matriksinin hazırlanması için örneğin nasıl alınacağı, saklanacağı ile ilgili olumsuz koşullardan haberdar olması önemlidir. Bir lab belirli bir analiz hizmeti verdiği zaman, örnek toplama, saklama ve transfer ile ilgili talimatları oluşturmalı ve yöntem geliştirme uygun incelemeleri içermelidir. 3 Örneklerin Saklanması Karşılaşılan bazı problemler: Kan örneklerinin toplanmasında metodolojik sorunlar. Bu duruma metrifonidat’ın diklorvos’a dönüşmesi örnek verilebilir, bu dönüşüm asitlendirme ile önlenmiştir. Ester yapılı bileşikler için serum esterazların varlığı. Örnek toplama tüpüne NaF eklenmesi esterazları inhibe eder. Plazmadaki dekompozisyonun engellenmesinde esterazların inhibe edilmesi için, +4oC yerine derin dondurucuda saklamak yararlıdır. Saklama aşamasında ilacın stabilitesini sağlamak için en kullanışlı işlem toplamadan hemen sonra derin dondurucuda dondurmaktır, yine de çok güvenli değildir. 4 Örneklerin Saklanması İlaç dondurulduktan sonra da kararlı olmayabilir, araştırmalar ile desteklenmesi gerekir. Örnek çözüldükten sonra da sorunlar olabilir. Örnek yavaşça çalkalanarak homojen hale getirilmelidir, böylece derişim etkilerinden kaynaklanan sorunlar en az düzeye indirilebilir. Çözünme sırasında saklama aşamasında inaktif olan enzimler aktif hale gelebilir. 5 Ekstraksiyon İlaç içeren sıvıların saflaştırılmasında en çok kullanılan yöntem organik çözücü ile ekstraksiyondur. İlacın sulu çözeltiden organik çözücüye alınabilmesi için ilacın non-iyonize formda olması gerekir. İlacı non iyonize forma çevirebilmek için sulu çözelti pH değerinin ayarlanması gerekir. pH değerine karar vermek için pKa değerinin bilinmesi önemlidir. Sulu fazdan ilacın ekstraksiyonunda önemli olan diğer konu organik çözücünün yapısıdır. Lipofilik özelliği fazla olan bileşikler hekzan gibi nonpolar çözücülere çok kolay ekstre edilebilirken, hidroksil grubu taşıyan bileşikler için daha polar çözücülerin kullanılması gerekir. 6 Ekstraksiyon Organik çözücünün kendi yoğunluğu da bu konuda önem taşır. Fazlardan hangisinin kullanılacağı ve hangi tip ekstraksiyon tekniği ve aleti kullanılacağı organik çözücü seçimini etkileyebilir. Organik çözücü sonraki deriştirme basamağında kolay uzaklaştırılabilir olmalıdır. Bunun için en uygun çözücü dietil eterdir. Uçucu özelliğin fazla olması mutlaka iç standart kullanımını gerektirir. 7 Ekstraksiyon Organik çözücülerin kimyasal etkisi beklenmeyen etkilerin ortaya çıkmasına neden olabilir. Etil amin gibi primer aminler, Schiff bazı oluşturmak için aldehit ve ketonlarla reaksiyona girebilir. Etil asetat yüksek polaritesi, ucuzluğu ve uçuculuğu nedeniyle ekstraksiyonda çok kullanılan bir organik çözücüdür. Ancak pH > 9.0 ve oda sıcaklığında hidroliz olarak asetik asit ve etanol üretir. 8 9 Fazların ayrılması Ekstraksiyon sonrası fazların ayrılmasında en önemli sorun emülsiyon oluşumudur. Fazları santrifüj ederek ayırmak en yaygın uygulamadır. Bunun dışında dondurma ve çözme döngüsü, filtrasyon, sulu fazı bir tuz ile doygun hale getirmek, ve az miktarda alkol eklenmesi uygulanabilir. 10 11 Organik fazın uzaklaştırılması Organik fazın uçurulması ve kalıntı eldesi için organik fazın su içermemesi gerekir. Uçurma sırasında birkaç damla etanol ilavesi işlemleri kolaylaştırır. Ayrıca susuz sodyum sülfat ve kalsiyum klorür organik fazdaki suyun uzaklaştırılması için yararlıdır. Organik fazı uzaklaştırılan ekstre desikatörde saklanır. 12 Kurutma Az miktarda ilaç içeren numunelerin ölçümünden önce, ekstreyi kuruluğa kadar buharlaştırmak ve az miktarda çözücü içinde çözmek gerekir. Bu işlem sırasında (kuruluğa kadar buharlaştırma) numunenin kaybına neden olabilecek çeşitli durumlarla karşılaşılır. Bunlar çözücünün sıçraması, cam kaplara adsorpsiyon ve ilacın uçuculuğudur. Analitik geri kazanımda meydana gelen değişimler kalibrasyon grafiğinin ve tekrar edilebilirliğin kötüleşmesine neden olur. 13 Kurutma Önlem olarak kromatografi öncesinde silanize cam kaplar kullanmak, organik çözücüyü 40 oC de uçurmak ve iki adet iç standart kullanmak önerilir. 14 Katı faz ekstraksiyon (SPE) Katı faz ekstraksiyon tekniklerinin kullanımı ile çözücü ekstraksiyonunda karşılaşılan bir çok sorun ve aşırı miktarda organik çözücü harcanması en az düzeye indirilebilir. İstenmeyen bileşikler düşük polaritedeki çözücü ile elüe edilir ve istenen bileşik daha uygun bir organik çözücünün düşük miktarı ile elüe edilir. Çeşitli ve bol miktarda bulunan SPE kartuşları çeşitli çözücüler ve tamponlar kullanılarak organik çözücü ile yapılan ekstraksiyona göre daha iyi çözümler sağlar. 15 Katı faz ekstraksiyon 16 Kontaminasyon (Bulaşma) Kaynakları Bir bulaşan, işlemler sırasında numuneye alınan istenmeyen bir maddedir ve analitik problemin bir parçası haline gelir. Bulaşan kaynakları genellikle, Numune almaya başlarken (örn kan numunelerinde kullanılan koagulan madde) Laboratuvarda çalışanların kendisi ve alışkanlıkları, parmaklar, kağıt ve giysilerden gelen lifler, plastik ve kauçuk malzemeler, filtre kağıdı, cam yünü vs. bulaşanlara örnek verilebilir. PVC yerine PTFE tüp kullanmak önlemiş Kaynak bilindiğinde bulaşanların etkisi önlenebilir. 17 Artifactların Oluşumu Biyolojik sıvılarda yanlış ölçüm sonuçlarına neden olan etkilerdir. Ölçüm sırasında ilacın düzeyinde azalma, artış veya metabolitlerin yanlış teşhisine neden olur. Bu soruna en fazla adli toksikoloji veya tarama yöntemlerinde rastlanır. İlacın artan miktarlarına en fazla analitik işlemler sırasında metabolitlerin ana bileşiklere dönüşmesi nedeniyle rastlanır. N-oksit veya S-oksit içeren bileşikler saklama sırasında beklenmeyen indirgenme nedeniyle ana bileşiğin artan miktarlarına neden olur. Metabolitler izolasyon için kullanılan analitik işlemler sırasında yanlış teşhiş edilebilir. Dikkatle kontrol edilen numune toplama işlemleri önem taşır. Artifact oluşumunun önemli bir tipi rasemizasyon veya optik aktif bileşiklerin inversiyonudur. Özellikle rasemat halde uygulanan ilaçta belli dönüşümler nedeniyle yanlış sonuçların elde edilmesi önemlidir. Gaz kromatografi yönteminin kullanıldığı analizlerde analitin uçuculuğu yaygın karşılaşılan problemden biridir. 18 İlginiz için teşekkür ederim.
© Copyright 2024 Paperzz
