Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MİKROBİYOLOJİ STANDARTLARI (UMS) Lizin-Ornitin-Arjinin Aminoasit Dekarboksilaz-Dihidrolaz Testleri Hazırlayan Birim Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Bakteriyoloji Bölüm Test Prosedürleri Standart No B-TP-13 Sürüm No 1.1 Onay tarihi 01.01.2015 Geçerlilik tarihi 01.01.2018 Sürüm no Tarih Değişiklik Lizin-Ornitin-Arjinin testleri İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3 KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3 GENEL BİLGİ ................................................................... 3 TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 4 1 2 3 4 Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 4 Testin uygulanması ....................................................... 5 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 6 Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 6 EKLER............................................................................. 7 Ek-1 Aminoasit besiyerinin hazırlanması3,5 ........................... 7 Ek-2 Steril mineral yağ hazırlanması .................................. 9 KAYNAKLAR ................................................................... 10 Sayfa 2 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-13 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji Lizin-Ornitin-Arjinin testleri Kapsam ve Amaç Bu UMS‟nin amacı bakteri tanımlamasında rutin test edilen aminoasitler olan lizin, ornitin ve arjinin için dekarboksilaz/dihidrolaz testlerinin doğru uygulanması ve yorumlanmasına yönelik bir rehber sunmaktır. Kısaltmalar ve Tanımlar LIA Lysine iron agar MIO Motility-indole-ornithine (Hareket-İndol-Ornitin) besiyeri NH2 Amino grubu. Aminoasitler karakteristik iki fonksiyonel grup içerirler; bu gruplardan biri amino (-NH2) grubudur, diğeri de karboksil (-COOH) grubudur. Genel Bilgi Dekarboksilazlar, aminoasitlerin karboksil (COOH) kökünü ayırarak aminler (alkali son ürünler) meydana getiren bir grup enzimlerdir. Olay dekarboksilasyon olarak bilinir. Her dekarboksilaz bir aminoaside özgüldür. Aminoasit dekarboksilasyon testleri yaygın olarak Enterobacteriaceae ailesi üyeleri ile Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio spp ve nonfermentatif gram negatif bakterilerin tanımlanmasında tercih edilir. Özellikle enterik patojenlerin tanı algoritmasında IMViC test paketini tamamlayıcı işlev görürler (1,2). Laboratuvarlarda rutin olarak test edilen amino asitler lizin, ornitin ve arjinin olup reaksiyon sonunda sırasıyla kadaverin, putressin ve sitrulin ortaya çıkar. Aslında sitruline yıkım arjininden bir NH2 grubunun ayrılması ile gerçekleşir ki bu bir dihidrolaz aktivitesidir; sitrulin de bir sonraki adımda ornitine ve son olarak dekarboksilasyon ile putresine dönüşür (3). Test için baz besiyeri „Moeller dekarboksilaz‟ besiyeri olup temel bakteriyel üreme için pepton, maya-özütü, %0.05 glikoz, dekarboksilaz aktivitesini destekleyen pridoksal ve pH indikatörü (brom krezol moru ve krezol kırmızısı) içerir (4). Baz besiyerine -ayrı ayrı- lizin, ornitin ve arjinin eklenmesi ile aminoasitli Moeller tüpleri hazırlanır. Bir organizma test edilirken aminoasit içeren tüplerin yanına gerekirse baz besiyeri tüpü (kontrol) de konarak bir set oluşturulur. Dekarboksilasyon anaerob şartlarda oluşan bir reaksiyondur; bu nedenle, bakteri ekimi yapıldıktan sonra, hava ile teması kesmek için besiyerinin üzeri mineral yağ ile kaplanır. Fermentatif bakteriler inkübasyonun ilk evresinde, ortamdaki glikozu fermente ettiklerinden, renk sarıya döner. Üremenin ilerleyen evrelerinde eğer aminoasit dekarboksile edilirse alkali aminler açığa çıkacağından aminoasit içeren tüp(ler)de renk mora dönerken kontrol tüpü sarı kalır (3,5). Nonfermentatif organizma söz konusu ise kontrol tüpünde üreme varlığına rağmen hiç renk değişikliği olmaz. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-13 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 3 / 10 Lizin-Ornitin-Arjinin testleri Teknik Bilgiler 1 Test için asgari laboratuvar koşulları 1.1. Laboratuvar güvenliği Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi”). 1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır. 1.3. Örnek, Besiyeri, Donanım Test mikroorganizmaları Enterik gram negatif çomaklar ve Vibrio, Plesiomonas ve Aeromonas spp şüpheli izolatlar – tür düzeyinde tanımlama için Koagülaz negatif stafilokoklar (ornitin) Viridans grup streptokoklar (arjinin) Çeşitli nonfermentatif, gram negatif çomaklar (arjinin) Stenotrophomonas ve Burkholderia şüpheli izolatlar (lizin ve arjinin) Besiyerleri Dekarboksilaz testleri için aşağıda listelenen Moeller besiyerleri (sıvı) kullanılır. Piyasadan hazır temin edilebileceği gibi laboratuvarda da hazırlanabilirler. Laboratuvarda hazırlamak için bkz. Ek-1. Moeller Moeller Moeller Moeller baz besiyeri (aminoasit içermeyen) arjinin dekarboksilaz (%1 arjinin) lizin dekarboksilaz (%1 lizin) ornitin dekarboksilaz (%1 ornitin) MIO besiyeri – ornitin dekarboksilaz test edilebilir; yarı-katı agardır. LIA – enterik patojenlerin özellikle Salmonella‟ların (lizin-dekarboksilaz pozitif; dip kısım mor) tanımlanmasında kullanışlıdır. Diğer gereç, donanım Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom Mineral yağ veya vaspar (1 kısım mineral yağ + 2 kısım petrol jeli) veya sıvı parafin ya da 56°C‟de eritilmiş petrol jeli, steril (bkz. Ek-2) Sayfa 4 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-13 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji Lizin-Ornitin-Arjinin testleri 1.4. Kalite kontrol Her yeni besiyeri lotu kullanıma sokulmadan önce pozitif ve negatif kalite kontrol suşları ile test edilmelidir. Lotlar arasında haftada bir ya da, laboratuvar testi daha uzun aralıklarla yapıyorsa her testte, kalite kontrol uygulanmalıdır. Her kullanım öncesi Moeller besiyeri tüpleri incelenmeli; renk mor olmalı; bulanıklık gözlenmemelidir. Eğer bulanık ise veya mor değilse tüp atılmalıdır. Kalite kontrol organizmaları – aşağıdaki tabloda listelenmiştir. Sonuç* Kontrol tüpü Lizin Ornitin Arjinin Klebsiella pneumoniae / 13883 Sarı + - - Enterobacter cloacae /23355 Sarı - + + Staphylococcus aureus / 25923 Sarı NA - NA Staphylococcus lugdunensis / 700328 Sarı NA + NA Organizma /ATCC * +, mor; -, sarı; NA, uygulanmaz 2 Testin uygulanması Test edilmek istenen aminoasit tüpü/tüpleri ve kontrol tüpü olacak şekilde dekarboksilaz test seti hazırlanır. Her tüp organizmanın 18-24 saatlik saf kültüründen öze ile bir-iki koloni alınarak inoküle edilir. ÖNEMLİ: Kontrol tüpü her sete konmayabilir. Ancak şüpheli test sonuçları elde edilmesi halinde sette kontrol tüpü bulunması değerlendirmeyi kolaylaştırıcı özelliktedir. Karar için yardımcı bir liste aşağıda verilmiştir; laboratuvarlara, -eğer tecrübe kazanma sürecinde iseler- her durumda kontrol tüpü kullanmaları tavsiye edilir. (a) Enterobacteriaceae için kontrol tüpü gerekli değildir (bütün türler glikozu fermente ettiklerinden dolayı). (b) Gram pozitif koklar için kontrol tüpü genellikle gerekli değildir. (c) Nonfermentatif gram negatif bakteriler için kontrol tüpü eklenir. Tüplere yoğun ekim (McFarland standardı ≥ No.8) yapılmalıdır. İnoküle edilmiş tüplerde anaerob ortam sağlamak için besiyerlerinin üzeri 0.5 mm kalınlıkta mineral yağ ile kaplanır. Kaplama dikkatli bir şekilde yapılmalı, besiyerinin hava ile teması tam olarak kesilmeli, kesinlikle hava kabarcığı oluşturulmamalıdır. ÖNEMLİ: Besiyeri yüzeyinin mineral yağ veya benzeri madde ile kaplanması zorunludur. Eğer kaplanmadıysa sonuç değerlendirilemez! Kalın bir yağ tabakasına gerek yoktur. Besiyeri yüzeyinin hava ile teması kesecek ancak gaz çıkışına da izin verecek kalınlıkta kaplanması Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-13 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 5 / 10 Lizin-Ornitin-Arjinin testleri gerekir; yağ ile kaplama oksijen girişine izin vermediğinden dolayı fermentasyonu teşvik eder, hem de besiyeri yüzeyinde kendiliğinden alkalileşmeyi önler. Kapaklar sıkıca kapatılır. Tüpler 35-37°C‟de en az 18 saat, gerekiyorsa 4-7 güne kadar -her gün incelenerek- inkübe edilir. NOT: MIO besiyeri kullanılıyorsa inokülasyon iğne öze ile batırma kültürü şeklinde yapılır. 18 saate kadarki inkübasyonlar için yağ kaplamak gerekli değildir. İnkübasyon şartları ve süresi sıvı besiyeri için önerildiği gibidir. 3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması Pozitif test sonucu – mor (alkali) renk değişimi; NOT: Nonfermentatifler yeterli düzeyde aminler üretmişlerse, baz besiyeri ile kıyaslandığında daha koyu görünen bir mor renk meydana getirirler. Negatif test sonucu – kontrol tüpü ile aynı (a) parlak temiz bir sarı renk (asit), veya (b) renk değişikliği olmaması (nonfermentatifler) NOT: Kontrol tüpü sarıya dönmüş olmalıdır (fermentatiflerde) ya da orijinal renginde kalmış olmalıdır (nonfermentatiflerde). Bulanıklık mutlaka görülmelidir. Kontrol tüpünde alkali reaksiyon veya koyu mor renk oluşumu gözlenmesi halinde test geçersiz olur. Şüpheli sonuçlar kontrol tüpü ile karşılaştırılarak yorumlanmalıdır. 4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar Testin değerlendirmesi 18-24 saatten önce yapılmamalıdır. Erken değerlendirmeler hatalı yorumlara neden olabilir. Glikoz fermentasyonu ilk 10-12 saatte olur ve ortaya çıkan asit ürünler sarı renk oluşumu ile sonuçlanır. Dekarboksilaz enzimleri asidik evre tamamlanıncaya kadar indüklenmeyecektir. Bazı nonfermentatifler zayıf dekarboksilaz aktivitesine sahip olabilirler ve dolayısı ile aminlerin yetersiz üretimi pH indikatör sistemini dönüştürmeye yeterli olmayabilir. Gri renk oluşumu alkali reaksiyondan ziyade indikatörün indirgendiğine işaret eder. İlave brom krezol moru konarak yeniden değerlendirilmelidir. Eğer iki farklı renk tabakası oluşmuş ise tüp nazikçe çalkalandıktan sonra değerlendirme yapılmalıdır (6). Nonfermentatif bakteriler, eğer arjinin pozitif iseler, lizin ve ornitin negatif olmalıdırlar (6). Sayfa 6 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-13 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji Lizin-Ornitin-Arjinin testleri Ekler Ek-1 Aminoasit besiyerinin hazırlanması3,5 Moeller Baz Besiyeri karışımı (sıvı) Pepton Et özütü Glikoz Brom krezol moru Krezol kırmızısı Pridoksal Distile/deiyonize su 5g 5g 0.5 g 0.01 g 0.005 g 0.005 g 1000 mL* * NOT: Laboratuvar kendi tüketim hızına göre hazırlayacağı besiyeri miktarına karar vermelidir. Burada formül 1000 mL‟lik baz besiyeri için verilmiştir. Moeller Aminoasit Besiyerlerinin hazırlanması 1. Yukarıda listelenen maddeler suda eritilir; „baz besiyeri‟ karışımı elde edilir. Dört ayrı erlen alınır ve baz besiyeri bunların içine 250‟şer ml. olacak şekilde bölünür (bkz. Şekil 1) 2. Aminoasitler tartılır. Tartım son konsantrasyonda %1 aminoasit olacak miktarda (250 mL besiyerine 2.5 g aminoasit olacak şekilde) yapılır. ÖNEMLİ: L- form aminoasitler (L-lizin, L-ornitin, L-arjinin) kullanılmalıdır. Eğer DL- aminoasitler kullanılacaksa son konsantrasyon %2 olacak şekilde tartım yapılır. 3. Her bir aminoasit bir erlene olmak üzere üç erlendeki baz besiyerlerine eklenir. Dördüncü erlen aminoasit içermeyen „baz besiyeri kontrol‟ olarak bırakılır (bkz. Şekil 1). 4. Besiyerlerinin pH‟ları ölçülür; 1N NaOH kullanılarak pH 6.0‟ya ayarlanır. Güvenlik uyarısı! NaOH koroziv (tahriş edici) etkilidir! Deri ve mukozalara temasından kaçınılmalıdır. 5. 1-2 mL alikotlar halinde burgu kapaklı küçük tüplere (1275mm) dağıtılırlar. ÖNEMLİ: (i) Hem laboratuvar güvenliği gerekleri hem de metot güvenliği nedeniyle kesinlikle pamuk tıkaçlı tüpler kullanılmaz! (ii) Tüpler aynı renkte olduklarından asla gözle ayırt edilemezler; mutlaka içlerindeki besiyerini niteleyecek şekilde (lizin tüpü, ornitin tüpü, arjinin tüpü veya baz Moeller tüpü şeklinde) etiketlenmelidir. Etiketli olmayan tüpler kullanılmaz! 6. Tüpler 121°C‟de 15 dk otoklavlanır. Raf ömrü 3 aydır. Buzdolabında saklanır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-13 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 7 / 10 Lizin-Ornitin-Arjinin testleri Şekil 1. Moeller baz besiyeri ve Moeller aminoasit dekarboksilaz besiyerlerinin hazırlanması için şematik diyagram (Kaynak: Akbas E. Standard Operating Procedures (SOPs) for Laboratory Diagnosis of Communicable Diseases in the Azerbaijan Surveillance System. Azerbaijan Ministry of Health. 2013) Sayfa 8 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-13 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji Lizin-Ornitin-Arjinin testleri Ek-2 Steril mineral yağ hazırlanması Laboratuvarda çeşitli nedenlerle anaerob ortam sağlamak istendiğinde besiyeri üzerinin yağ veya benzeri maddelerle kaplanması gerekir. Mineral yağ, vaspar, petrol jeli ya da sıvı parafin bu amaç için kullanılabilir. Ancak bu maddelerin sterilizasyonunu sağlamak güçtür. Belli başlı öneriler aşağıda verilmiştir: Otoklavda sterilizasyon Mineral yağın 100 mL‟sine 1 mL distile su ilave edilir. 121°C‟de en az 45 dakika otoklavlanır (1). Pastör fırınında sterilizasyon Bazı kaynaklar otoklavdan ziyade Pastör fırınında sterilizasyon önermektedir. Özellikle vaspar ve petrol jeli sterilizasyonu söz konusu ise, 180°C‟de >2 saat tutulmalıdır (7,8). Filtrasyon ile sterilizasyon Isı uygulamaları mineral yağın bulanıklaşmasına neden olabildiğinden ve bulanıklık bazı amaçlar için dezavantaj oluşturabildiğinden mineral yağın filtrasyon ile steril edilmesi önerilir. Filtrasyon için por çapı 0.4 µm olan polikarbonat filtre kullanılmalı ve işlem dikkatli bir şekilde yapılmalıdır (9,10). Steril mineral yağ oda ısısında saklanır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-13 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 9 / 10 Lizin-Ornitin-Arjinin testleri Kaynaklar 1 Shigei J. Test methods used in the identification of commonly isolated aerobic gram-negative bacteria: Decarboxylase-Dihydrolase Tests. In: Isenberg HD (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. ASM Press, Washington D.C. 1992, p. 1.19.36 2 Bilgehan H. Arginine-lysine-ornithine dekarboksilaz besiyeri (Moeller). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. 5. Baskı, Barış Yayınları, Izmir. 2009, p. 650 3 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic bacteria. Decarboxylase-Dihydrolase Tests.In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.15.1 3.17.15.4 4 Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (Eds). Conventional and rapid microbiological methods for identification of bacteria and fungi: amino acid degradation. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed., J.B. Lippincott Company, Philadelphia. 1992, p. 117 5 Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (Eds). The Enterobacteriaceae. Chart 3-9: Decarboxylases. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed., J.B. Lippincott Company, Philadelphia. 1992, p. 179. 6 MacFaddin JF. Biochemical Tests forthe Identification of Medical Bacteria, 3rd ed. The Lippincott, Williams & Wilkins Co., Philadelphia, PA. 2000, p. 120–135. 7 Petti CA, Carroll KC. Procedures for the storage of microorganisms. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW (eds). Manual of Clinical Microbiology. 10th ed., ASM Press, Washington D.C. 2011, p. 124-131 8 Sulfite Agar. http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/ IFU/Difco_BBL/297210.pdf (son erişim: 29.12.2013) 9 Mineral oil. http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/m8410pis.pdf (son erişim: 29.12.2013) 10 BioSampler: How can you sterilize the mineral oil used in the BioSampler? http://www.skcinc.com/FAQ/skcfaqs.php?action=showEntry&data=345 (son erişim: 29.12.2013) Sayfa 10 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-13 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
© Copyright 2024 Paperzz
