Koagülaz testi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Koagülaz Testi
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-12
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Koagülaz testi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 3
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 3
Testin uygulanması ....................................................... 5
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 6
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 6
KAYNAKLAR ..................................................................... 8
Sayfa 2 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 /Sürüm: 1.1 / B-TP-12 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Koagülaz testi
Kapsam ve Amaç
Stafilokok türlerinin en patojeni olan Staphylococcus aureus diğerlerinden
koagülaz üretimi ile ayrılır. Bu UMS‟de koagülaz testinin dayandığı prensipler ile
kullanım ve yorumlanmasına dair bir rehber sunulması hedeflenmiştir
Kısaltmalar ve Tanımlar
EDTA etilen diamin tetra-asetik asit
PYR
L-pirolidonil--naftilamid
Genel Bilgi
Koagülaz, fibrinojeni fibrin oluşturmak üzere aktive ederek pıhtı gelişimine neden
olan termostabil trombin-benzeri bir maddedir ve üretimi bir test tüpünde
stafilokok inoküle edilmiş plazmanın pıhtılaşması ile gösterilebilir. Bu madde
hücre tarafından ortama salındığı için “serbest koagülaz” olarak da bilinmektedir
(1,2). S. aureus‟un hücre duvarında ayrıca “bağlı koagülaz” veya “kümelenme
(clumping) faktörü” olarak adlandırılan bir fibrinojen bağlayıcı yüzey reseptörü de
bulunur. Bu faktörü taşıyan organizmalar doğrudan plazmanın fibrinojeni ile
etkileşerek küme oluşturabildiğinden, lam testi ile gözlenebilir (1). Özetle; bağlı
koagülaz lam testinde bakterinin aglütinasyonu şeklinde, serbest koagülaz ise
tüp testinde pıhtı oluşumu şeklinde tespit edilebilir.
Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında en yaygın tercih edilen koagülaz testi lam
testidir. Uygulanması kolay olmakla birlikte, bu faktör S.aureus‟un bazı
kökenlerinde olmayabileceğinden lam testi ile negatif sonuç elde edilebilir. Bazen
de kümelenme faktörü kapsül polisakkaritleri tarafından maskelenebilmektedir.
Bu nedenlerle lam testinin negatif sonuç vermesi halinde doğrulama için tüp
testine başvurulması gerekir. Yine de, laboratuvarlar için algoritması oldukça
basit olduğundan, S. aureus tanısında koagülaz testleri hızlı bir şekilde ve yüksek
bir doğruluk derecesi ile kullanılmaktadır (1).
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-12 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 8
Koagülaz testi
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Reaktif, Donanım
Test mikroorganizmaları

S. aureus olabileceği düşünülen bakteri izolatı - plak besiyerinde tek
düşmüş koloni halinde
ÖNEMLİ: Yanlış tanımlamayı önlemek için, koagülaz testi sadece
katalaz pozitif, gram pozitif kok kümeleri şeklinde ön tanımlaması
yapılmış olan klasik görünümlü beyaz-sarı, opak, hemolitik kolonilere
uygulanmalıdır. Hemolizin taze (18 saatlik) kültürlerde gözlenebileceği
hatırlanmalıdır (1).
Reaktif

Tavşan plazması, EDTA‟lı – ticari olarak temin edilir. Liyofilize veya
donmuş preparat şeklinde olabilir; üretici firmanın önerisi
doğrultusunda sulandırılmalı ve saklanmalıdır.
NOT: Tüp testi için, vida kapaklı küçük tüplere plazmanın 0.5 mL
alikotlar halinde ayrılması ve saklanması önerilir.
ÖNEMLİ: Koagülaz testi için insan plazması kullanılmaz! Duyarlılığı
düşüktür. Ayrıca HIV ve diğer patojen virüslerin bulaşması potansiyeli
taşır.

%5‟lik kalsiyum klorür (CaCl2) çözeltisi – isteğe bağlı
Diğer gereç, donanım

Lam veya siyah aglütinasyon kartı (serolojik testler için olan tipte)

Test tüpleri – vida kapaklı, steril, küçük (ör., 1275mm)

Öze – halka ya da iğne tipi; tek kullanımlık veya nikrom

Damlalık veya tek kullanımlık Pastör pipeti

Kesici delici atık kabı, enfeksiyöz atık kabı, eldiven
1.4. Kalite kontrol

Her yeni açılan plazma lotu mutlaka kalite kontrol suşları ile test
edilmelidir!

Derin dondurucu ya da buzdolabında saklanmamış veya bulanık
görünümlü plazma kesinlikle testte kullanılmaz!

Kalite kontrol organizmaları (1):
S. aureus ATCC 25923 – koagülaz pozitif (pozitif kontrol)
S. epidermidis ATCC 12228 veya 14990 – koagülaz negatif (negatif
kontrol)
Sayfa 4 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 /Sürüm: 1.1 / B-TP-12 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Koagülaz testi
2 Testin uygulanması
2.1. Lam koagülaz testi

Bir lam üzerine küçük bir damla (10-15 µL) distile su konur.

Bir öze ile test edilecek koloniden alınır; lamın üzerindeki su ile
homojen, koyu, süt-benzeri bir süspansiyon elde edecek şekilde
karıştırılır.
NOT: Yeterince koyu bir süspansiyon elde edilemez ise yanlış-negatif
sonuç alma olasılığı vardır.

Süspansiyon „otoaglütinasyon‟ olup olmadığı bakımından incelenir.
NOT: Eğer suda süspansiyon oluşturulamıyor, kümelenmeler meydana
geliyor ise, lam testi gerçekleştirilemez. Organizmanın kendiliğinden
kümelenme (otoaglütinasyon) eğiliminde olduğundan bahsedilir. Bu
durumda serbest koagülazı göstermek amacıyla tüp testi yapılmalıdır!

10-15 µL plazma eklenir, nazikçe karıştırılır.

Hemen 10 saniye içinde gözle görülür bir kümelenme olup olmadığı
incelenir.

Test sonrası lam bir kesici-delici atık kabına, kart kullanıldıysa
enfeksiyöz-atık kabına atılır.
2.2. Tüp koagülaz testi

0.5 mL plazma içeren tüp oda ısısına getirilir.

İncelenecek stafilokok kolonisi öze ile alınır; plazma içinde homojenize
edilir.
NOT: Kan kültüründe üreme bulgusu ve mikroskopide gram pozitif
küme yapmış kokların görülmesi halinde S.aureus‟un hızlı tanısı için
plazma içeren tüpe 2 damla kan kültürü de inoküle edilebilir (1).

Tüp 35-37°C‟de saat başı incelenerek 4 saate kadar inkübe edilir. Tüp
içinde gevşek bir fibrin ağı oluşumu ya da tam bir pıhtılaşma olup
olmadığı gözlenir. İnceleme yaparken tüp çalkalanmamalıdır! Pıhtı
oluşumunu anlamak için tüp hafifçe eğilip sallanabilir.

Eğer plazmada bir değişiklik yoksa gecikmiş koagülaz aktivitesi olasılığı
için 22-25°C‟de 24 saat inkübasyonun ardından tekrar değerlendirme
yapılır (3).
ÖNEMLİ: S.aureus‟un fibrinolizinleri oluşan pıhtıyı eritebileceğinden
dolayı, test tüpü 35°C‟de 4 saatten daha uzun tutulmamalıdır. Eğer
mesai sonu vb. nedenlerle 4 saat uygun değilse, 22-25°C‟de 24 saat
inkübasyon önerilir ki bu aynı zamanda sonuç almak bakımından daha
duyarlı bir yöntem olarak kabul edilmektedir (4).
Alternatif olarak; tüp 35°C‟de 24 saat inkübe edilir ve 1-2 damla %5
CaCl2ilave edilir. Eğer pıhtı oluşursa izolat “koagülaz negatif”tir; eğer
pıhtı gözlenmez ise fibrinolizinin oluşmuş pıhtıyı erittiği kabul edilir ki
bu sonuç izolatın “koagülaz pozitif” olduğunu doğrular (1).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-12 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 8
Koagülaz testi
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması
3.1. Lam koagülaz testi

Pozitif test – Plazma ilavesi ile 10 sn içinde aglütinasyon gözlenmesi

Negatif test – 10 sn.de gözle görülür bir aglütinasyon olmaması
3.2. Tüp koagülaz testi

Pozitif test – Aşağıdakilerden biri ile uyumlu sonuç:
(a) Tüp içinde 24 saatten önce tam veya kısmi pıhtı oluşumu
(b) 35°C‟de 24 saat inkübasyon sonunda tüpe 1-2 damla %5 CaCl2
ilave edildiğinde pıhtı oluşmaması

Negatif test – Aşağıdakilerden biri ile uyumlu sonuç:
(a) Tüp içinde 24 saatte 22-25°C‟de pıhtı oluşmaması
(b) 35°C‟de 24 saat inkübasyon sonunda tüpe 1-2 damla %5 CaCl2
ilave edildiğinde pıhtı oluşması
3.3. Sonuçların raporlanması
Koagülaz testi stafilokok tanımlamasında bazı durumlarda karar verdirici
bir testtir. Buna göre elde edilen sonuçlar aşağıdaki şartlarda
raporlanabilir:

Katalaz pozitif, gram pozitif kok kümeleri izlenen organizma için eğer
tüp testi pozitif ise izolat “Staphylococcus aureus” olarak rapor edilir.

Mikroskopik olarak gram pozitif kok kümeleri izlenmiş kan kültüründen
yapılan tüp koagülaz testi pozitif ise rapor -koloni elde edilip katalaz
testi yapılıncaya kadar geçici olarak- “olası Staphylococcus aureus;
doğrulama için inceleme devam ediyor” şeklinde düzenlenir.

Krem-beyaz tipik koloni görünümü ile birlikte katalaz pozitif, gram
pozitif kok kümeleri izlenen organizma için eğer tüp testi negatif ise
izolat “koagülaz negatif stafilokok” olarak rapor edilir.

Pozitif lam testi S. aureus olarak rapor edilir. Bununla birlikte test
sonucu, (S.aureus„u S. lugdunensis ve S. schleiferi’den ayırt etmek
gerektiğinden dolayı), kan gibi steril vücut bölgelerinden izole edilmiş
hafif hemolitik veya hemolitik olmayan koloniler için tüp koagülaz testi
ile de doğrulanmalıdır.

Negatif lam testi kesin negatif sonuç rapor edilebilmesi için
geçerli/yeterli değildir. Tüp testi ile doğrulanmalıdır!
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Lam koagülaz testinde otoaglütinasyon olabilir.

Aşırı karıştırma kümelenmenin çözülmesine neden olabilir.
Sayfa 6 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 /Sürüm: 1.1 / B-TP-12 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Koagülaz testi

Koagülaz testleri „mannitol salt agar‟da üremiş kolonilerden
yapılmamalıdır.

Sitratlı plazma sitratı kullanan organizmalar tarafından pıhtılaştırılabilir
(yanlış pozitiflik). Bu nedenle EDTA, okzalat veya heparin içeren
plazma kullanılmalıdır.

Tüp testinde 35°C‟de inkübasyon süresinin uzamasının pıhtının
çözülmesine neden olabileceği hatırlanmalıdır.

Metisilin-rezistan S.aureus (MRSA) kökenlerinde bağlı koagülaz
olmayabilir ve lam testi negatif çıkabilir (5). Bazı MRSA‟lar da zayıf
pozitif olabilir. Lateks kitleri aynı zamanda Protein A‟yı da
saptayabildiği için böyle suşların tanımlanmasında koagülaz testinden
daha duyarlıdır.

S. lugdunensis ve S. schleiferi lam koagülaz pozitiftir (özellikle insan
plazması ile). Bunlar S. aureus‟tan güçlü PYR pozitifliği ve S.
intermedius‟dan tüp koagülaz testlerinin negatif olması ile ayırt edilirler
(Tablo 1) (1).

Tüp testinde S. intermedius ve S. hyicus pozitif olabilir. Bunlar
(sırasıyla) köpek ve domuz izolatlarıdır ancak nadiren insanda
enfeksiyona yol açtıklarında S.aureus kadar ciddi hastalığa neden
olabilirler. Ayırıcı tanı için bkz Tablo 1 (1).
Tablo 1. Önemli ve/veya yaygın görülen, büyük beyaz-sarı koloniler oluşturabilen, katalaz pozitif,
gram pozitif kokların temel biyokimyasal reaksiyonları* (1 no.lu kaynaktan uyarlanmıştır)
Lam
koag
Tüp
koag
Basit
Poli B
(0.04U)
(300U)
VP+
V
+
R
R
-
VP-
V
+
R
S
+
S. delphini (yunus) #
VP-
-
+
R
NA
NA
S. hyicus (domuz) #
VP-
-
V
R
R
-
S. lugdunensis
Ornithin +
V
-
R
R
+
S. schleiferi
Ornithin -
+
-+
R
S
+
S. saprophyticus
İdrar; novo R; nonhemolitik
-
-
R
S
-
S. epidermidis
Nonhemolitik
-
-
R
R
-
S. haemolyticus
Üreaz -, VP+, DNase -
-
-
R
S
+
S. caprae
Üreaz +, DNase +,
-
-
R
S
+
Tür
Bazı tipik özellikler
S. aureus ssp aureus
S. intermedius (köpek)#
PYR$
Diğer koagülaz negatif
Nonhemolitik veya gecikmiş
R
S
V
stafilokoklar
hemoliz; novo V; üreaz V
* +, izolatların %90‟dan fazlası 48 saat içinde pozitif; -, izolatların %90‟dan fazlası negatif; V, değişken
(variable) ya da %10-90 arasında pozitif; -+, çoğu negatif ama nadiren pozitif izolatlar olabilir; koag,
koagülaz; Basit, basitrasin; Poli, polimiksin B; PYR, L-pirolidonil-ß-naftilamid; VP, Voges-Proskauer;
Novo, novobiyosin; NA, uygulanamaz ya da mevcut değil; R, rezistan; S, sensitif (duyarlı).
$
#
PYR verisi sıvı test içindir (disk test ile S. aureus standart suşlarının zayıf reaksiyon verdiği gözlemlendiği ve S.
intermedius‟dan ayrımının mümkün olamayabileceği nedeniyle)
klinik örneklerden nadiren izole edilebilirler.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-12 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 8
Koagülaz testi
Kaynaklar
1 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Coagulase test - rabbit plasma method. In: Garcia LS (ed in chief). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.14.1 3.17.14.3
2 MacFaddin JF, ed. Biochemical tests for identification of medical bacteria. 3rd ed., Lippincott
Williams and Wilkins, Philadelphia. 2000, p. 105–119.
3 Cowan ST. The classification of staphylococci by precipitation and biological reactions. J Pathol
Bacteriol1938;46:31–45.
4 Baker JS, Bormann MA, Boudreau DH. Evaluation of various rapid agglutination methods for the
identification of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1985;21:726–729
5 Lally R, Woolfrey B. Clumping factor defective MRSA. Eur J Clin Microbiol 1984;3:151–152
Sayfa 8 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 /Sürüm: 1.1 / B-TP-12 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji

Download Report