close

Enter

Log in using OpenID

CAPILLARYS / MINICAP URINE

embedDownload
CAPILLARYS / MINICAP URINE
Ref. 2013
2014/06
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
NAMJENA
Komplet CAPILLARYS / MINICAP URINE namijenjen je za pripremu uzoraka mokraće prije odvajanja proteina u ljudskoj mokraći u lužnatom puferu
(pH 9,9) instrumentima CAPILLARYS i MINICAP.
Instrumenti CAPILLARYS i MINICAP automatski provode sve sekvencije kojima se dobiva profil proteina u mokraći za kvalitativnu analizu ili za
kvantitativnu analizu u instrumentu CAPILLARYS (PHORESIS verzija ≥ 8.61). Proteini, razdvojeni u silika kapilarama, izravno se detektiraju prema
adsorbanciji na 200 nm. Elektroforegrami se mogu interpretirati vizualno kako bi se ustanovilo postoje li abnormalnosti obrasca.
For In Vitro Diagnostic Use.
PRINCIP TESTA
Elektroforeza proteina je dobro poznata tehnika koja se svakodnevno primjenjuje u kliničkim laboratorijima za analizu uzoraka na abnormalnosti
proteina (3, 4, 6, 12). Instrumenti CAPILLARYS i MINICAP razvijeni su kako bi se omogućila potpuna automatizacija ovog testiranja s brzim odvajanjem i
dobrom rezolucijom. U mnogo pogleda, ova se metodologija može smatrati posrednom vrstom tehnike između klasične zonske elektroforeze i
tekućinske kromatografije (4, 14).
Instrumenti CAPILLARYS i MINICAP koriste princip kapilarne elektroforeze u slobodnoj otopini. Tom se tehnikom, u lužnatom puferu specifične pH
vrijednosti, nabijene molekule razdvajaju uslijed svoje elektroforetske mobilnosti. Odvajanje se također provodi prema pH vrijednosti elektrolita i
elektroosmotskom protoku (12).
Instrument CAPILLARYS sadrži 8 kapilara koje funkcioniraju paralelno i omogućavaju 8 istodobnih analiza. Instrument MINICAP sadrži 2 kapilare koje
funkcioniraju paralelno i omogućavaju 2 istodobne analize. Prije analize, uzorak se priprema dijalizom i ukoncentriravanjem s pomoću pufera, a zatim
se aspiracijom ubrizgava na anodnom kraju kapilare. Tada se provodi razdvajanje proteina pod visokim naponom, a direktna detekcija proteina provodi
se na 200 nm na katodnom kraju kapilare. Kapilare se odmah ispiru otopinom za ispiranje (Wash Solution) i pripremaju za sljedeću analizu s puferom.
Proteini u mokraći razdvajaju se u lužnatom puferu u pet različitih zona, i detektiraju sljedećim redoslijedom: gama zona, beta zona, alfa-2 zona, alfa-1
zona i albumin za svaku zonu koja sadrži jedan ili više proteina.
REAGENSI KOJI SE DOBIJU U KOMPLETU CAPILLARYS / MINICAP URINE
UPOZORENJE: Vidjeti sigurnosne podatke.
DIO
PN 2013
Pufer za diijalizu (gotova otopina)
ZA POSTIZANJE OPTIMALNIH REZULTATA:
Sve reagense iz istog kompleta treba uvijek upotrijebiti zajedno, i u skladu s uputama priloženima u pakovanju.
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITAJTE PRILOŽENE UPUTE.
1 bočica, 480 mL
UPOZORENJE: Nemojte koristiti deioniziranu vodu dostupnu na tržištu, kao što je na primjer voda za glačanje (opasnost od značajnog
oštećenja kapilara). Koristite jedino vodu ultra čiste kvalitete, kao što je voda za injekcije.
PUFER ZA DIJALIZU
Priprema
Bočicu gotovog pufera za dijalizu treba razrijediti dva puta (v/v) destiliranom ili deioniziranom vodom (1 volumen pufera + 1 volumen destilirane ili
deionizirane vode).
Nakon razrjeđivanja, pufer sadrži: pufersku otopinu pH 9,9 ± 0,5 i aditive koji u upotrijebljenim koncentracijama nisu štetni, a potrebni su za optimalan
učinak.
Upotreba
Pufer za dijalizu za analizu proteina u uzorcima mokraće postupkom kapilarne elektroforeze (vidjeti "Priprema uzoraka").
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Gotovi pufer za dijalizu držati na sobnoj temperaturi (15 do 30 °C) ili u hladnjaku (2 do 8 °C). Pufer je stabilan do isteka roka valjanosti naznačenog
na pakiranju ili na naljepnicama na bočici pufera. Izbjegavajte čuvanje blizu prozora ili izvora topline.
Razrijeđeni pufer za dijalizu stabilan je do isteka roka valjanosti naznačenog na pakiranju ili na naljepnicama na bočicama pufera, pri sobnoj
temperaturi ili u hladnjaku.
NAPOMENA: Kada se pufer za dijalizu čuva na temperaturi od 2 do 8 °C, preporučuje se prije upotrebe pustiti da reagens postigne sobnu
temperaturu.
NEMOJTE ZAMRZAVATI.
Ako razrijeđeni pufer promijeni izgled npr. postane mutan kao posljedica kontaminacije mikrobima, bacite ga.
NAPOMENA: Za vrijeme pohrane, gotovi pufer može postati žute boje bez ikakvih negativnih učinaka na njegovu djelotvornost.
- 189 -
INSTRUKCIJSKI LIST SEBIA - Hrvatski
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
POSTUPAK CAPILLARYS URINE
CAPILLARYS 1 i 2 verzija 5.4x
UPOZORENJE: U ovoj verziji nije moguća imunotipizacija uzoraka mokraće.
POTREBNI REAGENSI (koji se ne dobiju u kompletu CAPILLARYS / MINICAP URINE)
UPOZORENJE: Vidjeti sigurnosne podatke.
1. KOMPLET CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (SEBIA, PN 2003)
Prezentacija, upotreba, skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Vidjeti upute priložene uz komplet.
VAŽNO: Dijelovi kompleta CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 potrebni su za provedbu postupka CAPILLARYS URINE.
Neobojeni segmenti razrjeđenja koji se dobiju u kompletu CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 ne mogu se upotrijebiti za analizu uzoraka
pripremljenih u epruvetama Vivaspin® 6 ml.
2. DESTILIRANA ILI DEIONIZIRANA VODA
Upotreba
Za razrjeđivanje uzoraka mokraće ako je potrebno, i za prvu dijalizu (vidjeti "Priprema uzoraka").
Koristi se za isplahnjivanje kapilara u instrumentu za kapilarnu elektroforezu SEBIA CAPILLARYS.
Preporučuje se upotrijebiti filtriranu destiliranu ili deioniziranu vodu (filtar poroznosti ≤ 0,45 μm) te otpora iznad 10 megaohma x cm.
Kako biste spriječili kontaminaciju mikrobima, promijenite vodu svaki dan.
Za optimalan rad dodajte 35 µL/dL CLEAN PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).
VAŽNO: Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
3. CAPICLEAN
Sastav
Bočica koncentrirane otopine CAPICLEAN (SEBIA, PN 2058, 25 mL) sadrži: proteolitičke enzime, tenzide i aditive koji nisu štetni u korištenim
koncentracijama a potrebni su za optimalan učinak.
Upotreba
Za čišćenje sonde za uzorke u automatiziranom instrumentu za kapilarnu elektroforeze CAPILLARYS, SEBIA za vrijeme sekvence čišćenja
CAPICLEAN.
VAŽNO :
- Ako se u tjedan dana analizira manje od 500 uzoraka, pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN barem jednom tjedno.
- Ako se u jednom danu analizira manje od 500 uzoraka, ali se u tjedan dana analizira više od 500 uzoraka, pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN
nakon svakih 500 analiza.
- Ako se u jednom danu analizira više od 500 uzoraka, pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN barem jednom dnevno.
Vidjeti upute za CAPICLEAN, SEBIA.
VAŽNO: Ne upotrebljavajte ponovno segment razrjeđivanja nakon čišćenja sonde za uzorke.
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Otopinu CAPICLEAN čuvajte u hladnjaku (2 – 8 °C). Ona je stabilna do isteka roka trajanja naznačenog na naljepnici na bočici. NEMOJTE
ZAMRZAVATI.
Možda će se u bočici CAPICLEAN-a opaziti talog ili kombinirane čestice (flokule), ali to nema nikakvih štetnih utjecaja na upotrebu.
Nemojte otapati talog ili te čestice. Preporučuje se uzeti samo supernatant.
4. OTOPINA NATRIJEVOG HIPOKLORITA (za čišćenje sonde za uzorkovanje)
Priprema
Pripremite otopinu natrijevog hipoklorita (2 % do 3 % klorida) razrjeđivanjem 250 mL 9,6 %-tne kloridne koncentrirane otopine hladnom destiliranom
ili deioniziranom vodom do 1 litre.
Upotreba
Koristi se za čišćenje sonde za uzorkovanje u instrumentu CAPILLARYS (za tjedno održavanje kako bi se eliminirali adsorbirani proteini sa sonde).
Vidjeti priručnik s uputama za SEBIA CAPILLARYS.
•
•
•
•
Upotrijebite nosač uzorka namijenjen za održavanje (br. 100).
Stavite epruvetu koja sadrži 2 mL prethodno pripremljene razrijeđene klorirane otopine (2 – 3 %) na mjesto br. 1 na nosaču uzoraka.
Umetnite nosač uzoraka br. 100 za održavanje u instrument CAPILLARYS.
U prozorčiću "MAINTENANCE" (održavanje), koji se pojavi na zaslonu, izaberite "Launch the probe cleaning (chlorinated sodium hypochlorite
solution or CDT wash solution)", odnosno, aktivirajte čišćenje sonde (kloriranom otopinom natrijevog hipoklorita ili CDT otopinom za ispiranje) i
validirajte.
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite radnu kloriranu otopinu na sobnoj temperaturi u zatvorenoj posudi, ona je tako stabilna 3 mjeseca. Izbjegavajte skladištenje na sunčevoj
svjetlosti, blizu izvora topline ili zapaljivog izvora te blizu kiselina i amonijaka.
5. CAPILLARYS / MINICAP WASH SOLUTION
Priprema
Svaku bočicu gotove otopine za ispiranje CAPILLARYS / MINICAP Wash Solution (SEBIA, PN 2052, 2 bočice, 75 mL) treba razrijediti do 750 mL
destiliranom ili deioniziranom vodom.
Nakon razrjeđenja, otopina za ispiranje sadrži lužnatu otopinu pH ≈ 12.
- 190 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Upotreba
Za pranje kapilara u instrumentu CAPILLARYS. Kada je broj testova po seriji manji od 40, potrebna je dodatna tekućina za ispiranje.
VAŽNO: Prije punjenja spremnika otopinom za ispiranje, preporučuje se oprati otvor spremnika, konektor i epruvetu s mnogo destilirane ili deionizirane
vode kako bi se izbjeglo taloženje soli.
Vidjeti upute za detalje.
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite gotovu otopinu i radnu otopinu za ispiranje u zatvorene spremnike na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Gotova otopina za ispiranje stabilna
je do isteka roka trajanja naznačenog na kompletu ili na naljepnici bočice otopine za ispiranje. Radna otopina za ispiranje stabilna je 3 mjeseca.
Bacite radnu otopinu za ispiranje ako promijeni izgled, npr. postane zamućena zbog kontaminacije mikrobima.
NAPOMENE:
Testovi koji su provedeni za validaciju reagensa pokazali su da za različite otopine te uz primjenu opreme prilagođene volumenu za rekonstituciju,
varijacija od ± 5 % za konačni volumen nema štetni učinak na analizu.
U destiliranoj ili deioniziranoj vodi koja se upotrebljava za rekonstituiranje otopina ne smije postojati proliferacija bakterija i plijesni (upotrijebiti filtar
≤ 0.45 µm) i treba imati otpornost veću od 10 megohms x cm.
POTREBNA OPREMA I DODACI
1. Instrument CAPILLARYS, SEBIA: CAPILLARYS PN 1220 ili CAPILLARYS 2 PN 1222.
2. Nosači uzoraka isporučeni uz CAPILLARYS.
3. Komplet spremnika isporučen uz CAPILLARYS: Spremnik za isplahnjivanje (za punjenje destiliranom ili deioniziranom vodom) i spremnik za
otpad.
4. Za dijalizu i ukoncentriravanje uzoraka mokraće:
- Sustav za dijalizu SEBIA, PN 9200: 24 epruvete od 20 mL s PES membranom 10 000 MWCO (granična vrijednost molekulske mase
10 KDa),
ili
- Sustav za dijalizu i ukoncentriravanje tipa Vivaspin® 6 ml, s PES membranom 10 000 MWCO (granična vrijednost molekulske mase
10 KDa), VIVASCIENCE,
ili ekvivalentni uređaj kojim se postiže jednaka učinkovitost, i odobren je za kliničke testove.
VAŽNO: Molimo pažljivo pročitajte upute priložene uz svaki uređaj za dijalizu i ukoncentriravanje.
5. Centrifuga s vodoravnom osi, s rotorima za epruvete promjera 17 mm i duljine 122 mm (kada se koriste epruvete Vivaspin® 6 ml) ili za epruvete
promjera 30 mm i duljine 116 mm (kada se upotrebljavaju sustavi za dijalizu SEBIA).
6. Zeleni segmenti razrjeđenja SEBIA, PN 2081, za instrument CAPILLARYS, za analizu uzoraka pripremljenih u epruvetama Vivaspin® 6 ml.
7. Pipete: 200 µL, 1 mL i 5 mL.
UZORCI ZA ANALIZU
Skupljanje i čuvanje uzoraka
Analizu je poželjno provoditi na svježim uzorcima mokraće prikupljenim u roku od 24 sata. Uzorke mokraće treba uzimati prema ustanovljenim
postupcima koji se koriste u kliničkim laboratorijskim testiranjima.
NAPOMENA: Iako su za analizu najprikladniji uzorci mokraće prikupljeni u roku od 24 sata, slučajno uzeti uzorci također se mogu upotrijebiti za
kvalitativnu analizu.
Uzorci mogu biti pohranjeni na temperaturi od 2 do 8 °C najviše do sedam dana.
Za duža razdoblja čuvanja, preporučuje se uzorke čuvati zamrznute na - 70 °C (stabilni su najmanje mjesec dana).
VAŽNO: Ne čuvajte uzorke na - 20 °C.
Odmrznuti ili nepravilno pohranjeni uzorci mogu pokazati modificirane ili dodatne frakcije uslijed degradacije proteina.
NAPOMENA: Uzorci mokraće ne smiju se čuvati na sobnoj temperaturi!
Priprema uzorka
Za najbolji oporavak proteina mokraće, izrazito se preporučuje upotreba centrifuge za korak uklanjanja soli / ukoncentriravanje uzorka u
ovoj analizi.
VAŽNO: Tehnika analize mokraće kapilarnom elektroforezom zahtijeva 2 koraka: korak dijalize i korak ukoncentriravanja uzoraka mokraće sustavima
za dijalizu SEBIA (epruvete 20 mL) ili Vivaspin® epruvete 6 ml Upotrijebite samo jednu epruvetu po uzorku.
Za upotrebu sustava za dijalizu SEBIA ili Vivaspin® epruveta 6 ml s centrifugom vodoravne osi, određeni su dalje navedeni parametri.
Molimo pažljivo pročitajte upute priložene uz svaki uređaj za dijalizu ili ukoncentriravanje za upotrebu uz centrifugu nepromjenjivog kuta.
Prije nego što nastavite s analizom, svaki uzorak pripremite prema jednom od sljedećih postupaka:
NAPOMENA: Razrijedite dva puta (v/v) gotovi pufer za dijalizu destiliranom ili deioniziranom vodom, kako biste dobili radni pufer za dijalizu (1 volumen
pufera + 1 volumen destilirane ili deionizirane vode).
Priprema uzoraka sustavima za dijalizu SEBIA (samo neobojeni segmenti razrjeđenja isporučeni su u kompletu CAPILLARYS PROTEIN(E) 6)
1. Provedite kvantifikaciju ukupne koncentracije proteina u uzorku mokraće za analizu.
2. Centrifugirajte 5 mL nerazrijeđene mokraće na 4 300 g* u trajanju od 10 minuta.
3. Skupite supernatant.
- 191 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
4. Pripremite svaki uzorak u novom sustavu za dijalizu prema ukupnoj koncentraciji proteina u uzorku:
- Ako je ukupna koncentracija proteina manja od 100 mg/dL: izmiješajte u epruveti uzorak mokraće od 1 mL i 9 mL destilirane ili deionizirane
vode.
- Ako je ukupna koncentracija proteina između 100 i 300 mg/dL: izmiješajte u epruveti uzorak mokraće od 0,25 mL i 10 mL destilirane ili
deionizirane vode.
- Ako je ukupna koncentracija proteina veća od 300 mg/dL: najprije destiliranom ili deioniziranom vodom razrijedite uzorak mokraće do
koncentracije proteina od 300 mg/dL; zatim u epruveti izmiješajte 0,25 mL razrijeđene mokraće i 10 mL destilirane ili deionizirane vode.
5. Homogenizirajte razrijeđeni uzorak mokraće.
6. Ekvilibrirajte epruvete destiliranom ili deioniziranom vodom i centrifugirajte na 4 000 g* u trajanju od 30 minuta.
UPOZORENJE: Nakon koncentriranja centrifugiranjem, dobiveni volumen mora biti najviše 0,2 mL.
7. Dodajte 10 mL radnog pufera za dijalizu po sustavu za dijalizu.
8. Ekvilibrirajte epruvete radnim puferom za dijalizu i centrifugirajte na 4 000 g* u trajanju od 30 minuta.
9. Ako je nakon centrifugiranja konačni volumen manji od 0,2 mL, dodajte radni pufer za dijalizu do konačnog volumena od 0,2 mL (nakon što se
uspostavila ravnoteža donje razine meniskusa).
10. Homogenizirajte uzorak u epruveti.
11. Uzmite 200 µL dijaliziranog uzorka mokraće i nanesite izravno u jažicu novog neobojanog segmenta razrjeđenja.
12. Bacite sustav za dijalizu.
ili
Priprema uzoraka u Vivaspin® epruvetama od 6 ml (i samo sa zelenim segmentima razrjeđenja)
1. Provedite kvantifikaciju ukupne koncentracije proteina u uzorku mokraće za analizu.
2. Centrifugirajte 5 mL nerazrijeđene mokraće na 4 300 g* u trajanju od 10 minuta.
3. Skupite supernatant.
4. Pripremite svaki uzorak u novoj Vivaspin® epruveti 6 ml prema ukupnoj koncentraciji proteina u uzorku:
- Ako je ukupna koncentracija proteina manja od 100 mg/dL: izmiješajte u epruveti 0,5 mL uzorka mokraće i 5,5 mL destilirane ili deionizirane
vode.
- Ako je ukupna koncentracija proteina između 100 i 300 mg/dL: izmiješajte u epruveti 0,125 mL uzorka mokraće i 6 mL destilirane ili
deionizirane vode.
- Ako je ukupna koncentracija proteina veća od 300 mg/dL: najprije destiliranom ili deioniziranom vodom razrijedite uzorak mokraće do
koncentracije proteina od 300 mg/dL; zatim u epruveti izmiješajte 0,125 mL razrijeđene mokraće i 6 mL destilirane ili deionizirane vode.
5. Homogenizirajte razrijeđeni uzorak mokraće.
6. Ekvilibrirajte epruvete destiliranom ili deioniziranom vodom i centrifugirajte na 3.500 g* u trajanju od 30 minuta.
UPOZORENJE: Nakon koncentriranja centrifugiranjem, dobiveni volumen mora biti najviše 0,1 mL.
7.
8.
9.
10.
Bacite otopinu koja se nalazi u donjem dijelu Vivaspin® epruvete.
Dodajte 6 mL radnog pufera za dijalizu po Vivaspin® epruveti.
Ekvilibrirajte epruvete radnim puferom za dijalizu i centrifugirajte na 3 500 g* u trajanju od 30 minuta.
Ako je nakon centrifugiranja konačni volumen manji od 0,1 mL, dodajte radni pufer za dijalizu do konačnog volumena od 0,1 mL (nakon što se
uspostavila ravnoteža donje razine meniskusa).
11. Homogenizirajte uzorak u epruveti.
12. Uzmite 100 µL dijaliziranog uzorka mokraće i nanesite izravno u jažicu novog zelenog segmenta razrjeđenja.
13. Bacite Vivaspin® epruvetu.
VAŽNO: Nakon pripreme, uzorke mokraće analizirajte unutar najviše jednog dana. Da biste ograničili adsorpciju proteina na membranu uređaja za
dijalizu i ukoncentriravanje (Vivaspin® epruveta 6 ml ili sustav za dijalizu SEBIA), ne preporučuje se uzorak staviti u epruvetu nakon centrifugiranja
nego u mikroepruvetu, i pohraniti u hladnjaku (između 2 i 8 °C).
* Za izračun broja okretaja u minuti odgovarajućeg za rotor, pogledajte priručnik s uputama za centrifugu.
Upute za upotrebu uređaja za dijalizu i ukoncentriravanje s centrifugom vodoravne osi razlikuju se od uputa za centrifugu nepromjenjivog kuta, zato
pažljivo pogledajte odgovarajuće upute.
Uzorci koje treba izbjegavati
• Izbjegavajte stare, nepravilno pohranjene uzorke mokraće jer će frakcije zbog denaturacije biti izmijenjene.
• Preporučuje se provjeriti svojstva uzorka mokraće nakon prvog centrifugiranja (4 300 g u trajanju od 10 minuta) (npr. znakove hemolize ili
zamućenosti).
• Ne pohranjujte uzorke u uređaje za dijalizu i ukoncentriravanje, jer bi se neki proteini mogli vezati na membranu.
• Ne držite dijalizirane uzorke mokraće u segmentu razrjeđenja dulje od 30 minuta.
POSTUPAK
Instrument CAPILLARYS je višeparametarski instrument za analizu proteina u mokraći na 8 paralelnih kapilara sljedećim redoslijedom:
• Očitavanje bar koda na nosačima uzoraka;
• Ispiranje kapilara;
• Ubrizgavanje uzoraka;
• Analiza proteina i izravna detekcija na kapilarama.
- 192 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Koraci koji se provode ručno, uključuju:
• Priprema uzoraka (dijaliza i ukoncentriravanje);
• Nanošenje uzoraka u jažice segmenta razrjeđenja (neobojani ili zeleni segment razrjeđenja, ovisno o uređaju za dijalizu i ukoncentriravanje);
• Stavljanje segmenata razrjeđenja s uzorcima na nosače uzoraka i identifikacija uzoraka;
• Umetanje nosača u instrument CAPILLARYS;
• Vađenje nosača uzoraka nakon analize.
MOLIMO VAS PAŽLJIVO PROČITAJTE PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA CAPILLARYS.
I. PRIPREMA ELEKTROFORETSKE ANALIZE
1. Uključite instrument CAPILLARYS i kompjutor.
2. Pokrenite softver i instrument će se pokrenuti automatski.
3. Analizirajte uzorke mokraće pripremljene upotrebom kompleta CAPILLARYS URINE pomoću programa analize "URINE" na instrumentu
CAPILLARYS, i primjenom pufera CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. Za izbor programa "URINE" i stavljanje bočice s puferom CAPILLARYS
PROTEIN(E) 6 u instrument, pažljivo pročitajte priručnik s uputama za CAPILLARYS.
4. Stavite na nosač uzoraka novi segment razrjeđenja napunjen dijaliziranim uzorcima mokraće: 100 µL uzorka po jažici zelenog segmenta
razrjeđenja ili 200 µL uzorka po jažici neobojanog segmenta razrjeđenja. Ako segment nedostaje, nosač uzorka bit će izbačen.
VAŽNO: Ako je broj uzoraka za analizu manji od 8, dopunite segment razrjeđenja destiliranom ili deioniziranom vodom.
5. Umetnite cijeli nosač/nosače uzoraka u instrument CAPILLARYS kroz otvor u sredini instrumenta. Sukcesivno i kontinuirano, u instrument
može biti umetnuto do 4 nosača uzoraka.
6. Uklonite analizirane nosače s ploče na lijevoj strani instrumenta.
7. Sa svakog nosača pažljivo skinite upotrijebljene segmente razrjeđenja i bacite ih.
UPOZORENJE: Segmentima razrjeđenja s biološkim uzorcima treba pažljivo rukovati.
RAZRJEĐIVANJE - MIGRACIJA - OPIS AUTOMATIZIRANIH KORAKA
1.
2.
3.
4.
5.
Očitani su bar kodovi na nosačima uzoraka sa segmentima razrjeđenja i uzorcima mokraće za analzu.
Kapilare su oprane.
Uzorci se ubrizgavaju u kapilare.
Migracija se provodi pod konstantnim naponom kontrolirana Peltierovim efektom, u trajanju od otprilike 4 minute.
Proteini se detektiraju izravno, skeniranjem na 200 nm, a na zaslonu instrumenta pojavi se elektroforetski profil.
NAPOMENA: Ovi koraci opisani su za prvi umetnuti nosač uzorka. Elektroforetski obrasci pojave se nakon 10 minuta. Za sljedeći nosač uzoraka, prvi
korak (očitavanje bar koda) provodi se za vrijeme analize prethodnog nosača.
II. ANALIZA REZULTATA
Na kraju analize mogu se analizirati elektroforetski profili i vizualno interpretirati nepravilnosti obrasca. Na zaslonu i u izvješću rezultata identificiraju
se različiti položaji zone proteina (albumin, alfa 1, alfa 2, beta i gama).
NAPOMENA: U svakom od ova 3 postupka pripreme uzorka, opseg obrasca vizualiziranog na y osi zaslona uzima u obzir ukupnu koncentraciju
proteina svakog analiziranog uzorka.
MOLIMO VAS PAŽLJIVO PROČITAJTE PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA CAPILLARYS.
III. KRAJ CIKLUSA ANALIZE
Na kraju svakog ciklusa analize, osoba koja provodi analizu mora na instrumentu CAPILLARYS pokrenuti postupak "stand by" (spremno) ili "shut
down" (isključivanje) kako bi kapilare ostale u optimalnim uvjetima.
IV. PUNJENJE SPREMNIKA ZA REAGENS
Instrument CAPILLARYS ima automatsku kontrolu reagensa.
VAŽNO: Molimo pogledajte upute za zamjenu spremnika za reagens, vodeći računa o boji koda za bočice i konektore.
Pojavit će se poruka kada bude potrebno obaviti neki od sljedećih zadataka:
• staviti novu bočicu s puferom i / ili;
• napuniti spremnik radnom otopinom za ispiranje i / ili;
• napuniti spremnik filtriranom destiliranom ili deioniziranom vodom za isplahnjivanje kapilara i / ili;
• isprazniti spremnik za otpadni materijal.
UPOZORENJE: Nemojte koristiti deioniziranu vodu dostupnu na tržištu, kao što je na primjer voda za glačanje (opasnost od značajnog
oštećenja kapilara). Koristite jedino vodu ultra čiste kvalitete, kao što je voda za injekcije.
VAŽNO: Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
MOLIMO VAS PAŽLJIVO PROČITAJTE PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA CAPILLARYS.
REZULTATI
Tumačenje
Tumačenje je kvalitativno.
Kao pomoć u interpretaciji, rezultati se mogu prekriti obrascem za normalni kontrolni serum (SEBIA, PN 4785) kao referentnim obrascem.
Rekonstituirajte liofilizirani serum destiliranom ili deioniziranom vodom, razrijedite 40 puta u radnom puferu za dijalizu i razrijeđeni serum analizirajte
izravno kao uzorak mokraće.
- 193 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Fiziološka proteinurija (1, 2, 7, 8, 9, 13): Ona je slaba, najčešće manja od 120 mg / 24 sata i nema značajne razlike između elektroforetskih profila muškaraca
i žena. Najvažniji protein je albumin povezan s tragovima transferina i imunoglobulina. Proteinurija viša od 120 mg / 24 sata mora se smatrati
patološkom.
U slučaju pozitivne proteinurije (> 120 mg / 24 sata) treba nastaviti s kvalitativnom analizom eliminiranih proteina (5).
Elektroforeza uzoraka mokraće provodi se kako bi se detektirale monoklonske komponente, posebice Bence Jones protein (slobodni laki lanac) te
drugi proteini u mokraći. U usporedbi s normalnim obrascem, dodatna frakcija, a osobito u zoni gamaglobulina ili betaglobulina, povezuje se s
poremećajem (9, 10, 11).
Elektroforeza mokraće učinkovita je za detekciju monoklonskih komponenti (monoklonskih imunoglobulina ili slobodnih lakih lanaca) u niskim
koncentracijama od otprilike 2,0 mg/dL.
Za karakterizaciju monoklonskih ili oligoklonskih komponenti, preporučuje se identifikacija imunofiksacijom primjenom kompleta HYDRAGEL BENCE
JONES, HYDRAGEL IF i HYDRAGEL URINE PROFIL(E) SEBIA i specifičnih antiseruma anti-slobodnih kapa i lambda lakih lanaca.
Komplementarni testovi, kao što je elektroforeza primjenom kompleta SEBIA HYDRAGEL PROTEINURIE ili HYDRAGEL URINE PROFIL(E), ili
nefelometrijski imunološki testovi, potrebni su za karakterizaciju u slučaju sumnje na tubularnu, glomerularnu ili miješanu proteinuriju nakon kapilarne
elektroforeze (3).
Za pomoć pri interpretaciji elektroforegrama proteina mokraće, vidjeti BIBLIOGRAFIJU.
Posebni slučajevi:
- Uzorci mokraće s koncentracijom ukupnih proteina ispod 15 mg/dL (prije pripreme za analizu) mogu pokazati proteine u podlozi (razmaz) po cijelom
obrascu.
- Kada se sumnja na abnormalnost u beta ili gama zoni, preporučuje se dalje provesti analizu na Bence Jones protein, bez obzira na koncentraciju
ukupnih proteina.
Međudjelovanje i ograničenja
Vidjeti UZORCI ZA ANALIZU.
Analizirajte samo uzorke pripremljene uređajima za dijalizu i ukoncentriravanje, vidjeti POTREBNA OPREMA I DODACI, kao što su Vivaspin®
epruvete 6 ml, sustavi za dijalizu SEBIA ili ekvivalentni uređaji kojima se postiže jednaka učinkovitost i odobreni su za kliničke testove.
Neodgovarajuća dijaliza uzorka može dovesti do ne-proteinskih rezidualnih frakcija. Ako se sumnja na interferencijsku frakciju, preporuka je ponovo
dijalizirati uzorak mokraće.
Interferencije kao što su lijek ili soli, eliminiraju se tijekom koraka dijalize. Ako se ovaj korak ne provodi pažljivo, vršci koji se opažaju mogu biti
artefaktualni.
Zbog rezolucije i granica osjetljivosti zonske elektroforeze, moguće je da se ovom metodom neki proteini u mokraći ne mogu detektirati.
Rješavanje problema
Nazovite tvrtku SEBIA ako test ne uspije iako ste se pažljivo pridržavali uputa za pripremu, pohranu materijala i provođenje postupka.
Sigurnosni podaci za komplet reagensa i informacije o čišćenju i zbrinjavanju otpadnih tvari, označavanju i pravilima sigurnosti koje primjenjuje SEBIA,
pakovanja za transport bioloških uzoraka i čišćenje instrumenata, dostupni su na DVD-u "UPUTE I SIGURNOSNI PODACI".
- 194 -
CAPILLARYS 1 i 2 (PHORESIS verzija ≥ 6.x)
CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING (PHORESIS verzija ≥ 8.60)
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
NAPOMENA: U ovim uputama, naziv "CAPILLARYS" koristi se za automatizirane instrumente CAPILLARYS, CAPILLARYS 2 i CAPILLARYS 2 FLEXPIERCING.
POTREBNI REAGENSI (koji se ne dobiju u kompletu CAPILLARYS / MINICAP URINE)
UPOZORENJE: Vidjeti sigurnosne podatke.
1. KOMPLET CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (SEBIA, PN 2003)
Prezentacija, upotreba, skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Vidjeti upute priložene uz komplet.
VAŽNO: Dijelovi kompleta CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 potrebni su za provedbu postupka CAPILLARYS URINE.
UPOZORENJE: Ne koristite neobojene segmente razrjeđenja koji se nalaze u kompletu CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 za analizu uzoraka
tehnikom CAPILLARYS URINE.
2. NORMALAN KONTROLNI SERUM
Sastav
Normalan kontrolni serum (Normal Control Serum, SEBIA, PN 4785) dobiva se iz skupa normalnih ljudskih seruma. Normalan kontrolni serum nalazi
se u stabiliziranom liofiliziranom obliku.
Namjena
Normalan kontrolni serum namijenjen je za normalizaciju kapilara prije početka nove sekvence analize te za kontrolu migracije proteina u ljudskoj
mokraći postupkom elektroforeze CAPILLARYS URINE.
Rekonstituirajte svaku bočicu normalnog kontrolnog seruma s 1 mL destilirane ili deionizirane vode. Pustite stajati 30 minuta i lagano promiješajte
(izbjeći stvaranje pjene).
Rekonstituirani normalan kontrolni serum treba koristiti kao normalni ljudski serum.
Za normalizaciju kapilara vidjeti odjeljak "Priprema elektroforetske analize".
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Prije rekonstitucije liofilizirani normalan kontrolni serum čuvajte u hladnjaku (2 do 8 °C). Stabilan je do isteka roka valjanosti naznačenog na kutiji ili
na naljepnicama bočica.
Rekonstituirani normalan kontrolni serum pohranite na temperaturi 2 – 8 °C. Zbog opasnosti od kontaminacije mikrobima i denaturacije, upotrijebite
ga unutar tjedan dana.
Osim toga, rekonstituirani serum može se zamrznuti (u alikvotima) i čuvati na temperaturi od - 18 / - 30 °C najviše 6 mjeseci.
Prije upotrebe držite odmrznuti normalan kontrolni serum na temperaturi 2 – 8 °C i upotrijebite unutar istog dana.
NAPOMENA: Za optimalnu upotrebu u instrumentu CAPILLARYS, preporučuje se prije zamrzavanja razdijeliti normalan kontrolni serum u
mikroepruvete u alikvotima.
NAPOMENA: Tijekom prijevoza, liofilizirani kontrolni serum može se držati izvan hladnjaka (na temperaturi od 15 do 30 °C) u trajanju od 15 dana bez
negativnih učinaka na njegovu djelotvornost.
Nijedna metoda testiranja ne može u potpunosti jamčiti odsutnost virusa HIV-a, hepatitisa B i C ili drugih uzročnika zaraze. Stoga postupajte s
kontrolnim serumom kao s opasnim biološkim materijalom.
Ova serija kontrolnog seruma ustanovljena je kao negativna u ispitivanjima koje je odobrila FDA ili neka ekvivalentna regulatorna agencija EU:
- protiv površinskog antigena hepatitisa B;
- za antitijela protiv HCV;
- za antitijela protiv HIV1 i HIV2.
3. DESTILIRANA ILI DEIONIZIRANA VODA
Upotreba
Za razrjeđivanje uzoraka mokraće ako je potrebno, i za prvu dijalizu (vidjeti "Priprema uzoraka").
Koristi se za isplahnjivanje kapilara u instrumentu za kapilarnu elektroforezu SEBIA CAPILLARYS.
Preporučuje se upotrijebiti filtriranu destiliranu ili deioniziranu vodu (filtar poroznosti ≤ 0,45 μm) te otpora iznad 10 megaohma x cm.
Kako biste spriječili kontaminaciju mikrobima, promijenite vodu svaki dan.
Za optimalan rad dodajte 35 µL/dL CLEAN PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).
VAŽNO: Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
4. CAPICLEAN
Sastav
Bočica koncentrirane otopine CAPICLEAN (SEBIA, PN 2058, 25 mL) sadrži: proteolitičke enzime, tenzide i aditive koji nisu štetni u korištenim
koncentracijama a potrebni su za optimalan učinak.
Upotreba
Za čišćenje sonde za uzorke u automatiziranom instrumentu za kapilarnu elektroforezu CAPILLARYS, SEBIA za vrijeme sekvence čišćenja
CAPICLEAN.
- 195 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
VAŽNO :
- Ako se u tjedan dana analizira manje od 500 uzoraka, pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN barem jednom tjedno.
- Ako se u jednom danu analizira manje od 500 uzoraka, ali se u tjedan dana analizira više od 500 uzoraka, pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN
nakon svakih 500 analiza.
- Ako se u jednom danu analizira više od 500 uzoraka, pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN barem jednom dnevno.
Vidjeti upute za CAPICLEAN, SEBIA.
VAŽNO: Ne upotrebljavajte ponovno segment razrjeđivanja nakon čišćenja sonde za uzorke.
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Otopinu CAPICLEAN čuvajte u hladnjaku (2 – 8 °C). Ona je stabilna do isteka roka trajanja naznačenog na naljepnici na bočici. NEMOJTE
ZAMRZAVATI.
Možda će se u bočici CAPICLEAN-a opaziti talog ili kombinirane čestice (flokule), ali to nema nikakvih štetnih utjecaja na upotrebu.
Nemojte otapati talog ili te čestice. Preporučuje se uzeti samo supernatant.
5. OTOPINA NATRIJEVOG HIPOKLORITA (za čišćenje sonde za uzorkovanje)
Priprema
Pripremite otopinu natrijevog hipoklorita (2 % do 3 % klorida) razrjeđivanjem 250 mL 9,6 %-tne kloridne koncentrirane otopine hladnom destiliranom
ili deioniziranom vodom do 1 litre.
Upotreba
Koristi se za čišćenje sonde za uzorkovanje u instrumentu CAPILLARYS (za tjedno održavanje kako bi se eliminirali adsorbirani proteini sa sonde).
Vidjeti priručnik s uputama za SEBIA CAPILLARYS.
•
•
•
•
Upotrijebite nosač uzorka namijenjen za održavanje (br. 100).
Stavite epruvetu koja sadrži 2 mL prethodno pripremljene razrijeđene klorirane otopine (2 – 3 %) na mjesto br. 1 na nosaču uzoraka.
Umetnite nosač uzoraka br. 100 za održavanje u instrument CAPILLARYS.
U prozorčiću "MAINTENANCE" (održavanje), koji se pojavi na zaslonu, izaberite "Launch the probe cleaning (chlorinated sodium hypochlorite
solution or CDT wash solution)", odnosno, aktivirajte čišćenje sonde (kloriranom otopinom natrijevog hipoklorita ili CDT otopinom za ispiranje) i
validirajte.
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite radnu kloriranu otopinu na sobnoj temperaturi u zatvorenoj posudi, ona je tako stabilna 3 mjeseca. Izbjegavajte skladištenje na sunčevoj
svjetlosti, blizu izvora topline ili zapaljivog izvora te blizu kiselina i amonijaka.
6. CAPILLARYS / MINICAP WASH SOLUTION
Priprema
Svaku bočicu gotove otopine za ispiranje CAPILLARYS / MINICAP Wash Solution (SEBIA, PN 2052, 2 bočice, 75 mL) treba razrijediti do 750 mL
destiliranom ili deioniziranom vodom.
Nakon razrjeđenja, otopina za ispiranje sadrži lužnatu otopinu pH ≈ 12.
Upotreba
Za pranje kapilara u instrumentu CAPILLARYS. Kada je broj testova po seriji manji od 40, potrebna je dodatna tekućina za ispiranje.
VAŽNO: Prije punjenja spremnika otopinom za ispiranje, preporučuje se oprati otvor spremnika, konektor i epruvetu s mnogo destilirane ili deionizirane
vode kako bi se izbjeglo taloženje soli.
Vidjeti upute za detalje.
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite gotovu otopinu i radnu otopinu za ispiranje u zatvorene spremnike na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Gotova otopina za ispiranje stabilna
je do isteka roka trajanja naznačenog na kompletu ili na naljepnici bočice otopine za ispiranje. Radna otopina za ispiranje stabilna je 3 mjeseca.
Bacite radnu otopinu za ispiranje ako promijeni izgled, npr. postane zamućena zbog kontaminacije mikrobima.
NAPOMENE:
Testovi koji su provedeni za validaciju reagensa pokazali su da za različite otopine te uz primjenu opreme prilagođene volumenu za rekonstituciju,
varijacija od ± 5 % za konačni volumen nema štetni učinak na analizu.
U destiliranoj ili deioniziranoj vodi koja se upotrebljava za rekonstituiranje otopina ne smije postojati proliferacija bakterija i plijesni (upotrijebiti filtar
≤ 0.45 µm) i treba imati otpornost veću od 10 megohms x cm.
POTREBNA OPREMA I DODACI
1. SEBIA CAPILLARYS instrument: CAPILLARYS PN 1220, CAPILLARYS 2 PN 1222 ili CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING PN 1227.
2. Nosači uzoraka isporučeni uz CAPILLARYS.
3. Komplet spremnika isporučen uz CAPILLARYS: Spremnik za isplahnjivanje (za punjenje destiliranom ili deioniziranom vodom) i spremnik za
otpad.
4. Sustav za dijalizu SEBIA, PN 9200, 24 epruvete od 20 mL s PES membranom 10 000 MWCO (granična molekulska masa 10 KDa) za dijalizu i
ukoncentriravanje uzoraka mokraće,
ili ekvivalentni uređaj kojim se postiže jednaka učinkovitost i odobren je za kliničke testove a kojim se dobiva konačni volumen dijaliziranog i
ukoncentriranog uzorka mokraće od 500 µL (volumen uzorka potreban kako bi se mogla provesti analiza tehnikama CAPILLARYS URINE i
IMMUNOTYPING URINE).
VAŽNO: Molimo pažljivo pročitajte upute priložene uz svaki uređaj za dijalizu i ukoncentriravanje.
5.
6.
7.
8.
9.
Centrifuga s vodoravnom osi i rotorima za epruvete promjera 30 mm i dužine 116 mm, kada se koriste sustavi za dijalizu SEBIA.
Zeleni segmenti razrjeđenja SEBIA, PN 2081, za instrument CAPILLARYS.
Pipete: 200 µL, 1 mL i 5 mL.
Mikroepruvete 1,5 mL.
Epruvete za hemolizu (visine 75 mm, promjera 13 mm).
- 196 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
UZORCI ZA ANALIZU
Skupljanje i čuvanje uzoraka
Analizu je poželjno provoditi na svježim uzorcima mokraće prikupljenim u roku od 24 sata. Uzorke mokraće treba uzimati prema ustanovljenim
postupcima koji se koriste u kliničkim laboratorijskim testiranjima.
NAPOMENA: Iako su za analizu najprikladniji uzorci mokraće prikupljeni u roku od 24 sata, slučajno uzeti uzorci također se mogu upotrijebiti za
kvalitativnu analizu.
Uzorci mogu biti pohranjeni na temperaturi od 2 do 8 °C najviše do sedam dana.
Za duža razdoblja čuvanja, preporučuje se uzorke čuvati zamrznute na - 70 °C (stabilni su najmanje mjesec dana).
VAŽNO: Ne čuvajte uzorke na - 20 °C.
Odmrznuti ili nepravilno pohranjeni uzorci mogu pokazati modificirane ili dodatne frakcije uslijed degradacije proteina.
NAPOMENA: Uzorci mokraće ne smiju se čuvati na sobnoj temperaturi!
Priprema uzoraka (sustavima za dijalizu SEBIA)
Za najbolji oporavak proteina mokraće, izrazito se preporučuje upotreba centrifuge za korak uklanjanja soli / ukoncentriravanje uzorka u
ovoj analizi.
VAŽNO: Tehnika analize mokraće kapilarnom elektroforezom zahtijeva 2 koraka: korak dijalize i korak ukoncentriravanja uzoraka mokraće sustavima
za dijalizu SEBIA (epruvete 20 mL). Upotrijebite samo jednu epruvetu po uzorku.
Za upotrebu sustava za dijalizu SEBIA s centrifugom vodoravne osi indicirani su sljedeći parametri. Molimo pažljivo pročitajte upute
priložene uz svaki uređaj za dijalizu ili ukoncentriravanje za upotrebu uz centrifugu nepromjenjivog kuta.
Prije nego što nastavite s analizom, svaki uzorak pripremite prema sljedećem postupku:
NAPOMENA: Razrijedite dva puta (v/v) gotovi pufer za dijalizu destiliranom ili deioniziranom vodom, kako biste dobili radni pufer za dijalizu (1 volumen
pufera + 1 volumen destilirane ili deionizirane vode).
1. Provedite kvantifikaciju ukupne koncentracije proteina u uzorku mokraće za analizu.
UPOZORENJE: Za kvantitativno određivanje monoklonske komponente radi praćenja bolesnika, potrebno je upotrijebiti uvijek istu
tehniku kvantifikacije proteina u mokraći.
2. Centrifugirajte 5 mL nerazrijeđene mokraće na 4 300 g* u trajanju od 10 minuta.
3. Skupite supernatant.
4. Pripremite svaki uzorak u novom sustavu za dijalizu prema ukupnoj koncentraciji proteina u uzorku:
- Ako je ukupna koncentracija proteina manja od 100 mg/dL: izmiješajte u epruveti 2 mL uzorka mokraće i 18 mL destilirane ili deionizirane
vode.
- Ako je ukupna koncentracija proteina između 100 i 300 mg/dL: izmiješajte u epruveti 0,5 mL uzorka mokraće i 19,5 mL destilirane ili
deionizirane vode.
- Ako je ukupna koncentracija proteina veća od 300 mg/dL: najprije destiliranom ili deioniziranom vodom razrijedite uzorak mokraće do
koncentracije proteina od 300 mg/dL; zatim u epruveti izmiješajte 0,5 mL razrijeđene mokraće i 19,5 mL destilirane ili deionizirane vode.
5. Homogenizirajte razrijeđeni uzorak mokraće.
6. Ekvilibrirajte epruvete destiliranom ili deioniziranom vodom i centrifugirajte na 4 000 g* u trajanju od 40 minuta.
UPOZORENJE: Nakon koncentriranja centrifugiranjem, dobiveni volumen mora biti najviše 0,5 mL.
7. Za dijalizu, dodajte po sustavu za dijalizu 20 mL radnog pufera za dijalizu.
8. Ekvilibrirajte epruvete radnim puferom za dijalizu i centrifugirajte na 4 000 g* u trajanju od 40 minuta.
9. Nakon centrifugiranja, dio uzorka može ostati na gornjoj ravnoj zoni sustava za dijalizu (vidjeti sliku). Uz pomoć mikropipete skupite uzorak i
prenesite ga u donju jažicu dijaliznog sustava. Ako je nakon centrifugiranja konačni volumen manji od 0,5 mL, dodajte radni pufer za dijalizu do
konačnog volumena od 0,5 mL (nakon što se uspostavila ravnoteža donje razine meniskusa).
1
0.75
0.5
0.2
10. Homogenizirajte uzorak u epruveti.
11. Skupite dijaliziranu mokraću koja je ostala u epruveti, i stavite je u mikroepruvetu od 1,5 mL.
12. Bacite sustav za dijalizu.
VAŽNO: Nakon pripreme, uzorke mokraće analizirajte unutar najviše jednog dana. Da biste ograničili adsorpciju proteina na membranu uređaja za
dijalizu i ukoncentriravanje (sustav za dijalizu SEBIA), ne preporučuje se nakon centrifugiranja uzorak držati u dijaliznom sustavu, nego u
mikroepruveti pohraniti u hladnjak (između 2 i 8 °C).
* Za izračun broja okretaja u minuti odgovarajućeg za rotor, pogledajte priručnik s uputama za centrifugu.
- 197 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Upute za upotrebu uređaja za dijalizu i ukoncentriravanje s centrifugom vodoravne osi, razlikuju se od uputa za centrifugu nepromjenjivog kuta. Gore
navedeni parametri odnose se na upotrebu sustava za dijalizu SEBIA s centrifugom vodoravne osi. Molimo pažljivo pročitajte upute priložene uz svaki
uređaj za dijalizu ili ukoncentriravanje za upotrebu uz centrifugu nepromjenjivog kuta.
Uzorci koje treba izbjegavati
• Izbjegavajte stare, nepravilno pohranjene uzorke mokraće jer će frakcije zbog denaturacije biti izmijenjene.
• Preporučuje se provjeriti svojstva uzorka mokraće nakon prvog centrifugiranja (4 300 g u trajanju od 10 minuta) (npr. znakove hemolize ili
zamućenosti).
• Ne pohranjujte uzorke u uređaje za dijalizu i ukoncentriravanje, jer bi se neki proteini mogli vezati na membranu.
• Ne upotrebljavajte ponovo uzorak mokraće nanesen na segment razrjeđenja.
POSTUPAK
CAPILLARYS je višeparametarski instrument za analizu proteina u mokraći na 8 paralelnih kapilara sljedećim redoslijedom:
• Očitavanje bar kodova nosača uzoraka i uzoraka za analizu;
• Nanošenje uzoraka iz mikroepruveta s dijaliziranim uzorcima u jažice segmenta razrjeđenja;
• Ispiranje kapilara;
• Ubrizgavanje uzoraka;
• Analiza proteina i izravna detekcija na kapilarama.
Koraci koji se provode ručno, uključuju:
• Priprema uzoraka (dijaliza i ukoncentriravanje);
• Postavljanje mikroepruveta (bez kapica) s uzorcima za analizu na epruvete za hemolizu na nosaču uzoraka: svaka epruveta obilježena je
specifičnom naljepnicom s bar kodom za identifikaciju uzorka, u skladu s uzorkom za analizu.
• Stavljanje novih zelenih segmenata razrjeđenja od 100 µL u nosače uzoraka;
• Umetanje nosača u instrument CAPILLARYS;
• Uklanjanje nosača uzoraka i mikroepruveta poslije analize zbog potencijalne analize imunotipizacijom.
MOLIMO VAS PAŽLJIVO PROČITAJTE PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA CAPILLARYS.
I. PRIPREMA ELEKTROFORETSKE ANALIZE
1. Uključite instrument CAPILLARYS i kompjutor.
2. Pokrenite softver i instrument će se pokrenuti automatski.
3. Instrument CAPILLARYS treba upotrebljavati uz program za analizu "URINE" i pufer CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. Za izbor programa
"URINE" i stavljanje bočice s puferom CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 u instrument, pažljivo pročitajte priručnik s uputama za CAPILLARYS.
4. Normaliziranje kapilara s normalnim kontrolnim serumom (vidjeti odjeljak "Potrebni reagensi koji nisu isporučeni").
VAŽNO: Prije analize uzoraka mokraće u instrumentu CAPILLARYS, kapilare je potrebno normalizirati kako bi ih se kasnije analiziralo
postupkom imunotipizacije CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE.
- Nanesite 25 µL rekonstituiranog normalnog kontrolnog seruma (Normal Control Serum) u epruvetu za hemolizu obilježenu naljepnicom s
bar kodom za normalni kontrolni serum, i 2 mL radnog pufera za dijalizu, a zatim homogenizirajte.
- Stavite ovu epruvetu na mjesto br. 1 na nosač uzoraka br. 0 instrumenta CAPILLARYS namijenjenog za kontrolne uzorke, i novi zeleni
segment razrjeđenja. Ako nedostaje segment prikazat će se poruka.
- Počnite s analizom: Umetnite nosač uzoraka br. 0 u instrument CAPILLARYS, u prozorčiću koji se pojavi na zaslonu odaberite "Normal
Control", i potvrdite.
Rezultati se zatim automatski obrađuju uz pomoć programa za analizu podataka.
5. Analiza uzoraka mokraće pripremljenih kompletom CAPILLARYS / MINICAP URINE:
- Nosač uzoraka sadrži 8 mjesta za epruvete. Na svaki nosač uzoraka postavite osam praznih epruveta za hemolizu (služe kao držači), a
zatim mikroepruvete s dijaliziranim uzorcima mokraće. Prije upotrebe odrežite kapicu na svakoj mikroepruveti.
- Sačuvajte kapicu svake mikroepruvete radi daljnjeg čuvanja uzoraka, ako je potrebno.
VAŽNO: Preporučuje se svaku epruvetu za hemolizu, koja drži mikroepruvetu s uzorkom za analizu, obilježiti posebnom naljepnicom za
identifikaciju uzorka, s bar kodom koji odgovara uzorku. Ta identifikacija omogućava da se odredi program razrjeđivanja koji treba primijeniti
kada se provodi tehnika imunotipizacije za mokraću CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE.
- Bar kod svake epruvete mora biti vidljiv kroz otvore na nosaču uzoraka.
NAPOMENA: Ako je broj epruveta za analizu manji od 8, popunite nosač epruvetama s destiliranom ili deioniziranom vodom.
- Stavite novi zeleni segment razrjeđenja na svaki nosač uzorka. Ako segment nedostaje, nosač uzorka bit će izbačen.
- Umetnite cijeli nosač/nosače uzoraka u instrument CAPILLARYS kroz otvor u sredini instrumenta. Sukcesivno i kontinuirano, u instrument
može biti umetnuto do 13 nosača uzoraka.
6. Uklonite analizirane nosače s ploče na lijevoj strani instrumenta.
7. Sa svakog nosača pažljivo skinite upotrijebljene segmente razrjeđenja i bacite ih.
UPOZORENJE: Segmentima razrjeđenja s biološkim uzorcima treba pažljivo rukovati.
8. Skinite mikroepruvete s analiziranim uzorcima mokraće s nosača, i pohranite ih u hladnjak (između 2 i 8 °C) za daljnju analizu tehnikom
CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE ako je potrebno.
- 198 -
RAZRJEĐIVANJE - MIGRACIJA - OPIS AUTOMATIZIRANIH KORAKA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Očitani su bar kodovi na nosačima uzoraka i na epruvetama s uzorcima mokraće za analizu.
Uzorci se nanose na segmente razrjeđenja, a sonda za uzorkovanje isplahnjuje se nakon svakog uzorka.
Kapilare su oprane.
Uzorci se ubrizgavaju u kapilare.
Migracija se provodi pod konstantnim naponom kontrolirana Peltierovim efektom, u trajanju od otprilike 4 minute.
Proteini se detektiraju izravno, skeniranjem na 200 nm, a na zaslonu instrumenta pojavi se elektroforetski profil.
NAPOMENA: Ovi koraci opisani su za prvi umetnuti nosač uzorka. Elektroforetski obrasci pojave se nakon 10 minuta. Za sljedeći nosač uzorka, koraci
1 i 2 (očitavanje bar koda i nanošenje uzorka) provedeni su za vrijeme koraka 5 prethodnog nosača uzorka.
II. ANALIZA REZULTATA
Na kraju analize mogu se analizirati elektroforetski profili i vizualno interpretirati nepravilnosti obrasca. Na zaslonu i u izvješću rezultata identificiraju
se različiti položaji zone proteina (albumin, alfa 1, alfa 2, beta i gama).
NAPOMENA: U svakom od ova 3 postupka pripreme uzorka, opseg obrasca vizualiziranog na y osi zaslona uzima u obzir ukupnu koncentraciju
proteina svakog analiziranog uzorka.
Za imunotipizaciju,abnormalne se frakcije moraju integrirati upotrebom softverskog alata za kvantifikaciju vršaka ("quantify peaks"), zatim se
automatski izačuna omjer mokraće ("Ratio urine"), definiran kao proporcija područja abnormalne frakcije u odnosu na ukupno područje proteina
normalnog kontrolnog seruma, i on će se prikazati u prozorčiću za modifikaciju krivulja. Taj će omjer biti upotrijebljen u tehnici CAPILLARYS
IMMUNOTYPING URINE kako bi se odredio program za razrjeđivanje uzoraka ("HYPOGAMMA", "STANDARD" ili "HYPERGAMMA").
Kada imunotipizacija omogući detekciju monoklonske komponente, ona se može kvantificirati (u PHORESIS verzija ≥ 8.61).
Za kvantitativno određivanje, abnormalne frakcije se moraju integrirati primjenom softverskog alata "quantify peaks" (kvantificiraj vrškove) i funkcije
"peak quantification" (kvantifikacija vrška).
Ponuđena su dva režima integracije: vodoravna integracija između dva minimuma ("valley to valley") ili okomita integracija između minimuma i
maksimuma ("from bottom to top"). Izbor režima integracije ovisi o obilježju elektroforetskog obrasca (pozicija vrška od interesa u odnosu na početnu
vrijednost) te o uobičajenim postupcima laboratorija.
Rezultati za kvantifikaciju vrška prikažu se:
- u postocima ili,
- u koncentracijama u g/dL ili g/24 sata (u tom slučaju koncentraciju proteina u uzorku mokraće treba prethodno navesti u radnom listu).
NAPOMENA: Rezultati koji se dobiju kvantifikacijom monoklonskih komponenti u potpunosti ovise o vrijednosti proteinurije koja je unesena u softver
PHORESIS-a; ako je pri unosu vrijednosti proteinurije učinjena greška, ta će greška utjecati na dobivene rezultate.
Za monoklonsku komponentu niske razine, opažena vrijednost može biti u velikoj mjeri precijenjena kada se za integraciju izabere režim "from bottom
to top" (od dna do vrha).
Pri praćenju bolesnika, režim integracije monoklonskih komponenti u elektroforetskom obrascu mora biti isti za različite analize, a u slučaju prethodnih
analiza treba paziti da se monoklonske komponente od interesa integriraju na isti način. Osim toga, kada se opazi novi obrazac abnormalnosti (izvan
zone albumina), preporučuje se ponoviti analizu imunotipizacije uzorka.
MOLIMO VAS PAŽLJIVO PROČITAJTE PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA CAPILLARYS.
III. KRAJ CIKLUSA ANALIZE
Na kraju svakog ciklusa analize, osoba koja provodi analizu mora na instrumentu CAPILLARYS pokrenuti postupak "stand by" (spremno) ili "shut
down" (isključivanje) kako bi kapilare ostale u optimalnim uvjetima.
IV. PUNJENJE SPREMNIKA ZA REAGENS
Instrument CAPILLARYS ima automatsku kontrolu reagensa.
VAŽNO: Molimo pogledajte upute za zamjenu spremnika za reagens, vodeći računa o boji koda za bočice i konektore.
Pojavit će se poruka kada bude potrebno obaviti neki od sljedećih zadataka:
• staviti novu bočicu s puferom i / ili;
• napuniti spremnik radnom otopinom za ispiranje i / ili;
• napuniti spremnik filtriranom destiliranom ili deioniziranom vodom za isplahnjivanje kapilara i / ili;
• isprazniti spremnik za otpadni materijal.
UPOZORENJE: Nemojte koristiti deioniziranu vodu dostupnu na tržištu, kao što je na primjer voda za glačanje (opasnost od značajnog
oštećenja kapilara). Koristite jedino vodu ultra čiste kvalitete, kao što je voda za injekcije.
VAŽNO: Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
MOLIMO VAS PAŽLJIVO PROČITAJTE PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA CAPILLARYS.
REZULTATI
Tumačenje
Tumačenje je kvalitativno.
Kao pomoć u interpretaciji, preporučuje se obrazac prekriti obrascem dobivenim nakon normalizacije kapilara normalnim kontrolnim serumom kao
referentnim obrascem.
Od PHORESIS verzije ≥ 8.61, postupak CAPILLARYS URINE je i kvantitativan. U slučaju opaženog abnormalnog elektroforetskog obrasca, provedite
imunotipizaciju uzorka, a ako se detektira i karakterizira monoklonska komponenta, kvantificirajte tu komponentu prema prethodno opisanom
postupku.
- 199 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Fiziološka proteinurija (1, 2, 7, 8, 9, 13): Ona je slaba, najčešće manja od 120 mg / 24 sata i nema značajne razlike između elektroforetskih profila muškaraca
i žena. Najvažniji protein je albumin povezan s tragovima transferina i imunoglobulina. Proteinurija viša od 120 mg / 24 sata mora se smatrati
patološkom.
U slučaju pozitivne proteinurije (> 120 mg / 24 sata) treba nastaviti s kvalitativnom analizom eliminiranih proteina (5).
Elektroforeza uzoraka mokraće provodi se kako bi se detektirale monoklonske komponente, posebice Bence Jones protein (slobodni laki lanac) te
drugi proteini u mokraći. U usporedbi s normalnim obrascem, dodatna frakcija, a osobito u zoni gamaglobulina ili betaglobulina, povezuje se s
poremećajem (9, 10, 11).
Elektroforeza mokraće učinkovita je za detekciju monoklonskih komponenti (monoklonskih imunoglobulina ili slobodnih lakih lanaca) u niskim
koncentracijama od otprilike 2,0 mg/dL kvalitativnom analizom.
Preporučuje se identifikacija kako bi se utvrdile monoklonske ili oligoklonske komponente:
- imunotipizacijom pomoću kompleta SEBIA CAPILLARYS IMMUNOTYPING ili
- imunofiksacijom pomoću kompleta SEBIA HYDRAGEL BENCE JONES, HYDRAGEL IF i HYDRAGEL URINE PROFIL(E) te specifičnim
antiserumima anti-slobodnih kapa i lambda lakih lanaca.
Komplementarni testovi, kao što je elektroforeza primjenom kompleta SEBIA HYDRAGEL PROTEINURIE ili HYDRAGEL URINE PROFIL(E), ili
nefelometrijski imunološki testovi, potrebni su za karakterizaciju u slučaju sumnje na tubularnu, glomerularnu ili miješanu proteinuriju nakon kapilarne
elektroforeze (3).
Za pomoć pri interpretaciji elektroforegrama proteina mokraće, vidjeti BIBLIOGRAFIJU.
Posebni slučajevi:
- Uzorci mokraće s koncentracijom ukupnih proteina ispod 15 mg/dL (prije pripreme za analizu) mogu pokazati proteine u podlozi (razmaz) po cijelom
obrascu.
- Kada se sumnja na abnormalnost u beta ili gama zoni, preporučuje se dalje provesti analizu na Bence Jones protein, bez obzira na koncentraciju
ukupnih proteina.
Međudjelovanje i ograničenja
Vidjeti UZORCI ZA ANALIZU.
Analizirajte samo uzorke pripremljene uređajima za dijalizu i ukoncentriravanje navedenim pod naslovom "POTREBNA OPREMA I DODACI", kao što
su sustavi za dijalizu SEBIA ili neki ekvivalentni uređaj koji ima jednaku djelotvornost i odobren je za kliničke analize.
Neodgovarajuća dijaliza uzorka može dovesti do ne-proteinskih rezidualnih frakcija. Ako se sumnja na interferencijsku frakciju, preporuka je ponovo
dijalizirati uzorak mokraće.
Interferencije kao što su lijek ili soli, eliminiraju se tijekom koraka dijalize. Ako se ovaj korak ne provodi pažljivo, vršci koji se opažaju mogu biti
artefaktualni.
Zbog rezolucije i granica osjetljivosti zonske elektroforeze, moguće je da se ovom metodom neki proteini u mokraći ne mogu detektirati.
Za kvantitativno određivanje monoklonske komponente radi praćenja bolesnika, potrebno je upotrijebiti uvijek istu tehniku kvantifikacije proteina u
mokraći.
Rezultati koji se dobiju kvantifikacijom monoklonskih komponenti u potpunosti ovise o vrijednosti proteinurije koja je unesena u softver PHORESIS-a;
ako je pri unosu vrijednosti proteinurije učinjena greška, ta će greška utjecati na dobivene rezultate.
Rješavanje problema
Nazovite tvrtku SEBIA ako test ne uspije iako ste se pažljivo pridržavali uputa za pripremu, pohranu materijala i provođenje postupka.
Sigurnosni podaci za komplet reagensa i informacije o čišćenju i zbrinjavanju otpadnih tvari, označavanju i pravilima sigurnosti koje primjenjuje SEBIA,
pakovanja za transport bioloških uzoraka i čišćenje instrumenata, dostupni su na DVD-u "UPUTE I SIGURNOSNI PODACI".
PODACI O UČINKOVITOSTI
Kvalitativna analiza
Upotrijebljeni su standardni materijali, priprema uzoraka i postupci. Svi elektroforegrami procijenjeni su vizualno.
Reproducibilnost unutar analize
Reproducibilnost unutar analize dokazana je na dva različita patološka uzorka mokraće (na jednom koji sadrži pet proteinskih frakcija, i na drugom s
proteinom Bence Jones) te na jednom normalnom uzorku (fiziološka mokraća). Svaki uzorak pripremljen je s puferom za dijalizu iz dvije različite serije,
zatim je nanesen u sve jažice segmenta razrjeđenja i analiziran postupkom CAPILLARYS URINE uz isti pufer.
Sva ponavljanja dala su podudarne rezultate unutar analize i unutar dviju serija pufera za dijalizu. Obrasci su odgovarali tipu svakog testiranog uzorka.
Postupkom CAPILLARYS URINE, proteini u mokraći su pravilno identificirani u oba patološka uzorka, nije bilo lažno pozitivnih rezultata i nisu opažene
razlike među ponavljanjima. Uz normalni uzorak nisu detektirani proteini.
Reproducibilnost između analiza i između serija
Reproducibilnost između analiza dokazana je na šest različitih patoloških uzoraka mokraće koji su sadržavali od jedne do sedam proteinskih frakcija,
i na dva normalna uzorka (fiziološka mokraća), pripremljenih s puferom za dijalizu iz tri različite serije.
Ti su uzorci analizirani 10 puta postupkom CAPILLARYS URINE za svaku seriju pufera za dijalizu te s istim puferom.
Sva ponavljanja dala su podudarne rezultate između analiza i između serija.
Postupkom CAPILLARYS URINE, proteini u mokraći su pravilno identificirani u svih šest patoloških uzoraka, nije bilo lažno pozitivnih rezultata i nisu
opažene razlike među ponavljanjima. Za svaki testirani uzorak mokraće, detektiran tipičan obrazac i specifični proteini u mokraći bili su kako se
očekivalo za svaki tip uzorka. Uz normalne uzorke nisu detektirani abnormalni proteini.
Ispitivanje podudarnosti
Ispitivanje podudarnosti (konkordancije) provedeno je na 100 uzoraka mokraće analiziranih postupkom CAPILLARYS URINE i komercijalno
dostupnim sustavom za elektroforezu na agaroznom gelu za analizu mokraće ( bez ukoncentriravanja mokraće): primjenom obje tehnike analizirano
je 19 normalnih uzoraka mokraće i 81 različit patološki uzorak mokraće; ukupne koncentracije proteina bile su između 0,07 i 19,83 g/dL.
- 200 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Ovo ispitivanje pokazalo je 100%-tno slaganje između te dvije tehnike:
Za 19 normalnih uzoraka mokraće: potpuno slaganje (konkordancija).
Za 81 patološki uzorak mokraće: potpuno slaganje (konkordancija).
Svi analizirani patološki uzorci mokraće pokazali su pojedinačnim postupcima slaganje rezultata, a na svim patološkim uzorcima u svakom sustavu
detektirane su proteinske frakcije.
Osjetljivost
Serijska razrjeđenja pripremljena su s jednim patološkim uzorkom mokraće s proteinom Bence Jones (u koncentraciji oko 0,34 g/L), koji je razrijeđen
u normalnoj mokraći i analiziran postupkom CAPILLARYS URINE.
Minimalna granica detekcije monoklonske komponente bila je oko 2,0 mg/dL.
NAPOMENA: Granica detekcije može varirati s obzirom na položaj monoklonske komponente i poliklonsku pozadinu u gama i beta zoni.
Kvantitativna analiza
NAPOMENA: Kvantitativna analiza može se provoditi u oba instrumenta, CAPILLARYS 2 i CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING, a rezultati kvantifikacije
monoklonske komponente ekvivalentni su u oba instrumenta primjenom 2 predložena režima integracije: okomita integracija između minimuma i
maksimuma (from bottom to top) i vodoravna integracija između dva minimuma (valley to valley).
Reproducibilnost unutar analize, između priprema i između instrumenata
Tri (3) različita patološka uzorka mokraće s proteinom Bence Jones (uzorak mokraće br. 1 s kapa slobodnim lakim lancem i proteinurijom od 0,28 g/L,
uzorak mokraće br. 2 s kapa slobodnim lakim lancem i proteinurijom od 2,90 g/L i uzorak mokraće br. 3 s lambda slobodnim lakim lancem i
proteinurijom od 5,49 g/L), pripremljena su sukcesivno 3 puta s 2 serije pufera za dijalizu po pripremi. Zatim je svaki dijalizirani uzorak analiziran na
ponovljivost postupkom CAPILLARYS URINE na svim kapilarama na 2 različita instrumenta, primjenom istog pufera za analizu i uključujući jednu
sekvencu analize po pripremljenom uzorku.
U tablicama koje slijede prikazani su sažeti rezultati raspona KV% unutar analize, između serija i između priprema te ukupnu reproducibilnost
instrument-reagens za postotke monoklonske komponente (u g/L) u 2 režima integracije (okomitom, između minimuma i maksimuma i vodoravnom,
između dva minimuma).
Okomita integracija
Postoci za monoklonsku komponentu
Reproducibilnost unutar analize (KV%)
KV min (%)
KV maks (%)
0.5
3.5
0.2
Reproducibilnost između serija (KV%)
Reproducibilnost između priprema (KV%)
2.1
0.6
Ukupno (KV%)
3.9
0.7
3.8
Okomita integracija
Koncentracije monoklonskih komponenti (g/L)
Reproducibilnost unutar analize (KV%)
KV min (%)
KV maks (%)
0.5
3.9
0.0
Reproducibilnost između serija (KV%)
Reproducibilnost između priprema (KV%)
2.6
0.6
Ukupno (KV%)
KV min (%)
KV maks (%)
1.0
4.5
0.5
1.1
1.2
3.8
4.4
4.3
Vodoravna integracija minimuma
KV min (%)
KV maks (%)
1.0
5.2
0.0
4.1
0.7
Preciznost
Vodoravna integracija minimuma
1.1
4.0
1.2
4.5
4.6
4.7
Ispitivanje podudarnosti rezultata kvantitativnog određivanja monoklonskih komponenti provedeno ja na 56 različitih uzoraka mokraće, postupkom
kapilarne elektroforeze CAPILLARYS URINE i komercijalno dostupnim sustavom elektroforeze na agaroznom gelu za analizu mokraće, uz
denzitometrijsko skeniranje (bez koncnetracije mokraće): s obje tehnike analizirano je 9 uzoraka mokraće bez monoklonske komponente i 47 uzoraka
s monoklonskom komponentom; ukupne koncentracije proteina bile su između 0,09 i 20,86 g/L.
Izmjerene vrijednosti postotaka i koncentracije monoklonskih komponenti dobivene u oba postupka, statistički su analizirane linearnom regresijom.
Dobiveni rezultati pokazali su za svaki uzorak savršenu korelaciju kvantitativno određenih monoklonskih komponenti između oba postupka.
Rezultati linearne regresije za obje tehnike tablično su prikazani niže (y = CAPILLARYS URINE) za svaki režim integracije.
Monoklonska komponenta, okomita
integracija
Postotak (%)
Koncentracija (g/dL)
Monoklonska komponenta, vodoravna
integracija minimuma
Postotak (%)
Koncentracija (g/dL)
Koeficijent korelacije
y-sjecište
Nagib
Koeficijent korelacije
y-sjecište
Nagib
0.987
0.999
- 3.580
- 0.033
0.990
0.999
- 1.525
- 0.019
- 201 -
0.976
0.981
0.952
0.971
Raspon vrijednosti
CAPILLARYS URINE
2.0 – 91.8
0.01 – 17.65
Raspon vrijednosti
CAPILLARYS URINE
0.6 – 87.7
0.00 – 15.58
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Linearnost
Dva karakteristična uzorka mokraće, uključujući uzorak s proteinurijom od 7,49 g/L i proteinom Bence Jones te uzorak s proteinurijom od 6,03 g/L bez
proteina Bence Jones, izmiješani su u različitim omjerima a razrjeđenja su analizirana postupkom elektroforeze CAPILLARYS URINE i kvantitativno
su određene monoklonske komponente režimima integracije između minimuma i maksimuma ("from bottom to top") i između dva minimuma ("valley
to valley").
Rezultati su pokazali potpunu korelaciju između postotka i koncentracije monoklonske komponente i omjera oba uzorka mokraće u mješavini, i
dokazali da se svaka varijacija može linearno detektirati postupkom CAPILLARYS URINE u oba režima integracije.
Test CAPILLARYS URINE pokazao se linearnim za monoklonsku komponentu unutar cijelog ispitivanog raspona koncentracija od 0,00 do 5,98 g/L u
režimu okomite integracije i od 0,00 do 5,65 g/L u režimu vodoravne integracije minimuma.
Osjetljivost
Serijska razrjeđenja pripremljena s jednim patološkim uzorkom mokraće s proteinom Bence Jones u koncentraciji oko 1,44 g/L primjenom režima
integracije od dna do vrha, i oko 1,39 g/L primjenom režima vodoravne integracije minimuma ("valley to valley"), razrijeđena su u normalnoj mokraći
i analizirana postupkom CAPILLARYS URINE uz kvanitativno određivanje vrijednosti.
Minimalna granica kvantifikacije proteina Bence Jones bila je oko 15 mg/dL u oba režima integracije.
NAPOMENA: Granica kvanitifikacije može varirati s obzirom na položaj monoklonske komponente i poliklonsku pozadinu u gama i beta zoni.
- 202 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
POSTUPAK MINICAP URINE
POTREBNI REAGENSI (koji se ne dobiju u kompletu CAPILLARYS / MINICAP URINE)
UPOZORENJE: Vidjeti sigurnosne podatke.
1. KOMPLET MINICAP PROTEIN(E) 6 (SEBIA, PN 2203)
Prezentacija, upotreba, skladištenje, stabilnost i znakovi promjena
Vidjeti upute priložene uz komplet.
VAŽNO: Dijelovi kompleta MINICAP PROTEIN(E) 6 potrebni su za provedbu postupka MINICAP URINE.
2. NORMALAN KONTROLNI SERUM
Sastav
Normalan kontrolni serum (Normal Control Serum, SEBIA, PN 4785) dobiva se iz skupa normalnih ljudskih seruma. Normalan kontrolni serum nalazi
se u stabiliziranom liofiliziranom obliku.
Namjena
Normalan kontrolni serum namijenjen je za normalizaciju kapilara prije početka nove sekvence analize te za kontrolu migracije proteina u ljudskoj
mokraći postupkom elektroforeze MINICAP URINE.
Rekonstituirajte svaku bočicu normalnog kontrolnog seruma s 1 mL destilirane ili deionizirane vode. Pustite stajati 30 minuta i lagano promiješajte
(izbjeći stvaranje pjene).
Rekonstituirani normalan kontrolni serum treba koristiti kao normalni ljudski serum.
Za normalizaciju kapilara vidjeti odjeljak "Priprema elektroforetske analize".
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Prije rekonstitucije liofilizirani normalan kontrolni serum čuvajte u hladnjaku (2 do 8 °C). Uzorak je stabilan do isteka roka valjanosti naznačenog na
kutiji ili na naljepnicama bočica.
Rekonstituirani normalan kontrolni serum pohranite na temperaturi 2 – 8 °C. Zbog opasnosti od kontaminacije mikrobima i denaturacije, upotrijebite
ga unutar tjedan dana.
Osim toga, rekonstituirani serum može se zamrznuti (u alikvotima) i čuvati na temperaturi od - 18 / - 30 °C najviše 6 mjeseci.
Prije upotrebe držite odmrznuti normalan kontrolni serum na temperaturi 2 – 8 °C i upotrijebite unutar istog dana.
NAPOMENA: Za optimalnu upotrebu u instrumentu MINICAP, preporučuje se prije zamrzavanja razdijeliti normalan kontrolni serum u mikroepruvete
u alikvotima.
NAPOMENA: Tijekom prijevoza, liofilizirani kontrolni serum može se držati izvan hladnjaka (na temperaturi od 15 do 30 °C) u trajanju od 15 dana bez
negativnih učinaka na njegovu djelotvornost.
Nijedna metoda testiranja ne može u potpunosti jamčiti odsutnost virusa HIV-a, hepatitisa B i C ili drugih uzročnika zaraze. Stoga postupajte s
kontrolnim serumom kao s opasnim biološkim materijalom.
Ova serija kontrolnog seruma ustanovljena je kao negativna u ispitivanjima koje je odobrila FDA ili neka ekvivalentna regulatorna agencija EU:
- protiv površinskog antigena hepatitisa B;
- za antitijela protiv HCV;
- za antitijela protiv HIV1 i HIV2.
3. DESTILIRANA ILI DEIONIZIRANA VODA
Upotreba
Za razrjeđivanje uzoraka mokraće ako je potrebno, i za prvu dijalizu (vidjeti "Priprema uzoraka").
Koristi se za isplahnjivanje kapilara u instrumentu za kapilarnu elektroforezu SEBIA MINICAP.
Preporučuje se upotrijebiti filtriranu destiliranu ili deioniziranu vodu (filtar poroznosti ≤ 0,45 μm) te otpora iznad 10 megaohma x cm.
Kako biste spriječili kontaminaciju mikrobima, promijenite vodu svaki dan.
Za optimalan rad dodajte 35 µL/dL CLEAN PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).
VAŽNO: Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
4. CAPICLEAN
Sastav
Bočica koncentrirane otopine CAPICLEAN (SEBIA, PN 2058, 25 mL) sadrži: proteolitičke enzime, tenzide i aditive koji nisu štetni u korištenim
koncentracijama a potrebni su za optimalan učinak.
Upotreba
Za čišćenje sonde za uzorke u automatiziranom instrumentu za kapilarnu elektroforezu MINICAP, SEBIA za vrijeme sekvence čišćenja CAPICLEAN.
VAŽNO: Pokrenite sekvencu čišćenja CAPICLEAN barem jednom tjedno a najviše jednom dnevno, ili poslije svakih 500 analiza ako su provedene
unutar manje od tjedan dana.
Vidjeti upute za CAPICLEAN, SEBIA.
VAŽNO: Za optimalnu upotrebu otopine CAPICLEAN u instrumentu MINICAP, neophodno je upotrijebiti naljepnicu s bar kodom i obilježiti epruvetu za
hemolizu koja drži mikroepruvetu s razrijeđenom CAPICLEAN otopinom (odrezati kapicu na mikroepruveti prije upotrebe).
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Otopinu CAPICLEAN čuvajte u hladnjaku (2 – 8 °C). Ona je stabilna do isteka roka trajanja naznačenog na naljepnici na bočici. NEMOJTE
ZAMRZAVATI.
Možda će se u bočici CAPICLEAN-a opaziti talog ili kombinirane čestice (flokule), ali to nema nikakvih štetnih utjecaja na upotrebu.
Nemojte otapati talog ili te čestice. Preporučuje se uzeti samo supernatant.
Za kasniju upotrebu, epruvetu s razrijeđenom otopinom pohranite na temperature 2 – 8 °C. Valja je upotrijebiti u istom danu.
- 203 -
5. OTOPINA NATRIJEVOG HIPOKLORITA (za čišćenje sonde za uzorkovanje)
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Priprema
Pripremite otopinu natrijevog hipoklorita (2 % do 3 % klorida) razrjeđivanjem 250 mL 9,6 %-tne kloridne koncentrirane otopine hladnom destiliranom
ili deioniziranom vodom do 1 litre.
Upotreba
Koristi se za čišćenje sonde za uzorkovanje u instrumentu MINICAP (za tjedno održavanje kako bi se eliminirali adsorbirani proteini sa sonde).
Vidi priručnik s uputama za SEBIA MINICAP.
• Stavite 500 µL prethodno pripremljene razrijeđene klorirane otopine u mikroepruvetu.
• uklonite kapicu na mikroepruveti.
• Postavite mikroepruvetu, spojenu na novu epruvetu za hemolizu koja služi kao nosač (označenu naljepnicom s bar kodom specifičnim za otopinu
natrijeva hipoklorita), na mjesto br. 1 na rotirajućem uzimatelju uzoraka na instrumentu MINICAP.
• Postavite novu reagens čašicu na automatizirani sustav za punjenje čašica u MINICAP-u (ako nedostaje reagens čašica, pojavit će se poruka).
• Umetnite rotirajući uzimatelj uzoraka u instrument MINICAP.
• Zatvorite vratašca instrumenta MINICAP i automatski će početi sekvenca čišćenja.
VAŽNO: Za optimalnu upotrebu otopine natrijeva hipoklorita u instrumentu MINICAP, neophodno je upotrijebiti naljepnicu s bar kodom i obilježiti
epruvetu za hemolizu koja drži mikroepruvetu s otopinom (odrezati kapicu na mikroepruveti prije upotrebe).
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite radnu kloriranu otopinu na sobnoj temperaturi u zatvorenoj posudi, ona je tako stabilna 3 mjeseca. Izbjegavajte skladištenje na sunčevoj
svjetlosti, blizu izvora topline ili zapaljivog izvora te blizu kiselina i amonijaka.
6. CAPILLARYS / MINICAP WASH SOLUTION
Priprema
Svaku bočicu gotove otopine za ispiranje CAPILLARYS / MINICAP Wash Solution (SEBIA, PN 2052, 2 bočice, 75 mL) treba razrijediti do 750 mL
destiliranom ili deioniziranom vodom.
Za MINICAP je odgovarajuće razrijediti samo 25 mL gotove otopine do 250 mL destiliranom ili deioniziranom vodom.
Nakon razrjeđenja, otopina za ispiranje sadrži lužnatu otopinu pH ≈ 12.
Upotreba
Za pranje kapilara u instrumentu MINICAP.
VAŽNO: Prije punjenja spremnika otopinom za ispiranje, preporučuje se oprati otvor spremnika, konektor i epruvetu s mnogo destilirane ili deionizirane
vode kako bi se izbjeglo taloženje soli.
Čuvanje, stabilnost i znakovi promjena
Pohranite gotovu otopinu i radnu otopinu za ispiranje u zatvorene spremnike na sobnoj temperaturi ili u hladnjaku. Gotova otopina za ispiranje stabilna
je do isteka roka trajanja naznačenog na kompletu ili na naljepnici bočice otopine za ispiranje. Radna otopina za ispiranje stabilna je 3 mjeseca.
Bacite radnu otopinu za ispiranje ako promijeni izgled, npr. postane zamuĆena zbog kontaminacije mikrobima.
NAPOMENE:
Testovi koji su provedeni za validaciju reagensa pokazali su da za različite otopine te uz primjenu opreme prilagođene volumenu za rekonstituciju,
varijacija od ± 5 % za konačni volumen nema štetni učinak na analizu.
U destiliranoj ili deioniziranoj vodi koja se upotrebljava za rekonstituiranje otopina ne smije postojati proliferacija bakterija i plijesni (upotrijebiti filtar
≤ 0.45 µm) i treba imati otpornost veću od 10 megohms x cm.
POTREBNA OPREMA I DODACI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
MINICAP instrument, SEBIA, PN 1230.
Rotirajući uzimatelj uzoraka isporučen uz MINICAP
Komplet spremnika isporučen uz MINICAP: spremnik za isplahnjivanje (za punjenje destiliranom ili deioniziranom vodom) i spremnik za otpad.
MINICAP reagens čašice, SEBIA (250 čašica), PN 2280.
Poklopci za spremnik za odlaganje iskorištenih čašica reagensa, SEBIA (12 komada), PN 2286: poklopci za zatvaranje posuda koje sadrže
korištene čašice.
Sustav za dijalizu SEBIA, PN 9200, 24 epruvete od 20 mL s PES membranom 10 000 MWCO (granična molekulska masa 10 KDa) za dijalizu i
ukoncentriravanje uzoraka mokraće,
ili ekvivalentni uređaj kojim se postiže jednaka učinkovitost i odobren je za kliničke testove a kojim se dobiva konačni volumen dijaliziranog i
ukoncentriranog uzorka mokraće od 500 µL (volumen uzorka potreban kako bi se mogla provesti analiza tehnikama MINICAP URINE i MINICAP
IMMUNOTYPING URINE).
VAŽNO: Molimo pažljivo pročitajte upute priložene uz svaki uređaj za dijalizu i ukoncentriravanje.
Centrifuga s vodoravnom osi i rotorima za epruvete promjera 30 mm i dužine 116 mm, kada se koriste sustavi za dijalizu SEBIA.
Pipete: 200 µL, 1 mL i 5 mL.
Mikroepruvete 1,5 mL.
Epruvete za hemolizu (visine 75 mm, promjera 13 mm).
UZORCI ZA ANALIZU
Skupljanje i čuvanje uzoraka
Analizu je poželjno provoditi na svježim uzorcima mokraće prikupljenim u roku od 24 sata. Uzorke mokraće treba uzimati prema ustanovljenim
postupcima koji se koriste u kliničkim laboratorijskim testiranjima.
NAPOMENA: Iako su za analizu najprikladniji uzorci mokraće prikupljeni u roku od 24 sata, slučajno uzeti uzorci također se mogu upotrijebiti za
kvalitativnu analizu.
- 204 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Uzorci mogu biti pohranjeni na temperaturi od 2 do 8 °C najviše do sedam dana.
Za duža razdoblja čuvanja, preporučuje se uzorke čuvati zamrznute na - 70 °C (stabilni su najmanje mjesec dana).
VAŽNO: Ne čuvajte uzorke na - 20 °C.
Odmrznuti ili nepravilno pohranjeni uzorci mogu pokazati modificirane ili dodatne frakcije uslijed degradacije proteina.
NAPOMENA: Uzorci mokraće ne smiju se čuvati na sobnoj temperaturi!
Priprema uzoraka (sustavima za dijalizu SEBIA)
Za najbolji oporavak proteina mokraće, izrazito se preporučuje upotreba centrifuge za korak uklanjanja soli / ukoncentriravanje uzorka u
ovoj analizi.
VAŽNO: Tehnika analize mokraće kapilarnom elektroforezom zahtijeva 2 koraka: korak dijalize i korak ukoncentriravanja uzoraka mokraće sustavima
za dijalizu SEBIA (epruvete 20 mL). Upotrijebite samo jednu epruvetu po uzorku.
Za upotrebu sustava za dijalizu SEBIA s centrifugom vodoravne osi indicirani su sljedeći parametri. Molimo pažljivo pročitajte upute
priložene uz svaki uređaj za dijalizu ili ukoncentriravanje za upotrebu uz centrifugu nepromjenjivog kuta.
Prije nego što nastavite s analizom, svaki uzorak pripremite prema sljedećem postupku:
NAPOMENA: Razrijedite dva puta (v/v) gotovi pufer za dijalizu destiliranom ili deioniziranom vodom, kako biste dobili radni pufer za dijalizu (1 volumen
pufera + 1 volumen destilirane ili deionizirane vode).
1.
2.
3.
4.
Provedite kvantifikaciju ukupne koncentracije proteina u uzorku mokraće za analizu.
Centrifugirajte 5 mL nerazrijeđene mokraće na 4 300 g* u trajanju od 10 minuta.
Skupite supernatant.
Pripremite svaki uzorak u novom sustavu za dijalizu prema ukupnoj koncentraciji proteina u uzorku:
- Ako je ukupna koncentracija proteina manja od 100 mg/dL: izmiješajte u epruveti 2 mL uzorka mokraće i 18 mL destilirane ili deionizirane
vode.
- Ako je ukupna koncentracija proteina između 100 i 300 mg/dL: izmiješajte u epruveti 0,5 mL uzorka mokraće i 19,5 mL destilirane ili
deionizirane vode.
- Ako je ukupna koncentracija proteina veća od 300 mg/dL: najprije destiliranom ili deioniziranom vodom razrijedite uzorak mokraće do
koncentracije proteina od 300 mg/dL; zatim u epruveti izmiješajte 0,5 mL razrijeđene mokraće i 19,5 mL destilirane ili deionizirane vode.
5. Homogenizirajte razrijeđeni uzorak mokraće.
6. Ekvilibrirajte epruvete destiliranom ili deioniziranom vodom i centrifugirajte na 4 000 g* u trajanju od 40 minuta.
UPOZORENJE: Nakon koncentriranja centrifugiranjem, dobiveni volumen mora biti najviše 0,5 mL.
7. Za dijalizu, dodajte po sustavu za dijalizu 20 mL radnog pufera za dijalizu.
8. Ekvilibrirajte epruvete radnim puferom za dijalizu i centrifugirajte na 4 000 g* u trajanju od 40 minuta.
9. Nakon centrifugiranja, dio uzorka može ostati na gornjoj ravnoj zoni sustava za dijalizu (vidjeti sliku). Uz pomoć mikropipete skupite uzorak i
prenesite ga u donju jažicu dijaliznog sustava. Ako je nakon centrifugiranja konačni volumen manji od 0,5 mL, dodajte radni pufer za dijalizu do
konačnog volumena od 0,5 mL (nakon što se uspostavila ravnoteža donje razine meniskusa).
1
0.75
0.5
0.2
10. Homogenizirajte uzorak u epruveti.
11. Skupite dijaliziranu mokraću koja je ostala u epruveti, i stavite je u mikroepruvetu od 1,5 mL.
12. Bacite sustav za dijalizu.
VAŽNO: Nakon pripreme, uzorke mokraće analizirajte unutar najviše jednog dana. Da biste ograničili adsorpciju proteina na membranu uređaja za
dijalizu i ukoncentriravanje (sustav za dijalizu SEBIA), ne preporučuje se nakon centrifugiranja uzorak držati u dijaliznom sustavu, nego u
mikroepruveti pohraniti u hladnjak (između 2 i 8 °C).
* Za izračun broja okretaja u minuti odgovarajućeg za rotor, pogledajte priručnik s uputama za centrifugu.
Upute za upotrebu uređaja za dijalizu i ukoncentriravanje s centrifugom vodoravne osi, razlikuju se od uputa za centrifugu nepromjenjivog kuta. Gore
navedeni parametri odnose se na upotrebu sustava za dijalizu SEBIA s centrifugom vodoravne osi. Molimo pažljivo pročitajte upute priložene uz svaki
uređaj za dijalizu ili ukoncentriravanje za upotrebu uz centrifugu nepromjenjivog kuta.
- 205 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Uzorci koje treba izbjegavati
• Izbjegavajte stare, nepravilno pohranjene uzorke mokraće jer će frakcije zbog denaturacije biti izmijenjene.
• Preporučuje se provjeriti svojstva uzorka mokraće nakon prvog centrifugiranja (4 300 g u trajanju od 10 minuta) (npr. znakove hemolize ili
zamućenosti).
• Ne pohranjujte uzorke u uređaje za dijalizu i ukoncentriravanje, jer bi se neki proteini mogli vezati na membranu.
• Ne upotrebljavajte ponovo uzorak mokraće nanesen u reagens čašicu.
POSTUPAK
MINICAP je višeparametarski instrument za analizu proteina mokraće na 2 paralelne kapilare. Slijed automatiziranih koraka:
• Očitavanje bar koda na rotirajućem uzimatelju uzoraka i epruvetama s uzorcima (do 26 epruveta).
• Nanošenje uzoraka iz mikroepruveta s dijaliziranim uzorcima u reagens čašice;
• Ispiranje kapilara;
• Ubrizgavanje uzoraka;
• Analiza proteina i izravna detekcija na kapilarama.
Koraci koji se provode ručno, uključuju:
• Priprema uzoraka (dijaliza i ukoncentriravanje);
• Postavljanje mikroepruveta (bez kapica) s uzorcima za analizu na epruvete za hemolizu, na mjesta od br. 1 do 26 na rotirajućem uzimatelju uzoraka:
svaka epruveta obilježena je specifičnom naljepnicom s bar kodom za identifikaciju uzorka, u skladu s uzorkom za analizu;
• Stavljanje normalnog kontrolnog seruma u rotirajući uzimatelj uzoraka na mjesto br. 28;
• Stavljanje rotirajućeg uzimatelja uzoraka u instrument MINICAP;
• Uklanjanje rotirajućeg uzimatelja uzoraka i mikroepruveta poslije analize za moguću analizu imunotipizacijom;
• Uklanjanje i zatvaranje posude za korištene čašice.
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITATI PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA MINICAP.
I. PRIPREMA ELEKTROFORETSKE ANALIZE
1. Uključite instrument MINICAP i kompjutor.
2. Kako biste pokrenuli instrument, postavite bar jednu novu reagens čašicu na automatizirani sustav za čašice instrumenta MINICAP (pojavit
će se poruka ako nedostaje reagens čašica).
3. Odredite postavke softvera i instrument će se pokrenuti automatski.
4. Instrument MINICAP treba upotrebljavati uz program za analizu "URINE" i pufer MINICAP PROTEIN(E) 6. Za izbor programa analize "URINE"
i postavljanje bočice pufera MINICAP PROTEINE 6 u položaj "B1" na instrumentu, molimo pažljivo pročitajte priručnik s uputama za MINICAP
i slijedite upute prikazane na zaslonu.
5. Postavite nove reagens čašice na automatizirani sustav za punjenje čašica u instrumentu MINICAP (ako nedostaju reagens čašice, pojavit će
se poruka).
6. Stavite u MINICAP novu posudu za iskorištene čašice, na mjesto predviđeno za tu svrhu.
7. Provjerite razinu ispunjenosti bočica reagensa, dodajte reagens ako je potrebno i ispraznite spremnik za otpadni materijal. U prozorčiću
"Provjerite razine reagensa" ("Check reagent levels"), ažurirajte softver pomicanjem kursora miša.
8. Rotirajući uzimatelj uzoraka sadrži 28 mjesta za epruvete. Analiza uzoraka mokraće pripremljenih kompletom CAPILLARYS / MINICAP
URINE:
• Stavite do 26 praznih epruveta za hemolizu (služe kao nosači) na rotirajući uzimatelj uzoraka (mjesta br. 1 do 26) počevši od broja 1, a
zatim mikroepruvete s dijaliziranim uzorcima mokraće. Prije upotrebe odrežite kapicu na svakoj mikroepruveti. Bar kod svake epruvete mora
biti vidljiv kroz otvore na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
VAŽNO: Preporučuje se svaku epruvetu za hemolizu, koja drži mikroepruvetu s uzorkom za analizu, obilježiti posebnom naljepnicom za
identifikaciju uzorka, s bar kodom koji odgovara uzorku. Ta identifikacija omogućava da se odredi program razrjeđivanja koji treba primijeniti
kada se provodi tehnika imunotipizacije za mokraću MINICAP IMMUNOTYPING URINE. Ako nedostaje bar kod, poslužite se funkcijom
softvera koja omogućava povezivanje mjesta epruvete na rotirajućem uzimatelju uzoraka s programom razrjeđivanja izabranom za
postupak MINICAP IMMUNOTYPING URINE.
• Sačuvajte kapicu svake mikroepruvete radi daljnjeg čuvanja uzoraka, ako je potrebno.
• Ako je broj uzoraka koje treba analizirati neparan, dodajte jednu epruvetu s destiliranom ili deioniziranom vodom.
• Za normalizaciju kapilara normalnim kontrolnim serumom (vidjeti odjeljak "Potrebni reagensi koji nisu isporučeni"), nanesite 25 µL
rekonstituiranog normalnog kontrolnog seruma u epruvetu za hemolizu i 2 mL radnog pufera za dijalizu, zatim homogenizirajte i postavite
tu epruvetu na mjesto br. 28 na rotirajući uzimatelj uzoraka (mjesto "Control").
VAŽNO: Prije analize uzoraka mokraće u instrumentu MINICAP, kapilare je potrebno normalizirati kako bi ih se kasnije analiziralo
postupkom imunotipizacije MINICAP IMMUNOTYPING URINE. Rezultati se zatim automatski obrađuju uz pomoć programa za analizu
podataka.
VAŽNO: Ako na mjestu br. 1 (uzorak mokraće) i na mjestu br. 28 (normalan kontrolni serum) nedostaju epruvete, analiza ne može početi i
pojavit će se poruka.
NAPOMENA: Kada koristite normalan kontrolni serum, potrebno je upotrijebiti specifičnu naljepnicu s bar kodom.
9. Umetnite rotirajući uzimatelj uzoraka u instrument MINICAP.
10. Zatvorite vratašca instrumenta MINICAP i pokrenite analizu.
11. Poslije analize uklonite rotirajući uzimatelj uzoraka i mikroepruvete s analiziranim uzorcima mokraće, i pohranite ih u hladnjak (na temperaturu
između 2 i 8 °C) radi daljnje analize tehnikom MINICAP IMMUNOTYPING URINE, ako je potrebno.
12. Ako je potrebno, pažljivo skinite posudu s upotrijebljenim reagens čašicama, čvrsto je zatvorite odgovarajućim poklopcem i bacite je.
UPOZORENJE: Pažljivo rukovati posudama koje sadrže korištene reagens čašice s biološkim uzorcima.
- 206 -
RAZRJEĐIVANJE - MIGRACIJA - OPIS AUTOMATIZIRANIH KORAKA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Očitani su bar kodovi na epruvetama s uzorcima mokraće za analizu i na rotirajućem uzimatelju uzoraka.
Uzorci se nanose u reagens čašice, a sonda za uzorkovanje isplahnjuje se nakon svakog uzorka.
Kapilare su oprane.
Uzorci se ubrizgavaju u kapilare.
Migracija se provodi pod konstantnim naponom kontrolirana Peltierovim efektom, u trajanju od otprilike 4 minute.
Proteini se detektiraju izravno, skeniranjem na 200 nm, a na zaslonu instrumenta pojavi se elektroforetski profil.
NAPOMENA: Ovi automatizirani koraci opisani su za prve dvije analizirane epruvete s uzorcima. Elektroforetski obrasci pojavljuju se otprilike
10 minuta nakon početka analize. Za sljedeće epruvete s uzorcima, prva dva koraka (očitavanje bar koda i nanošenje uzorka) provedena su tijekom
analize 2 prethodne epruvete s uzorcima.
II. ANALIZA REZULTATA
Na kraju analize mogu se analizirati elektroforetski profili i vizualno interpretirati nepravilnosti obrasca. Na zaslonu i u izvješću rezultata identificiraju
se različiti položaji zone proteina (albumin, alfa 1, alfa 2, beta i gama).
NAPOMENA: U svakom od ova 3 postupka pripreme uzorka, opseg obrasca vizualiziranog na y osi zaslona uzima u obzir ukupnu koncentraciju
proteina svakog analiziranog uzorka.
Za imunotipizaciju, abnormalne se frakcije moraju integrirati upotrebom softverskog alata za kvantifikaciju vršaka ("quantify peaks"), zatim se
automatski izačuna omjer mokraće ("Ratio urine"), definiran kao proporcija područja abnormalne frakcije u odnosu na ukupno područje proteina
normalnog kontrolnog seruma, i on će se prikazati u prozorčiću za modifikaciju krivulja. Taj će omjer biti upotrijebljen u tehnici MINICAP
IMMUNOTYPING URINE kako bi se odredio program za razrjeđivanje uzoraka ("HYPOGAMMA", "STANDARD" ili "HYPERGAMMA").
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITATI PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA MINICAP.
III. KRAJ CIKLUSA ANALIZE
Na kraju svakog ciklusa analize, osoba koja provodi analizu mora na instrumentu MINICAP pokrenuti postupak "stand by" (spremno) ili "shut down"
(isključivanje) kako bi kapilare ostale u optimalnim uvjetima.
VAŽNO: Stavite najmanje jednu novu reagens čašicu na automatizirani sustav za punjenje čašica u instrumentu MINICAP (ako nedostaje reagens
čašica, pojavit će se poruka).
IV. PUNJENJE SPREMNIKA ZA REAGENS
Instrument MINICAP ima automatsku kontrolu reagensa.
VAŽNO: Molimo pogledajte upute za zamjenu spremnika za reagens, vodeći računa o boji koda za bočice i konektore.
Pojavit će se poruka kada bude potrebno obaviti neki od sljedećih zadataka:
• staviti novu bočicu s puferom i / ili;
• napuniti spremnik radnom otopinom za ispiranje i / ili;
• napuniti spremnik filtriranom destiliranom ili deioniziranom vodom za isplahnjivanje kapilara i / ili;
• isprazniti spremnik za otpadni materijal.
UPOZORENJE: Nemojte koristiti deioniziranu vodu dostupnu na tržištu, kao što je na primjer voda za glačanje (opasnost od značajnog
oštećenja kapilara). Koristite jedino vodu ultra čiste kvalitete, kao što je voda za injekcije.
VAŽNO: Prije punjenja, preporučuje se spremnik za isplahnjivanje obilno isprati destiliranom ili deioniziranom vodom.
MOLIMO PAŽLJIVO PROČITATI PRIRUČNIK S UPUTAMA ZA MINICAP.
REZULTATI
Tumačenje
Tumačenje je kvalitativno.
Kao pomoć u interpretaciji, preporučuje se obrazac prekriti obrascem dobivenim nakon normalizacije kapilara normalnim kontrolnim serumom kao
referentnim obrascem.
Fiziološka proteinurija (1, 2, 7, 8, 9, 13): Ona je slaba, najčešće manja od 120 mg / 24 sata i nema značajne razlike između elektroforetskih profila muškaraca
i žena. Najvažniji protein je albumin povezan s tragovima transferina i imunoglobulina. Proteinurija viša od 120 mg / 24 sata mora se smatrati
patološkom.
U slučaju pozitivne proteinurije (> 120 mg / 24 sata) treba nastaviti s kvalitativnom analizom eliminiranih proteina (5).
Elektroforeza uzoraka mokraće provodi se kako bi se detektirale monoklonske komponente, posebice Bence Jones protein (slobodni laki lanac) te
drugi proteini u mokraći. U usporedbi s normalnim obrascem, dodatna frakcija, a osobito u zoni gamaglobulina ili betaglobulina, povezuje se s
poremećajem (9, 10, 11).
Elektroforeza mokraće učinkovita je za detekciju monoklonskih komponenti (monoklonskih imunoglobulina ili slobodnih lakih lanaca) u niskim
koncentracijama od otprilike 2,0 mg/dL.
Preporučuje se identifikacija kako bi se utvrdile monoklonske ili oligoklonske komponente:
- imunotipizacijom primjenom tehnike SEBIA MINICAP IMMUNOTYPING URINE ili,
- imunofiksacijom pomoću kompleta SEBIA HYDRAGEL BENCE JONES, HYDRAGEL IF i HYDRAGEL URINE PROFIL(E) te specifičnim
antiserumima anti-slobodnih kapa i lambda lakih lanaca.
Komplementarni testovi, kao što je elektroforeza primjenom kompleta SEBIA HYDRAGEL PROTEINURIE ili HYDRAGEL URINE PROFIL(E), ili
nefelometrijski imunološki testovi, potrebni su za karakterizaciju u slučaju sumnje na tubularnu, glomerularnu ili miješanu proteinuriju nakon kapilarne
elektroforeze (3).
Za pomoć pri interpretaciji elektroforegrama proteina mokraće, vidjeti BIBLIOGRAFIJU.
- 207 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
Posebni slučajevi:
- Uzorci mokraće s koncentracijom ukupnih proteina ispod 15 mg/dL (prije pripreme za analizu) mogu pokazati proteine u podlozi (razmaz) po cijelom
obrascu.
- Kada se sumnja na abnormalnost u beta ili gama zoni, preporučuje se dalje provesti analizu na Bence Jones protein, bez obzira na koncentraciju
ukupnih proteina.
Međudjelovanje i ograničenja
Vidjeti UZORCI ZA ANALIZU.
Analizirajte samo uzorke pripremljene uređajima za dijalizu i ukoncentriravanje navedenim pod naslovom "POTREBNA OPREMA I DODACI", kao što
su sustavi za dijalizu SEBIA ili neki ekvivalentni uređaj koji ima jednaku djelotvornost i odobren je za kliničke analize.
Neodgovarajuća dijaliza uzorka može dovesti do ne-proteinskih rezidualnih frakcija. Ako se sumnja na interferencijsku frakciju, preporuka je ponovo
dijalizirati uzorak mokraće.
Interferencije kao što su lijek ili soli, eliminiraju se tijekom koraka dijalize. Ako se ovaj korak ne provodi pažljivo, vršci koji se opažaju mogu biti
artefaktualni.
Zbog rezolucije i granica osjetljivosti zonske elektroforeze, moguće je da se ovom metodom neki proteini u mokraći ne mogu detektirati.
Rješavanje problema
Nazovite tvrtku SEBIA ako test ne uspije iako ste se pažljivo pridržavali uputa za pripremu, pohranu materijala i provođenje postupka.
Sigurnosni podaci za komplet reagensa i informacije o čišćenju i zbrinjavanju otpadnih tvari, označavanju i pravilima sigurnosti koje primjenjuje SEBIA,
pakovanja za transport bioloških uzoraka i čišćenje instrumenata, dostupni su na DVD-u "UPUTE I SIGURNOSNI PODACI".
PODACI O UČINKOVITOSTI
Upotrijebljeni su standardni materijali, priprema uzoraka i postupci. Svi elektroforegrami procijenjeni su vizualno.
Ispitivanje podudarnosti
Ispitivanje podudarnosti rezultata provedeno je na 46 različitih uzoraka mokraće između postupka MINICAP URINE i komercijalno dostupnog sustava
za kapilarnu elektroforezu za analizu mokraće: u oba sustava analiziran je 1 normalan uzorak mokraće i 45 različitih patoloških uzoraka mokraće;
ukupne koncentracije proteina bile su između 0,005 i 1,196 g/dL.
Ovo ispitivanje pokazalo je 100 %-tno slaganje između te dvije tehnike:
Za normalan uzorak mokraće: potpuno slaganje (konkordancija).
Za 45 patoloških uzoraka mokraće: potpuno slaganje (konkordancija).
Svi analizirani patološki uzorci mokraće pokazali su pojedinačnim postupcima slaganje rezultata, a na svim patološkim uzorcima u svakom sustavu
detektirane su proteinske frakcije.
- 208 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Cameron JS. 1987. The nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis, 10 : 157-171.
Chopin N. 1991. Étude de la protéinurie. Inf Tech Biol, 1 : 23-28.
Henskens Y et al. Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis. Clin Chem, 44, 1184-1190 (1998).
Jellum E et al. Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis. J Chromatogr B, 689, 155-164 (1997).
Joachim GR, Cameron JS, Chwartz M, Belker EL. 1964. Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J Clin Invest,
43, 2332-2346.
Landers JP. Clinical Capillary Electrophoresis. Clin Chem, 41, 495-509 (1995).
Le Bricon T. 2002. Identification et dosage des proteines urinaires au laboratoire d’analyses. Ann Biol Clin, 60 : 525-540.
Le Carrer D. 1990. Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en 1990. L’Eurobiologiste, 190 : 395-405.
Le Carrer D, Nicolas A, Ducasse L. 1992. L’analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en 1992. Revue française des laboratoires, 225 :
41-47.
Le Carrer D, Chopin N. 1994. Profil protéique urinaire : Proposition d’un protocole d’exploration biologique des protéinuries. Revue française des
laboratoires, 269 : 29-37.
Philipon C. 1989. Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : 239-249.
Oda RP et al. Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids. Electrophoresis, 18, 1715-1723
(1997).
Waller KV, Ward KM, Mahan JD, Wismatt DK. 1989. Current concepts in proteinuria. Clin Chem, 35 : 755-765.
Westermeier R., "Electrophoresis in Practice. A Guide to Theory and Practice", VCH Publishers, New York, NY, 1993.
Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.
Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.
JB Oudart et al (2014) Place des explorations urinaires dans le diagnostic et le suivi des gammapathies monoclonales en pratique quotidienne.
Ann. Biol. Clin., 72 (2) : 147 – 152.
- 505 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 1
Urine normale
Normal
Zones protéiques
Protein zones
Albumin(e)
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Gamma
Alpha 2
Beta
Gamma
Figure 2
Urine pathologique avec 5 zones protéiques
Pathological urine sample with 5 protein zones
Zones protéiques
Protein zones
Albumin(e)
Alpha 1
- 506 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 3
Urine pathologique avec protéine de Bence Jones
Pathological urine sample with Bence Jones protein
Zones protéiques
Protein zones
Albumin(e)
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Gamma
protéine de Bence Jones
Bence Jones protein
Figure 4
Urine pathologique avec 2 protéines de Bence Jones
Pathological urine sample with 2 Bence Jones proteins
Zones protéiques
Protein zones
Albumin(e)
Alpha 1
Alpha 2
Beta
Gamma
2 protéines de Bence Jones
2 Bence Jones proteins
- 507 -
CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 5
Profil de référence : Sérum de Contrôle Normal dilué au 1/40
Reference pattern : Normal Control Serum diluted 40 times
Zones protéiques
Protein zones
Albumin(e)
Alpha 1 Alpha 2 Beta
- 508 -
Gamma
Author
Document
Category
Uncategorized
Views
1
File Size
352 KB
Tags
1/--pages
Report inappropriate content