EN
ImmuLisa™
Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
Combined detection of IgA and IgG antibodies against human tissue
transglutaminase and deamidated gliadin peptide
[IVD]
For in vitro diagnostic use
PRODUCT INSERT
[REF] 5157
Celiac Fusion™ ELISA
96 Determinations
INTENDED USE
Enzyme linked immunoassay (ELISA) for the qualitative and semi-quantitative
detection of anti-human Tissue Transglutaminase (tTG) and deamidated gliadin
peptide (DGP) IgA and IgG antibodies in human serum to aid in the diagnosis of
gluten sensitive enteropathy / celiac disease in conjunction with other laboratory
and clinical findings.
SUMMARY AND EXPLANATION
Celiac Disease (CD) is an autoimmune gastrointestinal disorder that may occur
in genetically susceptible individuals triggered by the ingestion of glutencontaining grains such as wheat, barley and rye. Studies have found the
prevalence of CD to be highly variable. The current estimated prevalence of CD
is 1%, with a statistical range of probability between 0.5–1.26% in the general
population in Europe and the USA. Using serological methods, the incidence of
1,2
CD in the general population is approximately one in 100.
Failure to diagnose CD early on may predispose an individual to long-term
3,4
complications such as splenic atrophy and intestinal lymphoma. A gluten-free
diet normalizes the mucosa and helps reduce the malignant potential.
Histological examination of the small intestinal biopsy remains the gold standard
for diagnosing CD, but it has its own limitations. These include some patients
5
with latent or even active CD that may have normal histopathology.
The various serological tests employed in the work-up of patients suspected to
have CD include gliadin (AGA), DGP, tTG and endomysial (EMA), antibody tests.
Antibodies to gliadin, DGP, and tTG are detected by ELISA, whereas EMA are
detected by indirect immunofluorescence. EMA are very specific indicators of
CD. However, the EMA test is an immunohistochemical method that requires
6
experience in reading immunofluorescence reactions.
Since identification of tTG as the endomysial antigen, ELISA methods have been
described for detecting antibodies in the sera of patients with CD. The advantage
of the anti-tTG antibody ELISA assay is that it is automatable and less subjective
than EMA. The addition of DGP based assays have shown promising results in
7-13
addressing the limitations of the current panel of assays.
For this reason,
many laboratories have opted to use tTG antibody paired with deamidated gliadin
1
EN
antibody as the preferred screening method. The combination of tTG and DGP in
one assay can increase sensitivity by exposing multiple analyte epitopes
especially in IgA-deficient celiac patients. Unfortunately, simply adding DGP to
tTG in a mixture can increase non-specific interactions or mask required
14
epitopes. This assay utilizes a proprietary recombinant antigen that displays a
predetermined ratio of both tTG and DGP epitopes on a single molecule. This
approach allows for the reduction of the potential for epitope masking
encountered in mixtures of antigens while effectively improving reproducibility of
the assay and minimizing non-specific binding in disease controls reported in
15-21
some other tTG immunoassays.
The ImmuLisa™ Celiac Fusion™ Screen
ELISA is a unique, high specificity and sensitivity immunoassay for the detection
of antibodies of IgA and IgG isotypes against tTG and DGP suitable as an initial
serological screen for celiac disease.
PRINCIPLES OF PROCEDURE
The test is performed as a solid phase immunoassay. Microwells are coated with
a recombinant antigen containing tTG and DGP epitopes followed by a blocking
step to reduce non-specific binding during the assay run. Controls, calibrators
and patient sera are incubated in the antigen coated wells to allow specific
antibodies present in the serum to bind to the antigen. Unbound antibodies and
other serum proteins are removed by washing the microwells. Bound antibodies
are detected by adding an enzyme labeled anti-human IgA/IgG conjugate to the
microwells. Unbound conjugate is removed by washing. Specific enzyme
substrate (TMB) is then added to the wells and the presence of antibodies is
detected by a color change produced by the conversion of TMB substrate to a
colored reaction product. The reaction is stopped and the intensity of the color
change, which is proportional to the concentration of antibody, is read by a
spectrophotometer at 450 nm. Results are expressed in ELISA units per milliliter
(EU/ml) and reported as positive or negative.
REAGENTS
Storage and Preparation
Store all reagents at 2-8°C. Do not freeze. Reagents are stable until the
expiration date when stored and handled as directed.
Do not use if reagent is not clear or if a precipitate is present. All reagents must
be brought to room temperature (20-25°C) prior to use.
Reconstitute the wash buffer to 1 liter with distilled or deionized water. When
stored at 2-8°C, the reconstituted wash buffer is stable until the kit expiration
date.
Coated microwell strips are for one time use only. Unused microwell strips should
be carefully resealed in the pouch containing desiccants to prevent condensation
and stored at 2-8°C.
Precautions
All human derived components used have been tested for HBsAg, HCV, HIV-1
and 2 and HTLV-I and found negative by FDA required tests. However, human
blood derivatives and patient specimens should be considered potentially
2
EN
infectious. Follow good laboratory practices in storing, dispensing and disposing
22
of these materials.
Stop Solution is a dilute sulfuric acid solution. Sulfuric acid (H 2SO4) is poisonous
and corrosive. Do not ingest and avoid contact with skin and eyes. Avoid
exposure to bases, metals or other compounds that may react with acids.
TMB Enzyme Substrate contains an irritant that may be harmful if inhaled,
ingested or absorbed through the skin. Do not ingest and avoid contact with skin
and eyes.
Instructions should be followed exactly as they appear in this kit insert to
ensure valid results. Do not interchange kit components with those from other
sources. Follow good laboratory practices to minimize microbial and cross
contamination of reagents when handling. Do not use kit components beyond
expiration date on the labels.
Materials provided
ImmuLisa™ Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
[REF] 5157
Kits contains sufficient reagents to perform 96 determinations.
12 x 8
[MICROPLATE|FUSION]
Microplate with individual breakaway microwells.
Coated with recombinant tTG/DGP antigen.
Ready for use.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|+|FUSION]
Ready to use Positive Control (red cap).
Contains human serum positive for tTG and DGP
antibodies. The expected concentration range in
EU/ml is printed on the label.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|-]
Ready to use Negative Control (white cap).
Contains human serum.
5 x 1.75 ml
[CALIBRATOR|A|FUSION]
Ready to use set of 5 Calibrators. Calibrator A
(green cap) 160 EU/ml, Calibrator B (violet cap)
80 EU/ml, Calibrator C (blue cap) 40 EU/ml,
Calibrator D (yellow cap) 20 EU/ml, and Calibrator
E (orange cap) 1 EU/ml. Derived from human
serum containing tTG and DGP antibodies.
Concentrations in EU/ml are printed on the labels.
[CALIBRATOR|B|FUSION]
[CALIBRATOR|C|FUSION]
[CALIBRATOR|D|FUSION]
[CALIBRATOR|E|FUSION]
1 x 15 ml
[IgA/IgG-CONJ|HRP]
HRP goat anti-human IgA/IgG Conjugate. Ready
for use. Color coded pink.
1 x 60 ml
[DIL]
Serum Diluent. Ready for use. Color coded
purple.
1 x 15 ml
[SUBSTRATE|TMB]
TMB enzyme substrate. Ready for use. Protect
from light.
1 x 15 ml
[STOP|H2SO4]
Stop Solution. Ready for use.
2 x vials
[BUF|WASH]
Powder Wash Buffer. Reconstitute to one liter
each.
1x
Protocol Sheets
Optional Components
1 x 60ml
[BUF|WASH]
Liquid concentrated Wash Buffer. Reconstitute to
one liter.
3
EN
Symbols used on labels
[LOT]
Lot number
[REF]
Catalog number
[IVD]
In vitro diagnostic use
e
t
!
s
Use by
Storage temperature
Read instructions before use
Number of tests
Manufacturer
Materials Required But Not Provided
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Deionized or distilled water
Squeeze bottle to hold diluted wash buffer
Pipettes capable of delivering 5 µl to 1000 µl
Disposable pipette tips
Clean test tubes 12 x 75 mm and test tube rack
Timer
Absorbent paper towels
Microplate reader capable of reading absorbance values at 450 nm. If dual
wavelength microplate reader is available, the reference filter should be set
at 600-650 nm
Automatic microplate washer capable of dispensing 200 µl
SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING
Only serum specimens should be used in this procedure. Grossly hemolyzed,
lipemic or microbially contaminated specimens may interfere with the
performance of the test and should not be used. Store specimens at 2°- 8°C for
no longer than one week. For longer storage, serum specimens should be
frozen. Avoid repeated freezing and thawing of samples. It is recommended that
frozen specimens be tested within one year.
PROCEDURE
Procedural Notes
•
•
•
•
Carefully read the product insert before starting the assay.
All dilutions of the patient samples should be prepared prior to starting with
the assay.
Let patient specimens and test reagents equilibrate to room temperature
before starting with the test procedure. It is suggested that reagents be left
on the bench out of the box for 30 minutes prior to use. Return all unused
specimens and reagents to refrigerator immediately after use.
Remove required microwell strips from the pouch and carefully reseal the
pouch to prevent condensation in the unused wells. Return pouch
immediately to refrigerator.
4
EN
•
Good washing technique is critical. If washing is performed manually,
adequate washing is accomplished by directing a forceful stream of wash
buffer with a wide tip wash bottle across the entire microplate. An
automated microplate washer is recommended.
•
Use a multichannel pipette capable of delivering 8 or 12 wells
simultaneously. This speeds the process and provides more uniform
incubation times.
•
For all steps, careful control of timing is important. The start of all incubation
periods begins with the completion of reagent addition.
•
Addition of all samples and reagents should be performed at the same rate
and in the same sequence.
Test Method
Step 1
Step 2
Step 3
Let all reagents and specimens equilibrate to room temperature.
Label protocol sheet to indicate sample placement in the wells. It is
good laboratory practice to run samples in duplicate.
For a qualitative determination use Calibrator D (vial with yellow cap)
only.
or
For a semi-quantitative determination use Calibrators A through E
as depicted in the sample layout below.
Qualitative
A
B
C
D
E
F
G
H
Step 4
Step 5
Step 6
Step 7
Blank
+
Control
Cal D
Control
S1
S2
S3
S4
1
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
2
Semi-Quantitative
Etc.
A
B
C
D
E
F
G
H
3
Blank
+
Control
Cal A
Control
Cal B
Cal C
Cal D
Cal E
1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
2
Etc.
3
Prepare a 1:101 dilution of the patient samples by mixing 5 µl of the
patient sera with 500ul of Serum Diluent.
Remove the required microwells from pouch and return unused strips
in the sealed pouch to refrigerator. Securely place the microwells into
the extra provided holder.
Pipette 100 µl of Ready to use Calibrators, Positive and Negative
controls and diluted patient samples (1:101) to the appropriate
microwells as per protocol sheet.
Note: Include one well which contains 100 µl of the Serum Diluent as a
reagent blank. Zero the ELISA reader against the reagent blank.
Incubate 30 minutes (± 5 min) at room temperature.
5
EN
Step 8
Step 9
Step 10
Step 11
Step 12
Step 13
Step 14
Step 15
Wash 4x with wash buffer. For manual washing, fill each microwell with
reconstituted wash buffer. Discard the fluid by inverting and tapping out
the contents of each well or by aspirating the liquid from each well. To
blot at the end of the last wash, invert strips and tap the wells
vigorously on absorbent paper towels. For automatic washers, program
the washer as per manufacturer’s instructions.
Pipette 100 µl of Conjugate into microwells.
Incubate 30 minutes (± 5 min) at room temperature.
Wash all microwells as in Step 8.
Pipette 100 µl of Enzyme Substrate into each microwell in the same
order and timing as for the Conjugate.
Incubate 30 minutes (± 5 min) at room temperature.
Pipette 100 µl of Stop Solution into each microwell using the same
order and timing as for the addition of the Enzyme Substrate. Read
absorbance values within 30 minutes of adding Stop Solution.
Read absorbance of each microwell at 450 nm using a single or at
450/630nm using a dual wavelength microplate reader against the
reagent blank set at zero absorbance.
Quality Control
Calibrators, Positive and Negative Controls and a reagent blank must be run with
each assay to verify the integrity and accuracy of the test. The absorbance
reading of the reagent blank should be <0.3. The Calibrator A should have an
absorbance reading of not less than 1.0, otherwise the test must be repeated.
The negative control must be <10 EU/ml. If the test is run in duplicate, the mean
of the two readings should be taken for determining EU/ml. While performing
Qualitative determinations, the optical density of Calibrator D must be greater
than that of the negative control and less than the absorbance of the positive
control. For semi-quantitative determinations the positive control must give
values in the range stated on the vial.
RESULTS
Calculations
The concentrations of the patient samples can be determined by either of two
methods:
1.
QUALITATIVE DETERMINATION
Abs. of Test Sample
---------------------------Abs. of Calibrator D
X EU/ml of Calibrator D
=
EU/ml Test Sample
It is recommended that qualitative results be reported as “positive” or
“negative.” Sample results greater than or equal to Calibrator D are
considered positive.
6
EN
2. SEMI-QUANTITATIVE DETERMINATION
Plot the absorbance of Calibrator A through E against their respective
concentrations on linear-log graph paper. Plot the concentrations in EU/ml
on the X-axis against the absorbance on the Y-axis and draw a point-to-point
curve fit. Determine the concentrations of the patient samples from the curve
according to corresponding absorbance values.
Alternately, a four
parameter curve may be used to plot the standard curve.
It is recommended that semi-quantitative results be reported as “positive,”
“negative,”
or
“indeterminate”
with
EU/ml
unit
values.
Indeterminate/borderline results should be retested and evaluated along with
other laboratory methods, such as assays for detection of EMA and/or
Gliadin antibodies.
Interpretation
The following serves only as a guide in the interpretation of the laboratory
results. These values were determined by testing 123 normal blood donors
and non-celiac disease control specimens. The mean of the normal subjects
plus 2.5 SD was established as the assay cutoff and assigned an arbitrary
value of 20 EU/ml. Each laboratory must determine its own normal values.
Celiac Fusion™ value
Interpretation
<20 EU/ml
20-25 EU/ml
>25 EU/ml
Negative
Indeterminate (Borderline)
Positive
Calibrator
The Ready to Use Calibrators are included to provide semi-quantitation and
must be used with each run. Patient samples containing high antibody levels
may give absorbance values greater than that of Calibrator A. For
determining accurate semi-quantitative values, such specimens should be
further diluted so they fall within the range of the calibrator curve when
retested. For determining EU/ml values, multiply the units obtained by the
dilution factor.
LIMITATIONS OF PROCEDURE
Only serum specimens should be used in this procedure. Grossly hemolyzed,
lipemic or microbially contaminated specimens may interfere with the
performance of the test and should not be used. Store specimens at 2-8°C for no
longer than one week. For longer storage, serum specimens should be frozen.
Avoid repeated freezing and thawing of samples.
Test results serve as an aid in the diagnosis and should be considered in
conjunction with other laboratory and clinical findings.
EXPECTED VALUES
Test results in a normal population are usually expected to be negative.
However, as the incidence of CD in the normal population is about 1%, some
apparently healthy, asymptomatic individuals may test positive for tTG
antibodies.
7
EN
The incidence and levels of autoantibodies associated with gluten sensitive
enteropathy / CD are dependent upon the diet status. The levels of these
antibodies decrease and eventually will become negative in patients who are on
a gluten-free diet. Similarly, the levels of these antibodies will increase and may
become positive when patients with CD who were on a gluten-free diet ingest a
18-20
gluten-containing diet.
Patients who have CD but are IgA deficient will
generally be positive for IgG antibodies to tTG and gliadin. In such cases studies
can be performed to confirm that the patient is IgA deficient.
Sets of clinical samples were tested on the ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA.
Results demonstrating incidence in the populations for this study are provided
below.
Patient Group
Disease Associated
Celiac Disease
Disease Control
Hashimoto’s Thyroiditis
Mixed Connective Tissue Disease
Rheumatoid Arthritis
Scleroderma
Systemic Lupus Erythematosus
Vasculitis
Healthy normals
IMMCO
n Pos
% Pos
n
166
157
94.6%
16
8
8
8
16
8
112
0
0
1
0
0
0
6
0.0%
0.0%
12.5%
0.0%
0.0%
0.0%
5.4%
Note: Population tested included a large number of challenging low EMA titer
samples and does not reflect a typical diagnosed CD population nor a typical
screening population.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
The utility of the ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA was evaluated by testing
well-characterized EMA positive serum specimens from CD subjects alongside
disease controls and “normal” human sera. These specimens were also tested
on a commercially available tTG/DGP Antibody Screen ELISA. These results are
summarized below.
A. Method Comparison: ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA vs. other tTG/DGP
screen ELISA.
8
EN
Other tTG/DGP Screen ELISA
IMMCO
Positive
Celiac Fusion™ Negative
Screen ELISA Total
Positive
52
2
54
Negative
3
52
55
Total
55
54
109
Positive Percent Agreement:
96.3% (95% CI 86.2% to 99.4%)
Negative Percent Agreement:
94.5% (95% CI 83.9% to 98.6%)
Overall Percent Agreement:
95.4% (95% CI 89.1% to 98.3%)
EMA Positive Celiac Subjects: 57
Disease Controls: 20
Healthy Normal Subjects: 32
B. Cross Reactivity: A total of 64 potentially cross-reactive specimens from
individuals with other autoimmune disorders or positive for other autoantibodies
were tested for tTG/DGP antibodies using the ImmuLisa™ Celiac Fusion™
ELISA.
Condition
Hashimoto’s Thyroiditis
Mixed Connective Tissue Disease
Rheumatoid Arthritis
Scleroderma
Systemic lupus erythematosus
Vasculitis
n
16
8
8
8
16
8
n Positive
0
0
1
0
0
0
Total
64
1 (1.6%)
Precision
Precision was tested with multiple specimens selected throughout the range of
the assay. Multiple assay runs were performed to determine results between
days. An additional run of twelve replicates was performed to determine
repeatability. Results are summarized below.
Mean
(EU/ml)
Total Imprecision
SD
Kit
Celiac
Fusion™
Screen
Assay
#
1
2
3
4
5
6
8.0
16.8
27.1
37.9
75.5
151.2
(EU/ml)
0.844
1.406
1.789
1.777
3.297
4.877
CV%
10.5%
8.4%
6.6%
4.7%
4.4%
3.2%
Between days
Within run
(Repeatability)
SD
SD
(EU/ml)
0.885
1.387
1.818
1.793
3.368
4.683
CV%
11.7%
8.5%
6.8%
4.7%
4.4%
3.1%
(EU/ml)
0.503
1.255
1.402
1.753
2.766
4.630
CV%
6.6%
7.6%
5.2%
4.6%
3.6%
3.1%
Reproducibility
Eighty replicates of samples in the negative range, ~20% below cutoff, ~20%
above cutoff and in the moderate positive range of the assay were performed to
determine qualitative reproducibility. These samples were tested in multiple runs.
Assay results for each specimen produced 100% qualitative agreement.
9
EN
Limit of Detection
The limit of detection (LoD) was determined based on 60 replicates of the blank
and 10 replicates each of 6 low-level (NHS) samples. LoD for was 3.0 EU/ml.
Linearity and Recovery
Linearity and recovery were tested by diluting positive specimens through the
assay range in equidistant dilutions and comparing actual vs. expected results.
The linear range of the assay was determined be 3.0 (LoD) – 160 EU/ml. Results
are summarized below:
Test Range
(EU/ml)
2.90 to 37.4
25.3 to 74.5
47.7 to 153.9
Slope (95% CI)
1.062
(1.007 to 1.117)
0.998
(0.907 to 1.090)
1.024
(0.861 to 1.187)
Y-intercept
(95% CI)
-1.907
(-3.28 to -0.53)
0.603
(-4.156 to 5.361)
2.049
(-14.90 to 18.99)
1.0
% recovery
(obtained/expected)
97.3 to 114.6
0.99
90.3 to 104.7
0.99
92.4 to 100.0
R²
Interference
Interference was studied by mixing sera with known tTG/DGP antibody levels
with potentially interfering serum samples and studying deviation from expected
results.
No significant interference was demonstrated for the following
substances at the levels indicated: Hemoglobin (2 g/L), Bilirubin (342 μmol/L),
Rheumatoid Factor (100 EU/ml), Triglycerides (37 mmol/L) and Cholesterol (130
mmol/L).
10
EL
ImmuLisa™
Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
Συνδυασμένη ανίχνευση αντισωμάτων IgA και IgG έναντι
τρανσγλουταμινάσης ανθρώπινου ιστού και deamidated πεπτιδίου
γλιαδίνης
[IVD]
Για in vitro διαγνωστική χρήση
ΕΝΘΕΤΟ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ
[REF] 5157
Celiac Fusion™ ELISA
96 Προσδιορισμοί
ΣΚΟΠΟΥΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ
Ανοσοενζυμική δοκιμασία (ELISA) για την ποιοτική ή ημιποσοτική ανίχνευση
Τρανσγλουταμινάσης ανθρώπινου Ιστού (tTG) και αντισωμάτων deamidated
πεπτιδίου γλιαδινης (DGP) IgA και IgG σε ανθρώπινο ορό ως βοήθημα στη
διάγνωση εντεροπάθειας ευαίσθητης στη γλουτένη / κοιλιοκάκη σε συνδυασμό με
άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ
Η Κοιλιοκάκη (CD) είναι μια αυτοάνοση γαστρεντερική διαταραχή που μπορεί να
εμφανισθεί σε γενετικά επιρρεπή άτομα που πυροδοτείται από την λήψη κόκκων
που περιέχουν γλουτένη, όπως σιτάρι, κριθάρι και σίκαλη. Μελέτες έχουν δείξει
ότι η εξάπλωση της CD είναι άκρως ευμετάβλητη. Η τρέχουσα εκτιμώμενη
εξάπλωση της CD είναι 1%, με στατιστικό εύρος πιθανότητας μεταξύ 0.5–1.26%
στον γενικό πληθυσμό στην Ευρώπη και τις ΗΠΑ. Η χρήση ορολογικών
μεθόδων, τα περιστατικά CD στον γενικό πληθυσμό είναι περίπου ένα στα
1,2
100.
Αδυναμία διάγνωσης της CD σε πρώιμο στάδιο μπορεί να προδιαθέσει ένα
άτομο για μακροπρόθεσμες επιπλοκές, όπως σπληνική ατροφία και εντερικό
3,4
λέμφωμα. Μια δίαιτα χωρίς γλουτένη εξομαλύνει τη βλέννα και βοηθά στη
μείωση της πιθανότητας κακοήθειας. Η ιστολογική εξέταση της βιοψίας του
μικρού εντέρου παραμένει ο χρυσός κανόνας για τη διάγνωση της CD, ωστόσο
έχει τους δικούς της περιορισμούς. Αυτοί περιλαμβάνουν κάποιους ασθενείς με
5
λανθάνουσα ή ενεργή CD που μπορεί να έχουν φυσιολογική ιστοπαθολογία.
Οι διάφορες ορολογικές εξετάσεις που πραγματοποιούνται κατά την βελτίωση
των ασθενών που πιθανώς να έχουν CD περιλαμβάνουν εξετάσεις αντισωμάτων
γλιαδίνης (AGA), DGP, tTG και ενδομυϊου (EMA). Αντισώματα σε γλιαδίνη, DGP,
και tTG ανιχνεύονται από τη μέθοδο ELISA, ενώ ενδομυϊου (EMA) ανιχνεύονται
με έμμεσο ανοσοφθορισμό. Τα EMA είναι πολύ συγκεκριμένοι δείκτες της CD.
Ωστόσο, η δοκιμή EMA είναι μια ανοσοϊστοχημική μέθοδος που απαιτεί εμπειρία
6
στην ανάγνωση των αντιδράσεων ανοσοφθορισμού.
Από την εξακρίβωση του tTG ως το αντιγόνο ενδομυϊου, οι μέθοδοι ELISA έχουν
περιγραφεί για την ανίχνευση αντισωμάτων στον ορό ασθενών με CD. Η
11
EL
υπεροχή της δοκιμασίας ELISA για αντισώματα έναντι tTG είναι ότι είναι
αυτοματοποιήσιμη και λιγότερο υποκειμενική από το EMA. Η προσθήκη
δοκιμασιών με βάση την DGP έχουν δείξει ευοίωνα αποτελέσματα στον
7-13
καθορισμό των περιορισμών του τρέχοντος σετ δοκιμασιών.
Για τον λόγο
αυτό, πολλά εργαστήρια έχουν επιλέξει να χρησιμοποιήσουν αντίσωμα tTG
συνταιριασμένο με deamidated αντίσωμα γλιαδίνης ως την προτιμώμενη μέθοδο
ελέγχου. Ο συνδυασμός tTG και DGP σε μία δοκιμασία μπορεί να αυξήσει την
ευαισθησία εκθέτοντας πολλαπλούς επίτοπους αναλύτες ειδικά σε ασθενείς με
κοιλιάκη και ανεπάρκεια ανοσοσφαιρίνης Α (IgA-deficient). Δυστυχώς, η απλή
προσθήκη DGP στο tTG σε ένα μείγμα μπορεί να αυξήσει μη συγκεκριμένες
14
αλληλεπιδράσεις ή να αποκρύψει απαιτούμενα επίτοπα. Αυτή η δοκιμασία
χρησιμοποιεί ένα αποκλειστικό ανασυνδυαζόμενο αντιγόνο που παρουσιάζει μια
προκαθορισμένη αναλογία επίτοπων τόσο tTG και DGP σε ένα μόνο μόριο. Η
προσέγγιση αυτή επιτρέπει την μείωση της πιθανότητας το επίτοπο που
αποκρύπτει όσα βρίσκονται σε μείγματα αντιγόνων ενώ βελτιώνει
αποτελεσματικά την αναπαραγωγιότητα της δοκιμασίας και την ελαχιστοποίηση
μη συγκεκριμένης δέσμευσης σε ελέγχους νόσου που αναφέρθηκαν σε κάποες
15-21
άλλες ανοσοδοκιμασίες tTG.
Η μέθοδος ImmuLisa™ Celiac Fusion™ Screen
ELISA είναι μια μοναδική, υψηλής ιδιαιτερότητας και ευαισθησίας για την
ανίχνευση αντισωμάτων ισοτύπων IgA και IgG έναντι tTG και DGP κατάλληλη ως
αρχικός ορολογικός έλεγχος για την κοιλιοκάκη.
ΑΡΧΕΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ
Η δοκιμασία εκτελείται ως στερεά φάση ανοσοβιολογικής δοκιμασίας. Τα
βυθίσματα (microwells) επενδύονται με ανσυνδυαζόμενο αντίγονο που περιέχει
επίτοπα tTG και DGP και ακολουθεί το βήμα μπλοκαρίσματος για τη μείωση μη
ειδικής δέσμευσης κατά τη διάρκεια της διεξαγωγής της δοκιμασίας. Έλεγχοι,
βαθμονομητές και οροί ασθενών επωάζονται στα επενδεδυμένα βυθίσματα
αντιγόνου για να επιτραπεί σε συγκεκριμένα αντισώματα παρόντα στον ορό για
να δεσμεύουν το αντιγόνο. Αδέσμευτα αντισώματα και άλλες πρωτεΐνες ορού
αφαιρούνται με την πλύση των βυθισμάτων. Δεσμευμένα αντισώματα
ανιχνεύονται προσθέτοντας σύζευξη ανθρώπινης αντι-ανοσοσφαιρίνης A και G
(IgA/IgG) με ενζυμική σήμανση (enzyme labeled anti-human IgG conjugate) στα
βυθίσματα. Η αδέσμευτη σύζευξη απομακρύνεται με την πλύση. Συγκεκριμένο
υπόστρωμα ενζύμου (TMB) προστίθεται στη συνέχεια στις κοιλότητες και η
παρουσία αντισωμάτων ανιχνεύεται με χρωματική αλλαγή που παράγεται από
την μετατροπή του υποστρώματος TMB σε προϊόν χρωματικής αντίδρασης. Η
αντίδραση διακόπτεται και η ακεραιότητα της χρωματικής αλλαγής, η οποία είναι
ανάλογη με την πυκνότητα του αντισώματος, διαβάζεται με ένα
φασματοφωτόμετρο στα 450 nm. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε Μονάδες
ELISA ανά χιλιοστόλιτρο (EU/ml) και αναφέρονται ως θετικά ή αρνητικά.
ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
Αποθήκευση και Προετοιμασία
Αποθηκεύστε όλα τα αντιδραστήρια στους 2-8°C. Μην καταψύχετε. Τα
αντιδραστήρια είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης, όταν αποθηκεύονται
και μεταχειρίζονται σύμφωνα με την καθοδήγηση.
12
EL
Μην χρησιμοποιείτε αν το αντιδραστήριο δεν είναι διαυγές ή υπάρχει ίζημα
παρόν. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου (2025°C) πριν τη χρήση.
Ανασυνθέστε το διάλυμα πλύσης στο 1 λίτρο με απεσταγμένο ή απιοντισμένο
νερό. Όταν αποθηκεύεται στους 2-8°C, το ανασυσταθέν διάλυμα πλύσης
παραμένει σταθερό έως την ημερομηνία λήξης του κιτ.
Οι λωρίδες επενδεδυμένων βυθισμάτων προορίζονται για χρήση μιας μόνο
φοράς. Οι μη χρησιμοποιηθείσες λωρίδες επενδεδυμένων βυθισμάτων θα πρέπει
να επανασφραγίζονται προσεκτικά στη σακούλα που περιέχει αποξηραντικές
ουσίες για να αποφευχθεί υγροποίηση και να αποθηκεύονται στους 2-8°C.
Προφυλάξεις
Όλα τα συστατικά που χρησιμοποιήθηκαν, τα προερχόμενα από τον άνθρωπο,
έχουν δοκιμαστεί για HBsAg, HCV, HIV-1 και 2 και HTLV-I και βρέθηκαν
αρνητικά από δοκιμασίες που απαιτούνται από την Υπηρεσία Τροφίμων και
Φαρμάκων (FDA). Ωστόσο, παράγωγα ανθρώπινου αίματος και δείγματα
ασθενών θα πρέπει να θεωρούνται δυνητικά μολυσματικά. Τηρείτε τις ορθές
εργαστηριακές πρακτικές για την αποθήκευση, χορήγηση και διάθεση αυτών των
22
υλικών.
Το Διάλυμα Παύσης είναι διάλυμα αραιωμένου θειικού οξέως. Το θειικό οξύ
(H2SO4) είναι δηλητηριώδες και διαβρωτικό. Μην το φάτε και αποφύγετε την
επαφή με το δέρμα και τα μάτια. Αποφύγετε τη έκθεση σε βάσεις, μέταλλα ή
άλλες ενώσεις που μπορεί να αντιδρούν με οξέα.
Το Υπόστρωμα Ενζύμου TMB περιέχει μια ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι
επιβλαβής αν την εισπνεύσετε, την φάτε ή απορροφηθεί μέσω του δέρματος.
Μην το φάτε και αποφύγετε την επαφή με το δέρμα και τα μάτια.
Οι οδηγίες θα πρέπει να τηρούνται ακριβώς όπως εμφανίζονται στο ένθετο
του παρόντος κιτ για να διασφαλιστούν έγκυρα αποτελέσματα. Μην
εναλλάσσετε στοιχεία του κιτ με εκείνα από άλλες πηγές. Τηρήστε τις ορθές
εργαστηριακές πρακτικές για να ελαχιστοποιήσετε μικροβιακή και αλληλομόλυνση αντιδραστηρίων κατά τον χειρισμό. Μην χρησιμοποιείτε στοιχεία του κιτ
μετά την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στις ετικέτες.
Υλικά που παρασχέθηκαν
ImmuLisa™ Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
[REF] 5157
Το κιτ περιέχει επαρκή αντιδραστήρια για την εκτέλεση 96 προσδιορισμών.
12 x 8
[MICROPLATE|FUSION]
Μικροπλάκα με ατομικά βυθίσματα εκκίνησης
(breakaway microwells). Επενδεδυμένη με
ανασυνδυαζόμενο αντίγονο tTG/DGP. Έτοιμη
προς χρήση.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|+|FUSION]
Έτοιμος προς χρήση Θετικός Έλεγχος (Positive
Control) (κόκκινο πώμα). Περιέχει ανθρώπινο ορό
θετικό για αντισώματα tTG και DGP. Το εύρος
αναμενόμενης πυκνότητας σε EU/ml εμφανίζεται
στην ετικέτα.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|-]
Έτοιμος προς χρήση Αρνητικός Έλεγχος
(Negative Control) (λευκό πώμα). Περιέχει
ανθρώπινο ορό.
13
EL
5 x 1.75 ml
[CALIBRATOR|A|FUSION]
[CALIBRATOR|B|FUSION]
[CALIBRATOR|C|FUSION]
[CALIBRATOR|D|FUSION]
[CALIBRATOR|E|FUSION]
Έτοιμο προς χρήση σετ 5 Βαθμονομητών.
Βαθμονομητής Α (πράσινο πώμα) 160 EU/ml,
Βαθμονομητής Β (μωβ πώμα) 80 EU/ml,
Βαθμονομητής
Γ (μπλε πώμα) 40 EU/ml,
Βαθμονομητής Δ (κίτρινο πώμα) 20 EU/ml και
Βαθμονομητής Ε (πορτοκαλί πώμα) 1 EU/ml.
Προερχόμενα από ανθρώπινο ορό που περιέχει
αντισώματα tTG και DGP. Συγκεντρώσεις σε
EU/ml αναγράφονται στις ετικέτες.
1 x 15 ml
[IgA/IgG-CONJ|HRP]
Σύζευξη
ορού
ανθρώπινης
αντιανοσοσφαιρίνης A και G από υπεροξειδάση
από ραφανίδα. (HRP goat anti-human IgA/IgG
Conjugate). Έτοιμο προς χρήση. Κωδικοποιημένη
με ροζ χρώμα.
1 x 60 ml
[DIL]
Αραιωτικό ορού (Serum Diluent). Έτοιμο προς
χρήση. Κωδικοποιημένο με μωβ χρώμα.
1 x 15 ml
[SUBSTRATE|TMB]
Ενζυμο-υπόστρωμα τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB
enzyme substrate). Έτοιμο προς χρήση.
Προστατέψτε από το φως.
1 x 15 ml
[STOP|H2SO4]
Διάλυμα παύσης (Stop Solution). Έτοιμο προς
χρήση.
2 x vials
[BUF|WASH]
Διάλυμα Πλύσης σε μορφή Σκόνης (Powder Wash
Buffer). Ανασυνθέστε στο ένα λίτρο έκαστο.
Φύλλα Πρωτοκόλλου
1x
Προαιρετικά Συστατικά
1 x 60ml
[BUF|WASH]
Υγρό
Συμπυκνωμένο
Διάλυμα
Ανασυνθέστε στο ένα λίτρο.
Πλύσης.
Σύμβολα που χρησιμοποιούνται σε ετικέτες
[LOT]
Αριθμός παρτίδας
[REF]
Αριθμός καταλόγου
[IVD]
In vitro διαγνωστική χρήση
e
t
!
s
Χρήση από
Θερμοκρασία αποθήκευσης
Διαβάστε οδηγίες πριν τη χρήση
Αριθμός δοκιμών
Κατασκευαστής
Υλικά Που Απαιτούνται Αλλά Δεν Παρέχονται
•
•
•
•
•
•
Απιοντισμένο ή απεσταγμένο νερό
Εύκαμπτο πλαστικό μπουκάλι για το αραιωμένο διάλυμα πλύσης
Πιπέτες ικανές να απελευθερώνουν 5 µl έως 1000 µl
Ρύγχη πιπετών (pipette tips) μιας χρήσεως
Καθαροί δοκιμαστικοί σωλήνες 12 x 75 mm και στηρίγματα δοκιμαστικών
σωλήνων
Χρονομέτρης
14
EL
•
Απορροφητικές χάρτινες χειροπετσέτες
•
Αναγνώστης
μικροπλάκας
ικανός
για
την
ανάγνωση
τιμών
απορροφητικότητας στα 450 nm. Εάν είναι διαθέσιμος αναγνώστης
μικροπλάκας διπλού μήκους κύματος, το φίλτρο αναφοράς θα πρέπει να
οριστεί στα 600-650 nm
•
Αυτόματο πλυντήριο μικροπλάκας ικανό να διανέμει 200 µl
ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ
Μόνον δείγματα ορού θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σ’ αυτήν τη διαδικασία.
Aιμολυμένα, λιπαιμικά ή βακτηριδιακά επιμολυσμένα δείγματα μπορούν να
παρεμβληθούν στην εκτέλεση της δοκιμασίας και δεν θα πρέπει να
χρησιμοποιούνται. Τα δείγματα δεν θα πρέπει να φυλάσσονται γα παραπάνω
από μία εβδομάδα στους 2°- 8°C. Για αποθήκευση μεγαλύτερης διάρκειας, τα
δείγματα ορού θα πρέπει να καταψύχονται. Να αποφεύγετε επανειλημμένη
απόψυξη και νέα ψύξη των δειγμάτων. Συνιστάται τα κατεψυγμένα δείγματα να
υποβάλλονται σε έλεγχο εντός ενός έτους.
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
Διαδικαστικές Σημειώσεις
•
•
•
•
•
•
•
•
Διαβάστε προσεκτικά το ένθετο προϊόντος πριν ξεκινήσετε τη δοκιμασία.
Όλα τα διαλύματα των δειγμάτων του ασθενούς θα πρέπει να
προετοιμάζονται πριν την έναρξη της δοκιμασίας.
Αφήστε τα δείγματα ασθενών και τα αντιδραστήρια δοκιμασίας να
εξισορροπήσουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν την έναρξη της διαδικασίας
δοκιμασίας. Προτείνεται τα αντιδραστήρια να παραμείνουν στον πάγκο έξω
από το κουτί για 30 λεπτά πριν τη χρήση. Βάζετε πίσω όλα τα δείγματα και
τα αντιδραστήρια που δεν χρησιμοποιήσατε στο ψυγείο αμέσως μετά τη
χρήση.
Αφαιρείτε τις απαιτούμενες λωρίδες βυθισμάτων από τη σακούλα και
προσεκτικά σφραγίζετε ξανά τη σακούλα για να αποφύγετε υγροποίηση στα
μη χρησιμοποιηθέντα βυθίσματα. Βάζετε τη σακούλα πίσω στο ψυγείο
αμέσως.
Η τεχνική καλής πλύσης είναι πολύ σημαντική. Αν η πλύση εκτελείται με
το χέρι, η σωστή πλύση επιτυγχάνεται κατευθύνοντας δυνατή ροή
διαλύματος πλύσης με φιάλη πλύσης με ανοιχτό στόμιο σε ολόκληρη τη
μικροπλάκα. Συνιστάται αυτόματη συσκευή πλύσης μικροπλάκας.
Χρησιμοποιείτε πολυκάναλη πιπέτα ικανή να απελευθερώνει 8 ή 12
κοιλότητες ταυτόχρονα. Αυτό επιταχύνει τη διαδικασία και παρέχει χρόνους
πιο ομοιόμορφης επώασης.
Σε όλα τα βήματα, ο προσεκτικός έλεγχος χρονισμού είναι σημαντικός. Η
έναρξη όλων των περιόδων επώασης γίνεται με την ολοκλήρωση της
προσθήκης αντιδραστηρίου.
Προσθήκη όλων των δειγμάτων και αντιδραστηρίων θα πρέπει να εκτελείται
με τον ίδιο ρυθμό και την ίδια ακολουθία.
15
EL
Μέθοδος Δοκιμής
Βήμα 1
Βήμα 2
Βήμα 3
Αφήνετε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα να εξισορροπήσουν σε
θερμοκρασία δωματίου.
Τοποθετείτε ετικέτα στο φύλλο πρωτοκόλλου για να υποδηλώσετε την
τοποθέτηση δείγματος στις κοιλότητες. Αποτελεί ορθή εργαστηριακή
πρακτική να εκτελείτε τα δείγματα εις διπλούν.
Για ποιοτικό προσδιορισμό χρησιμοποιήστε μόνο Βαθμονομητή Δ
(φιαλίδιο με κίτρινο πώμα).
ή
Για ημι-ποσοτικό προσδιορισμό χρησιμοποιήστε Βαθμονομητές Α
έως E, όπως απεικονίζεται στην παρακάτω διάταξη δείγματος.
Ποιοτικός
A
B
C
D
E
F
G
H
Βήμα 4
Βήμα 5
Βήμα 6
Βήμα 7
Βήμα 8
Κενός
+
Control
Cal D
Control
S1
S2
S3
S4
1
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
2
Ημι-Ποσοτικός
Κ.λπ.
A
B
C
D
E
F
G
H
3
Κενός
+
Control
Cal A
Control
Cal B
Cal C
Cal D
Cal E
1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
2
Κ.λπ.
3
Προετοιμάζετε διάλυμα 1:101 από τα δείγματα ασθενών
αναμειγνύοντας 5 µl των ορών των ασθενών με 500ul Ορού
Αραίωσης.
Αφαιρείτε τα απαιτούμενα βυθίσματα από το σάκο και βάζετε πίσω τις
λωρίδες που δεν έχετε χρησιμοποιήσει στη σφραγισμένη σακούλα στο
ψυγείο. Τοποθετείτε ασφαλώς τα βυθίσματα στην επιπλέον βάση που
παρέχεται.
Διανέμετε με την πιπέτα 100 µl τους Έτοιμους προς χρήση
Βαθμονομητές, τους Θετικούς και Αρνητικούς ελέγχους και τα
αραιωμένα δείγματα ασθενών (1:101) στα κατάλληλα βυθίσματα
σύμφωνα με το φύλλο πρωτοκόλλου.
Σημείωση: Συμπεριλαμβάνετε μία κοιλότητα που περιέχει 100 µl Ορού
Αραίωσης ως κενό αντιδραστήριο. Μηδενίζετε την συσκευή ανάγνωσης
ELISA έναντι του κενού αντιδραστηρίου.
Επωάζετε για 30 λεπτά (± 5 λεπτά) σε θερμοκρασία δωματίου.
Πλένετε 4 φορές με διάλυμα πλύσης. Για πλύσιμο με το χέρι, γεμίζετε
κάθε βύθισμα με ανασυσταθέν διάλυμα πλύσης. Πετάξτε το υγρό
αναστρέφοντας και κτυπώντας ελαφρά ώστε να βγουν τα περιεχόμενα
κάθε κοιλότητας ή αναρροφώντας το υγρό από κάθε κοιλότητα. Για να
κάνετε αποτύπωση στο τέλος της τελευταίας πλύσης, αναστρέψτε τις
λωρίδες και κτυπήστε τοις κοιλότητες έντονα πάνω σε απορροφητικές
χάρτινες χειροπετσέτες. Για αυτόματες συσκευές πλυσίματος,
προγραμματίστε την συσκευή πλύσης σύμφωνα με τις οδηγίες του
κατασκευαστή.
16
EL
Βήμα 9
Βήμα 10
Βήμα 11
Βήμα 12
Βάζετε με την πιπέτα 100 µl της σύζευξης σε βυθίσματα.
Επωάζετε για 30 λεπτά (± 5 λεπτά) σε θερμοκρασία δωματίου.
Πλένετε όλα τα βυθίσματα, όπως περιγράφεται στο Βήμα 8.
Διανέμετε με την πιπέτα 100 µl Ενζυμικού Υποστρώματος σε κάθε
βύθισμα με την ίδια σειρά και χρονισμό όπως για τη Σύζευξη.
Βήμα 13 Επωάζετε για 30 λεπτά (± 5 λεπτά) σε θερμοκρασία δωματίου.
Βήμα 14 Διανέμετε με την πιπέτα 100 µl Διαλύματος Παύσης σε κάθε βύθισμα
χρησιμοποιώντας την ίδια σειρά και χρονισμό όπως για την προσθήκη
του Ενζυμικού Υποστρώματος. Διαβάζετε τις τιμές απορροφητικότητας
εντός 30 λεπτών από την προσθήκη του Διαλύματος Παύσης.
Βήμα 15 Διαβάστε την απορροφητικότητα κάθε βυθίσματος σε 450 nm
χρησιμοποιώντας μονού ή στα 450/630nm χρησιμοποιώντας διπλού
μήκους κύματος συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας έναντι του σετ
κενού αντιδραστηρίου σε μηδενική απορροφητικότητα.
Ποιοτικός Έλεγχος
Οι Βαθμονομητές, ο Θετικός και Αρνητικός Έλεγχος και ένα κενό αντιδραστήριο
πρέπει να εκτελούνται με κάθε δοκιμασία για την εξακρίβωση της ακεραιότητας
και ακρίβειας της δοκιμασίας. Η ένδειξη απορροφητικότητας του κενού
αντιδραστηρίου θα πρέπει να είναι μικρότερη του 0.3. Ο Βαθμονομητής Α θα
πρέπει να έχει ένδειξη απορροφητικότητας όχι μικρότερη του 1.0, άλλως η
δοκιμασία θα πρέπει να επαναληφθεί. Ο αρνητικός έλεγχος πρέπει να είναι
μικρότερος από 10 EU/ml. Εάν η δοκιμασία διεξάγεται εις διπλούν, ο μέσος όρος
των δύο ενδείξεων θα πρέπει να λαμβάνεται για τον προσδιορισμό EU/ml. Κατά
την εκτέλεση των Ποιοτικών προσδιορισμών, η οπτική πυκνότητα
του
Βαθμονομητή Δ πρέπει να είναι μεγαλύτερη από εκείνην του αρνητικού ελέγχου
και μικρότερη από την απορροφητικότητα του θετικού ελέγχου. Για ημιποσοτικούς προσδιορισμούς ο θετικός έλεγχος πρέπει να δίνει τιμές εντός του
φάσματος που δηλώνεται στο φιαλίδιο.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Υπολογισμοί
Οι πυκνότητες των δειγμάτων των ασθενών μπορούν να προσδιοριστούν με μία
από τις δύο μεθόδους:
1.
ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ
Απορ. του Δείγματος Δοκιμασίας
---------------------------X EU/ml Βαθμονομητή Δ =
Απορ. Βαθμονομητή Δ
EU/ml Δείγμα Δοκιμασίας
Συνιστάται τα ποιοτικά αποτελέσματα να αναφέρονται ως “θετικά” ή
“αρνητικά.” Τα αποτελέσματα δειγμάτων που είναι μεγαλύτερα από ή ίσα με
τον Βαθμονομητή Δ θεωρούνται θετικά.
2.
ΗΜΙ-ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ
17
EL
Αποτυπώστε την απορροφητικότητα των Βαθμονομητών Α έως Ε έναντι των
αντίστοιχων συγκεντρώσεων σε χαρτί γραφημάτων γραμμικού αρχείου
καταγραφής (linear-log graph paper). Αποτυπώστε τις συγκεντρώσεις σε
EU/ml στον X-άξονα έναντι της απορροφητικότητας στον Y-άξονα και
σχεδιάστε μια καμπύλη προσαρμογής από σημείο σε σημείο. Καθορίστε τις
συγκεντρώσεις των δειγμάτων ασθενών από την καμπύλη σύμφωνα με τις
αντίστοιχες τιμές απορροφητικότητας. Εναλλακτικά, μια καμπύλη τεσσάρων
παραμέτρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αποτύπωση της πρότυπης
καμπύλης.
Συνιστάται τα ημι-ποσοτικά αποτελέσματα να αναφέρονται ως “θετικά,”
“αρνητικά,” ή “απροσδιόριστα” με τιμές μονάδας EU/ml. Τα
απροσδιόριστα/οριακά αποτελέσματα θα πρέπει να επανελέγχονται και
αξιολογούνται μαζί με άλλες εργαστηριακές μεθόδους για την ανίχνευση
αντισωμάτων EMA και/ή Γλιαδίνης.
Ερμηνεία
Οι ακόλουθες πληροφορίες εξυπηρετούν μόνον ως οδηγός στην ερμηνεία
των εργαστηριακών αποτελεσμάτων.
Αυτές οι τιμές ερμηνείας
προσδιορίστηκαν με δοκιμή 123 απλών δοτών αίματος και δείγματα ελέγχου
μη-κοιλιοκάκης. Ο μέσος όρος των συνήθων αντικειμένων συν 2.5 SD
καθιερώθηκε ως το έσχατο όριο της δοκιμασίας και καθόρισε την αυθαίρετη
τιμή των 20 EU/ml. Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθορίζει τις δικές του
φυσιολογικές τιμές.
τιμή Celiac Fusion™
Ερμηνεία
<20 EU/ml
20-25 EU/ml
>25 EU/ml
Αρνητικό
Απροσδιόριστο (Οριακό)
Θετικό
Βαθμονομητής
Οι Έτοιμοι προς Χρήση Βαθμονομητές συμπεριλαμβάνονται για να
παρέχουν ημι-ποσοτικό προσδιορισμό και πρέπει να χρησιμοποιούνται σε
κάθε εκτέλεση. Δείγματα ασθενών που περιέχουν υψηλά επίπεδα
αντισωμάτων μπορούν να δώσουν τιμές απορροφητικότητας μεγαλύτερες
από εκείνη του Βαθμονομητή Α. Για τον προσδιορισμό ακριβών ημιποσοτικών τιμών, αυτά τα δείγματα θα πρέπει να αραιώνονται περαιτέρω
ώστε να εμπίπτουν εντός του εύρους της καμπύλης του βαθμονομητή όταν
επανεξετάζονται. Για τον προσδιορισμό τιμών EU/ml, πολλαπλασιάστε τις
μονάδες που αποκτήθηκαν με τον διαλύτη.
ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ
Μόνον δείγματα ορού θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σ’ αυτήν τη διαδικασία.
Aιμολυμένα, λιπαιμικά ή βακτηριδιακά επιμολυσμένα δείγματα μπορούν να
παρεμβληθούν στην εκτέλεση της δοκιμασίας και δεν θα πρέπει να
χρησιμοποιούνται. Τα δείγματα δεν θα πρέπει να φυλάσσονται γα παραπάνω
από μία εβδομάδα στους 2°- 8°C. Για αποθήκευση μεγαλύτερης διάρκειας, τα
δείγματα ορού θα πρέπει να καταψύχονται. Να αποφεύγετε επανειλημμένη
απόψυξη και νέα ψύξη των δειγμάτων.
18
EL
Τα αποτελέσματα των δοκιμών εξυπηρετούν ως βοήθεια στη διάγνωση και θα
πρέπει να εξετάζονται σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά
ευρήματα.
ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ
Τα αποτελέσματα της δοκιμής σε φυσιολογικό πληθυσμό συνήθως αναμένονται
να είναι αρνητικά. Ωστόσο, καθώς η συχνότητα εμφάνισης της CD στους
φυσιολογικούς πληθυσμούς είναι περίπου 1%, κάποια προφανώς υγιή,
ασυμπτωματικά άτομα μπορεί να δοκιμαστούν θετικά για αντισώματα tTG.
Η συχνότητα εμφάνισης και τα επίπεδα των αυτοαντισωμάτων που σχετίζονται
με την ευαίσθητη στη γλουτένη εντεροπάθεια / κοιλιοκάκη εξαρτώνται από την
κατάσταση της διαίτας. Τα επίπεδα αυτών των αντισωμάτων μειώνονται και
τελικά θα καταστούν αρνητικά σε ασθενείς που ακολουθούν δίαιτα χωρίς
γλουτένη. Ομοίως, τα επίπεδα αυτών των αντισωμάτων θα αυξηθούν και μπορεί
να καταστούν θετικά όταν ασθενείς με κοιλιοκάκη, οι οποίοι ακολουθούσαν δίαιτα
18-20
χωρίς γλουτένη λάβουν δίαιτα που περιέχει γλουτένη.
Ασθενείς που έχουν
CD ωστόσο είναι ανεπαρκείς σε IgA θα είναι γενικά θετικοί για αντισώματα IgGσε
tTG και γλιαδίνη. Στις περιπτώσεις αυτές οι μελέτες μπορούν να εκτελεστούν για
να επιβεβαιώσουν ότι ο ασθενής είναι ανεπαρκής σε IgA.
Σετ κλινικών δειγμάτων δοκιμάστηκαν στις μεθόδους ImmuLisa™ Celiac
Fusion™ ELISA.
Τα αποτελέσματα που καταδεικνύουν επίπτωση στους
πληθυσμούς για την μελέτη αυτή παρέχονται κατωτέρω.
Ομάδα Ασθενών
Disease Associated
Κοιλιοκάκη
Έλεγχοι Νόσων
Θυρεοειδίτις του Hashimoto
Μεικτή Νόσος Συνδετικού Ιστού
Ρευματοειδής Αρθρίτιδα
Σκληροδερμία
Συστηματικός Ερυθηματώδης
Λύκος
Αγγειίτιδα
Healthy normals
IMMCO
n Θετ.
% Pos
n
166
157
94,6%
16
8
8
8
16
8
112
0
0
1
0
0
0
6
0,0%
0,0%
12,5%
0,0%
0,0%
0,0%
5,4%
Σημείωση: Οι πληθυσμοί που δοκιμάστηκαν περιελάμβαναν μεγάλο αριθμό
δειγμάτων που προκαλούν χαμηλή τιτλοποίηση EMA και δεν απεικονίζουν ένα
τυπικά διαγνωσθέντα με CD πληθυσμό ούτε ένα τυπικά ελεγχόμενο πληθυσμό.
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ
Η χρησιμότητα του ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA αξιολογήθηκε με δοκιμή
καλώς χαρακτηρισμένων δειγμάτων ορού θετικά ΕΜΑ από υποκείμενα με CD
μαζί με ελέγχους νόσων και “φυσιολογικούς” ανθρώπινους ορούς. Αυτά τα
δείγματα δοκιμάστηκαν επίσης σε εμπορικά διαθέσιμη μέθοδο tTG/DGP
Antibody Screen ELISA. Αυτά τα αποτελέσματα συνοψίζονται κατωτέρω.
19
EL
Α. Σύγκριση Μεθόδου: ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA έναντι άλλου ελέγχου
tTG/DGP ELISA.
Άλλος Έλεγχος tTG/DGP ELISA
IMMCO
Θετικό
Celiac Fusion™ Αρνητικό
Έλεγχος ELISA Σύνολο
Θετικό
52
2
54
Αρνητικό
3
52
55
Σύνολο
55
54
109
Συμφωνία Θετικού Ποσοστού:
96,3% (95% CI 86,2% έως 99,4%)
Συμφωνία Αρνητικού Ποσοστού:
94,5% (95% CI 83,9% έως 98,6%)
Συμφωνία Γενικού Ποσοστού:
95,4% (95% CI 89,1% έως 98,3%)
EMA Θετικά Υποκείμενα Κοιλιοκάκης: 57
Έλεγχοι Νόσων: 20
Υγιή Συνήθη Υποκείμενα: 32
B. Διασταυρωτή Αντιδραστικότητα: Ένα σύνολο από 64 δείγματα με πιθανή
διασταυρούμενη αντίδραση από άτομα με άλλες αυτάνοσες διαταραχές ή θετικά
για
άλλα
αυτοαντισώματα
εξετάστηκαν
για
αντισώματα
tTG/DGP
χρησιμοποιώντας το σύστημα ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA.
Πάθηση
Θυρεοειδίτις του Hashimoto
Μεικτή Νόσος Συνδετικού Ιστού
Ρευματοειδής Αρθρίτιδα
Σκληροδερμία
Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος
Αγγειίτιδα
n
16
8
8
8
16
8
n Θετικό
0
0
1
0
0
0
Σύνολο
64
1 (1,6%)
Ακρίβεια
Η ακρίβεια δοκιμάστηκε με πολλαπλά δείγματα που επιλέχθηκαν από όλο το
φάσμα της δοκιμασίας. Πολλαπλές εκτελέσεις της δοκιμασίας εκτελέστηκαν για
να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα μεταξύ των ημερών. Μια επιπρόσθετη
εκτέλεση δώδεκα πανομοιότυπων πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η
επαναληψιμότητα. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω.
Μέσος
όρος
(EU/ml)
Ολική Ανακρίβεια
Μεταξύ ημερών
SD
Κιτ
Δοκιμασί
α
Ελέγχου
Celiac
Fusion™
#
1
2
3
4
5
6
8,0
16,8
27,1
37,9
75,5
151,2
(EU/ml)
0,844
1,406
1,789
1,777
3,297
4,877
SD
CV%
10,5%
8,4%
6,6%
4,7%
4,4%
3,2%
(EU/ml)
0,885
1,387
1,818
1,793
3,368
4,683
20
Εντός
προσδιορισμού
(Επαναληψιμότητ
α)
SD
CV%
11,7%
8,5%
6,8%
4,7%
4,4%
3,1%
(EU/ml)
0,503
1,255
1,402
1,753
2,766
4,630
CV%
6,6%
7,6%
5,2%
4,6%
3,6%
3,1%
EL
Αναπαραγωγιμότητα
Oογδόντα πανομοιότυπα δειγμάτων στο αρνητικό εύρος, ~20% κάτω του
σημείου διαχωρισμού, ~20% άνω του σημείου διαχωρισμού και στο μέτρια θετικό
εύρος της δοκιμασίας εκτελέστηκαν για να προσδιορίσουν την ποιοτική
αναπαραγωγιμότητα. Αυτά τα δείγματα δοκιμάστηκαν σε πολλαπλές εκτελέσεις.
Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας για κάθε δείγμα παρήγαν 100% ποιοτική
συμφωνία.
Όριο Ανίχνευσης
Το όριο ανίχνευσης (LoD) για αυτήν τη δοκιμασία καθορίστηκε να είναι επί τη
βάσει 60 πανομοιότυπων κενού και 10 πανομοιότυπων καθένα από τα 6
δείγματα χαμηλού επιπέδου (NHS). Το LoD ήταν 3,0 EU/ml.
Γραμμικότητα και Ανάκαμψη
Η γραμμικότητα και η ανάκαμψη δοκιμάστηκαν αραιώνοντας θετικά δείγματα σε
όλο το εύρος της δοκιμασίας σε ισαπέχουσες αραιώσεις και συγκρίνοντας
πραγματικές έναντι αναμενόμενων τιμών. Το γραμμικό εύρος της δοκιμασίας
καθορίστηκε να είναι 3,0 (LoD) – 160 EU/ml. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται
παρακάτω:
Εύρος δοκιμής
(EU/ml)
2,9 έως 37,4
25,3 έως 74,5
47,7 έως 153,9
(95% CI)
Σημείο τομής Y
(95% CI)
1,062
(1,007 έως
1,117)
0,998
(0,907 έως
1,090)
1,024
(0,861 έως
1,187)
-1,907
(-3,28 έως 0,53)
0,603
(-4,156 έως
5,361)
2,049
(-14,90 έως
18,99)
1,0
% ανάκαμψης
(επιτευχθείσα/αναμε
νόμενη)
97,3 έως 114,6
0,99
90,3 έως 104,7
0,99
100,0 έως 112,3
R²
Παρέμβαση
Η παρέμβαση μελετήθηκε με την ανάμειξη ορών με γνωστά επίπεδα tTG/DGP
αντισωμάτων με δείγματα ορού πιθανώς παρεμβαλλόμενα και με την μελέτη
απόκλισης από τα αναμενόμενα αποτελέσματα. Καμία σημαντική παρέμβαση
δεν εκδηλώθηκε για τις ακόλουθες ουσίες στα επίπεδα που δηλώνονται:
Αιμοσφαιρίνη (2 g/L), Χολερυθρίνη (342 μmol/L),Ρευματοειδής Παράγοντας (100
EU/ml), Τριγλυκερίδια (37 mmol/L), και Χοληστερόλη (130 mmol/L).
21
ES
ImmuLisa™
Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
Detección combinada de anticuerpos IgA e IgG anti-transglutaminasa
tisular y péptido deamidado de la gliadina
[IVD]
Para utilización de diagnóstico in vitro
ETIQUETA DEL PRODUCTO
[REF] 5157
Celiac Fusion™ ELISA
96 Determinaciones
UTILIZACIÓN PREVISTA
Inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) para la detección cualitativa y
semicuantitativa de anticuerpos IgA e IgG de transglutaminasa tisular (tTG) y
péptido deamidado de gliadina (DGP) en suero humano para el diagnóstico de
enteropatía por gluten / enfermedades celiacas (EC) junto con otras
conclusiones clínicas y de laboratorio.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
Las enfermedades celiacas (EC) son afecciones gastrointestinales autoinmunes
que pueden tener lugar en individuos genéticamente susceptibles inducidas por
la ingestión de cereales que contienen gluten, como el trigo, la cebada y el
centeno. En base a los estudios, la difusión de las EC es muy variable. La
preponderancia estimada actual de las EC es del 1%, con un ámbito estadístico
de probabilidad de entre el 0,5-1,26% en la población general de Europa y
EE.UU. Utilizando métodos serológicos, la incidencia de las EC en la población
1,2
general es de aproximadamente 1 de cada 100.
El hecho de no diagnosticar las EC de forma temprana puede provocar en un
individuo complicaciones a largo plazo como atrofia esplénica y linfoma
3,4
intestinal. Una dieta sin gluten (DSG) normaliza la mucosa y ayuda a reducir el
potencial de gravedad. El examen histológico de la biopsia del intestino delgado
sigue siendo el procedimiento de preferencia para el diagnóstico de las EC, pero
tiene sus propias limitaciones. Por ejemplo, algunos pacientes con EC latentes o
5
incluso activas pueden presentar histopatologías normales.
Los diversos análisis serológicos utilizados en el examen de pacientes que se
cree que podrían sufrir EC incluyen los de anticuerpos anti-gliadiana (AGA),
DGT, tTG y endomisial (EMA). Los anticuerpos anti-gliadina, DGP y tTG son
detectados por el método ELISA, mientras que los EMA son detectados
mediante inmunofluorescencia indirecta. Los EMA son indicadores muy
específicos de las EC. Sin embargo, el análisis de EMA es un método
inmunohistoquímico que requiere experiencia a la hora de leer las reacciones de
6
inmunofluorescencia.
Desde la identificación del tTG como el antígeno endomisial, se han establecido
los métodos ELISA para detectar anticuerpos en el suero de pacientes con EC.
22
ES
La ventaja del ensayo ELISA para detección de anticuerpos anti-tTG es que es
automatizable y menos subjetivo que el EMA. La incorporación de ensayos
basados en DGP ha presentado unos resultados prometedores a la hora de
7-13
solucionar las limitaciones del panel de ensayos actual.
Por este motivo,
muchos laboratorios han optado por utilizar los anticuerpos anti-tTG junto con
anticuerpos de gliadina deamidada como método de análisis preferido. La
combinación de tTG y DGP en un único ensayo puede aumentar la sensibilidad
exponiendo múltiples epítopes de analitos especialmente en pacientes celíacos
deficientes en IgA. Por desgracia, añadir simplemente DGP a tTG en una mezcla
14
aumentará las interacciones no específicas o cubrirá los epítopes necesarios.
Este ensayo utiliza un antígeno recombinante que muestra un registro
predeterminado tanto para los epítopes tTG como DGP en una única molécula.
Este enfoque permite reducir el potencial de cobertura de epítopes encontrado
en mezclas de antígenos y a la vez mejorar la reproducibilidad del ensayo y
minimizar la unión no específica en controles de enfermedades que se da en
15-21
otros inmunoensayos para tTG.
El ensayo ELISA ImmuLisa™ Celiac
Fusion™ es un inmunoensayo único y con alta especificidad y sensibilidad para
la detección de anticuerpos de isotipos IgA e IgG anti-tTG y DGP adecuada
como análisis sexológico inicial para enfermedades celíacas.
PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO
El análisis es realizado como un inmunoensayo de fase sólida. Los micropocillos
son recubiertos con un antígeno recombinante que contiene epítopes de tTG y
DGP y a continuación se realiza una fase de bloqueo para reducir los vínculos
no específicos durante el ensayo. Se incuban en los pozos recubiertos con el
antígeno controles, calibradores y el suero del paciente para que los anticuerpos
específicos puedan presentarse en el suero para unirse al antígeno. Los
anticuerpos separados y otras proteínas del suero son eliminados lavando los
micropocillos. Se detectan los anticuerpos unidos añadiendo a los micropocillos
una enzima etiquetada conjugado anti-humano IgA/IgG. El conjugado no unido
es eliminado lavándolo. A continuación se añade a los pocillos substrato de
enzima específica (TMB) y se detecta la presencia de anticuerpos gracias a un
cambio de color producido por la conversión del sustrato de TMB en un producto
de reacción de color. Se detiene la reacción y la intensidad del cambio de color,
que es proporcional a la concentración de anticuerpos, es leída por un
espectrofotómetro a 250 nm. Los resultados son expresados en unidades de
ELISA por milímetro (EU/ml) y consignados como positivos o negativos.
REACTIVOS
Almacenamiento y preparación
Guarde todos los reactivos a entre 2 y 8°C. No los congele. Los reactivos son
estables hasta la fecha de caducidad si se los maneja y almacena de acuerdo
con estas instrucciones.
No lo utilice si el reactivo no está limpio o si contiene un precipitado. Todos los
reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente (20-25ºC) antes de su
utilización.
23
ES
Reconstituya el tampón de lavado hasta un litro con agua destilada o
desionizada. Si lo guarda entre 2 y 8ºC, el tampón de lavado reconstituido es
estable hasta la fecha de caducidad del equipo.
Las tiras de micropocillos recubiertos son de un solo uso. Las tiras de
micropocillos no utilizadas deberían ser recolocadas con cuidado en la bolsa con
desecantes para evitar la condensación y ser almacenadas a 2-8°C.
Precauciones
Todos los componentes provenientes de seres humanos utilizados han sido
analizados en busca de HBsAg, HCV, HIV-1 y 2 y HTLV-I y han dado negativo
de acuerdo con los exámenes necesarios de la FDA. Sin embargo, los derivados
de sangre humana y las muestras de pacientes deberían considerarse
potencialmente infecciosas. Siga unas buenas prácticas de laboratorio a la hora
22
de guardar, preparar y desechar estos materiales.
La solución de parada es una solución de ácido sulfúrico diluida. El ácido
sulfúrico (H2SO4) es venenoso y corrosivo. No lo ingiera y evite el contacto con
la piel y los ojos. Evite exponerlo a bases, metales u otros compuestos que
puedan reaccionar con ácidos.
El substrato de enzima TMB contiene un irritante que puede resultar nocivo si es
inhalado, ingerido o absorbido por la piel. No lo ingiera y evite el contacto con la
piel y los ojos.
Deben seguirse las instrucciones exactamente tal como aparecen aquí
para garantizar unos resultados válidos. No cambie los componentes del
equipo por otros de fuentes externas. Siga unas buenas prácticas de laboratorio
para minimizar la contaminación microbiana y cruzada de los reactivos a la hora
de manejarlos. No utilice los componentes del equipo después de la fecha de
caducidad que aparece en las etiquetas.
Materiales proporcionados
ImmuLisa™ Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
[REF] 5157
El equipo contiene suficientes reactivos para realizar 96 determinaciones.
12 x 8
[MICROPLATE|FUSION]
Microplaca
con
micropocillos
individuales
escindibles. Revestida de antígeno tTG/DGP
recombinante. Lista para su utilización.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|+|FUSION]
Control Positivo listo para su utilización (tapón
rojo). Contiene suero humano positivo en
anticuerpos tTG y DGP. El registro de
concentración esperado en EU/ml está impreso
en la etiqueta.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|-]
Control Negativo listo para su utilización (tapón
blanco). Contiene suero humano.
5 x 1.75 ml
[CALIBRATOR|A|FUSION]
Juego de 5 calibradores listos para su
utilización. Calibrador A (tapón verde) 160 EU/ml,
Calibrador B (tapón violeta) 80 EU/ml, Calibrador
C (tapón azul) 40 EU/ml, Calibrador D (tapón
amarillo) 20 EU/ml, y Calibrador E (tapón naranja)
1 EU/ml. Provenientes de suero humano con
anticuerpos tTG y DGP. Las concentraciones en
EU/ml están impresas en las etiquetas.
[CALIBRATOR|B|FUSION]
[CALIBRATOR|C|FUSION]
[CALIBRATOR|D|FUSION]
[CALIBRATOR|E|FUSION]
24
ES
1 x 15 ml
[IgA/IgG-CONJ|HRP]
Conjugado IgA/IgG antihumano de cabra HRP.
Lista para su utilización. De color rosa.
1 x 60 ml
[DIL]
Diluyente de suero. Listo para su utilización. De
color morado.
1 x 15 ml
[SUBSTRATE|TMB]
Sustrato de enzima TMB. Listo para su utilización.
Proteger de la luz.
1 x 15 ml
[STOP|H2SO4]
Solución de parada. Lista para su utilización.
2 x vials
[BUF|WASH]
Tampón de lavado en polvo. Reconstituir a un
litro cada uno.
1x
Hojas de protocolo
Componentes opcionales
1 x 60ml
[BUF|WASH]
Tampón
de
lavado
Reconstituir a un litro.
líquido
concentrado.
Símbolos utilizados en las etiquetas
[LOT]
Número de lote
[REF]
Número de catálogo
[IVD]
Utilización diagnóstica in vitro
e
t
!
s
Utilizar antes de
Temperatura de almacenamiento
Leer las instrucciones antes de utilizar
Número de análisis
Fabricante
Materiales necesarios pero no suministrados
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Agua desionizada o destilada
Botella de plástico blando para el tampón de lavado diluido
Pipetas capaces de suministrar de 5 µl a 1000 µl
Extremos de pipeta desechables
Tubos de ensayo limpios de 12 x 75 mm y rejilla para tubos de ensayo
Temporizador
Toallitas de papel absorbentes
Lector de microplaca capaz de leer valores de absorbencia a 450 nm. Si
está disponible el lector de microplaca de longitud de onda dual, el filtro de
referencia debería fijarse a 600-650 nm
Lavador de microplaca automático capaz de suministrar 200 µl
RECOGIDA Y TRATAMIENTO DE ESPECIMENES
En este procedimiento sólo deberían utilizarse especimenes de suero. Los
especimenes muy hemolizados, lipémicos o contaminados microbiológicamente
pueden afectar al funcionamiento del análisis y no deberían ser utilizados.
Guarde los especimenes entre 2° y 8°C durante un máximo de una semana.
Para periodos de almacenamiento más largos, los especimenes de suero
deberían ser congelados. Evite congelar y descongelar las muestras
25
ES
repetidamente. Es recomendable que los especimenes congelados sean
analizados al cabo de un año.
PROCEDIMIENTO
Notas del procedimiento
•
•
•
•
•
•
•
•
Lea detenidamente la etiqueta del producto antes de empezar el ensayo.
Todas las diluciones de las muestras del paciente deberían prepararse
antes de empezar con el ensayo.
Deje que los especimenes del paciente y los reactivos de los análisis se
adapten a la temperatura ambiente antes de empezar con el procedimiento
de análisis. Le sugerimos que deje los reactivos sobre la mesa de trabajo y
fuera de la caja unos 30 minutos antes de su utilización. Vuelva a meter
todos los especimenes y reactivos no utilizados en la nevera después de su
utilización.
Saque las tiras de micropocillos necesarias de la bolsa y vuelva a cerrarla
cuidadosamente para evitar la condensación de los pocillos no utilizados.
Vuelva a meter la bolsa a la nevera inmediatamente.
Una buena técnica de lavado es fundamental. Si el lavado va a ser
realizado a mano, aplique una corriente fuerte de tampón de lavado con una
botella de lavado de boca ancha por toda la microplaca. Se recomienda
utilizar un lavador de microplacas automático.
Utilice una pipeta multicanal capaz de proveer a 8 a 12 pozos
simultáneamente. Esto acelera el proceso y proporciona tiempos de
incubación más uniformes.
En todos los pasos es necesario controlar cuidadosamente el tiempo. El
inicio de todos los periodos de incubación empieza al terminar de añadir el
reactivo.
Todas las muestras y reactivos deberían ser añadidos a la misma velocidad
y en el mismo orden.
Método de análisis
Paso 1
Paso 2
Paso 3
Deje que los reactivos y especimenes se adapten a la temperatura
ambiente.
Etiquete la hoja de protocolo para indicar que se han colocado
muestras en los micropocillos. Una buena práctica de laboratorio es
analizar las muestras por duplicado.
Para una determinación cualitativa utilice únicamente el Calibrador
D (vial con tapón amarillo).
o
Para una determinación semi-cuantitativa utilice los Calibradores A
a E tal como aparece en el plan de muestras siguiente.
26
ES
Cualitativo
A
B
C
D
E
P
G
H
Paso 4
Paso 5
Paso 6
Paso 7
Paso 8
Paso 9
Paso 10
Paso 11
Paso 12
Paso 13
Paso 14
Paso 15
Base
+
Control
Cal D
Control
S1
S2
S3
S4
1
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
2
Semi-cuantitativo
Etc.
A
B
C
D
E
P
G
H
3
Base
+
Control
Cal A
Control
Cal B
Cal C
Cal D
Cal E
1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
2
Etc.
3
Prepare una dilución 1:101 de las mezclas del paciente mezclando 5
µl del suero del paciente con 500ul de Diluyente de Suero.
Saque los micropocillos necesarios de la bolsa y vuelva a meter en la
nevera las tiras no utilizadas dentro de la bolsa cerrada. Coloque los
micropocillos en la funda adicional proporcionada.
Vierta 100 µl de Calibradores listos para usar, controles positivos y
negativos y muestras del paciente diluidas (1:101) en los micropocillos
adecuados en base a la hoja de protocolo.
Nota: Incluya un pocillo con 100 µl del Diluyente de Suero como
reactivo base. Ajuste el medidor ELISA en función del reactivo base.
Incúbelo 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente.
Lávelo 4x con tampón de lavado. Para un lavado manual, llene cada
micropocillo con tampón de lavado reconstituido. Deseche el fluido
volcando y vertiendo el contenido de cada pocillo o aspirando el
líquido de cada pocillo. Para secar el final del último lavado, vuelque
las tiras y golpee los pocillos con fuerza con toallitas de papel
absorbentes. Para lavadores automáticos, programe el lavador
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Vierta 100 µl de Conjugado en los micropocillos.
Incúbelo 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente.
Lave todos los micropocillos siguiendo las instrucciones del Paso 8.
Vierta 100 µl de Sustrato de Enzimas en cada micropocillo con el
mismo orden y tiempo que aplicó el Conjugado.
Incúbelo 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente.
Vierta 100 µl de Solución de Parada en cada micropocillo con el
mismo orden y tiempo que aplicó el Sustrato de Enzimas. Lea los
valores de absorbencia a los 30 minutos de añadir la Solución de
Parada.
Lea la absorbencia de cada micropocillo a 450 nm si utiliza un lector
de microplaca de longitud de onda simple o a 450/630nm si utiliza un
lector de microplaca de longitud de onda dual con el reactivo base
fijado a absorbencia cero.
27
ES
Control de calidad
Los Calibradores, los Controles Positivo y Negativo y el reactivo base deben
comprobarse en cada ensayo para verificar la integridad y la precisión del
análisis. La medición de absorbencia del reactivo base debería ser <0,3. El
Calibrador A debería tener una lectura de absorbencia de no menos de 1,0, de lo
contrario la prueba debe repetirse. El control negativo debe ser <10 EU/ml. Si se
realiza la prueba por duplicado, debería tomarse la media de ambas lecturas
para determinar la lectura en EU/ml. Al realizar determinaciones cualitativas, la
densidad óptica del Calibrador D debe ser mayor que la del control negativo y
menor que la absorbencia del control positivo. Para las determinaciones
semicuantitativas el control positivo debe arrojar valores dentro del registro
estipulado en el vial.
RESULTADOS
Cálculos
Las concentraciones de las muestras del paciente pueden ser determinadas
utilizando dos métodos:
1.
DETERMINACIÓN CUALITATIVA
Abs. muestra de análisis
---------------------------- X EU/ml de Calibrador D =
Abs. de Calibrador D
EU/ml Muestra Análisis
Es recomendable indicar si los resultados cualitativos son “positivos” o
“negativos”. Los resultados de los análisis iguales o superiores al Calibrador
D son considerados positivos.
2.
DETERMINACIÓN SEMI-CUANTITATIVA
Determine la absorbencia de los Calibradores A a E en base a sus
concentraciones respectivas sobre papel para gráficos lineales logarítmicos.
Determine las concentraciones en EU/ml en el eje X y la absorbencia en el
eje Y y dibuje una curva de punto a punto. Determine las concentraciones
de las muestras del paciente desde la curva de acuerdo con los valores de
absorbencia correspondientes. Como alternativa, puede utilizar una curva
de cuatro parámetros para trazar la curva estándar.
Es recomendable indicar si los resultados semi-cuantitativos son “positivos”,
“negativos” o “indeterminados” con valores en unidades EU/ml. Los
resultados indeterminados/en el límite deberían ser reanalizados y
evaluados junto con otros métodos de laboratorio, como los ensayos para la
detección de EMA y anticuerpos anti-gliadina.
Interpretación
La información siguiente sirve únicamente como guía para la interpretación
de los resultados de laboratorio. Estos valores fueron determinados
analizando 123 especimenes de control de donantes de sangre normales y
sin enfermedades celiacas. La media de los sujetos normales más 2,5 SD
fue establecida como límite del ensayo y se le asignó un valor arbitrario de
20 EU/ml. Cada laboratorio debe determinar sus propios valores normales.
28
ES
Valor del Celiac Fusion™
Interpretación
<20 EU/ml
20-25 EU/ml
>25 EU/ml
Negativo
Indeterminado (Límite)
Positivo
Calibrador
Los calibradores listos para utilizar vienen incluidos para proporcionar una
determinación semi-cuantitativa y deben ser utilizados en cada análisis. Las
muestras de pacientes que contienen niveles altos de anticuerpos pueden
arrojar unos valores de absorbencia superiores que los del Calibrador A.
Para determinar unos valores semi-cuantitativos precisos, esos
especimenes deberían diluirse más para que entren en el registro de la
curva del calibrador al volver a analizarlos. Para determinar los valores en
EU/ml, multiplique las unidades obtenidas por el factor de dilución.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
En este procedimiento sólo deberían utilizarse especimenes de suero. Los
especimenes muy hemolizados, lipémicos o contaminados microbiológicamente
pueden afectar al funcionamiento del análisis y no deberían ser utilizados.
Guarde los especimenes entre 2°C y 8°C durante un máximo de una semana.
Para periodos de almacenamiento más largos, los especimenes de suero
deberían ser congelados. Evite congelar y descongelar las muestras
repetidamente.
Los resultados de los análisis sirven como ayuda para el diagnóstico y deberían
ser considerados conjuntamente con otras pruebas clínicas y de laboratorio.
VALORES ESPERADOS
Normalmente se espera que los resultados de los análisis en la población normal
sean negativos. Sin embargo, como la incidencia de las EC en la población
normal es aproximadamente del 1%, algunos individuos aparentemente
saludables y asintomáticos podrían dar positivo en anticuerpos tTG.
La incidencia y los niveles de anticuerpos asociados con la enteropatía sensible
al gluten / EC dependen de la dieta seguida. Los niveles de ese tipo de
anticuerpos disminuyen y acaban convirtiéndose en negativos en los pacientes
que siguen una dieta sin gluten. De un modo similar, los niveles de estos
anticuerpos aumentarán y podrían dar positivo en pacientes con EC que seguían
18-20
una dieta sin gluten pero en la actualidad ingieren una dieta con gluten.
Normalmente los pacientes que tienen EC pero son deficientes en IgA darán
positivo en anticuerpos IgG anti-tTG y gliadina. En esos casos se han realizado
estudios para confirmar que el paciente es deficiente en IgA.
Se analizaron series de muestras clínicas con el ELISA ImmuLisa™ Celiac
Fusion™. A continuación incluimos unos resultados que demuestran la
incidencia en la población para este estudio:
29
ES
Grupo de pacientes
Asociado a enfermedades
Enfermedad celíaca
Control de enfermedades
Tiroiditis de Hashimoto
Enfermedad mixta del tejido
conectivo
Artritis reumatoide
Escleroderma
Lupus Eritematoso Sistémico
Vasculitis
Sujetos sanos normales
IMMCO
n Inc
% Inc
n
166
157
94,6%
16
8
8
8
16
8
112
0
0
1
0
0
0
6
0,0%
0,0%
12,5%
0,0%
0,0%
0,0%
5,4%
Nota: Entre la población analizada se incluían gran cantidad de muestras
difíciles con un nivel de EMA reducido y no es una población diagnosticada con
EC típica ni una población de estudio típica.
CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
La utilidad de las pruebas ELISA ImmuLisa™ Celiac Fusion™ fue evaluada
analizando especimenes de suero positivos característicos EMA de sujetos con
EC junto con controles de enfermedades y sueros humanos "normales". Estos
especimenes también fueron analizados con un ELISA para anticuerpos
tTG/DGP disponible comercialmente. Los resultados se resumen a continuación.
A. Comparación de métodos: ELISA ImmuLisa™ Celiac Fusion™ vs. otros
ELISA para detección tTG/DGP:
Otros ELISA para detección de tTG/DGP
IMMCO
Positivo
Celiac Fusion™ Negativo
ELISA
Total
Positivo
52
2
54
Concordancia de porcentaje positivo:
Concordancia de porcentaje negativo:
Concordancia de porcentaje total:
Sujetos celiacos positivos en EMA: 57
Controles de enfermedades: 20
Sujetos normales sanos: 32
Negativo
3
52
55
Total
55
54
109
96,3% (95% CI 86,2% a 99,4%)
94,5% (95% CI 83,9% a 98,6%)
95,4% (95% CI 89,1% a 98,3%)
B. Reactividad cruzada: Un total de 64 especimenes potencialmente reactivos
cruzados de individuos con otras afecciones autoinmunes o que dieron positivo
en otros autoanticuerpos fueron analizados en anticuerpos tTG/DGP utilizando el
sistema ELISA ImmuLisa™ Celiac Fusion™.
30
ES
Enfermedad
Tiroiditis de Hashimoto
Enfermedad mixta del tejido conectivo
Artritis reumatoide
Esclerodermia
Lupus eritematoso sistémico
Vasculitis
n
16
8
8
8
16
8
n Positivo
0
0
1
0
0
0
Total
64
1 (1,6%)
Precisión
La precisión fue analizada con múltiples especimenes seleccionados en todo el
registro del ensayo. Se llevaron a cabo múltiples análisis para comparar los
resultados en días distintos. Se realizó otra serie adicional de doce duplicados
para determinar la repetibilidad. Los resultados se resumen a continuación.
Media
(EU/ml)
Imprecisión total
Entre días
SD
Equipo
Ensayo
Celiac
Fusion™
#
1
2
3
4
5
6
8,0
16,8
27,1
37,9
75,5
151,2
(EU/ml)
0,844
1,406
1,789
1,777
3,297
4,877
SD
CV%
10,5%
8,4%
6,6%
4,7%
4,4%
3,2%
(EU/ml)
0,885
1,387
1,818
1,793
3,368
4,683
Dentro de serie
(Repetibilidad)
SD
CV%
11,7%
8,5%
6,8%
4,7%
4,4%
3,1%
(EU/ml)
0,503
1,255
1,402
1,753
2,766
4,630
CV%
6,6%
7,6%
5,2%
4,6%
3,6%
3,1%
Reproducibilidad
Se realizaron ochenta noventa muestras duplicadas en el registro negativo,
~20% por debajo del límite, ~20% por encima del límite y en el registro positivo
moderado del ensayo para determinar la reproducibilidad cualitativa. Esas
muestras fueron analizadas múltiples veces. Los resultados de los análisis de
cada espécimen dieron una concordancia cualitativa 100%.
Límite de detección
El límite de detección (LD) fue determinado en base a 60 duplicados de la base
y 10 duplicados de 6 muestras de nivel bajo (NHS). El LD era de 3,0 EU/ml.
Linealidad y recuperación
La linealidad y la recuperación fueron analizadas diluyendo especimenes
positivos en el registro de ensayo en diluciones equidistantes y comparando los
resultados reales frente a los esperados. El registro lineal del ensayo se fijó en
3,0 (LD) – 160 EU/ml. Los resultados se resumen a continuación:
31
ES
Ámbito del
análisis
(EU/ml)
2,9 a 37,4
25,3 a 74,5
47,7 a 153,9
Inclinación
(95% CI)
Corte Y
(95% CI)
1,062
(1,007 a 1,117)
0,998
(0,907 a 1,090)
1,024
(0,861 a 1,187)
-1,907
(-3,28 a -0,53)
0,603
(-4,156 a 5,361)
2,049
(-14,90 a 18,99)
R²
% recuperación
(obtenido/esperado)
1,0
97,3 a 114,6
0,99
90,3 a 104,7
0,99
92,4 a 100,0
Interferencia
La interferencia fue estudiada mezclando sueros con niveles de anticuerpos
tTG/DGP conocidos con muestras de suero con interferencia potencial y
estudiando la desviación respecto a los resultados esperados. No se demostró
una interferencia importante para las siguientes sustancias en los niveles
indicados: Hemoglobina (2 g/L), Bilirrubina (342 μmol/L), Factor Reumatoide
(100 EU/ml, Triglicéridos (37 mmol/L), y Colesterol (130 mmol/L).
32
DE
ImmuLisa™
Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
Kombinierte Erfassung von IgA und IgG Antikörpern gegen die
menschliche Gewebe-Transglutaminase und das desamidierte GliadinPeptid
[IVD]
Für in vitro diagnostischen Gebrauch
PRODUKTBEILAGE
[REF] 5157
Celiac Fusion™ ELISA
96 Bestimmungen
VERWENDUNGSZWECK
Enzymgekoppeltes
Immunoassay
(ELISA)
für
die
qualitative
und
semiquantitative Erfassung der anti-menschlichen Gewebe-Transglutaminase
(tTG) und von desamidierten Gliadin-Peptid (DGP) IgA und IgG Antikörper im
Humanserum, um in der Diagnose von glutensensitiver Enteropathie / Zöliakie in
Verbindung mit anderen klinischen und Laborbefunden zu unterstützen.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG
Zöliakie (CD) ist eine autoimmune Magen-Darm-Störung, die bei genetisch
anfälligen Personen ausgelöst durch die Aufnahme von Gluten enthaltendem
Getreide wie z. B. Weizen, Gerste und Roggen auftreten kann. Studien haben
ergeben, dass die Prävalenz von CD sehr variabel sein kann. Die gegenwärtig
eingeschätzte Prävalenz von CD ist 1 % mit einer statistischen
Wahrscheinlichkeitsverteilung zwischen 0.5-1.26 % in der Allgemeinbevölkerung
in Europa und den USA. Mit der Verwendung von serologischen Verfahren
1,2
beträgt die Inzidenz von CD in der Allgemeinbevölkerung etwa 1 in 100.
Ein Versagen, CD früh zu diagnostizieren, kann eine Person für langfristige
3,4
Komplikationen wie z. B. Milzatrophie und Darmlymphom prädisponieren. Eine
Diät ohne Gluten normalisiert die Mukosa und hilft das maligne Potenzial zu
reduzieren. Die histologische Untersuchung der kleinen Darmbiopsie bleibt der
Goldstandard für das Diagnostizieren von CD, aber es hat seine eigenen
Begrenzungen. Diese umfassen einige Patienten mit latenter oder sogar aktiver
5
CD, welche normale Gewebepathologie aufweisen kann.
Die verschiedenen serologischen Tests, welche bei der Aufarbeitung von
Patienten, bei denen vermutet wird, dass sie CD haben, eingesetzt werden,
umfassen Gliadin (AGA), DGP, tTG und endomysiale (EMA) Antikörper-Tests.
Antikörper zu Gliadin, DGP und tTG werden durch ELISA erkannt, wohingegen
EMA durch indirekte Immunfluoreszenz erkannt werden. EMA sind sehr
spezifische Indikatoren von CD. Jedoch ist der EMA-Test ein
immunhistochemisches Verfahren, das Erfahrung im Ablesen von
6
Immunfluoreszenz-Reaktionen erfordert.
33
DE
Seit der Identifizierung von tTG als das endomysiale Antigen sind ELISAVerfahren beschrieben worden, um Antikörper in den Seren von Patienten mit
CD zu erkennen. Der Vorteil der anti-tTG Antikörper-ELISA-Prüfung besteht
darin, dass sie automatisierbar und weniger subjektiv ist als EMA. Die Ergänzung
von DGP basierenden Prüfungen hat vielversprechende Resultate bei der
7-13
Adressierung von Begrenzungen der gegenwärtigen Prüfungsgruppe gezeigt.
Deshalb haben viele Labore optiert, tTG-Antikörper gepaart mit desamidierten
Gliadin-Antikörpern als das bevorzugte Screening-Verfahren zu verwenden. Die
Kombination von tTG und DGP in einer Prüfung kann die Sensitivität durch
Exponieren von mehreren Analyt-Epitopen besonders bei Zöliakie-Patienten mit
IgA-Mangel erhöhen. Unglücklicherweise kann das einfache Hinzufügen von
DGP zu tTG in einer Mischung nichtspezifische Interaktionen erhöhen oder
14
erforderte Epitope verdecken. Diese Prüfung verwendet ein proprietäres
rekombinantes Antigen, das ein vorherbestimmtes Verhältnis von sowohl tTG als
auch von DGP Epitopen bei einem einzelnen Molekül anzeigt. Dieser Ansatz
ermöglicht die Reduktion des Potenzials für Epitopverdeckung, dem man in
Mischungen von Antigenen begegnet, während effektiv die Reproduzierbarkeit
der
Prüfung
verbessert
und
das
nichtspezifische
Binden
bei
Krankheitsbekämpfungen minimiert wird, das bei einigen anderen tTG15-21
Immunoassays berichtet wird.
Der ImmuLisa™ Celiac Fusion™ Screen
ELISA ist ein einzigartiges Immunoassay mit hoher Spezifität und Sensitivität für
die Erfassung von Antikörpern von IgA und IgG Isotypen gegen tTG und DGP,
welches als ein anfänglicher serologischer Screen für Zöliakie geeignet ist.
GRUNDSÄTZE DES VERFAHRENS
Der Test wird als ein Festphasenimmunoassay ausgeführt. Mikrovertiefungen
werden mit einem rekombinanten Antigen, das tTG und DGP Epitope enthält,
beschichtet. Dem folgt ein Blockierungsschritt, um eine nichtspezifische
Proteinbindung während des Prüfungsablaufs zu reduzieren. Kontrollen,
Kalibratoren und Patientenseren werden in den mit Antigen beschichteten
Vertiefungen inkubiert, um im Serum vorhandenen spezifischen Antikörpern zu
ermöglichen, sich an das Antigen zu binden. Ungebundene Antikörper und
andere Serum-Proteine werden durch Waschen der Mikrovertiefungen entfernt.
Gebundene Antikörper werden durch Hinzufügen von einem enzymmarkierten
anti-menschlichen IgA/IgG-Konjugat zu den Mikrovertiefungen erkannt.
Ungebundenes Konjugat wird durch Waschen entfernt. Spezifisches
Enzymsubstrat (TMB) wird dann zu den Vertiefungen hinzugefügt und das
Vorhandensein von Antikörpern wird durch einen Farbwechsel erzeugt durch die
Umwandlung des TMB-Substrats in ein farbiges Reaktionsprodukt erkannt. Die
Reaktion wird gestoppt und die Intensität des Farbwechsels, der zur
Konzentration an Antikörpern proportional ist, wird durch ein Spektralphotometer
bei 450 nm abgelesen. Die Resultate werden in ELISA-Einheiten pro Milliliter
(EU/ml) ausgedrückt und als positiv oder negativ berichtet.
34
DE
REAGENZIEN
Lagerung und Vorbereitung
Alle Reagenzien bei 2-8 °C lagern. Nicht einfrieren. Die Reagenzien sind bis
zum Ablaufdatum stabil, wenn sie wie angewiesen gelagert und behandelt
werden.
Verwenden Sie es nicht, wenn das Reagenz nicht farblos oder wenn ein
Präzipitat vorhanden ist. Alle Reagenzien müssen vor dem Gebrauch (20-25°C)
auf Raumtemperatur gebracht werden.
Den Waschpuffer zu 1 Liter mit destilliertem oder vollentsalztem Wasser
herstellen. Bei Lagerung mit 2-8°C bleibt der hergestellte Waschpuffer bis zum
Kit-Ablaufdatum stabil.
Beschichtete Mikrovertiefungsstreifen sind nur für den einmaligen Gebrauch
bestimmt. Ungebrauchte Mikrovertiefungsstreifen sollten im Beutel, der
Trocknungsmittel enthält, sorgfältig wieder versiegelt werden, um Kondensation
zu verhindern, und bei 2-8 °C gelagert werden.
Vorsichtsmaßnahmen
Alle verwendeten menschlichen Komponenten sind auf HBsAg, HCV, HIV 1 und
2 und HTLV-I geprüft und durch erforderliche Tests anhand FDA als negativ
festgestellt worden. Menschliche Blutderivate und Patientenproben sollten jedoch
als potenziell ansteckend betrachtet werden. Gute Laborpraktiken bei der
22
Lagerung, beim Abgeben und dem Entsorgen dieser Materialien befolgen.
Die Stopplösung ist eine verdünnte Schwefelsäurelösung. Schwefelsäure
(H2SO4) ist giftig und ätzend. Nicht einnehmen und den Kontakt mit der Haut und
den Augen vermeiden. Die Exponierung gegenüber Basen, Metallen oder
anderen Verbindungen vermeiden, die mit Säuren reagieren können.
TMB-Enzymsubstrat enthält einen Reizstoff, der schädlich sein kann, wenn er
eingeatmet, aufgenommen oder durch die Haut absorbiert wird. Nicht einnehmen
und den Kontakt mit der Haut und den Augen vermeiden.
Die Anweisungen wie sie in dieser Kit-Beilage angegeben sind sollten
genau befolgt werden, um gültige Resultate sicherzustellen. Tauschen Sie
Kit-Komponenten nicht mit denjenigen von anderen Quellen aus. Gute
Laborpraktiken befolgen, um mikrobische und Querkontamination von
Reagenzien beim Handling zu minimieren. Verwenden Sie die Kit-Komponenten
nicht über das auf den Etiketten angegebene Ablaufdatum hinaus.
Bereitgestellte Materialien
ImmuLisa™ Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
[REF] 5157
Kits enthalten ausreichende Reagenzien, um 96 Bestimmungen auszuführen.
12 x 8
[MICROPLATE|FUSION]
Mikroplatte
mit
Mikrovertiefungen.
rekombinantem
Gebrauchsfertig.
35
individuell
abbrechbaren
Beschichtet
mit
tTG/DGP-Antigen.
DE
1 x 1.75 ml
[CONTROL|+|FUSION]
Einsatzbereite
Positivkontrolle
(roter
Verschlussdeckel) Enthält Humanserum positiv
für tTG und DGP Antikörper. Der erwartete
Konzentrationsbereich in EU/ml ist auf dem
Etikett aufgedruckt.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|-]
Einsatzbereite
Negativkontrolle
(weißer
Verschlussdeckel). Enthält Humanserum.
5 x 1.75 ml
[CALIBRATOR|A|FUSION]
Einsatzbereiter Satz von 5 Kalibratoren.
Kalibrator A (grüner Verschlussdeckel) 160
EU/ml, Kalibrator B (violetter Verschlussdeckel)
80 EU/ml, Kalibrator C (blauer Verschlussdeckel)
40 EU/ml, Kalibrator D (gelber Verschlussdeckel)
20 EU/ml und Kalibrator E (orangefarbener
Verschlussdeckel) 1 EU/ml. Abgeleitet aus
Humanserum, das tTG und DGP Antikörper
enthält. Konzentrationen in EU/ml sind auf den
Etiketten aufgedruckt.
[CALIBRATOR|B|FUSION]
[CALIBRATOR|C|FUSION]
[CALIBRATOR|D|FUSION]
[CALIBRATOR|E|FUSION]
1 x 15 ml
[IgA/IgG-CONJ|HRP]
HRP Ziege anti-menschliches IgA/IgG Konjugat.
Gebrauchsfertig. Farbcode rosa.
1 x 60 ml
[DIL]
Serumverdünnungsmittel.
Farbcode violett.
1 x 15 ml
[SUBSTRATE|TMB]
TMB-Enzymsubstrat. Gebrauchsfertig. Vor Licht
schützen.
1 x 15 ml
[STOP|H2SO4]
Stop-Lösung. Gebrauchsfertig.
2
x
Fläschchen
[BUF|WASH]
Pulver Waschpuffer.
wiederherstellen.
1x
Zu
Gebrauchsfertig.
je
einem
Liter
Protokollblätter
Optionale Komponenten
1 x 60 ml
[BUF|WASH]
Flüssigkeit konzentrierter Waschpuffer. Zu einem
Liter wiederherstellen.
Symbole auf den Etiketten
[LOT]
Patientennummer
[REF]
Katalognummer
[IVD]
In-vitro-Diagnostik
e
t
!
s
Gebrauch durch
Lagertemperatur
Anweisungen vor dem Gebrauch lesen
Anzahl Tests
Hersteller
Erforderliche Aber Nicht Bereitgestellte Materialien
•
•
•
•
Entsalztes oder destilliertes Wasser
Quetschflasche, um verdünnten Waschpuffer aufzunehmen
Pipetten für 5 µl bis 1000 µl
Einwegpipettenspitzen
36
DE
•
•
•
•
•
Saubere Reagenzgläser 12 x 75 mm und Reagenzglasgestell
Zeitmesser
Saugfähige Papierhandtücher
Mikroplattenleser, fähig Absorptionswerte bei 450 nm abzulesen. Wenn ein
Zweiwellenlängen-Mikroplattenleser verfügbar ist, sollte der Referenzfilter
bei 600-650 nm eingestellt werden
Automatischer Mikroplattenwascher, fähig 200 µl zu dispensieren
PROBENENTNAHME UND HANDLING
Bei diesem Verfahren sollten nur Serumproben verwendet werden. Äußerst
hämolysierte, lipämisch oder mikrobisch verunreinigte Proben können die
Leistung des Tests beeinträchtigen und sollten nicht verwendet werden. Die
Proben bei 2 -8 °C für nicht länger als eine Woche lagern. Bei längerer Lagerung
sollten die Serumproben eingefroren werden. Das wiederholte Einfrieren und
Auftauen von Proben vermeiden. Es wird empfohlen, dass eingefrorene Proben
innerhalb eines Jahres geprüft werden.
VERFAHREN
Verfahrens-Hinweise
•
•
•
•
•
•
•
•
Die Produktbeilage vor dem Beginn der Untersuchung sorgfältig durchlesen.
Alle Verdünnungen der Patientenproben sollten vor dem Beginn der
Untersuchung vorbereitet werden.
Die Patientenproben und Testreagenzien auf Raumtemperatur bringen,
bevor mit dem Prüfverfahren begonnen wird. Es wird empfohlen, dass
Reagenzien vor dem Gebrauch auf dem Labortisch außerhalb des Kastens
für 30 Minuten verbleiben. Alle ungebrauchten Proben und Reagenzien
sofort nach dem Gebrauch wieder in den Kühlschrank stellen.
Erforderliche Mikrovertiefungsstreifen aus dem Beutel entnehmen und den
Beutel sorgfältig wieder versiegeln, um Kondensation in den ungebrauchten
Vertiefungen zu verhindern. Den Beutel sofort wieder in den Kühlschrank
stellen.
Eine gute Waschtechnik ist entscheidend. Bei manuellem Waschen wird
adäquates Waschen dadurch erreicht, dass ein kräftiger Waschpufferstrom
mit einer breitspitzigen Spritzflasche über die komplette Mikroplatte gerichtet
wird. Ein automatisierter Mikroplattenwascher wird empfohlen.
Eine Mehrkanalpipette verwenden, die 8 oder 12 Vertiefungen gleichzeitig
versorgen kann. Das beschleunigt den Prozess und ermöglicht einheitlichere
Inkubationszeiten.
Bei allen Schritten ist die sorgfältige Kontrolle der Zeitmessung wichtig. Der
Start aller Inkubationszeiten beginnt mit der Beendigung der
Reagenzzugabe.
Die Zugabe aller Proben und Reagenzien sollte bei der gleichen
Geschwindigkeit und in der gleichen Reihenfolge ausgeführt werden.
37
DE
Prüfmethode
Schritt 1
Alle Reagenzien und Proben bei Raumtemperatur ins
Gleichgewicht bringen.
Protokollblatt kennzeichnen, um die Probenanordnung in den
Vertiefungen anzuzeigen. Es ist gute Laborpraktik, mit einer
zweifachen Ausführung der Proben zu arbeiten.
Für eine qualitative Bestimmung nur den Kalibrator D (Phiole mit
gelbem Verschlussdeckel) verwenden.
Schritt 2
Schritt 3
oder
Für eine semiquantitative Bestimmung die Kalibratoren A bis E,
wie im nachfolgenden Proben-Layout verwenden.
Qualitativ
A
B
C
D
E
F
G
H
Schritt 4
Schritt 5
Schritt 6
Schritt 7
Schritt 8
Leerprobe
-Kontrolle
+
Cal D
Kontrolle
S1
S2
S3
S4
1
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
2
Semiquantitativ
Usw.
3
A
B
C
D
E
F
G
H
Leerprobe
-Kontrolle
+
Cal A
Kontrolle
Cal B
Cal C
Cal D
Cal E
1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
2
Usw.
3
1:101 Verdünnung der Patientenproben durch Mischen von 5 µl der
Patientenseren mit 500 ul des Serumverdünnungsmittels
vorbereiten.
Die erforderlichen Mikrovertiefungen aus dem Beutel entnehmen
und ungebrauchte Streifen im versiegelten Beutel wieder zurück in
den Kühlschrank stellen. Die Mikrovertiefungen sicher im extra
bereitgestellten Halter platzieren.
Mit der Pipette 100 µl von einsatzbereiten Kalibratoren, Positiv- und
Negativkontrollen und verdünnte Patientenproben (1:101) gemäß
dem Protokollblatt in die zugehörigen Mikrovertiefungen geben.
Hinweis: Eine Vertiefung, die 100 µl an Serumverdünnungsmittel
enthält, als eine Reagenz-Leerprobe einschließen. Den ELISALeser gegen die Reagenz-Leerprobe nullen.
30 Minuten (± 5 Minuten) bei Raumtemperatur inkubieren.
4x mit dem Waschpuffer waschen. Um manuell zu Waschen, füllen
Sie jede Mikrovertiefung mit dem wiederhergestellten Waschpuffer.
Die Flüssigkeit durch Umkehren und Ausklopfen des Inhalts jeder
Vertiefung oder durch Ansaugen der Flüssigkeit aus jeder
Vertiefung entsorgen. Die Streifen umkehren und die Vertiefungen
kräftig auf saugfähigen Papierhandtüchern ausklopfen, um am
Ende des letzten Waschens zu blotten. Bei einer automatischen
Wascheinrichtung programmieren Sie diese gemäß den
Anweisungen des Herstellers.
38
DE
Schritt 9
Schritt 10
Schritt 11
Schritt 12
Schritt 13
Schritt 14
Schritt 15
Mit der Pipette 100 µl des Konjugats in die Mikrovertiefungen
geben.
30 Minuten (± 5 Minuten) bei Raumtemperatur inkubieren.
Alle Mikrovertiefungen wie in Schritt 8 waschen.
Mit der Pipette 100 µl des Enzymsubstrats in jede Mikrovertiefung
in der gleichen Reihenfolge und Zeitabfolge wie für das Konjugat
zugeben.
30 Minuten (± 5 Minuten) bei Raumtemperatur inkubieren.
Mit der Pipette 100 µl der Stopp-Lösung in jede Mikrovertiefung
unter Verwendung der gleichen Reihenfolge und Zeitabfolge wie für
die Zugabe des Enzymsubstrats zugeben. Die Absorptionswerte
innerhalb von 30 Minuten nach Hinzufügen der Stopp-Lösung
ablesen.
Die Absorbtion jeder Mikrovertiefung bei 450 nm unter Verwendung
eines Ein- oder bei 450/630nm unter Verwendung eines
Zweiwellenlängen-Mikroplattenlesers gegen die auf Null-Absortion
gesetzte Reagenz-Leerprobe ablesen.
Qualitätskontrolle
Kalibratoren, Positiv- und Negativkontrollen und eine Reagenz-Leerprobe
müssen mit jeder Prüfung eingesetzt werden, um die Vollständigkeit und
Genauigkeit des Tests zu verifizieren. Die Absorptionsanzeige der ReagenzLeerprobe sollte <0,3 sein. Der Kalibrator A sollte eine Absorptionsanzeige von
nicht weniger als 1,0 aufweisen. Anderweitig muss der Test wiederholt werden.
Die Negativkontrolle muss <10 EU/ml sein. Wenn der Test als zweifache
Ausführung durchgeführt wird, sollte der Mittelwert der zwei Messdaten
aufgenommen werden, um EU/ml zu bestimmen. Beim Durchführen von
qualitativen Bestimmungen muss die optische Dichte von Kalibrator D größer
sein als die der Negativkontrolle und kleiner als die Absorption der
Positivkontrolle. Für semiquantitative Bestimmungen muss die Positivkontrolle
Werte im auf dem Fläschchen angegebenen Bereich ergeben.
RESULTATE
Berechnungen
Die Konzentrationen der Patientenproben können durch zwei Methoden
bestimmt werden:
1.
QUALITATIVE BESTIMMUNG
Abs. des Prüfmusters
---------------------------- X EU/ml von Kalibrator D
Abs. von Kalibrator D
=
EU/ml Prüfmuster
Es wird empfohlen, dass qualitative Ergebnisse, als „positiv“ oder „negativ“
berichtet werden. Probenresultate größer oder gleich Kalibrator D werden
als positiv betrachtet.
39
DE
2. SEMIQUANTITATIVE BESTIMMUNG
Die Absorption von Kalibrator A bis E gegen ihre jeweiligen Konzentrationen
auf dem linear-logarithmischen Millimeterpapier aufnehmen. Die
Konzentrationen in EU/ml auf der X-Achse gegenüber der Absorption auf
der Y-Achse aufnehmen und eine Punkt-Zu-Punkt-Kurvenanpassung
zeichnen. Die Konzentrationen der Patientenproben von der Kurve gemäß
den entsprechenden Absorptionswerten bestimmen. Alternativ kann eine
Vier-Parameter-Kurve verwendet werden, um die Standardkurve
aufzunehmen.
Es wird empfohlen, dass semiquantitative Resultate als „positiv“, „negativ“,
oder „unbestimmt“ mit EU/ml Einheitswerten berichtet werden.
Unbestimmte/Grenz-Resultate sollten erneut getestet und zusammen mit
anderen Labormethoden, wie z. B. Prüfungen für die Erfassung von EMA
und/oder Gliadin-Antikörper bewertet werden.
Ausdeutung
Das Folgende dient nur als eine Führung in der Ausdeutung der
Laborresultate. Diese Werte wurden durch Prüfen von 123 normalen
Blutspendern und Nicht-Zöliakie-Krankheitsbekämpfungsproben bestimmt.
Der Mittelwert des normalen Probanden plus 2,5 SD wurde als der
Prüfungs-Cutoff ermittelt und einem beliebigen Wert von 20 EU/ml
zugeordnet. Jedes Labor muss seine eigenen Normalwerte bestimmen.
Celiac Fusion™ Wert
Ausdeutung
<20 EU/ml
20-25 EU/ml
> 25 EU/ml
Negativ
Unbestimmt (Grenzlinie)
Positiv
Kalibrator
Die einsatzbereiten Kalibratoren sind enthalten, um Semiquantifizierung zu
ermöglichen, und müssen mit jedem Durchgang verwendet werden.
Patientenproben, die hohe Antikörperspiegel enthalten, können größere
Absorptionswerte ergeben als die von Kalibrator A. Um genaue
semiquantitative Werte festzulegen, sollte man solche Proben weiter
verdünnen, damit sie sich innerhalb des Bereichs der Kalibratorkurve
befinden, wenn erneut getestet wird. Um EU/ml-Werte zu bestimmen,
multiplizieren Sie die durch den Verdünnungsfaktor erhaltenen Einheiten.
BEGRENZUNGEN DES VERFAHRENS
Bei diesem Verfahren sollten nur Serumproben verwendet werden. Äußerst
hämolysierte, lipämisch oder mikrobisch verunreinigte Proben können die
Leistung des Tests beeinträchtigen und sollten nicht verwendet werden. Die
Proben bei 2- 8 °C für nicht länger als eine Woche lagern. Bei längerer Lagerung
sollten die Serumproben eingefroren werden. Das wiederholte Einfrieren und
Auftauen von Proben vermeiden.
Prüfergebnisse dienen als eine Arbeitshilfe in der Diagnose und sollten in
Verbindung mit anderen klinischen und Laborbefunden berücksichtigt werden.
40
DE
ERWARTETE WERTE
Bei einer normalen Population sind die Testresultate gewöhnlich als negativ zu
erwarten. Während jedoch die Inzidenz von CD in der normalen Population
ungefähr 1 % beträgt, können einige scheinbar gesunde, asymptomatische
Personen positiv auf tTG Antikörper testen.
Die Inzidenz und Spiegel von Autoantikörpern assoziiert mit glutensensitiver
Enteropathie / CD sind vom Diätzustand abhängig. Die Spiegel dieser Antikörper
nehmen ab und werden bei Patienten, die sich auf einer Diät ohne Gluten
befinden, schließlich negativ. Ähnlich werden die Spiegel dieser Antikörper
zunehmen und sie können positiv werden, wenn Patienten mit CD, die auf einer
18-20
Diät ohne Gluten waren, eine Gluten enthaltende Diät aufnehmen.
Patienten,
die CD haben, aber einen Mangel an IgA aufweisen, werden generell für IgG
Antikörper zu tTG und Gliadin positiv sein. In solchen Fällen können Studien
durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass der Patient einen IgA-Mangel
aufweist.
Sätze klinischer Proben wurden auf ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA geprüft.
Resultate, welche die Inzidenz in den Populationen für diese Studie
demonstrieren, sind nachstehend aufgeführt.
Patientengruppe
Zugehörige Erkrankung
Zöliakie
Krankheitsbekämpfung
Hashimoto-Thyeroiditis
Gemischte Bindegewebserkr.
Rheumatoidarthritis
Sklerodermie
System. Lupus erythematodes
Vasculitis
Gesunde Normale
IMMCO
n Pos
% Pos
n
166
157
94,6 %
16
8
8
8
16
8
112
0
0
1
0
0
0
6
0,0 %
0,0 %
12,5 %
0,0 %
0,0 %
0,0 %
5,4 %
Hinweis: Die geprüfte Population enthielt eine große Anzahl an herausfordernd
niedrigen EMA-Titer-Proben und spiegelt weder eine typische diagnostizierte
CD-Population noch eine typische Screening-Population wider.
LEISTUNGSEIGENSCHAFTEN
Die Nützlichkeit des ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA wurde durch Prüfen gut
charakterisierter EMA positiver Serumproben neben Krankheitsbekämpfungen
und „normalen“ Humanseren bewertet. Diese Proben wurden auch bei einer
handelsüblichen tTG/DGP Antikörper-Screen-ELISA geprüft. Die Resultate sind
nachstehend zusammengefasst.
41
DE
A. Methodenvergleich: ImmuLisa™ Celiac Fusion™ Screen ELISA geg. anderen
tTG/DGP Screen ELISA.
Andere tTG/DGP Screen ELISA
IMMCO
Positiv
Celiac Fusion™ Negativ
Screen ELISA Gesamt
Positiv
52
2
54
Negativ
3
52
55
Gesamt
55
54
109
Positive Prozent-Übereinstimmung: 96,3% (95% CI 86,2% bis 99,4%)
Negative Prozent-Übereinstimmung: 94,5% (95% CI 83,9% bis 98,6%)
Gesamte Prozent-Übereinstimmung: 95,4% (95% CI 89,1% bis 98,3%)
EMA positive Zöliakie-Probanden: 57
Krankheitskontrollen: 20
Gesunde Normale Probanden: 32
B. Kreuzreaktivität: Insgesamt 64 potenziell kreuzreaktive Proben von Personen
mit anderen Autoimmunerkrankungen oder positiv für andere Autoantikörper
wurden auf tTG/DGP unter Verwendung von ImmuLisa™ Celiac Fusion™
ELISA geprüft.
Zustand
Hashimoto-Thyeroiditis
Gemischte Bindegewebserkrankung
Rheumatoidarthritis
Sklerodermie
Systemischer Lupus erythematodes
Vasculitis
n
16
8
8
8
16
8
n Positiv
0
0
1
0
0
0
Gesamt
64
1 (1,6%)
Präzision
Die Präzision wurde mit mehreren aus dem gesamten Bereich der Prüfung
ausgewählten Proben geprüft. Mehre Prüfungsabläufe wurden durchgeführt, um
Resultate zwischen den Tagen zu bestimmen. Ein zusätzlicher Durchgang von
zwölf Replikaten wurde durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen.
Die Resultate sind nachstehend zusammengefasst.
Mittelwert
EU/ml
Gesamtungenauigkeit
Zwischen Tagen
SD
Kit
Celiac
Fusion™
Screen
Assay
#
1
2
3
4
5
6
8,0
16,8
27,1
37,9
75,5
151,2
EU/ml
0,844
1,406
1,789
1,777
3,297
4,877
SD
CV %
10,5 %
8,4 %
6,6 %
4,7 %
4,4 %
3,2 %
EU/ml
0,885
1,387
1,818
1,793
3,368
4,683
42
Innerhalb des
Ablaufs
(Wiederholbarkeit)
SD
CV %
11,7 %
8,5 %
6,8 %
4,7 %
4,4 %
3,1 %
EU/ml
0,503
1,255
1,402
1,753
2,766
4,630
CV %
6,6 %
7,6 %
5,2 %
4,6 %
3,6 %
3,1 %
DE
Reproduzierbarkeit
Achtzig Replikate von Proben im negativen Bereich, ~20 % unter dem Cutoff,
~20 % über dem Cutoff und im mittelmäßigen positiven Bereich der Prüfung
wurden ausgeführt, um qualitative Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Diese
Proben wurden in mehreren Durchgängen getestet. Die Resultate der Prüfung
für jede Probe erzeugten eine qualitative Übereinstimmung von 100 %.
Nachweisgrenze
Die Nachweisgrenze (LoD) wurde bestimmt basierend auf 60 Replikaten der
Leerprobe und 10 Replikaten von je 6 Proben auf niedriger Stufe (NHS) . LoD
dafür war 3,0 EU/ml.
Linearität und Rückgewinnung
Linearität und Rückgewinnung wurden mittels Verdünnen positiver Proben durch
den Prüfungsbereich in abstandsgleichen Verdünnungen und dem Vergleichen
tatsächlicher Resultate gegenüber erwarteten Resultaten geprüft. Der lineare
Bereich der Prüfung wurde bestimmt zu 3,0 (LoD) - 160 EU/ml. Die Resultate
sind nachstehend zusammengefasst:
Prüfbereich
EU/ml
Anstieg (95%
CI)
2,9 bis 37,4
1,062
(1,007 bis
1,117)
0,998
(0,907 bis
1,090)
1,024
(0,861 bis
1,187)
25,3 bis 74,5
47,7 bis 153,9
Y-Achsenabschnitt
(95 % CI)
1,907
(-3,28 bis -0,53)
0,603
(-4,156 bis
5,361)
2,049
(-14,90 bis
18,99)
R²
% Rückgewinnung
(Erhalten/Erwartet)
1,0
97,3 bis 114,6
0,99
90,3 bis 104,7
0,99
92,4 bis 100,0
Interferenz
Interferenz wurde durch Mischen von Seren mit bekannten tTG/DGPAntikörperspiegeln mit sich potenziell gegenseitig beeinflussenden Serumproben
und der Abweichung von erwarteten Resultaten studiert. Keine bedeutende
Interferenz wurde fόr die folgenden Substanzen bei den angezeigten Spiegeln
demonstriert: Hδmoglobin (2 g/L), Bilirubin (342 µmol/L), Rheumafaktor (100
EU/ml), Triglyceride (37 mmol/L) und Cholesterin (130 mmol/L).
43
FR
ImmuLisa™
Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
Détection combinée des anticorps IgA et IgG dirigés contre la
transglutaminase tissulaire et les peptides de gliadine désaminée
[IVD] Pour utilisation en diagnostic in vitro
DESCRIPTION DU PRODUIT
[REF] 5157
Celiac Fusion™ ELISA
96 Déterminations
UTILISATION VISÉE
Un test d'immuno-absorption enzymatique (ELISA) pour la détection qualitative
et semi quantitative des anticorps IgA et IgG dirigés contre la transglutaminase
tissulaire (tTG) et les peptides de gliadine désaminées (DGP) contenus dans le
sérum humain, comme aide au diagnostic d'entéropathie sensible au gluten /
maladie cœliaque en combinaison avec d'autres résultats laboratoires et
cliniques.
RÉSUMÉ ET EXPLICATION
La maladie cœliaque (MC) est un dysfonctionnement auto-immun du tube
digestif qui peut être constaté chez des individus qui ont des prédispositions
génétiques et qui est déclenchée par l'ingestion de céréales contenant du gluten
comme le blé, l'orge et le seigle. Des études ont montré que la prévalence de la
MC était très variable. La prévalence de la MC est actuellement estimée à 1%,
avec une étendue statistique de probabilité située entre 0,5 et 1,26% pour la
population générale d'Europe et des États-Unis. En utilisant les méthodes
1,2
sérologiques, l'incidence de la MC a été évaluée à 1 pour 100.
Ne pas parvenir à diagnostiquer la MC suffisamment tôt peut prédisposer un
individu à des complications sur le long terme telles que l'atrophie splénique ou
3,4
le lymphome intestinal. Une alimentation ne comportant pas de gluten stabilise
les muqueuses et aide à réduire le potentiel malin. Un examen histologique sous
forme de biopsie de l'intestin grêle reste la meilleure solution pour diagnostiquer
la MC, mais cette méthode a ses propres limites. Parmi celles-ci, il peut y avoir
des patients qui ont une MC latente ou même active mais qui ont une
5
histopathologie normale.
Les différents tests sérologiques employés dans l'investigation de patients chez
qui on soupçonne une MC comprennent les tests d'anticorps gliadine (AGA),
DGP, tTG et endomysium (EMA). Les anticorps dirigés contre la gliadine, les
DGP et la tGP sont détectés par ELISA, alors que les EMA sont détectés par
immunofluorescence indirecte. Les EMA sont des indicateurs très spécifiques de
la MC. Cependant, le test EMA est une méthode d'himmunohistochimie qui
6
requiert l'expérience de la lecture des réactions d'immunofluorescence.
44
FR
Depuis l'identification de la tTG comme antigène endomysial, les méthodes
ELISA ont été prescrites pour la détection des anticorps dans les sera de
patients atteints de MC. L'avantage du dosage ELISA pour les anticorps anti-tTG
est que celui-ci est automatisable et moins subjectif que pour les EMA. L'ajout
des dosages se basant sur les DGP a fournit des résultats encourageants pour
7-13
l'amélioration des limitations de l'éventail de dosages actuel.
Pour cette
raison, de nombreux laboratoires ont choisi d'utiliser les anticorps tTG en
combinaison avec les anticorps anti-gliadine désaminée comme méthode
préférée de dépistage. La combinaison des tTG et DGP dans un dosage peut
augmenter le sensibilité en exposant plusieurs épitopes en particulier chez les
patients atteints de maladie cœliaque ayant un déficit IgA. Malheureusement, le
simple ajout de DGP à tTG dans un mélange peut augmenter les interactions
14
non spécifiques ou masquer les épitopes nécessaires. Ce dosage utilise un
antigène recombinant propriétaire qui présente un ratio prédéterminé d'épitopes
spécifiques tTG et DGP sur une seule molécule. Cette approche permet la
réduction du risque de masquage des épitopes rencontré avec les mélanges
d'antigènes tout en améliorant de façon efficace le reproductibilité du dosage et
en minimisant les associations non spécifiques dans le contrôle des maladies,
15-21
qui ont été signalées pour d'autres immunodosages tTG.
ImmuLisa™ Celiac
Fusion™ Dépistage ELISA est un immunodosage unique, hautement spécifique
et sensible pour la détection des anticorps isotypes IgA et IgG dirigés contre la
tTG et les DGP en tant que dépistage sérologique initial pour la maladie
cœliaque.
PRINCIPES DE LA PROCÉDURE
Ce test est effectué comme un immuno-essai en phase solide. Les micropuits
sont enduits d'un antigène recombinant contenant des épitopes tTG et DGP,
suivi par un blocage pour réduire les unions non spécifiques pendant l'exécution
du dosage. Les contrôles, les calibreurs et les sera de patients sont incubés
dans les puits enduits d'antigène pour permettre aux anticorps spécifiques
présents de se fixer à l'antigène. Les anticorps qui ne sont pas fixés et les autres
protéines sériques sont éliminés en lavant les micropuits. Les anticorps qui sont
fixés sont détectés en ajoutant une enzyme nommée conjugué anti IgA / IgG
humaine aux micropuits. Le conjugué qui n'est pas fixé est éliminé par nettoyage.
Le substrat d'enzyme spécifique (tétra-méthyl-benzidine TMB) est ensuite ajouté
aux puits et la présence d'anticorps est détectée par un changement de couleur
produit par la conversion du substrat TMB en un produit de réaction coloré. La
réaction est arrêtée et l'intensité du changement de couleur, qui est
proportionnelle à la concentration d'anticorps, est lue par un spectrophotomètre à
450 nm. Les résultats sont exprimés en unités ELISA par millilitre (UE/ml) et
reportés comme positifs ou négatifs.
RÉACTIFS
Stockage et Préparation
Stocker tous les réactifs à une température comprise entre 2 et 8°C. Ne pas
congeler. Les réactifs sont stables jusqu’à la date d'expiration lorsqu'ils sont
stockés et manipulés comme indiqué.
45
FR
Ne pas utiliser un réactif s'il n'est pas clair ou si un précipité est présent. Tous les
réactifs doivent être amenés à température ambiante (20-25°C) avant utilisation.
Réhydratez le tampon de lavage jusqu’à 1 litre avec de l’eau distillée ou
déminéralisée. Lorsque le tampon de lavage est conservé entre 2 et 8°C, il est
stable jusqu'à la date d'expiration.
Les barrettes enduites des micropuits sont réservées à un usage unique. Les
barrettes de micropuits non utilisées doivent être replacées avec précaution dans
le sachet contenant les déshydratants pour empêcher une condensation et
stockés entre 2 et 8°C.
Précautions
Tous les éléments dérivés du corps humain utilisés ont été testés pour les virus
HBsAg, HCV, HIV-1 et 2 et HTLV-1 et le résultat des tests était négatif,
conformément aux exigences de la FDA. Cependant, les dérivés de sang humain
et les spécimens des patients doivent être considérés comme potentiellement
infectieux. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire lors du stockage, de la
22
délivrance et de l'élimination de ces matériaux.
La solution d'arrêt est une solution d'acide sulfurique diluée. L'acide sulfurique
(H2SO4) est toxique et corrosive. Ne pas ingérer et éviter le contact avec la peau
et les yeux. Éviter le contact avec les bases, métaux et autres composants qui
pourraient réagir avec les acides.
Le Substrat d'Enzyme TMB contient une substance irritante qui peut être
dangereuse si elle est inhalée, ingérée ou absorbée par voie cutanée. Ne pas
ingérer et éviter le contact avec la peau et les yeux.
Les instructions doivent être suivies précisément, telles qu'elles
apparaissent dans cette notice d'utilisation afin de garantir la validité des
résultats. Ne pas interchanger les éléments du kit avec des éléments provenant
d'autres sources. Suivez les bonnes pratiques de laboratoire afin de minimiser la
contamination microbienne et la contamination croisée des réactifs lors de la
manipulation. Ne pas utiliser les éléments au delà de la date d'expiration qui
figure sur les étiquettes.
Matériel fourni
ImmuLisa™ Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
[REF] 5157
Les kits contiennent suffisamment de réactifs pour effectuer 96 déterminations.
12 x 8
[MICROPLATE|FUSION]
Microplaque constituée de micropuits individuels
sécables. Enduits d'antigène recombinant tTG /
DGP. Prêts à l'emploi.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|+|FUSION]
Contrôle Positif Prêt à être utilisé (bouchon
rouge). Contient du sérum humain testé positif
pour les anticorps tTP et DGP. La concentration
qui est attendue est inscrite sur l'étiquette en
UE/ml.
46
FR
1 x 1.75 ml
[CONTROL|-]
Contrôle Négatif prêt à l'emploi
blanche). Contient du sérum humain.
5 x 1.75 ml
[CALIBRATOR|A|FUSION]
Lot de 5 Calibreurs Prêt à être utilisé. Calibreur A
(bouchon vert) 160 UE/ml, Calibreur B (bouchon
violet) 80 UE/ml, Calibreur C (bouchon bleu) 40
UE/ml, Calibreur D (bouchon jaune) 20 UE/ml et
Calibreur E (bouchon orange) 1 UE/ml. Dérivé de
sérum humain contenant des anticorps dirigés
contre les tTG et DGP. Les concentrations en
UE/ml sont inscrites sur les étiquettes.
[CALIBRATOR|B|FUSION]
[CALIBRATOR|C|FUSION]
[CALIBRATOR|D|FUSION]
[CALIBRATOR|E|FUSION]
(capsule
1 x 15 ml
[IgA/IgG-CONJ|HRP]
Globuline de chèvre anti-IgA/IgG humaine
conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP).
Prête à l'emploi. Code couleur rose.
1 x 60 ml
[DIL]
Diluant sérum. Prêt à l'emploi. Code couleur
violet.
1 x 15 ml
[SUBSTRATE|TMB]
Substrat d'enzyme TMB. Prêt à l'emploi. Protéger
de la lumière.
1 x 15 ml
[STOP|H2SO4]
Solution d'arrêt. Prête à l'emploi.
2 x fioles
[BUF|WASH]
Tampon de Lavage en Poudre. Reconstituer
jusqu'à un volume d'un litre chacun.
1x
Feuille de Protocole
Éléments Additionnels
1 x 60ml
[BUF|WASH]
Tampon
de
Lavage
Liquide
concentré.
Reconstituer jusqu'à un volume d'un litre.
Symboles utilisés sur les étiquettes
[LOT]
Numéro de lot
[REF]
Numéro Catalogue
[IVD]
Utilisation pour un diagnostic in vitro
e
t
!
s
Utiliser avant
Température de stockage
Lire les instructions avant utilisation
Nombre de tests
Fabriquant
Matériel Requis Mais Non Fourni
•
•
•
•
•
•
•
Eau déminéralisée ou distillée
Pissette en plastique pour distribuer la solution de tampon de lavage
Pipeteurs volumétriques de précision permettant de prélever 5 µl à 1000 µl
Embouts de pipettes jetables
Tubes à essai propres 12 x 75 mm et support de tubes à essai
Chronomètre de laboratoire
Serviettes de papier absorbant
47
FR
•
Lecteur de microplaque capable de lire les valeurs d'absorbance à 450 nm.
Si un lecteur de microplaque à double longueur d'onde est disponible, le
filtre de référence doit être réglé sur 600-650 nm
•
Système de lavage automatique de microplaques capable de délivrer 200 µl
COLLECTE ET MANIUPULATION DES SPECIMENS
Seuls des spécimens de sérum doivent être utilisés pour cette procédure.
L'emploi d'échantillons hémolysés, nettement lipémiques ou contaminés par des
microbes peut interférer avec la réalisation du test et ceux-ci ne doivent pas être
utilisés. Veuillez conserver les spécimens à 2°-8°C pendant une période
inférieure à une semaine. Pour un stockage pendant une période plus longue,
les spécimens de sérum doivent être congelés. Eviter les congélations et
décongélations successives des échantillons. Il est recommandé de tester les
spécimens congelés dans un délai d’un an.
PROCÉDURE
Notes concernant la Procédure
•
•
•
•
•
•
•
•
Veuillez lire attentivement la notice du produit avant de commencer
l'analyse.
Toutes les dilutions des échantillons des patients doivent être préparées
avant le début de l'analyse.
Laissez les spécimens des patients et les réactifs du test s'équilibrer à la
température ambiante avant de commencer la procédure de test. Il est
souhaitable de laisser les réactifs sur la table en dehors de la boite pendant
30 minutes avant utilisation. Replacez tous les spécimens et réactifs non
utilisés dans le réfrigérateur immédiatement après utilisation.
Otez les barrettes de puits nécessaires du sachet et refermer
soigneusement le sachet pour éviter la condensation des barrettes de puits
inutilisées. Rangez immédiatement le sachet dans le réfrigérateur.
Une bonne technique de lavage est essentielle. Si le lavage est effectué
manuellement, un lavage approprié peut être réalisé en appliquant un jet
puissant de tampon de lavage avec une pissette équipée d'un embout large,
sur l'intégralité de la microplaque.
Un système de lavage de
microplaques automatisé est recommandé.
Utiliser un pipeteur multicanaux capable de remplir 8 à 12 puits
simultanément. Cela permet d'accélérer le processus et permet également
des temps d'incubation plus uniformes.
Durant toutes les étapes, un contrôle attentif du temps est important. Le
début de toute période d’incubation commence avec la réalisation de
l’addition de réactif.
L’addition de tous les échantillons et des réactifs doit être réalisée au même
rythme et dans le même ordre.
48
FR
Méthode de Test
Étape 1 Laisser tous les réactifs et les spécimens s'équilibrer à la température
ambiante.
Étape 2 Etiqueter la feuille de protocole pour indiquer la disposition des
échantillons dans les puits. Selon les bonnes pratiques de laboratoire,
il est souhaitable d'analyser des échantillons en double.
Étape 3 Pour une détermination qualitative utiliser le Calibreur D (fiole avec
la capsule jaune) seulement.
ou
Pour une détermination semi quantitative utiliser les Calibreurs A
jusqu'à E, comme décrit dans l'exemple de disposition ci-dessous.
Qualitative
A
B
C
D
E
F
G
H
Vierge
+
Contrôle
Cal D
Contrôle
S1
S2
S3
S4
1
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
2
Semi Quantitative
Etc.
A
B
C
D
E
F
G
H
3
Vierge
+
Contrôle
Cal A
Contrôle
Cal B
Cal C
Cal D
Cal E
1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
2
Etc.
3
Étape 4 Préparer une dilution 1:101 des échantillons du patient en mélangeant
5 µl des sera du patient avec 500ul de diluant sérum.
Étape 5 Retirer les micropuits nécessaires du sachet et ranger les barrettes
inutilisées dans le sachet fermé, dans le réfrigérateur. Placer
fermement les micropuits dans le support supplémentaire fourni.
Étape 6 Verser à l'aide d'une pipette 100 µl de Calibreurs prêts à l'emploi,
contrôles positifs et négatifs et d'échantillons du patient dilués (1:101)
dans les micropuits appropriés, selon la feuille de protocole.
Note : Inclure un puits qui ne contient que 100 µl de diluant sérum
comme blanc de réactif. Mettez sur zéro le lecteur ELISA avec le blanc
de réactif.
Étape 7 Incuber pendant 30 minutes (± 5 min) à température ambiante.
Étape 8 Laver 4x avec le tampon de lavage. Pour un lavage manuel, remplir
chaque micropuits avec le tampon de lavage reconstitué. Disposez du
fluide en renversant et en tapant afin de vider le contenu de chaque
puits ou en aspirant le liquide contenu dans chaque puits. Pour
absorber le liquide résiduel après le dernier lavage, inverser les
barrettes et taper les puits vigoureusement sur des serviettes de papier
absorbantes. Pour les systèmes de lavage automatisés, programmer
le système de lavage selon les instructions du fabriquant.
Étape 9 Verser à l'aide d'une pipeteur 100 µl de Conjugué dans les micropuits.
Étape 10 Laisser incuber pendant 30 minutes (± 5 min) à température
ambiante.
49
FR
Étape 11 Laver tous les micropuits selon la même méthode que lors de l'étape
8.
Étape 12 Verser à l'aide d'un pipeteur 100 µl de Substrat d'Enzyme dans chaque
micropuits dans le même ordre et selon le même minutage que pour le
Conjugué.
Étape 13 Incuber pendant 30 minutes (± 5 min) à température ambiante.
Étape 14 Verser à l'aide d'un pipeteur 100 µl de Solution d'Arrêt dans chaque
micropuits dans le même ordre et selon le même minutage que lors de
l'ajout du Substrat d'Enzyme. Lire les valeurs d’absorbance dans un
délai de 30 minutes à partir du moment où la solution d'arrêt a été
ajoutée.
Étape 15 Lire l'absorbance de chaque micropuits à 450 nm en utilisant un
lecteur simple ou à 450/630 nm en utilisant un lecteur de microplaques
à double longueur d'onde en comparaison avec le blanc de réactif
placé sur zéro absorbance.
Contrôle Qualité
Les Calibreurs, les Contrôles Positifs et Négatifs et le blanc de réactif doivent
être utilisés pour chaque analyse afin de vérifier l'intégrité et la précision du test.
La valeur d'absorbance du blanc de réactif doit être <0,3.
La valeur
d'absorbance du Calibreur A ne doit pas être inférieure à 1,0 sinon le test devra
être répété. Le contrôle négatif doit être <10 UE/ml. Si le test est effectué en
double, la moyenne des deux valeurs doit être prise en compte pour déterminer
le nombre d'Unités Elisa/ml. Lorsque vous effectuez des déterminations
Qualitatives, la densité optique de Calibreur D soit être supérieur à celle du
contrôle négatif et son absorbance doit être inférieure à celle du contrôle positif.
Pour les déterminations semi quantitatives, le contrôle positif doit donner des
valeurs comprises dans l'intervalle inscrit sur la fiole.
RÉSULTATS
Calculs
La concentration des échantillons de patients peut être déterminée par l’une des
deux méthodes suivantes :
1.
DETERMINATION QUALITATIVE
Abs. de l'échant. Test
------------------------------- X UE/ml du Calibreur D
Abs. du Calibreur D
=
UE/ml de l'échantillon Test
Il est recommandé que les résultats qualitatifs soient signalés comme «
positif » ou « négatif ». Les résultats d’échantillon supérieurs ou égaux au
calibreur D sont considérés comme positifs.
2.
DETERMINATION SEMI-QUANTITATIVE
Relever l’absorbance du calibreur A jusqu’au calibreur E par rapport à leurs
concentrations respectives sur un papier graphique à logarithme linéaire.
Tracer la variation des concentrations en Unités Elisa/ml sur l'abscisse en
50
FR
fonction de l'ordonnée et dessiner une courbe ajustée. Déterminer les
concentrations sur les échantillons patients en se basant sur la courbe en
accord avec les valeurs d’absorbance correspondantes. Alternativement,
une courbe à quatre paramètres peut être utilisée pour tracer la courbe
standard.
Il est recommandé que les résultats semi quantitatifs soient signalés comme
« positif », « négatif » ou « indéterminé » avec les valeurs unitaires en
UE/ml. Les résultats indéterminés ou limites doivent être testés de nouveau
et évalués selon d’autres méthodes de laboratoire, telles que des dosages
pour la détection des anticorps EMA et / ou gliadine.
Interprétation
Les informations suivantes servent seulement de guide pour l'interprétation
des résultats laboratoires. Les valeurs d’interprétation ont été déterminées
en testant 123 donneurs de sang normaux et des spécimens de contrôle
non atteints de maladie cœliaque. La moyenne des sujets normaux, à
laquelle sont ajoutés 2,5 écarts types, a été établie comme limite de
l'analyse et la valeur de 20 UE/ml lui a été attribuée. Chaque laboratoire doit
déterminer les valeurs normales qui lui sont propres.
Valeur Celiac Fusion™
Interprétation
<20 UE/ml
20-25 UE/ml
>25 UE/ml
Négatif
Indéterminé (Limite)
Positif
Calibreur
Les Calibreurs prêts à l'emploi sont inclus pour fournir une détermination
semi quantitative et doivent être utilisés à chaque série de test. Les
échantillons de patient contenant des niveaux d’anticorps élevés peuvent
donner des valeurs d’absorbances supérieures à celles du calibreur A. Afin
de déterminer des valeurs semi quantitatives exactes, de tels spécimens
doivent être dilués encore plus afin de rentrer dans l’éventail de la courbe du
calibreur lorsqu’ils seront testés de nouveau. Pour déterminer les valeurs en
Unités Elisa/ml, multipliez le nombre d'unités obtenues par le facteur de
dilution.
LIMITATIONS DE LA PROCÉDURE
Seuls des spécimens de sérum doivent être utilisés pour cette procédure.
L'emploi d'échantillons hémolysés, nettement lipémiques ou contaminés par des
microbes peut interférer avec la réalisation du test et ceux-ci ne doivent pas être
utilisés. Conserver les spécimens à 2°-8°C pendant une période inférieure à une
semaine. Pour un stockage pendant une période plus longue, les spécimens de
sérum doivent être congelés. Evitez de congeler et décongeler plusieurs fois les
échantillons.
Ces résultats sont une aide au diagnostic et les résultats d'autres tests
laboratoires et d'analyses cliniques doivent être pris en considération.
51
FR
VALEURS ATTENDUES
Les résultats des tests pour une population normale doivent habituellement être
négatifs. Cependant, comme l'incidence de la MC dans une population normale
est d'environ 1%, certains individus apparemment en bonne santé peuvent être
testés positifs pour les anticorps tTG.
L'incidence et les niveaux d'anticorps associés à l'entéropathie sensible au
gluten / à la MC dépendent de l'état du régime. Les niveaux d'anticorps
diminuent et deviennent finalement négatifs chez les patients dont le régime ne
comporte pas de gluten. De façon similaire, les niveaux de ces anticorps
augmenteront et pourront devenir positifs lorsque les patients atteints de MC qui
18-20
suivaient un régime sans gluten ingèrent des aliments contenant du gluten.
Les patients qui sont atteints de MC mais qui ont un déficit IgA seront
généralement testés positifs pour les anticorps IgG dirigés contre la tTG et la
gliadine. Dans ces cas, des études peuvent être effectuées pour confirmer que le
patient a bien un déficit IgA.
Des ensembles d'échantillons cliniques ont été testés à l'aide d'ImmuLisa™
Celiac Fusion™ ELISA. Les résultats démontrant l'incidence chez les populations
pour cette étude sont fournis ci-dessous.
Groupe de Patients
Maladie associée
Maladie Cœliaque
Contrôle Maladie
Thyroïdite de Hashimoto
Maladie Mixte du Tissu Conjonctif
Arthrite Rhumatoïde
Sclérodermie
Lupus Érythémateux Disséminé
Vascularite
Normaux en bonne santé
IMMCO
n Pos
% Pos
n
166
157
94,6%
16
8
8
8
16
8
112
0
0
1
0
0
0
6
0,0%
0,0%
12,5%
0,0%
0,0%
0,0%
5,4%
Note : La population testée comprend un grand nombre de titrages ayant des
niveaux bas d'EMA et ne reflète pas une population typiquement diagnostiquée
de MC, ni une population dépistée typique.
CHARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE
L'utilité des solutions ImmuLisa™ Celiac Fusion™ Dépistage ELISA a été
évaluée en testant des spécimens de sérums bien caractérisés provenant de
sujets atteints de MC avec des contrôles maladie et des sérums humains «
normaux ».
Ces spécimens ont également été testés avec des kits ELISA
Dépistage Anticorps tTG / DGP disponibles dans le commerce. Ces résultats
sont résumés ci-dessous.
52
FR
A.
Comparaison Méthode : ImmuLisa™ Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
contre autre ELISA dépistage tTG / DGP
Autre ELISA Dépistage tTG/DGP
IMMCO
Positif
Celiac Fusion™ Négatif
ELISA
Total
Positif
52
2
54
Négatif
3
52
55
Concordance en pourcentage cas positifs :
Concordance en pourcentage cas négatifs :
Concordance en pourcentage tous les cas :
Sujets atteints de MC positifs EMA : 57
Contrôle Maladie : 20
Sujets normaux en bonne santé : 32
Total
55
54
109
96,3% (95% CI 86,2% to 99,4%)
94,5% (95% CI 83,9% to 98,6%)
95,4% (95% CI 89,1% to 98,3%)
B. Réactivité Croisée : Un total de 64 spécimens ayant un potentiel de réactivité
croisée provenant d'individus atteints d'autres dysfonctionnements autoimmunitaires ou testés positifs pour d'autres anticorps ont été testés pour les
anticorps tTG / DGP en utilisant le système ImmuLisa™ Celiac Fusion™
Dépistage ELISA.
Condition
Thyroïdite de Hashimoto
Maladie Mixte du Tissu Conjonctif
Arthrite Rhumatoïde
Sclérodermie
Lupus Érythémateux Disséminé
Vascularite
n
16
8
8
8
16
8
n Positif
0
0
1
0
0
0
Total
64
1 (1,6%)
Précision
La précision a été testée avec plusieurs spécimens sélectionnés a travers
l’échantillon utilisé pour l’analyse. Plusieurs dosages ont été effectués pour
déterminer les résultats entre les jours. Une analyse supplémentaire de douze
répliques a été effectuée pour déterminer la reproductibilité. Les résultats sont
résumés ci-dessous.
53
FR
Moyen
ne
(UE/ml)
Kit
Dosage
Dépistag
e Celiac
Fusion™
#
1
2
3
4
5
6
8,0
16,8
27,1
37,9
75,5
151,2
Imprécision totale
Écarttype
(UE/ml)
0,844
1,406
1,789
1,777
3,297
4,877
Entre les jours
Écarttype
CV%
10,5%
8,4%
6,6%
4,7%
4,4%
3,2%
(UE/ml)
0,885
1,387
1,818
1,793
3,368
4,683
CV%
11,7%
8,5%
6,8%
4,7%
4,4%
3,1%
En cours
(Reproductibilité)
Écarttype
(UE/ml)
0,503
1,255
1,402
1,753
2,766
4,630
CV%
6,6%
7,6%
5,2%
4,6%
3,6%
3,1%
Reproductibilité
80 dosages des échantillons dans l’éventail des cas négatifs bas, environ 20%
des cas en dessous de la limite et environ 20% des cas au dessus de la limite et
dans l'éventail des cas modérément positifs ont été réalisés afin de déterminer la
reproductibilité qualitative. Ces échantillons ont été testés à plusieurs reprises.
Les résultats d'analyse pour chaque spécimen ont fourni une concordance
qualitative de 100%.
Limites de Détection
La limite de détection (LoD) a été déterminée à partir de 60 mesures
d'échantillons vierges et 10 mesures de chacun des 6 échantillons avec des
niveaux bas (NHS). La LoD a été déterminée à 3,0 UE/ml.
Linéarité et rétablissement
La linéarité et la récupération ont été testées en diluant des spécimens positifs
dans la gamme du dosage en dilutions équidistantes et en les comparant les
résultats réels et attendus. L’étendue linéaire du dosage a été déterminée et
correspond à 3,0 - 160 UE/ml. Les résultats sont résumés ci-dessous :
Portée du Test
(UE/ml)
2,9 à 37,4
25,3 à 74,5
47,7 à 153,9
Pente (95% CI)
1,062
(1,007 à 1,117)
0,998
(0,907 à 1,090)
1,024
(0,861 à 1,187)
Segment sur
l'axe Y
(95% CI)
-1,907
(-3,28 à -0,53)
0,603
(-4,156 à 5,361)
2,049
(-14,90 à 18,99)
R²
% Récupération
(obtenu/attendu)
1,0
97,3 à 114,6
0,99
90,3 à 104,7
0,99
92,4 à 100,0
Interférence
L’interférence a été étudiée en mélangeant le sérum avec des niveaux
d’anticorps tTG / DGP connus avec des échantillons de sérum potentiellement
interférant puis en étudiant la déviation par rapport aux résultats escomptés.
Aucune interférence significative n’a été démontrée pour les substances
suivantes aux niveaux indiqués : Hémoglobine (2 g/L), Bilirubine (342 μmol/L),
Facteur rhumatoïde (100 EU/ml), Triglycérides (37 mmol/L), et Cholestérol (13
mmol/L).
54
IT
ImmuLisa™
Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
Rilevamento combinato degli anticorpi IgA e IgG diretti contro la
transaminasi tissutale umana e il peptide gliadina deamidata.
[IVD]
Per uso diagnostico in vitro
FOGLIO ILLUSTRATIVO DEL PRODOTTO
[REF] 5157
Celiac Fusion™ ELISA
96 determinazioni
USO PREVISTO
Dosaggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per il rilevamento
qualitativo e semiquantitativo degli anticorpi IgA o IgG anti-transglutaminasi
tissutale umana nel siero umano come ausilio nella diagnosi dell'enteropatia
sensibile al glutine o malattia celiaca (CD) in combinazione con altri risultati
clinici e di laboratorio.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE
La malattia celiaca (CD) è un disturbo gastrointestinale autoimmune che può
colpire soggetti geneticamente sensibili ed è scatenato dall'ingestione di cereali
contenenti glutine, come ad esempio grano, orzo e segale. Gli studi hanno
scoperto che la prevalenza della CD è molto variabile. La prevalenza stimata
corrente della CD è dell'1%, con un intervallo statistico delle probabilità di 0,51,26% nella popolazione generale in Europa e Stati Uniti.Utilizzando metodi
sierologici, l'incidenza della CD nella popolazione generale è di circa un soggetto
1,2
su 100.
L'incapacità di diagnosticare precocemente la CD può predisporre un individuo
3,4
alle complicanze a lungo termine come l'atrofia splenica e il linfoma intestinale.
Una dieta priva di glutine normalizza la mucosa e aiuta a ridurre il potenziale
maligno. L'esame istologico di un campione bioptico del piccolo intestino resta lo
standard di riferimento per la diagnosi di CD, sebbene abbia i suoi limiti. Questi
includono alcuni pazienti con CD latente o persino attiva che possono avere
5
un'istopatologia normale.
I vari test sierologici impiegati negli accertamenti diagnostici dei pazienti con CD
sospetta includono i test per gli anticorpi anti-gliadina (AGA), anti-endomisio
(EMA) e anti-transglutaminasi tissutale (tTG). Gli anticorpi anti-gliadina, anti-DGP
e anti-tTG sono rilevati mediante ELISA, mentre gli anti-EMA sono rilevati
mediante immunofluorescenza indiretta. Gli anticorpi anti-EMA sono indicatori
molto specifici della CD. Il test EMA è tuttavia un metodo immunoistochimico che
6
richiede esperienza nella lettura delle reazioni di immunofluorescenza.
Da quando la tTG è stata identificata come antigene dell'endomisio, sono stati
descritti metodi ELISA per la rilevazione anticorpale nei sieri dei pazienti con CD.
Il vantaggio del dosaggio ELISA degli anticorpi anti-tTG è che si tratta di un
55
IT
metodo automatizzabile e meno soggettivo rispetto all'EMA. L'aggiunta dei
dosaggi basati sul DGP ha mostrato risultati promettenti nell'affrontare i limiti
7-13
dell'attuale serie di dosaggi.
Per questa ragione, molti laboratori hanno scelto
di usare come metodo di screening il rilevamento degli anticorpi anti-tTG
abbinato a quello degli anticorpi anti-gliadina deamidata. La combinazione di tTG
e DGP in un solo dosaggio può aumentare la sensibilità dal momento che
espone multipli epitopi dell'analita, soprattutto nei pazienti celiaci carenti di IgA.
Sfortunatamente, la semplice aggiunta di DGP e tTG a una miscela può
14
aumentare le interazioni aspecifiche o mascherare gli epitopi necessari. Questo
dosaggio utilizza un antigene ricombinante proprietario che mostra un rapporto
prestabilito degli epitopi tTG e DGP in una singola molecola. Questo approccio
consente di ridurre la possibile mascheratura dell'epitopo riscontrata nelle
miscele di antigeni, migliorando allo stesso tempo in modo efficace la
riproducibilità del dosaggio e minimizzando il legame aspecifico nei controlli di
15-21
malattia riportato in alcuni altri dosaggi immunologici tTG.
Il dosaggio
ImmuLisa™ Celiac Fusion™ Screen ELISA è un dosaggio immunologico
originale, caratterizzata da specificità e sensibilità elevate, per il rilevamento degli
anticorpi degli isotipi IgA e IgG diretti contro tTG e DGP, idoneo come screening
sierologico iniziale per la malattia celiaca.
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il test viene eseguito come dosaggio immunoenzimatico in fase solida. I
micropozzetti sono rivestiti con un antigene ricombinante contenente gli epitopi
tTG e DGP, cui segue un passaggio di arresto per ridurre il legame non specifico
durante l'esecuzione del dosaggio. Controlli, calibratori e sieri del paziente
vengono incubati nei pozzetti rivestiti con l'antigene per consentire agli anticorpi
specifici presenti nel siero di legarsi all'antigene. Gli anticorpi non legati e le altre
proteine seriche vengono rimossi tramite lavaggio dei micropozzetti. Gli anticorpi
legati sono rilevati aggiungendo ai micropozzetti un coniugato anti-IgA/IgG
umane marcato enzimaticamente. Il coniugato non legato viene rimosso
mediante lavaggio. Viene quindi aggiunto ai pozzetti un substrato enzimatico
specifico (TMB) e viene rilevata la presenza degli anticorpi tramite una variazione
di colore prodotta dalla conversione del substrato TMB in un prodotto di reazione
colorato. La reazione viene arrestata e l'intensità della variazione di colore, che
è proporzionale alla concentrazione anticorpale, viene letta con uno
spettrofotometro a 450 nm. I risultati sono espressi in unità ELISA per millilitro
(UE/ml) e refertati come positivi o negativi.
REAGENTI
Conservazione e preparazione
Conservare tutti i reagenti a 2-8 °C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino
alla data di scadenza, quando conservati e maneggiati secondo le indicazioni.
Non utilizzare se il reagente non è limpido o in presenza di un precipitato. Tutti i
reagenti devono essere portati a temperatura ambiente (20-25 °C) prima dell'uso.
Ricostituire il tampone di lavaggio a 1 litro con acqua distillata o deionizzata.
Quando conservato a 2-8 °C, il tampone di lavaggio ricostituito è stabile fino alla
data di scadenza del kit.
56
IT
Le strisce di micropozzetti rivestiti sono monouso. Le strisce di micropozzetti non
utilizzate devono essere risigillate accuratamente in buste contenenti essiccanti
per impedire la formazione di condensa e conservati a 2-8 °C.
Precauzioni
Tutti i componenti di origine umana utilizzati sono stati testati per HBsAg, HCV,
HIV-1, HIV-2 e HTLV-I e sono risultati negativi in base ai test richiesti dalla FDA.
Gli emoderivati umani e i campioni dei pazienti vanno tuttavia considerati
potenzialmente infettivi. Seguire le buone pratiche di laboratorio durante la
conservazione, la preparazione, la distribuzione e lo smaltimento di questi
22
materiali.
La soluzione di arresto è costituita da acido solforico diluito. L'acido solforico
(H2SO4) è velenoso e corrosivo. Non ingerire ed evitare il contatto con gli occhi e
con la pelle. Evitare l'esposizione a basi, metalli o altri composti che potrebbero
reagire con gli acidi.
Il substrato enzimatico TMB contiene un irritante che può essere nocivo se
inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. Non ingerire ed evitare il contatto
con la pelle e con gli occhi.
Per garantire la validità dei risultati, seguire le istruzioni esattamente come
appaiono nel presente foglio illustrativo del kit. Non scambiare i componenti
del kit con quelli di altre fonti. Seguire le buone pratiche di laboratorio per
minimizzare la contaminazione microbica e crociata dei reagenti durante la
manipolazione. Non utilizzare i componenti del kit oltre la data di scadenza
segnata sulle etichette.
Materiali forniti
ImmuLisa™ Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
[REF] 5157
I kit contengono reagenti sufficienti per eseguire 96 determinazioni.
12 x 8
[MICROPLATE|FUSION]
Micropiastra
con
micropozzetti
separabili
singolarmente.
Rivestimento
con
antigene
tTG/DGP ricombinante. Pronta per l'uso.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|+|FUSION]
Controllo positivo (tappo rosso), pronto per
l’uso. Contiene siero umano positivo per anticorpi
anti-tTG e anti-DGP. L'intervallo di concentrazione
previsto in UE/ml è stampato sull'etichetta.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|-]
Controllo negativo (tappo bianco) pronto per
l'uso. Contiene siero umano.
5 x 1.75 ml
[CALIBRATOR|A|FUSION]
Serie di 5 calibratori, pronti per l'uso. Calibratore
A (tappo verde) 160 UE/ml, calibratore B (tappo
viola) 80 UE/ml, calibratore C (tappo blu) 40
UE/ml, calibratore D (tappo giallo) 20 UE/ml, e
calibratore E (tappo arancione) 1 UE/ml. Derivati
da siero umano contenente anticorpi anti-tTG e
anti-DGP. Le concentrazioni in UE/ml sono
stampate sulle etichette.
[CALIBRATOR|B|FUSION]
[CALIBRATOR|C|FUSION]
[CALIBRATOR|D|FUSION]
[CALIBRATOR|E|FUSION]
1 x 15 ml
[IgA/IgG-CONJ|HRP]
Coniugato HRP di montone anti-IgA/IgG umane.
Pronto per l'uso. Colore codificato rosa.
1 x 60 ml
[DIL]
Diluente per siero. Pronto per l'uso. Colore
codificato porpora.
57
IT
1 x 15 ml
[SUBSTRATE|TMB]
Substrato enzimatico TMB. Pronto per l'uso.
Proteggere dalla luce.
1 x 15 ml
[STOP|H2SO4]
Soluzione di arresto. Pronta per l'uso.
2 flacone
[BUF|WASH]
Tampone di lavaggio in polvere. Ricostituire a un
litro ciascuno.
1x
Schede del protocollo
Componenti facoltativi
1 x 60 ml
[BUF|WASH]
Tampone di lavaggio
Ricostituire a un litro.
concentrato
liquido.
Simboli utilizzati sulle etichette
[LOT]
Numero di lotto
[REF]
Numero di catalogo
[IVD]
Uso diagnostico in vitro
e
t
!
s
Utilizzare entro
Limiti di temperatura
Consultare le istruzioni per l'uso
Sufficiente per
Fabbricante
Materiali necessari ma non forniti
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Acqua deionizzata o distillata
Boccetta comprimibile per contenere il tampone di lavaggio diluito
Pipette con capacità di erogazione da 5 µl a 1000 µl
Puntali monouso per pipette
Provette sterili 12 x 75 mm e relativa rastrelliera
Contaminuti
Salviette di carta assorbente
Lettore per micropiastre capace di leggere i valori di assorbanza a 450 nm.
Se è disponibile un lettore per micropiastre a doppia lunghezza d'onda, il
filtro di riferimento deve essere impostato a 600-650 nm
Lavatrice automatica per micropiastre capace di erogare 200 µl
PRELIEVO E MANIPOLAZIONE DEL CAMPIONE
In questa procedura utilizzare solo campioni di siero. I campioni che mostrano
emolisi macroscopica, lipemia o contaminazione microbica possono interferire
con le prestazioni del test e non devono essere utilizzati. Conservare i campioni
a 2-8 °C per una settimana al massimo. Per conservazioni più prolungate,
congelare i campioni di siero. Evitare il congelamento e lo scongelamento
ripetuto dei campioni. Si raccomanda di analizzare i campioni congelati entro un
anno.
58
IT
PROCEDURA
Note sulla procedura
•
•
•
•
•
•
•
•
Prima di iniziare il dosaggio, leggere attentamente il foglio illustrativo del
prodotto.
Tutte le diluizioni dei campioni del paziente vanno preparate prima di iniziare
il dosaggio.
Prima di avviare la procedura del test, attendere che i campioni del paziente
e i reagenti del test raggiungano l'equilibrio a temperatura ambiente. Prima
dell'uso, si consiglia di lasciare i reagenti sul piano di lavoro e fuori dalla
scatola per 30 minuti. Immediatamente dopo l'uso, rimettere in frigorifero tutti
i campioni e i reagenti non utilizzati.
Rimuovere le strisce di micropozzetti necessarie dalla busta e risigillare
accuratamente quest'ultima per evitare la formazione di condensa nei
pozzetti non utilizzati. Rimettere immediatamente la busta in frigorifero.
È fondamentale una tecnica di lavaggio valida. Se il lavaggio viene
effettuato manualmente, è adeguato se viene eseguito dirigendo sull'intera
micropiastra un energico getto di tampone di lavaggio prodotto con una
boccetta di lavaggio a bocca larga. Si raccomanda l'uso di una lavatrice
automatica per micropiastre.
Utilizzare una pipetta multicanale capace di gestire 8 o 12 pozzetti allo
stesso tempo. Questo strumento accelera il lavoro e fornisce tempi di
incubazione più uniformi.
Per tutti i passaggi è importante controllare accuratamente i tempi. L'inizio di
tutti i periodi di incubazione corrisponde al completamento dell'aggiunta del
reagente.
L'aggiunta di tutti i campioni e dei reagenti deve avvenire alla stessa velocità
e con la stessa sequenza.
Metodo del test
Passaggio 1
Passaggio 2
Passaggio 3
Lasciar equilibrare tutti i reagenti e i campioni a temperatura
ambiente.
Etichettare la scheda del protocollo per indicare l'inserimento del
campione nei pozzetti. La buona pratica di laboratorio richiede
l'analisi dei campioni in duplicato.
Per una determinazione qualitativa utilizzare solo il Calibratore
D (flacone con tappo giallo).
oppure
Per una determinazione semiquantitativa utilizzare i calibratori
da A fino a E come illustrato nel seguente schema
esemplificativo.
59
IT
Qualitativa
A
B
C
D
E
F
G
H
Bianco
Controllo
Controllo
Cal
+D
S1
S2
S3
S4
1
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
2
Semiquantitativa
Ecc.
A
B
C
D
E
F
G
H
3
Passaggio 4
Bianco
Controllo
Controllo
Cal
+A
Cal B
Cal C
Cal D
Cal E
1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
2
Ecc.
3
Preparare una diluizione 1:101 dei campioni del paziente
mescolando 5 µl dei sieri del paziente con 500 µl di diluente per
siero.
Passaggio 5 Rimuovere i micropozzetti richiesti dalla busta e rimettere in
frigorifero le strisce non utilizzate nella busta sigillata.
Posizionare perfettamente i micropozzetti nel supporto aggiuntivo
fornito.
Passaggio 6 Pipettare 100 µl dei calibratori pronti all'uso, dei controlli positivo
e negativo e dei campioni del paziente diluiti (1:101) nei
micropozzetti appropriati come indicato nella scheda del
protocollo.
Nota: includere un pozzetto contente 100 µl del diluente per siero
come reagente bianco. Azzerare il lettore ELISA contro il
reagente bianco.
Passaggio 7 Incubare per 30 minuti (± 5 minuti) a temperatura ambiente.
Passaggio 8 Lavare 4 volte con il tampone di lavaggio. Per il lavaggio
manuale, riempire ogni micropozzetto con tampone di lavaggio
ricostituito. Gettare il fluido presente nei pozzetti capovolgendo
questi ultimi e picchiettandone il fondo oppure aspirando il liquido
contenuto. Per asciugare al termine dell'ultimo lavaggio,
capovolgere le strisce e picchiettare energicamente i pozzetti su
salviette di carta assorbente. Per le lavatrici automatiche,
programmare la macchina in base alle istruzioni del produttore.
Passaggio 9 Pipettare 100 µl di coniugato nei micropozzetti.
Passaggio 10 Incubare per 30 minuti (± 5 minuti) a temperatura ambiente.
Passaggio 11 Lavare tutti i micropozzetti come nel Passaggio 8.
Passaggio 12 Pipettare 100 µl di substrato enzimatico in ogni micropozzetto
nello stesso ordine e con gli stessi tempi del coniugato.
Passaggio 13 Incubare per 30 minuti (± 5 minuti) a temperatura ambiente.
Passaggio 14 Pipettare 100 µl di soluzione di arresto in ogni micropozzetto
utilizzando lo stesso ordine e gli stessi tempi del substrato
enzimatico. Leggere i valori di assorbanza entro 30 minuti
dall'aggiunta della Soluzione di arresto.
60
IT
Passaggio 15 Leggere l'assorbanza di ogni micropozzetto a 450 nm utilizzando
un lettore per micropiastre a lunghezza d'onda singola o doppia
(450/630 nm) contro il reagente bianco impostato ad assorbanza
zero.
Controllo di qualità
Inserire in ogni dosaggio i calibratori, i controlli positivo e negativo e il reagente
bianco per verificare l'integrità e l'accuratezza del test. La lettura dell'assorbanza
per il reagente bianco deve essere <0,3. Il calibratore A deve avere una lettura
dell'assorbanza non inferiore a 1, altrimenti il test deve essere ripetuto. Il
controllo negativo deve essere <10 UE/ml. Se il test viene eseguito in duplicato,
calcolare la media di due letture per determinare il valore in UE/ml. Durante
l'esecuzione delle determinazioni qualitative, la densità ottica del calibratore D
deve essere superiore a quella del controllo negativo e inferiore all'assorbanza
del controllo positivo. Per le determinazioni semiquantitative, il controllo positivo
deve fornire valori compresi nell'intervallo dichiarato sul flacone.
RISULTATI
Calcoli
Le concentrazioni dei campioni del paziente possono essere stabilite con uno dei
due metodi seguenti:
1.
DETERMINAZIONE QUALITATIVA
Ass. del campione test
---------------------------- X UE/ml del calibratore D =
Ass. del calibratore D
UE/ml del campione test
Si raccomanda di refertare i risultati qualitativi come "positivi" o "negativi".
Risultati del campione superiori o pari al calibratore D sono considerati
positivi.
2.
DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA
Tracciare su carta millimetrata lineare-logaritmica l'assorbanza dal
calibratore A fino al calibratore E rispetto alle loro concentrazioni. Tracciare
le concentrazioni in UE/ml sull'asse X rispetto all'assorbanza sull'asse Y e
disegnare una curva interpolante punto per punto. Determinare le
concentrazioni dei campioni del paziente dalla curva in base ai valori di
assorbanza corrispondenti. In alternativa, è possibile utilizzare una curva a
quattro parametri per tracciare la curva standard.
Si raccomanda di refertare i risultati semiquantitativi come "positivi",
"negativi" o "indeterminati" con i valori delle unità in UE/ml. In presenza di
risultati indeterminati/borderline, ripetere il test e valutare unitamente ad altri
metodi di laboratorio, come ad esempio i dosaggi per il rilevamento degli
anticorpi anti-EMA e/o anti-gliadina.
61
IT
Interpretazione
le informazioni seguenti servono solo come guida nell'interpretazione dei
risultati di laboratorio. Questi valori sono stati determinati testando 123
donatori di sangue normali e campioni di controllo senza malattia celiaca.
Come cutoff del dosaggio è stata stabilita la media dei soggetti normali più
2,5 DS (deviazione standard) ed è stato assegnato un valore arbitrario di 20
UE/ml. Ogni laboratorio deve determinare i propri valori normali.
Interpretazione dei valori per Celiac Fusion™ Interpretazione
<20 UE/ml
20-25 UE/ml
Negativo
Indeterminato
(borderline)
Positivo
>25 UE/ml
Calibratore
Il kit include calibratori pronti all'uso da usare in ogni sessione analitica per
fornire una determinazione semiquantitativa. Campioni del paziente
contenenti livelli anticorpali elevati possono fornire valori di assorbanza
superiori a quello del calibratore A. Per determinare valori semiquantitativi
accurati, questi campioni devono essere ulteriormente diluiti in modo da
rientrare nell'intervallo della curva del calibratore alla ripetizione del test. Per
determinare i valori UE/ml, moltiplicare le unità ottenute per il fattore di
diluizione.
LIMITI DELLA PROCEDURA
In questa procedura utilizzare solo campioni di siero. I campioni che mostrano
emolisi macroscopica, lipemia o contaminazione microbica possono interferire
con le prestazioni del test e non devono essere utilizzati. Conservare i campioni
a 2-8 °C per una settimana al massimo. Per conservazioni più prolungate,
congelare i campioni di siero. Evitare il congelamento e lo scongelamento
ripetuto dei campioni.
I risultati del test facilitano la diagnosi e devono essere considerati unitamente ad
altri riscontri clinici e di laboratorio.
VALORI PREVISTI
I risultati del test previsti in una popolazione normale sono solitamente negativi.
Tuttavia, dato che l'incidenza della CD nella popolazione normale è di circa l'1%,
alcuni soggetti apparentemente sani e asintomatici possono risultare positivi al
test per gli anticorpi anti-tTG.
L'incidenza e i livelli degli autoanticorpi associati all'enteropatia sensibile al
glutine/CD dipendono dallo stato dietetico. I livelli di questi anticorpi diminuiscono
e finiscono per diventare negativi nei pazienti sotto dieta priva di glutine.
Analogamente, i livelli di questi anticorpi aumentano e possono diventare positivi
quando i pazienti con CD sotto dieta priva di glutine ingeriscono una dieta che lo
18-20
contiene.
I pazienti affetti da CD ma carenti di IgA sono generalmente
positivi per gli anticorpi IgG anti-tTG e anti-gliadina. In questi casi, si possono
condurre studi per confermare la carenza di IgA del paziente.
62
IT
Le serie di campioni clinici sono state testate con il dosaggio ImmuLisa™ Celiac
Fusion™ ELISA. La tabella seguente fornisce i risultati dell'incidenza nelle
popolazioni per questo studio.
Gruppo di pazienti
Malattia associata
Malattia celiaca
Controllo di malattia
Tiroidite di Hashimoto
Malattia mista del tessuto
connettivo
Artrite reumatoide
IMMCO
n pos.
% pos.
n
Scleroderma
Lupus eritematoso sistemico
Vasculite
Soggetti normali
166
157
94,6%
16
8
8
8
16
8
112
0
0
1
0
0
0
6
0,0%
0,0%
12,5%
0,0%
0,0%
0,0%
5,4%
Nota: le popolazioni testate hanno incluso una grande quantità di campioni con
titolo EMA provocatoriamente basso e non riflettono una tipica popolazione con
diagnosi di CD e neppure una tipica popolazione di screening.
CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI
L'utilità dei test ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA è stata valutata testando
campioni di siero positivi per EMA ben caratterizzati da soggetti con CD, accanto
a controlli di malattia e sieri umani "normali". Questi campioni sono stati anche
testati con un dosaggio ELISA per lo screening degli anticorpi anti-tTG e antiDGP commercialmente disponibile. Questi risultati sono riepilogati di seguito.
A. Confronto dei metodi: ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA vs. tTG/DGP
ELISA.
Altro tTG/DGP Screen ELISA
IMMCO
Positivo
Celiac Fusion™ Negativo
Screen ELISA Totale
Positivo
52
2
54
Concordanza percentuale positiva:
Concordanza percentuale negativa:
Concordanza percentuale totale:
Soggetti celiaci positivi per EMA: 57
Controlli di malattia: 20
Soggetti sani normali: 32
Negativo
3
52
55
Totale
55
54
109
96,3% (IC al 95%: da 86,2% a 99,4%)
94,5% (IC al 95%: da 83,9% a 98,6%)
95,4% (IC al 95%: da 89,1% a 98,3%)
B. Reattività crociata: 64 campioni totali con reattività crociata potenziale,
provenienti da soggetti con altri disturbi immunitari o positivi per altri
autoanticorpi, sono stati testati per gli anticorpi anti-tTG utilizzando il dosaggio
ImmuLisa™ Celiac Fusion™.
63
IT
Condizione
Tiroidite di Hashimoto
Malattia mista del tessuto connettivo
Artrite reumatoide
Scleroderma
Lupus eritematoso sistemico16
Vasculite
n
16
8
8
8
0
8
n. positivi
0
0
1
0
Totale
64
1 (1,6%)
0
Precisione
La precisione è stata testata con campioni multipli selezionati attraverso
l'intervallo del dosaggio. Per determinare i risultati tra i giorni sono state eseguite
sessioni di dosaggio multiple. È stata eseguita un'altra sessione di dodici replicati
per determinare la ripetibilità. I risultati sono riepilogati di seguito.
Media
(UE/ml)
Imprecisione
totale
Tra i giorni
DS
Kit
Dosaggio
Celiac
Fusion™
Screen
#
1
2
3
4
5
6
8,0
16,8
27,1
37,9
75,5
151,2
(UE/ml)
0,844
1,406
1,789
1,777
3,297
4,877
DS
CV %
10,5%
8,4%
6,6%
4,7%
4,4%
3,2%
(UE/ml)
0,885
1,387
1,818
1,793
3,368
4,683
Tra le sessioni
(Ripetibilità)
DS
CV %
11,7%
8,5%
6,8%
4,7%
4,4%
3,1%
(UE/ml)
0,503
1,255
1,402
1,753
2,766
4,630
CV %
6,6%
7,6%
5,2%
4,6%
3,6%
3,1%
Riproducibilità
Per determinare la riproducibilità qualitativa, sono stati eseguiti ottanta replicati
dei campioni nell'intervallo negativo, ~20% sotto il cut-off, ~20% sopra il cut-off e
nell'intervallo positivo moderato del dosaggio. Questi campioni sono stati testati
in sessioni multiple. I risultati del dosaggio per ogni campione hanno prodotto
una concordanza qualitativa del 100%.
Limite di rilevamento
Il limite di rilevamento (LoD) è stato determinato in base a 60 replicati del bianco
e 10 replicati ciascuno dei 6 campioni a basso livello (NHS). Il Lod era di 3,0
UE/ml.
Linearità e recupero
La linearità e il recupero sono stati testati diluendo i campioni positivi attraverso
l'intervallo del dosaggio in soluzioni equidistanti e confrontando i risultati reali con
quelli previsti.L’intervallo lineare determinato del dosaggio era di 3,0 (LoD), 160
UE/ml. I risultati sono riepilogati di seguito:
64
IT
Intervallo del
test
(UE/ml)
da 2,9 a 37,4
da 25,3 a 74,5
da 47,7 a 153,9
Pendenza (IC al
95%)
Intercetta Y
(IC al 95%)
1,062
(da 1,007 a
1,117)
0,998
(da 0,907 a
1,090)
1,024
(da 0,861 a
1,187)
-1,907
(da -3,28 a 0,53)
0,603
(da -4,156 a
5,361)
2,049
(da -14,90 a
18,99)
R²
% recupero
(ottenuto/previsto)
1,0
da 97,3 a 114,6
0,99
da 90,3 a 104,7
0,99
da 92,4 a 100,0
Interferenza
L'interferenza è stata studiata mescolando sieri con livelli noti di anticorpi antitTG/DGP con campioni di siero potenzialmente interferenti e studiando la
deviazione dai risultati previsti.
Non è stata dimostrata un'interferenza
significativa per le seguenti sostanze ai livelli indicati: emoglobina (2 g/l),
bilirubina (342 μmol/l), fattore reumatoide (100 UE/ml), trigliceridi (37 mmol/l) e
colesterolo (13 mmol/l).
65
PT
ImmuLisa™
Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
Detecção combinada de anticorpos IgA e IgG contra a transglutaminase
tecidual humana e peptídeos de gliadina desamidada
[IVD] Para utilização diagnóstica in vitro
FOLHETO DO PRODUTO
[REF] 5157
Celiac Fusion™ ELISA
96 Determinações
ÂMBITO DE UTILIZAÇÃO
Teste imuno-enzimático (ELISA) para a detecção qualitativa e semi-quantitativa
de anti-Transglutaminase Tecidual humana (tTG) e peptídeos de gliadina
desamidada (DGP) IgA e IgG no soro humano, para ajudar no diagnóstico da
enteropatia sensível ao glúten / doença celíaca, em conjunto com outros
resultados laboratoriais e clínicos.
RESUMO E EXPLICAÇÃO
A Doença Celíaca (DC) é um distúrbio gastrointestinal auto-imune, que pode
ocorrer em indivíduos geneticamente susceptíveis, sendo despoletada pela
ingestão de grãos que contém glúten, como o trigo, a cevada e o centeio.
Estudos demonstraram que a prevalência da DC é altamente variável. A
prevalência estimada actual da DC é de 1%, com uma série de probabilidade
estatística entre 0.5 – 1.26% na população em geral da Europa e dos EUA. Ao
utilizar métodos sorológicos, a incidência da DC sobre a população em geral é
1,2
de aproximadamente um em 100.
A falha no diagnóstico precoce da DC pode predispor um indivíduo a
3,4
complicações a longo prazo, como a atrofia esplênica e o linfoma intestinal.
Uma dieta sem glúten normaliza a mucosa e ajuda a reduzir o potencial maligno.
O exame histológico da biopsia do intestino delgado permanece o padrão ouro
para diagnosticar a DC, embora possua as suas próprias limitações. Estas
incluem alguns pacientes com DC latente ou inclusivamente activa, que possam
5
ter histopatologia normal.
Os diversos testes sorológicos utilizados no acompanhamento de pacientes
suspeitos de padecerem de DC incluem os testes de anticorpos gliadina (AGA),
DGP, tTG e o endomísio (EMA). Os anticorpos anti-gliadina, DGP e tTG são
detectados através do ELISA, enquanto os EMA são detectados através de
imunofluorescência indirecta. Os EMA constituem indicadores muito específicos
da DC. No entanto, o teste EMA constitui um método de imunohistoquímica que
exige experiência na leitura de reacções de imunofluorescência.6
Tendo em conta que a identificação do tTG como o antígeno endomísio, os
métodos ELISA foram descritos para a detecção de anticorpos no soro de
pacientes com DC. A vantagem do ensaio dos anticorpos anti-tTG consiste no
66
PT
facto de ser automatizável e menos subjectiva que o EMA. A adição de ensaios
com base no DGP revelou resultados prometedores na identificação das
7-13
limitações do painel de ensaios actual.
Por este motivo, diversos laboratórios
optaram por utilizar o anticorpo tTG, a par do anticorpo da gliadina desamidada,
como o melhor método de rastreio. A combinação do tTG e do DGP num ensaio
pode aumentar a sensibilidade ao expor múltiplos epótipos analito,
principalmente em pacientes celíacos com deficiência de IgA. Infelizmente, a
simples adição de DGP ao tTG numa mistura pode aumentar as interacções não
14
específicas ou mascarar os epítopos necessários. Este ensaio utiliza um
antígeno recombinante proprietário, que revela uma proporção pré-determinada
dos epítopos tTG e DGP numa única molécula. Esta abordagem permite a
redução do potencial de mascaramento dos epítopos encontrados nas misturas
de antígenos, melhorando de forma eficaz a reprodutibilidade do ensaio e
minimizando a fixação não específica em controlos de doenças comunicados
15-21
noutros imunoensaios tTG.
O ImmuLisa™ Celiac Fusion™ Screen ELISA é
um imunoensaio único, de elevada especificidade e sensibilidade, destinado à
detecção de anticorpos de isótipos IgA e IgG contra o tTG e DGP, adequado
como rastreio sorológico inicial para a doença celíaca.
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O teste é realizado como um imunoensaio de base sólida. Os micropoços são
revestidos com um antígeno recombinante, contendo epítopos tTG e DGP,
seguido por um passo bloqueador, para reduzir a ligação não específica durante
a realização do ensaio. Os controlos, os calibradores e o soro do paciente são
incubados em poços revestidos com antigénios, permitindo que os anticorpos
específicos presentes no soro se liguem ao antigénio. Os anticorpos não ligados
e as outras proteínas do soro são eliminados através da lavagem dos
micropoços. Os anticorpos ligados são detectados pela adição de uma enzima
conhecida como conjugado IgA/IgG anti-humana aos micropoços. O conjugado
não ligado é eliminado através de lavagem. Posteriormente, é adicionado aos
poços um substrato de uma enzima específica (TMB), sendo a presença de
anticorpos detectada através de uma mudança de cor, produzida pela conversão
do substrato TMB para um produto de reacção colorido. A reacção é
interrompida e a intensidade da mudança de cor, que é proporcional à
concentração de anticorpos, é lida através de um espectrofotómetro a 450 nm.
Os resultados são expressos em unidades ELISA por mililitro (EU/ml) e
comunicados como positivos ou negativos.
REAGENTES
Armazenamento e Preparação
Armazenar todos os reagentes a 2-8°C. Não congelar. Os reagentes são
estáveis até á data de expiração, quando são armazenados e manuseados
conforme as orientações.
Não utilizar reagentes se estes não apresentarem uma cor transparente ou se
houver presença de um precipitado. Todos os reagentes devem ser guardados a
temperatura ambiente (20-25°C) antes da sua utilização.
67
PT
Reconstituir o tampão de lavagem a 1 litro com água destilada ou desionizada.
Quando armazenado a 2-8°C, o tampão de lavagem reconstituído permanece
estável até à data de validade do kit.
As tiras de revestimento dos micropoços destinam-se a uma única utilização. As
tiras dos micropoços não utilizadas devem ser cuidadosamente novamente
seladas na bolsa com dessecantes, a fim de prevenir a condensação e ser
armazenadas a 2-8°C.
Precauções
Todos os componentes humanos utilizados foram testados para HBsAg, HCV,
HIV-1 e 2 e HTLV-I e considerados negativos pelos testes exigidos pela FDA. No
entanto, os derivados do sangue humano e as amostras de pacientes devem ser
consideradas potencialmente infecciosos. Devem ser cumpridas as boas
práticas laboratoriais de armazenamento, distribuição e eliminação destes
.24
materiais
A solução de paragem é uma solução diluída de ácido sulfúrico. O ácido
sulfúrico (H2SO4) é venenoso e corrosivo. Não ingerir e evitar o contacto com a
pele e olhos. Evitar a exposição a bases, metais ou outros compostos que
possam reagir com ácidos.
O Substrato Enzimático TMB contém um irritante que pode ser nocivo se
inalado, ingerido ou absorvido através da pele. Não ingerir e evitar o contacto
com a pele e olhos.
As instruções devem ser seguidas exactamente conforme constam no
presente folheto deste kit, a fim de assegurar resultados válidos. Não trocar
os componentes do kit com componentes provenientes de outras fontes. Devem
ser cumpridas as boas práticas laboratoriais, a fim de minimizar a contaminação
microbiana e cruzada dos reagentes aquando do seu manuseamento. Não
utilizar os componentes do kit para além da data de validade impressa nas
etiquetas.
Material fornecido
ImmuLisa™ Celiac Fusion™ tTG/DGP ELISA
[REF] 5157
O kit contém reagentes suficientes para realizar 96 determinações
12 x 8
[MICROPLATE|FUSION]
Microplaca
com
micropoços
individuais
separados. Revestida com antígeno recombinante
tTG/DGP. Pronto a utilizar,
1 x 1.75 ml
[CONTROL|+|FUSION]
Controlo Positivo (tampa vermelha) pronto a
utilizar. Contém soro humano positivo para
anticorpos tTG e DGP. A faixa de concentração
esperada em EU/ml está impressa na etiqueta.
1 x 1.75 ml
[CONTROL|-]
Controlo Negativo pronto a utilizar (tampa
branca). Contém soro humano.
68
PT
5 x 1.75 ml
[CALIBRATOR|A|FUSION]
[CALIBRATOR|B|FUSION]
[CALIBRATOR|C|FUSION]
[CALIBRATOR|D|FUSION]
[CALIBRATOR|E|FUSION]
Conjunto de 5 Calibradores pronto a utilizar.
Calibrador A (tampa verde) 160 EU/ml, Calibrador
B (tampa violeta) 80 EU/ml, Calibrador C (tampa
azul) 40 EU/ml, Calibrador D (tampa amarela) 20
EU/ml e Calibrador E (tampa laranja) 1 EU/ml.
Derivado do soro humano contendo anticorpos
tTG E DGP. As concentrações em EU/ml estão
impressas nas etiquetas.
1 x 15 ml
[IgA/IgG-CONJ|HRP]
Conjugado HRP de cabra IgA/IgG anti-humano.
Pronto a utilizar, Código de cor rosa.
1 x 60 ml
[DIL]
Diluente de Soro. Pronto a utilizar, Código de cor
púrpura.
1 x 15 ml
[SUBSTRATE|TMB]
Substrato enzimático TMB Pronto a utilizar,
Proteger da luz.
1 x 15 ml
[STOP|H2SO4]
Solução de Paragem. Pronta a utilizar,
2
x
ampolas
[BUF|WASH]
Tampão de Lavagem de Pó. Reconstituir para
um litro cada.
1x
Folhas de Protocolo.
Componentes Opcionais
1 x 60ml
[BUF|WASH]
Tampão de Lavagem líquido
Reconstituir para um litro.
concentrado.
Símbolos utilizados nas etiquetas
[LOT]
Número de lote
[REF]
Número de catálogo
[IVD]
Utilização diagnóstica in vitro
e
t
!
s
Utilização por
Temperatura de armazenamento
Ler as instruções antes de utilizar
Número de testes
Fabricante
Material Exigido Mas Não Fornecido
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Água desionizada ou destilada
Garrafa de plástico para conter o tampão de lavagem diluído
Pipetas com capacidade de libertação de 5 µl a 1000 µl
Pontas de pipeta descartáveis
Tubos de ensaio limpos de 12 x 75 mm e suporte para tubo de ensaio
Temporizador
Toalhetes de papel absorventes
Leitor de microplacas capaz de ler valores de absorvância a 450 nm. Se
estiver disponível um leitor de microplacas de duplo comprimento de onda,
o filtro de referência deve ser definido para 600-650 nm
Lavador automático de microplacas capaz de distribuir 200 µl
69
PT
RECOLHA E MANUSEAMENTO DE AMOSTRAS
Neste procedimento só deverão ser utilizadas amostras de soro. As amostras
excessivamente hemolizadas, lipémicas ou contaminadas microbiologicamente
podem interferir nos resultados do teste, não devendo ser utilizadas. Armazenar
as amostras a uma temperatura entre 2°a 8°C durante o máximo de uma
semana. Para um armazenamento de maior duração, as amostras de soro
deverão ser congeladas Evitar o repetido congelamento e derretimento das
amostras. Recomenda-se que as amostras congeladas sejam testadas no prazo
de um ano.
PROCEDIMENTO
Notas de Procedimento
•
•
•
•
•
•
•
•
Ler cuidadosamente o folheto do produto antes de iniciar o ensaio
Todas as diluições das amostras dos pacientes devem ser preparadas
antes de iniciar o ensaio
Permitir que as amostras dos pacientes e os reagentes de teste se
equilibrem a temperatura ambiente antes de iniciar o procedimento de teste.
Sugere-se que os reagentes sejam deixados em cima da bancada, no
exterior da caixa, durante 30 minutos antes da sua utilização. Voltar a
colocar todas as amostras e reagentes no frigorífico imediatamente após a
sua utilização.
Eliminar as tiras necessárias dos micropoços da embalagem, voltando a
fechá-la cuidadosamente, a fim de prevenir a condensação dos poços não
utilizados. Voltar a colocar a embalagem de imediato no frigorífico.
Uma boa técnica de lavagem é fundamental. Se a lavagem for realizada
manualmente, consegue-se uma lavagem adequada direccionando o fluxo
energético do tampão de lavagem por toda a microplaca, através de um
frasco de lavagem de ponta larga. Recomenda-se a utilização de uma
lavadora automática de microplacas.
Utilizar uma pipeta multicanal capaz de libertar 8 ou 12 poços em
simultâneo. Este procedimento acelera o processo, fornecendo tempos de
incubação mais uniformes.
È importante o controlo cuidadoso do tempo para todos os passos. O início
de todos os períodos de incubação começa com a conclusão da adição do
reagente.
A adição de todas as amostras e reagentes deve ser realizada na mesma
proporção e na mesma sequência.
Método de Teste
1º Passo
2º Passo
Permitir que todos os reagentes e amostras se equilibrem a uma
temperatura ambiente
Etiquetar folha de protocolo indicando a colocação da amostra nos
poços. A execução das amostras em duplicado constitui uma boa
prática laboratorial.
70
PT
3º Passo
Para obter uma determinação qualitativa utilizar apenas o
Calibrador D (ampola com tampa amarela).
ou
Para uma determinação semi-quantitativa utilizar os
Calibradores A até E, conforme se descreve no esquema de
amostras seguinte.
Qualitativa
A
B
C
D
E
F
G
H
4º Passo
5º Passo
6º Passo
7º Passo
8º Passo
9º Passo
10º Passo
11º Passo
12º Passo
13º Passo
Branco
+
Controlo
Cal D
Controlo
S1
S2
S3
S4
1
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
2
Semi-quantitativa
Etc.
A
B
C
D
E
F
G
H
3
Branco
+
Controlo
Cal A
Controlo
Cal B
Cal C
Cal D
Cal E
1
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
2
Etc.
3
Preparar uma diluição 1:101 das amostras dos pacientes,
misturando 5 µl do soro do paciente com 500ul de Diluente de
Soro.
Remover os micropoços necessários da embalagem, recolocando
as tiras não utilizadas na embalagem fechada, colocada no
frigorífico. Colocar os micropoços com firmeza no suporte extra
fornecido.
Pipetar 100 µl de Calibradores prontos a utilizar, controlos Positivo
e Negativo e amostras de pacientes diluídas (1:101) nos
micropoços apropriados, conforme a folha de protocolo.
Nota: Incluir um poço que contenha 100 µl do Diluente de Soro
como um reagente branco. Ajustar o leitor de ELISA para zero em
relação ao reagente branco.
Incubar durante 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente.
Lavar 4x com tampão de lavagem. Para lavagem manual, encha
cada micropoço com tampão de lavagem reconstituído. Descartar
o líquido por inversão retirando os conteúdos de cada poço ou
aspirando o líquido de cada poço. Para absorver o líquido da última
lavagem, inverter as tiras e limpar os poços, vigorosamente, com
toalhas de papel absorvente. Para lavadores automáticos,
programar o lavador conforme as instruções do fabricante.
Pipetar 100 µl de Conjugado nos micropoços.
Incubar durante 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente.
Lavar todos os micropoços conforme descrito no 8º Passo.
Pipetar 100 µl de Substrato Enzimático em cada micropoço, na
mesma ordem e timing utilizados para o Conjugado.
Incubar durante 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente.
71
PT
14º Passo
Pipetar 100 µl de Solução de Paragem em cada micropoço,
utilizando a mesma ordem e tempo utilizados na adição do
Substrato Enzimático. Ler os valores de absorvância, no espaço de
30 minutos, da adição da solução de paragem.
15º Passo Ler a absorvância de cada micropoço a 450 nm, utilizando um
único, ou, a 450/630nm, utilizando um leitor de microplacas de
duplo comprimento de onda contra o reagente branco fixado em
absorvância zero.
Controlo de Qualidade
Os Calibradores, os Controlos Positivos e Negativos e um reagente branco
devem ser executados em cada ensaio, a fim de verificar a integridade e a
precisão do teste. A leitura de absorvância do reagente branco deve ser <0.3. O
Calibrador A deve possuir uma leitura de absorvância não inferior a 1.0, caso
contrário, o teste deve ser repetido. O controlo negativo deve ser <10 EU/ml. Se
o teste for realizado em duplicado, deve ser retirada a média das duas leituras, a
fim de determinar EU/ml. Quando se realizam determinações Qualitativas, a
densidade óptica do Calibrador D deve ser superior à do controlo negativo e
inferior à absorvância do controlo positivo. Para as determinações semiquantitativas, o controlo positivo deve apresentar valores na range indicada na
ampola.
RESULTADOS
Cálculos
As concentrações das amostras do paciente podem ser determinadas por
qualquer um dos seguintes métodos:
1.
DETERMINAÇÃO QUALITATIVA
Abs. da Amostra de Teste
---------------------------- X EU/ml do Calibrador D =
Abs. do Calibrador D
EU/ml Amostra de Teste
Recomenda-se que os resultados qualitativos sejam comunicados como
“positivos” ou “negativos”. Os resultados das amostras superiores ou iguais
ao Calibrador D são considerados positivos.
2.
DETERMINAÇÃO SEMI-QUANTITATIVA
Traçar a absorvância do Calibrador A até E, consoante as respectivas
concentrações em papel gráfico de registo linear. Traçar as concentrações
em EU/ml no eixo X, consoante a absorvância no eixo Y, e desenhar uma
curva que ligue os pontos. Determinar as concentrações das amostras do
paciente a partir da curva, de acordo com os valores de absorvância
correspondentes. Em alternativa, pode ser utilizada uma curva de quatro
parâmetros para traçar uma curva padrão. Recomenda-se que os
resultados semi-quantitativos sejam relatados como “positivos,” “negativos,”
ou “indeterminados” com valores unitários de EU/ml. Os resultados
indeterminados/linha divisória devem ser novamente testados e avaliados a
par de outros métodos laboratoriais, como os ensaios para a detecção de
anticorpos EMA e/ou Gliadina.
72
PT
Interpretação
O seguinte serve apenas como orientação para a interpretação dos
resultados laboratoriais. Estes valores foram determinados, testando 123
dadores de sangue normal e amostras sem controlo da doença celíaca. A
média dos indivíduos normais mais 2.5 SD foi estabelecida como o corte do
ensaio e foi atribuído um valor arbitrário de 20 EU/ml. Cada laboratório deve
determinar os seus próprios valores normais.
Celiac Fusion™ Value
Interpretação
<20 EU/ml
20-25 EU/ml
>25 EU/ml
Negativo
Indeterminado (Linha
Divisória)
Positivo
Calibrador
São incluídos Calibradores Prontos a Utilizar para fornecer a semiquantificação, devendo ser utilizados em cada ensaio. As amostras de
pacientes que contenham elevados níveis de anticorpos podem apresentar
valores de absorvância superiores aos do Calibrador A. Para determinar
valores semi-quantitativos rigorosos, essas amostras devem ser ainda
diluídas de modo a recaírem na série da curva do calibrador quando forem
novamente testadas. Para determinar valores EU/ml, multiplicar as unidades
obtidas pelo factor de diluição.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Neste procedimento só deverão ser utilizados amostras de soro. As amostras
excessivamente hemolizadas, lipémicas ou contaminadas microbiologicamente
podem interferir nos resultados do teste, não devendo ser utilizadas. Armazenar
as amostras a uma temperatura entre 2°a 8°C durante o máximo de uma
semana. Para um armazenamento de maior duração, as amostras de soro
deverão ser congeladas. Evitar o repetido congelamento e derretimento das
amostras.
Os resultados do teste servem como um apoio ao diagnóstico e devem ser
considerados em conjunto com outras descobertas laboratoriais e clínicas.
VALORES ESPERADOS
Numa população normal, espera-se que os resultados do teste sejam negativos.
No entanto, como a incidência da DC na população normal é de cerca de 1%,
alguns indivíduos aparentemente saudáveis e assintomáticos podem apresentar
testes positivos para anticorpos tTG.
A incidência e os níveis de auto-anticorpos associados à enteropatia sensível ao
glúten / CD dependem da situação da dieta. Os níveis destes anticorpos
diminuem e tornar-se-ão eventualmente negativos em pacientes com DC que
pratiquem uma dieta sem glúten. Da mesma forma, os níveis destes anticorpos
irão aumentar e muitos tornar-se-ão positivos, quando os pacientes com DC,
18que tenham praticado uma dieta sem glúten realizarem uma dieta com glúten.
20
Os pacientes que padecem de DC, mas que tenham deficiência de IgA, serão
73
PT
geralmente positivos para anticorpos IgG para tTG e gliadina. Nesses casos,
podem ser realizados testes para confirmar se o paciente tem falta de IgA.
Foram testados conjuntos de amostras clínicas pelo ImmuLisa™ Celiac
Fusion™ ELISA. Os resultados que demonstram a incidência deste estudo na
população são seguidamente apresentados.
Grupo de Pacientes
Associação de Doenças:
Doença Celíaca
Controlo de Doenças
Tireoidite de Hashimoto
Doença Mista do Tecido
Conjuntivo
Artrite Reumatóide
Esclerodermia
Lúpus Eritematoso Sistémico
Vasculite
Saudáveis normais
IMMCO
n Pos
% Pos
n
166
157
94,6%
16
8
8
8
16
8
112
0
0
1
0
0
0
6
0,0%
0,0%
12,5%
0,0%
0,0%
0,0%
5,4%
Nota: A população testada incluiu um elevado número de amostras com
desafiadoras soluções reduzidas de EMA, não reflectindo uma população
tipicamente diagnosticada com DC num típico rastreio populacional.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
A utilidade da ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA foi avaliada ao testar
amostras de soro EMA positivas bem caracterizadas de sujeitos suspeitos de
DC, a par de controlos de doenças e de soro humano “normal”. Estas amostras
foram igualmente testadas nos testes comercialmente disponíveis de tTG/DGP
Antibody Screen ELISA. Estes resultados são seguidamente resumidos.
A. Método Comparativo: ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA vs. outro tTG/DGP
screen ELISA.
Outro tTG/DGP Screen ELISA
IMMCO
Positivo
Celiac Fusion™ Negativo
ELISA
Total
Positivo
52
2
54
Negativo
3
52
55
Total
55
54
109
Acordo percentual positivo:
96,3% (95% CI 86,2% a 99,4%)
Acordo Percentual Negativo:
94,5% (95% CI 83,9% a 98,6%)
Acordo Percentual Global:
95,4% (95% CI 89,1% a 98,3%)
Indivíduos positivos em celíaca EMA: 57
Controlos da Doença: 20
Indivíduos Saudáveis Normais: 32
74
PT
B. Reactividade Cruzada: Foi testado um total de amostras 64 com potencial de
reactividade cruzada de indivíduos com outros distúrbios auto-imunes ou
positivos para outros auto-anticorpos foram testadas para os anticorpos
tTG/DGP, utilizando o sistema ImmuLisa™ Celiac Fusion™ ELISA.
Condição
Tireoidite de Hashimoto
Doença Mista do Tecido Conjuntivo
Artrite Reumatóide
Esclerodermia
Lúpus Eritematoso Sistémico16
Vasculite
n
16
8
8
8
0
8
n Positivo
0
0
1
0
Total
64
1 (1,6%)
0
Precisão
A precisão foi testada com múltiplas amostras seleccionadas ao longo de todo o
intervalo de ensaio. Foram realizados três ensaios em dias diferentes, a fim de
determinar resultados entre dias. Foi realizada uma experiência adicional de
doze réplicas, a fim de determinar a repetitibilidade. Os resultados são
seguidamente resumidos.
Média
(EU/ml)
Imprecisão Total
Entre dias
SD
Kit
Celiac
Fusion™
Screen
Assay
#
1
2
3
4
5
6
8,0
16,8
27,1
37,9
75,5
151,2
(EU/ml)
0,844
1,406
1,789
1,777
3,297
4,877
SD
CV%
10,5%
8,4%
6,6%
4,7%
4,4%
3,2%
(EU/ml)
0,885
1,387
1,818
1,793
3,368
4,683
Na experiência
(Repetitibilidade)
SD
CV%
11,7%
8,5%
6,8%
4,7%
4,4%
3,1%
(EU/ml)
0,503
1,255
1,402
1,753
2,766
4,630
CV%
6,6%
7,6%
5,2%
4,6%
3,6%
3,1%
Reprodutibilidade
Foram realizadas oitenta réplicas de amostras na série negativa, ~20% abaixo
do corte, ~20% acima do corte e na série positiva moderada do ensaio, para
determinar a reprodutibilidade qualitativa. Estas amostras foram testadas em
múltiplos ensaios. Os resultados dos ensaios para cada amostra produziram
100% de concordância qualitativa.
Limite de Detecção
O limite de detecção (LoD) foi determinado com base em 60 réplicas das
amostras em branco e em 10 réplicas de cada uma das 6 amostras de baixo
nível (NHS). O LoD foi de 3,0 EU/ml.
75
PT
Linearidade e Recuperação
A linearidade e a recuperação foram testadas mediante diluição das amostras
positivas através da série de ensaio em diluições equidistantes e comparando os
resultados actuais e esperados. A série linear dos ensaios foi determinada como
3,0 (LoD) – 160 EU/ml. Os resultados são seguidamente resumidos.
Teste Série
(EU/ml)
2,9 to 37,4
25,3 a 74,5
47,7 a 153,9
Inclinação
(95% CI)
1,062
(1,007 a 1,117)
0,998
(0,907 a 1,090)
1,024
(0,861 a 1,187)
Y-intercepção
(95% CI)
-1,907
(-3,28 a -0,53)
0,603
(-4,156 a 5,361)
2,049
(-14,90 a 18,99)
1,0
% de Recuperação
(obtida/prevista)
97,3 a 114,6
0,99
90,3 a 104,7
0,99
92,4 a 100,0
R²
Interferência
A interferência foi estudada, misturando o soro com os níveis conhecidos de
anticorpos tTG/DGP com amostras de soro potencialmente interferentes, e
estudando o desvio dos resultados previstos. Não foi demonstrada interferência
significativa para as seguintes substâncias nos níveis indicados: Hemoglobina (2
g/L), Bilirrubina (342 µmol/L), Factor Reumatóide (100 EU/ml), Triglicéridos (37
mmol/L) e Colesterol (130 mmol/L).
76
REFERENCES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Dubé C. et al. Gastroenterology. 2005; 128 (Suppl. 1), S57–S67.
Fasano A et al. Arch Intern Med. 2003; 163:286-292.
Carpenter H et al. Gastroenterology. 1995; 108:917-924.
Catassi C et al. JAMA. 2002; 287:1413-1419.
Kurpa K et al. Gastroenterology. 2009; 136: 816-823.
Rosario D et al. J. Pediatr Gastroenterol Nutr. 1998; 27:191-195.
Mothes T. Adv Clin Chem. 2007; 44:35-63.
Kaukinen K et al. Scand J Gastroenterol. 2007; 42:1428-33.
Schwertz E et al. Clin Chem. 2004; 50: 2370-5.
Rashtak S et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2008; 6:426-32
Volta U et al. Dig Dis Sci. 2007; 3:1582-8.
Ankelo M et al. Clin Exp Immunol. 2007; 150: 285-293.
Bansal A et al. Annals NY Acad Sci. 2009.
Ndifon W et al. PNAS. 2009; 106:8701-8706
Sárdy M et al. Clin Chim Acta. 2007;376:126-35;
Song KS et al. Yonsei Med J. 2004; 45:960-2..
Bizzaro N et al. J Clin Lab Anal. 2006; 20:184-9.
Villalta D et al. Clin Chim Acta. 2005; 356:102-09.
Korponay-Szabo IR et al. Gut. 2003; 52:1567-1571.
Sulkanen S et al. Gastroenterology. 1998; 115:1322-1328.
Dietrich W et al. Gastroenterology. 1998; 115:1317-1321.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control
National Institutes of Health; 1993 (HHS Pub No [CDC] 93-8395).
77
78
79
For technical assistance please contact:
IMMCO Diagnostics, Inc.
60 Pineview Drive
Buffalo, NY 14228-2120
Telephone:
(716) 691-0091
Fax:
(716) 691-0466
Toll Free USA/Canada:
1-800-537-TEST
E-Mail: [email protected]
or your local product distributor
|
EMERGO Group, Inc.
Molenstraat 15, 2513 BH, The Hague,
The Netherlands
Tel (+31) 345 8570, Fax (+31) 346 7299
www.emergogroup.com
DEC2011
Document No. PI5157
80

Κυρία Μέρκελ, σταματήστε πια με τις προσπάθειες

Συμβουλευτείτε το Φύλλο Οδηγιών Χρήσης

εδώ

Untitled

CAMPING ALIKES AMMOULIANI TEL : +30.23770.51.379

περισσότερα

Preuzmi Brošuru

ArtScient_Efficacia e sicurezza di Optive Fusion in pazienti

PAS Scuola Primaria ELENCHI DEFINITIVI CANDIDATI AMMESSI

LISTINO PREZZI PRICE LIST LISTINO AL PUBBLICO

Mappa classificazione sismica in pdf