Dobivanje i korištenje transgeničnih životinja Genetski modificirani miševi - modeli za izučavanje humanih fizioloških i patofizioloških procesa Prof.dr. Bojan Polić Medicinski fakultet Sveučilišta u Rijeci Riejka, svibanj 2013. Humani genom Pristupi u izučavanju funkcije gena u eukariotskim stanicama In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - privremena (tranzijentna) - stabilna In vivo • Transgenične životinje (u užem smislu) • Ciljana mutacija gena („gene targeting”) – „knock out/in” mutante miševa - konvencionalna - kondicionalna Transfekcija ili transdukcija eukariotskih stanica • Transgen obično sadrži cDNA i regulacijske elemente (promotor , pojačivač, transkripcijski stop signal) • DNA vektor sadrži i marker gen za pozitivnu selekciju • Transgen se ubacuje u stanicu transfekcijom ( precipitacija CaCl2, elektroporacija, liposomi) ili transdukcijom (retrovirusni vektori) • Transfekcija može biti tranzijentna (vektor smješten ekstrakromosomalno) ili stabilna (vektor nasumično integriran u genom stanice) Transfekcija stanica Transdukcija stanica Transfekcija i transdukcija stanica • Nasumična integracija vektora (pozicioni efekt) • Često višestruka integracija vektora • Problematična razina izražaja gena (obično u suvišku) • Moguća upotreba „dominantno-negativnih” transgena • Ispitivanje funkcije gena ograničeno na vrstu tranficirane (transducirane) stanice Ispitivanje funkcije gena in vivo Najčešći organizam: MIŠ - sisavac - genom miša je približno velik kao humani (3 x 109 pb, < 25 000 gena) - mišji genom je sekvenciran - oko 99% mišjih gena ima svog homolognog partnera u humanom genomu - vrlo slična fiziologija humanoj - brzo se razmnožava - relativno mali troškovi održavanja (u odnosu na druge sisavce) Pristupi u izučavanju funkcije gena in vivo In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - tranzijentna - stabilna In vivo • Transgenične životinje (u užem smislu) • Ciljana mutacija gena („gene targeting”) – „knock out/in” mutante miševa - konvencionalna - kondicionalna Transgenični miševi - Jaenisch et al. (1976), Gordon et al. (1980), Brinster et al. (1981), Constantini & Lacy (1981), Gordon & Ruddle (1981), E. Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1. Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2. - Fenotipska karakterizacija transgena geni eksprimirani tijekom razvoja (Kessel & Gruss, 1990) geni za hormone i receptore (Adams & Cory, 1991) geni u imunološkom odgovoru (Hanahan, 1989; Goodnow, 1992) virusni geni (Berns, 1991; Skowronski et al. 1993) Transgenični miševi Izolacija zigota miša (0.5 dana od oplodnje) Mikroinjiciranje transgena u muški pronukleus zigote Dobivanje transgeničnih miševa („klasični način”) Transgenični miševi („klasični način”) • transgen obično sadrži cDNA i regulacijske elemente (promotor, pojačivač, transkripcijsku stop sekvencu) • nasumična integracija transgena (moguće narušavanje funkcije drugih gena ili utjecaj drugih gena na transgen - pozicioni efekt!) • često višestruka integracija transgena (na jednom ili više lokusa - pojačani izražaj!) • Potrebno je pažljivo karakterizirati „foundere” kako bi se pronašla jedinka koja je odgovarajuća za daljnja istraživanja Pristupi u izučavanju funkcije gena in vivo In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - privremena (tranzijentna) - stabilna In vivo • Transgenične životinje (u užem smislu) • Ciljana mutacija gena („gene targeting”) – „knock out/in” mutante miševa - konvencionalna - kondicionalna Ciljana mutacija gena („gene targeting”) Vektor za ciljanu mutaciju gena - Područja homologije koja omeđuju nehomolognu sekvencu DNK - Marker gen za pozitivnu selekciju EMS (rezistencija na G418 (genenticin), higromicin, puromicin, itd.) smješten u području nehomologne sekvence (središnji dio vektora) - Marker gen za negativnu selekciju (HSV tk; dt) smješten na kraju jedne od homolognih sekvenci – služi za kontraselekciju nasumično (nehomologno) integriranih vektora Ciljana mutacija gena („gene targeting”) Ciljana mutacija gena Ciljanu mutaciju gena postižemo homolognom rekombinacijom vektora u mišjim embironalnim matičnim stanicama (EMS) ili „embryonic stem cells” – (ESC) Embrionalne matične stanice - 1981.g. M. Evans et al. – prvi puta izolirali EM stanice iz teratoma, a potom iz blastociste - 1984.g. A. Bradley – mikroinjicirao EMS u blastocistu i dobio kimere - 1986.g. M. Capecchi; 1987/88.g. O. Smithies – prve ciljane mutacije u EMS - 1989.g. O. Smithies i sur. (HPRT)- dobiveni prvi miševi ciljanom mutacijom gena (Jaenisch 1990, Rajewsky 1990) 2007.g. – M. Evans, M. Capecchi i O. Smithies – Nobelova nagrada Rani embrionalni razvoj miša Blastocista miša Potencijal diferencijacije EMS Izolacija EMS Uzgoj EMS Uzgoj EMS Embrionalne matične stanice (EMS) Neke od EMS linija koje se koriste za ciljanu mutaciju: - E14, D3, AB1, R1, J1, CCE - izolirane iz 129 podsojeva miševa (H2b) - Bruce 4, ES623, B6-3 – izolirane iz C57BL/6 miševa (H2-b) Albino BL6 EMS iz C57BL/6-tyr(c-2J) - EMS izolirane iz Balb/c miševa Transfekcija i selekcija EMS • Pozitivna selekcija: G418 („Genenticin”), Puromicin, Higromicin, i dr. • Negativna selekcija: Ganciklovir, toksin difterije Mikroinjiciranje homolognih rekombinanti EMS u blastocistu Priprema donora i primaoca 3.5 dana starih embrija (blastociste) Donori embrija Primaoci embrija fertilna ženka X fertilni mužjak fertilna ženka X sterilni mužjak Početak parenja: ponedjeljak Vaginalni plak: utorak Blastociste: petak Početak parenja: utorak Vaginalni plak: srijeda Blastociste: petak Uvjeti pripreme donora i primaoca embrija • Vivarij mora imati reguliran režim svjetlog i tamnog perioda (npr. 19 h – 5 h mrak i 5 h – 19 h svjetlo) • Ženke pod konstantnim režimom svjetlog i tamnog perioda ovuliraju svakih 4-5 dana (3-5 h nakon početka mračnog perioda) • Koncepcija obično nastupa u sredini mračnog perioda • Ženke moraju biti starije od 6 tj. za prirodno parenje, a mlađe u slučaju hormonski stimulirane superovulacije • Dobri uvjeti uzgoja (mir, adekvatna hrana, vlažnost, jačina svjetla, odsutnost patogena, higijena, itd.) Hormonski stimulirana superovulacija • 3 – 5 tj. stare ženke (predpubertetno razdoblje) • 48 h prije parenja injicira im se 5 i.u. PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) - FSH • 2 - 6 h prije parenja injicira im se 5 i.u. hCG (humani korionski gonadotropin) Izolacija blastocisti miša Izolacija blastocisti miša Mikroinjiciranje homolognih rekombinanti EMS u blastocistu Prijenos embrija u uterus pseudotrudne ženke Prijenos embrija u uterus pseudotrudne ženke Prijenos embrija (embriotransfer) u uterus pseudotrudne ženke Kimerični miš Kimerični miš Prijenos mutacije („germ-line transmission”) Ciljana mutacija gena Rezultat ciljane mutacije gena: • „knock-out” miševi – ciljana delecija ili inaktivacija gena (potpuna ili parcijalna delecija gena) • „knock-in” miševi – ciljano ubacivanje nekog genskog elementa ili (trans)gena u točno određen genski lokus Ciljana mutacija gena • Konvencionalna – mutacija gena je prisutna već od ranog embrionalnog razvoja u svim stanicama („klasični” knock-out i knock-in miševi) • Kondicionalna – mutacija gena se može aktivirati specifično u pojedinim stanicama i/ili u željeno vrijeme - neinducibilna (specifična i nespecifična) - inducibilna (specifična i nespecifična) NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) Zafirova et al. Immunity 2009 NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) Zafirova et al. Immunity 2009 NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) Zafirova et al. Immunity 2009 NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) Zafirova et al. Immunity 2009 NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) Zafirova et al. Immunity 2009 NKG2D je važan za formiranje memorijskih CD8+ limfocita T Felix M. Wensveen et al. submitted, 2013. NKG2D je važan za formiranje memorijskih CD8+ limfocita T Felix M. Wensveen et al. submitted, 2013. NKG2D igra ulogu u atopisjkom odgovoru kože posredovanom γδ limfocitima T Science, 334:1293, 2011. TCR konck-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) TCR knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) Razvoj limfocita T u timusu TCR knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) P. Mombaerts et al. Nature, 1992. Konvencionalna ciljana mutacija Problem: • Izražaj mnogih gena je esencijalan za razvoj embrija ili pojedinih stanica • Inaktivacija (mutacija) istih u ranoj embrionalnoj fazi zaustavlja razvoj embrija ili stanica • To onemogućava istraživanje fukcije istih gena u odraslom organizmu ili zrelim stanicama Ciljana mutacija gena • Konvencionalna – mutacija gena je prisutna već od ranog embrionalnog razvoja u svim stanicama miša („klasični” knock-out i knock-in miševi) • Kondicionalna – mutacija gena se može aktivirati specifično u pojedinim stanicama i/ili u željeno vrijeme - neinducibilna (specifična i nespecifična) - inducibilna (specifična i nespecifična) Ciljana mutacija gena Konvencionalna mutacija Kondicionalna neinducibilna mutacija Kondicionalna inducibilna mutacija Kondicionalna ciljana mutacija Koriste se najčešće dva sustava: • Cre / loxP sustav (bakteriofag P1) • Flp / FRT sustav (kvasac) Kondicionalna ciljana mutacija loxP mjesto Cre / loxP sustav: • Cre rekombinaza • loxP mjesta Kondicionalna ciljana mutacija Da bismo ostvarili kondicionalnu mutaciju gena moramo imati dva miša (alela): • Miš koji sadrži gen ili dio gena omeđenog loxP sekvencama („floksiran” gen) • Miš koji sadrži Cre transgen (specifični i nespecifični, inducibilni i neinducibilini promotor) Kondicionalnu mutaciju gena možemo ostvariti onda kada križamo ova dva miša, odnsno kada imamo oba alela (cre i flox) u istoj životinji Kondicionalna ciljana mutacija Kondicionalna neinducibilna mutacija gena Kondicionalna ciljana mutacija (mutacija IKK kompleksa) Akitvacija NF-κB puta NF-κB NF-κB Kondicionalna ciljana mutacija (neinducibilna) IKK - kompleks Kondicionalna ciljana mutacija (neinducibilna) Incontinentia pigmenti Incontinentia pigmenti • X vezano svojstvo • mutacija u Nemo genu (Nemo dio IKK kompleksa • rana smrtnost muške djece Nemo knock-out (konvencionalna ciljana mutacija) M. Schmidt-Supprian et al., Mollecular Cell 2000 Kondicionalna ciljana mutacija (neinducibilna) Kondicionalna ciljana mutacija IKK2 (neinducibilna) K14 – Cre X IKK2 fl/fl M. Pasparakis, Nature 2002 Kondicionalna ciljana mutacija IKK2 (neinducibilna) M. Pasparakis, Nature 2002 Kondicionalna ciljana mutacija „Cre Zoo” Kondicionalna inducibilna ciljana mutacija Science, 269:1427-1429, 1995 Kondicionalna inducibilna ciljana mutacija • Miš sa „floxiranim” željenim alelom x • Miš sa MxCre ili nekim drugim inducibilnim transgenom (npr. CreERt2) Mx promotor – inducira ga IFNα CreERt2 – aktivira se Tamoksifenom TCR knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija) P. Mombaerts et al. Nature 360:225, 1992. Kondicionalna inducibilna ciljana mutacija Kako istražiti ulogu TCR-a u homeostazi zrelih naivnih i memorijskih limfocita T? Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi PNAS 98:8744, 2001 Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi Ciljana mutacija gena Rezultat ciljane mutacije gena: • „knock-out” miševi – ciljana nul-mutacija gena • „knock-in” miševi – ciljano ubacivanje nekog genskog elementa ili (trans)gena u točno određen genski lokus Knock-in miševi • Ciljano ubacujemo neki genski element ili transgen u određeni genski lokus (ili želimo ekspresiju nekog ektopičnog gena pod specifičnim promotorom ili želimo kontroliran broj kopija i ekspresiju nekog transgena) • Obično mijenjamo postojeću strukturu genskog lokusa • Reporter miševi (GFP, RFP, YFP i dr.) ili Cre (Flp) ili DT(R) miševi su obično knock-in miševi • Za knock-in transgena se često koriste Rosa-26 ili HPRT lokus, ali se može koristiti i bilo koji drugi genski lokus „Reporter” miševi Specifična ekspresija GFP na limfocitima B STOP CD19 Cre GFP Rosa26 lokus knock-in CD19 Cre transgen GFP miš Nespecifično izražen GFP (Deleter Cre + Reporter GFP) Kondicionalni transgen (knock-in) „Brainbow” vektor Kondicionalni transgen (konck-in) („Brainbow”) Specifična i kondicionalna deplecija stanica in vivo Specifična ekspresija difterija toksin receptora (DTR) na limfocitima B (miševi nemaju DTR!) STOP CD19 Cre DTR Rosa26 lokus knock-in CD19 Cre transgen • Injiciranje difterija toksina (DT) dovodi do deplecije limfocita B Genetski modificirani miševi International Mouse Strain Resource (IMSR) http://www.findmice.org/ European Mouse Mutant Archive (EMMA) http://www.emmanet.org/ Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC) – supported by NIH http://www.mmrrc.org/ The Mouse Mutant Resource – The Jackson Laboratory http://mousemutant.jax.org/ Kloniranje miševa Miševi s klonalnim TCR i BCR dobiveni nuklearnim transferom Nature, 415:1035, 2002 Monokonski TCR i BCR miš dobiven nuklearnim transferom Kloniranje miševa Potencijal diferencijacije EMS Ciljani popravak gena Terapeutsko kloniranje miševa i popravak Rag2 mutacije Da li možemo upotrebom određenih faktora reprogramirati bilo koju somatsku stanicu čime bismo mogli zaobići nuklearni transfer? Inducirane pluripotentne matične stanice (iPMS) Inducirane pluripotentne matične stanice (iPMS) Miševi dobiveni komplementacijom tetraploidnih blastocisti s iPMS Inducirane pluripotentne matične stanice (iPMS) Nobelova nagrada 2012.g. - Shinya Yamanaka - John B. Gurdon Reprogramiranje u iPMS je univerzalno Primjena iPMS Cell Stem Cell, 2012
© Copyright 2024 Paperzz
