ΘΕΜΕΛΙΩΣΗ ΤΗΣ «ΚΛΑΣΣΙΚΗΣ» ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ, ΤΟΥΣ ΦΑΓΟΥΣ ΚΑΙ ΤΟΥΣ ΜΥΚΗΤΕΣ 1941-45, G. Beadle/E. Tatum – Βιοχημική Γενετική - Τροφικές μεταλλάξεις στην N. crassa: γονίδια και μεταβολικές αντιδράσεις: ΕΝΑ ΓΟΝΙΔΙΟ Æ ΕΝΑ ΕΝΖΥΜΟ. Ένωση γενετικής, βιοχημείας, μικροβιολογίας. Μεταλλάξεις στα βακτήρια, γραμμική διάταξη βακτηριακών γονιδίων (χρωμόσωμα;). S. Luria, M. Delbrück. 1944, O. Avery, C. McLeod, M. McCarty – Μετασχηματισμός DNA: Φορέας γενετικής πληροφορίας και όχι το «ηλίθιο» μόριο (Dulbruck). Το DNA πια εκπροσωπεί τη γενετική οντότητα που είχε ανακαλύψει ο Mendel. Σεξουαλικότητα βακτηρίων (Streptococcus). 1950, Ε. Chargaff – Ποικιλότητα του DNA λόγω διαφορετικής σύστασης πουρινών, Α=Τ, G=C. 1952, A. Hershey, M. Chase – Ο ρόλος του DNA στη μόλυνση βακτηρίων από φάγους (Τ2). Ανακάλυψη σύζευξης, μεταγωγής (J. Lederberg, E. Tatum, N. Zinder). E. Wollman – Διακοπτόμενη σύζευξη, χαρτογράφηση του βακτηριακού χρωμοσώματος. J. Watson, F. Crick, M. Wilkins – Μοριακή δομή του DNA. Η διπλή έλικα και η σημασία της συμπληρωματικότητας. Αντιγραφή, μεταλλάξεις, μεταγραφή, ανασυνδυασμός, μεντελική οντότητα Æ γονίδιο Æ DNA Æ διάταξη πουρινών, χημικός κώδικας με την μορφή αλφαβήτου. Γονίδιο = Φράση. O ιδιαίτερος ρόλος της R. Franklin 1951 – 1958. Ανακάλυψη του RNA και προσδιορισμός μοριακής δομής πρωτεΐνης (ινσουλίνη) – F. Sanger. Gamow-υπόθεση γεν. κώδικα. M. Meselson & F. Stahl-αντιγραφή DNA Ένα γονίδιο Æ Μια πρωτεΐνη. Σχέση ανάμεσα σε δύο γραμμικά πολυμερή. Αλφάβητο 4 γραμμάτων Æ αλφάβητο 20 γραμμάτων Æ τελική δομή («ιδεογράμματα»). Ρόλος ριβοσωμάτων (F. Crick) 1961 – Η χρυσή χρονιά .... και η Γαλλική Σχολή Αγγελιοφόρο RNA, ο «ασύλληπτος» συνδετικός κρίκος – F. Jacob, S. Brenner, M. Meselson, F. Gros, S. Spegelman: ετερόδιπλο mRNA : DNA μόριο. Κεντρικό Δόγμα Μοριακής Βιολογίας ÆmRNAÆπρωτεΐνη – F. Crick Ο Γενετικός κώδικας. M. Nirenberg, J. Matthei, S. Brenner, S. Benzer, F. Crick, C. Barnett, R. Watts-Tobin. PolyU = F - F – F… Γονιδιακή ρύθμιση. A. Lwoff, F. Jacob, J. Monod Η ΔΕΥΤΕΡΗ ΕΠΑΝΑΣΤΑΣΗ (70’s-80’s) Ανακάλυψη ενζύμων τροποποίησης του DNA: περιοριστικά ένζυμα, λιγάσες, πολυμεράσες, μεθυλάσες, φωσφατάσες, κινάσες, κλπ. Χρήση πλασμιδίων ή φάγων ως φορέων γονιδίων. Μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων. Μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχιών DNA. Αντισώματα. Η ΤΡΙΤΗ ΕΠΑΝΑΣΤΑΣΗ (80’s-00’s) Τaq Πολυμεράση και PCR Αυτοματοποιημένες τεχνικές Γονιδιωματική-Πρωτεωμική–Βιοπληροφορική ΝΕΕΣ ΑΝΑΚΑΛΥΨΕΙΣ Μωσαϊκή δομή ευκαρυωτικών γονιδίων, κυτταρικός κύκλος, ενδοκυτταρική μεταφορά, ομοιότητα μηχανισμών, γονιδιακή ρύθμιση από απόσταση, η θεωρεία του μοριακού μαστορέματος, διπλασιασμός γονιδίων, πρωτεΐνες μωσαϊκού τύπου, μεταθετά και ρετρομεταθετά στοιχεία, ογκογονίδια, ρετροιοί, λεπτομερής δομή πρωτεϊνών μέσω αναλύσεων κρυσταλλογραφίας και NMR, νουκλεοπρωτεΐνες, η σημασία της χρωματίνης, πολυπλοκότητα ρυθμιστικών κυκλωμάτων, τελομερή, ο αναδυόμενος ρόλος των μικρών RNA στο γονιδίωμα των θηλαστικών, κρυσταλλογραφία διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, RNAi, κλπ, κλπ. ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ 1. Μεταγραφική ρύθμιση Ι - έλεγχος δράσης του υποκινητή – ταχύτητα παραγωγής mRNA. 2. 3. Μεταγραφική ρύθμιση ΙΙ - Μηχανισμός «εξασθένησης» παραγωγής mRNA. Μεταγραφική ρύθμιση ΙΙΙ - Εναλλακτικοί παράγοντες σ – έλεγχος δράσης της πολυμεράσης. 4. Μεταγραφική ρύθμιση ΙV - Μεταγραφική ρύθμιση μέσω μεταθετών στοιχείων. 5. Μετα-μεταγραφική ρύθμιση – Ελεγχος σταθερότητας mRNA – Αποικοδόμηση mRNA-Δευτεροταγείς δομές mRNA . 6. Μεταφραστική ρύθμιση (tRNA, frameshifting, εξασθένηση). 7. Μετα-μεταφραστική ρύθμιση – (Φωσφορυλίωση). 8. Επιγενετικά φαινόμενα - Μεθυλίωση του DNA ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ... μια ανασκόπηση Μια μεταγραφική οντότητα (γονίδιο) αποτελείται από το DNA μεταξύ του «υποκινητή», όπου αρχίζει η μεταγραφή, και της «απόληξης» (terminator), όπου τερματίζεται η μεταγραφή. Το DNA χρησιμεύει σαν εκμαγείο για την σύνθεση του RNA. Το υβρίδιο DNA-RNA είναι μικρό (2-3 ζβ) και παροδικό. Το ολοένζυμο RNA polymerase, α2ββ΄, είναι υπεύθυνο για την σύνθεση (επιμήκυνση) του RNA. Ο παράγοντας «σ» είναι απαραίτητος για το στάδιο της «έναρξης» μέσω της «αναγνώρισης» του υποκινητή. Ο πυρήνας του ενζύμου α2ββ΄ έχει γενική συνάφεια για το DNA αλλά ο «σ» μειώνει την μη-εξειδικευμένη δέσμευση σε «τυχαίο» DNA, αλλά αυξάνει την συνάφεια της πολυμεράσης για υποκινητές. Οι βακτηριακοί υποκινητές χαρακτηρίζονται από δύο συντηρημένες αλληλουχίες στις θέσεις –35 (TTGACA) και –10 (TATAAT) σχετικά με το σημείο έναρξης της μεταγραφής. Η πολυμεράση «προσγειώνεται» στην –35 και «απλώνεται» πέρα από την –10. Καλύπτει 77 ζβ. Το αρχικό «κλειστό» δυαδικό σύμπλοκο γίνεται «ανοικτό» τήκοντας μια περιοχή 12 ζβ από το –10 ώς το +2. Πολλαπλοί κύκλοι «ανεπιτυχούς» έναρξης που ελευθερώνουν μεταγραφήματα 2-9 ζβ προηγούνται της κανονικής έναρξης. Ο παράγοντας «σ» απελευθερώνει και το ένζυμο «συστέλλεται» σε 50 ζβ, κινείται κατά μήκος του DNA και συνθέτει RNA. Το ένζυμο συστέλλεται σε 30-40 ζβ όταν η νέα αλυσίδα RNA είναι 15-20 β. Το ένζυμο προχωρά μ’ έναν μηχανισμό συστολής – διαστολής όπου το πίσω μέρος του προχωρά 1 ζβ ενώ το πρόσθιο μέρος του παραμένει σταθερό για 7-8 ζβ που θα έχει κινηθεί το πίσω μέρος. Εάν συμβεί κάτι το «ασυνήθιστο», η πολυμεράση καταστρέφει το RNA και ξαναρχίζει. Η μεταγραφή τερματίζεται στην «απόληξη» και το DNA επανακτά την δομή της διπλής έλικας. Η «δύναμη» του υποκινητή περιγράφει την συχνότητα με την οποία η RNA πολυμεράση αρχίζει την μεταγραφή. Εξαρτάται από τις αλληλουχίες στις θέσεις – 35 ή –10 –εάν είναι ιδανικές- και από αλληλουχίες καθοδικά του σημείου έναρξης. Ο βαθμός υπερελίκωσης του DNA, διαφορετικοί παράγοντες «σ», και ρυθμιστικές πρωτεΐνες επηρεάζουν την δράση της πολυμεράσης. Ο τερματισμός της μεταγραφής γίνεται σε δύο ειδών θέσεις. Στην «ενδογενή απόληξη» περιοχές GC σχηματίζουν δομή φουρκέτας που ακολουθείται από μία σειρά U(T). Στην «ρ-εξαρτώμενη απόληξη» ο παράγων «ρ» αναγνωρίζει μία περιοχή 50-90 ζβ, πριν το σημείο τερματισμού, πλούσια σε C και φτωχή σε G. H αντίδραση του τερματισμού απαιτεί υδρόλυση ΑΤΡ. Οι παράγοντες Nus αυξάνουν την δράση του παράγοντα «ρ» και αποτελούν στόχους «αντι-αποληκτικών» παραγόντων. Οι παράγοντες «σ» και Nus είναι ανταγωνιστικοί και δεν συνυπάρχουν ποτέ στην RNA πολυμεράση. Η ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ H ΕΚΦΡΑΣΗ ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΣΥΝΕΧΗΣ («ΣΥΣΤΑΤΙΚΗ») Τα γονίδια «ανάβουν» και «σβήνουν» σε απόκριση σε φυσιολογικά και αναπτυξιακά σήματα. Οι μηχανισμοί ρύθμισης ενσωματώνονται σε αλληλοεξαρτώμενα «κυκλώματα» τα οποία εξασφαλίζουν ότι ομάδες γονιδίων θα τεθούν σε λειτουργία ή σε αδράνεια με την σειρά που πρέπει. Η σημασία του χρόνου στην γονιδιακή έκφραση της ανάπτυξης. ΟΠΕΡΟΝΙΑ Τα βακτηριακά γονίδια κοινών μεταβολικών οδών συχνά σχηματίζουν οπερόνια (συνεργιώματα) που εμπεριέχουν όλα τα γονίδια που κωδικεύουν μεταφορείς και ένζυμα για τον καταβολισμό ή αναβολισμό μιας ουσίας. Αποτέλεσμα της έκφρασης ενός οπερονίου είναι ένα «πολυσιστρονικό» mRNA που «ωριμάζει» σε αυτόνομα RNA για κάθε γονιδιακό προϊόν. Η οπερονική οργάνωση εξυπηρετεί την συνδυασμένη ρύθμιση γονιδίων που εμπλέκονται σε μια κυτταρική λειτουργία. ΚΥΡΙΟΙ ΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ: ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ –ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ-XEΙΡΙΣΤΕΣ Η μεταγραφή ρυθμίζεται από την αλληλεπίδραση «ρυθμιστικών πρωτεϊνών» (transπαράγοντες) και «χειριστών» (θέσεις cis). Μια ρυθμιστική πρωτεΐνη μπορεί να ρυθμίζει πολλά γονίδια και με διαφορετικό αποτέλεσμα. Οι χειριστές επηρεάζουν μόνο τα γονίδια που βρίσκονται δομικά συνδεδεμένα με αυτούς. ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΔΟΜΙΚΏΝ (S) ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ (R) ΓΟΝΙΔΙΩΝ R O S (-/+) Επαγωγέαςαναστολέας Τέσσερα βασικά συστήματα ρύθμισης PCI, NCI, PCR, NCR ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ Οι ρυθμιστικοί αναστολείς παρεμποδίζουν την RNA πολυμεράση είτε στην δέσμευση στον υποκινητή είτε στην έναρξη της μεταγραφής είτε στις επαφές της με τους επαγωγείς Οι επαγωγείς είτε ενεργοποιούν την RNA πολυμεράση, είτε την βοηθούν να δεσμευθεί σε μηιδανικούς στόχους DNA στον υποκινητή είτε παρεμποδίζουν τις επαφές της με τους αναστολείς ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΕΣ ΩΣ ΣΥΝΕΠΑΓΩΓΕΙΣ, ΣΥΝΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ, ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ Η ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ…. Μικρά οργανικά μόρια (μεταβολίτες), που συνήθως είναι ουσίες σχετικές με το μεταβολικό μονοπάτι το οποίο κωδικεύει ένα συγκεκριμένο οπερόνιο, ρυθμίζουν θετικά ή αρνητικά τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες μέσω αλλοστερικών αντιδράσεων που προκαλούν στις ρυθμιστικές πρωτεΐνες όταν αυτές είναι «ελεύθερες» ή ήδη δεσμευμένες στους υποκινητές. Ονομάζονται συνεπαγωγείς, συναναστολείς αλλά και επαγωγείς ή αναστολείς Ο όρος gratuitous inducer. Η ικανότητα ενός μορίου να λειτουργεί ως συνεπαγωγέας/συναναστολέας των ρυθμιστικών πρωτεϊνών δεν συνεπάγεται ότι το μόριο αυτό μπορεί πάντα να καταβολισθεί από τα ένζυμα που κωδικεύονται από το οπερόνιο που ενεργοποιείται (J. Monod) Αρνητική ρύθμιση R o S NCI PCI R o Ανενεργός Αναστολέας S (+) Eνεργός Eπαγωγέας Επαγωγέας π.χ. καταβολισμός N, C Επαγωγέας R o S NCR PCR (-) ΑΝΑΣΤΟΛΗ π.χ. lac operon ΕΠΑΓΩΓΗ (-) Θετική ρύθμιση Eνεργός Αναστολέας Συναναστολέας R o S (+) Επαγωγέας Συναναστολέας π.χ. try operons γεν-καταβολισμός C π.χ. γενικός έλεγχος καταβολισμού Ν ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ 1. Δέσμευση στον «χειριστή» - αναγνώριση στόχου στο DNA 2. 3. 4. Δέσμευση – αλληλεπίδραση με το μικρό μόριο συνεπαγωγέας – συναναστολέας Ενεργοποίηση του βασικού μεταγραφικού μηχανισμού – Πολυμεράση Ικανότητα των ρυθμιστικών πρωτεϊνών να αλληλεπιδρούν (συνεργατικά ή ανταγωνιστικά) με άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΑ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΤΩΝ ΟΠΕΡΟΝΙΩΝ Μεταλλαγές στην ρυθμιστική πρωτεΐνη ή στον χειριστή. Στα δομικά γονίδια οι μεταλλαγές επηρεάζουν μόνο την πρωτεΐνη που κωδικεύεται. Στον χειριστή οι μεταλλαγές επηρεάζουν όλα τα γονίδια – πρωτεΐνες του οπερονίου που βρίσκονται σε θέση –cis (cisdominant, trans-recessive) ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΑ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΤΩΝ ΟΠΕΡΟΝΙΩΝ Στο ρυθμιστικό γονίδιο οι μεταλλαγές επηρεάζουν όλα τα γονίδια, όλων των οπερονίων (-cis και –trans) που βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο της αντίστοιχης ρυθμιστικής πρωτεΐνης. Πλειοτροπικές μεταλλαγές. ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ 1. Στο μοτίβο-περιοχή αναγκαίο για την δέσμευση στο DNA. 2. Στο μοτίβο που αναγνωρίζει το μικρό μόριο επαγωγής ή αναστολής. 3. Στο μοτίβο που χρειάζεται για την ενεργοποίηση της πολυμεράσης. 4. Σε περιοχές που αλληλεπιδρούν (συνεργατικά ή ανταγωνιστικά) με άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες 5. Σε άλλες περιοχές που έμμεσα επηρεάζουν τα παραπάνω μοτίβα, συνήθως μέσω του αποτελέσματος που έχουν στην γενική δομή του μορίου. ΕΙΔΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΟΠΕΡΟΝΙΟΥ Θ Ε Τ Ι Κ Ε Σ Μερική απώλεια λειτουργικότητας (partial loss of function) Μεταλλαγές που είτε μειώνουν την απόδοση της πρωτεΐνης, είτε επηρεάζουν ένα από τα μοτίβα λειτουργίας της (δέσμευση στο DNA, δέσμευση ρυθμιστικού μορίου, κλπ). Αλλαγή της λειτουργίας (gain-of-function) Απόκτηση νέας λειτουργίας. π.χ. δέσμευση σε νέους στόχους αναγνώριση άλλων μορίων. Ολική απώλεια λειτουργικότητας (loss-of-function) Σημειακές, εξαλείψεις, παρεμβολές, κλπ. Σ’ ένα αρνητικό κύκλωμα τέτοιες μεταλλαγές στο R γονίδιο οδηγούν σε συνεχή («συστατική») έκφραση του οπερονίου, ενώ σ’ ένα θετικό κύκλωμα οδηγούν στην μη-έκφραση του οπερονίου («μη-επαγωγή»). Μεταλλαγή PCI PCR NCI NCR Απώλειας ΜΗ – ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΟΝΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗ - - + ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ (ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗ) Απώλεια ικανότητας δέσμευσης στο DNA ΜΗ – ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΟΝΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗ Απώλεια ικανότητας δέσμευσης με επαγωγέααναστολέα ΜΗ – ΕΠΑΓΩΓΗ ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ ΜΟΝΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ - + - + Μόνιμη δέσμευση στο DNA ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗ ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗ ΜΟΝΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΜΟΝΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ + + - - λειτουργίας - - + + ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ (ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗ) + ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 1) Ο φαινότυπος που προκαλεί μια μεταλλαγή είναι αποκαλυπτικός όσον αφορά: (i) στο είδος του γονιδίου (ρυθμιστικό, δομικό, χειριστής) (ii) στο είδος του κυκλώματος 2) Η συχνότητα του φαινότυπου αυτού είναι επίσης ενδεικτική του είδους του μεταλλαγμένου γονιδίου Άλλα κριτήρια που μας αποκαλύπτουν το είδος του κυκλώματος είναι: 3) Γενετική «κυριαρχία» (dominance) των μεταλλαγών, π.χ. σε «αρνητικά» συστήματα, «αρνητικές» μεταλλαγές είναι «υπολειπόμενες», ενώ οι «θετικές» μεταλλαγές είναι «κυρίαρχες». Το αντίθετο σε «θετικά» συστήματα. Πρόβλημα όταν η «κυριαρχία» είναι ποσοτικά εξαρτώμενη 4) Φαινότυποι μεταλλαγών «αναστροφής» (reversion). Σε «θετικό» κύκλωμα, «αρνητικές» μεταλλαγές αναστρέφονται σε φυσιολογικούς φαινότυπους. Σε αρνητικό κύκλωμα «αρνητικές» μεταλλαγές αναστρέφονται σε μεταλλαγές συνεχούς έκφρασης ΠΡΟΤΥΠΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ Πλεονεκτήματα Ταχεία αύξηση με μορφή αποικιών (2-3h χρόνος διπλασιασμού) Μαζική παραγωγή. Απλά θρεπτικά Οικονομικά συστήματα Moνοκύτταροι οργανισμοί (ζύμες)-μονοπυρηνικά σπόρια (νηματοειδείς) Κατάλληλοι για γενετική ανάλυση, καθώς είναι απλοειδείς οργανισμοί αλλά μπορούν να υπάρξουν και σε διπλοειδή κατάσταση – Γενετικοί χάρτες Μικρό γονιδίωμα (1/100(1/100-1/200 ανθρώπινου) ανθρώπινου) S. cerevisiae 1.4 x 107 bp A.nidulans 2.7 x 107 bp Ικανότητα μετασχηματισμού – «αντιστροφή» γενετική Ποικιλία εξωγονιδιωματικών φορέων, συστημάτων στοχευμένης ενσωμάτωσης – αντικατάστασης γονιδίων, knock-outs, κλπ. Κυτταρικοί ή μοριακοί μηχανισμοί όμοιοι με αυτούς των αντίστοιχων ανώτερων ευκαρυωτικών (>30% γονιδίων ομόλογα με ανθρώπινα γονίδια) Συστήματα έκφρασης γονιδίων από ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ΟΙ ΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ….. Ζύμες Saccharomyces cerevisiae Schizosacharomyces pombe Νηματοειδείς μύκητες Aspergillus nidulans Neurospora crassa ΛΙΓΑ ΙΣΤΟΡΙΚΑ….. Μερικά από τα καλύτερα στιγμιότυπα Πρώτο μισό του αιώνα, S. cerevisiae, A. nidulans & N. crassa, θεμελιώνονται ως εξαιρετικά συστήματα γενετικής ανάλυσης – Φυλετικός κύκλος, διασταυρώσεις, ανάλυση ασκών, γενετικοί χάρτες, κλπ 1941, Beadle & Tatum, μεταλλαγές αυξοτροφίας στη N. crassa, θεμελίωση του δόγματος ένα γονίδιο-ένα ένζυμο (πρωτεΐνη). Η αρχή της σύγκλισης γενετικήςβιοχημείας. 1949, Lindegren, Συζευκτικοί τύποι στο S. cerevisiae 1952, Ανακάλυψη του παραφυλετικού κύκλου στον A. nidulans από Pontecorvo & Roper 1960-1970’s Eδραίωση του γενετικού κώδικα και αναλόγων ρυθμιστικών κυκλωμάτων (Scazzocchio, Arst, Hershkowitz, Guarente) αλλά και της έλλειψης οπερονίων στα ευκαρυωτικά 1970-1980’s, Επίτευξη γενετικού μετασχηματισμού στη ζύμη (1978) και σε νηματοειδείς (1984), Απαρχή της Μοριακής Γενετικής σε ευκαρυωτικά. Μεταλλαγές ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου cdc σε S. cerevisiae & S. pombe (Nurse, Nasmyth , Hartwell) Μεταλλαγές ελαττωματικής έκκρισης sec (Sheckman), Μεταλλαγές μεταφραστικής & μεταγραφικής ρύθμισης (Hinnebush, Struhl, Fink, Cooper) στον S. cerevisiae . Μεταλλαγές κιρκαδικής ρύθμισης και επιγενετικών φαινομενένων RIP, MIP, quelling, (Selker, Faugeron, Rosignol), μεταλλαγές ρύθμισης κυτταροσκελετού (Morris, Osmani) σε Neurospora, Aspergillus, Podospora, Ascobolus 1990’s Γονιδίωμα Saccharomyces cerevisiae (Goffeau, 1996). Two-hybrisd system (Fields & Song 1990). Μεταλλαγές ρύθμισης της μεταγραφής μέσω τροποποίησης της χρωματίνης στον S. cerevisiae 2000’s Πρώτη πλήρης συλλογή απενεργοποιημένων γονιδίων (knock-outs) στον S. cerevisiae. Γονιδιώματα Aspergillus nidulans, Schizosaccharomnyces pombe, Neurospora crassa. Γονιδιώματα συγγενών παθογόνων μυκήτων. ΤΟ ΠΡΩΤΟ ΜΕΓΑΛΟ ΒΗΜΑ ΣΤΗΝ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ– Η ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ ΤΟΥ S. cerevisiae ~ 6000 γονίδια (~2κβ Μ.Ο.) 120 rRNAs 40 sRNA 274 tRNA 51 ρετρομεταθετά στοιχεία Τy Ιντρόνια μόνο σε rRNA 1 cM~ 3kb 28% γνωστές λειτουργίες 26% ορφανά γονίδια σε Β.Δ. 11% μόνο στον Saccharomyces 15% ομόλογα με γνωστές πρωτεΐνες 14% ομόλογα μοτίβα 6% Α.Π.Μ. ?? >30% γονίδια ομόλογα ανθρώπινων γονιδίων περιλαμβανομένων και γονιδίων «ασθενειών» Chromosomes Per haploid cell Organism Zea mays (corn) 10 H. sapiens (human) 23 C. elegans 8 1.05 x 10 14000 γονίδια D. melanogaster (fruit fly) 4 2.7x 107 bp 14000 γονίδια 8 A. nidulans S. cerevisiae (yeast) 1.4 x 10 7 bp 4 x 10 6 bp E. coli 106 16 1 107 108 109 1010 DNA content per cell (bp) Οικογένειες πρωτεϊνών Signal transduction Organelle biogenesis Nuclear structure Cell rescue Not clearclear-cut Amino acids Cytoplasmic structure Nitrogen/ Nitrogen/Sulfur Nucleotides Cell envelope Phosphate Intracellular trafficking Transport facilitators Protein shaping Translation Transcription, Transcription, transcription control Carbohydrates Lipids Cofactors Energy metabolism Cell growth, growth, cell division, division, DNA synthesis 14 Κατηγορίες Πρωτεϊνών του Σακχαρομύκητα 1/3 ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΓΙΑ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΦΥΛΕΤΙΚΟΣ & ΑΦΥΛΕΤΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΣΤΟΥΣ ΜΥΚΗΤΕΣ ΜΟΝΤΕΛΑ Απομόνωση μεταλλαγών, ταξινόμηση σε επικρατούσες-υπολειπόμενες, θετικές-αρνητικές Η «φύση» μιας μεταλλαγής μπορεί να μελετηθεί με 4 γενετικά Τεστ •Γενετικού Διαχωρισμού. Ένα γονίδιο; Διασταύρωση με φυσιολογικό τύπο (wt) & αναζήτηση του 1:1 •Επικράτειας. Φαινότυπος σε διπλοειδή. •Γενετικής Συμπλήρωσης. Τεστ λειτουργίας σε διπλοειδή. Είναι δυο μεταλλαγές λειτουργικά συμπληρωματικές; •Γενετικής Σύνδεσης. Τεστ τοπολογίας. Είναι δυο μεταλλαγές γενετικά συνδεδεμένες (στο ίδιο γονίδιο); Ανάλυση απογόνων Υπάρχουν εξαιρέσεις όπου τα τεστ δίνουν «περίεργα» αποτελέσματα; •Ενδογονιδιακή συμπληρωματικότητα •Μη-συνδεδεμένη μησυμπληρωματικότητα ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ S. cerevisiae Μεθοδολογία όμοια του χημικού μετασχηματισμού βακτηρίων Μεθοδολογία επιλογής μετασχηματισμένων: γενετική (λειτουργική) συμπλήρωση μεταλλαγής Βασική προϋπόθεση: Στέλεχος μεταλλαγμένο στο γονίδιο επιλογής Χ- (προτιμότερα με Μεταλλαγή ολικής έλλειψης) και πλασμίδιο με φυσιολογικό γονίδιο επιλογής Χ+ Κύτταρα στη λογαριθμική φάση αύξησης (OD=0.5) Επώαση σε οξικό Li (ανάλογο του Ca++, Rb++ στα βακτήρια)-ρευστοποίηση μεμβράνης Πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG)+DΝΑ (πλασμίδιο) Θερμικό σοκ 42 ο C Eπώαση σε επιλεκτικό θρεπτικό (συνήθως θρεπτικό χωρίς Απόδοση: διαφέρει ανάλογα το πλασμίδιο (αυτόνομο ή ενσωμάτωσης), μέγιστη 105-6 τ/μg ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ S. cerevisiae Πλασμίδια που αντιγράφονται σε βακτήρια (Ε.coli) και στον S. cerevisiae Περιέχουν γονίδια επιλογής σε E. coli (συνήθως Αr) και σε S. cerevisiae (LEU2, TRD1, HIS3, URA3, κλπ). Πλασμίδια ενσωμάτωσης στο γονιδίωμα CEN ARS 2μ Πλασμίδια αυτόνομης αντιγραφής που περιέχουν αλληλουχίες αυτόνομης αντιγραφής ARS από το γονιδίωμα του S. cerevisiae ή το φυσικό πλασμίδιο 2μ Τα πλασμίδια 2μ υπάρχουν >12 αντίγραφα/κύτταρο και είναι σταθερά. Τα πλασμίδια ARS υπάρχουν επίσης σε πολλαπλά αντίγραφα αλλά είναι ασταθή εκτός εάν περιέχουν και αλληλουχίες CEN από το κεντρομερές του S. cerevisiae. Τα πλασμίδια ARS-CEN: 1-2 αντίγραφα/κύτταρα. ΓΟΝΙΔΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΣΤΟΝ S. cerevisiae - Απαραίτητοι για την αναγνώριση των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων – κλώνων. Κυρίως γονίδια ενζύμων του μεταβολισμού αμινοξέων και βάσεων που αρχικά κλωνοποιήθηκαν σε βακτήρια. Leu2 + Mετασχηματισμός στελέχους Leu2- Leu2+ Ανάλογο σύστημα με αυτό των βακτηρίων όπου κυρίως χρησιμοποιούνται γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά. Κυριότερα Γονίδια Επιλογής στον S. cerevisiae γονίδια βιοσύνθεσης αμινοξέων-πυριμιδινών YEAST SELECTABLE ΜARKERS G ENE E NZYME S ELECTION HIS3 Imidazole glycerolphosphate dehydratase histidine LEU2 β - Isopropylmalare dehydrogenase leucine LYS2 a - Α minoadipate reductase lysine TRP1 N - (5 ΄ - phosphoribosyl) tryptophan URA 3 Orotidine - 5 ΄ - phosphate decarboxylase - anthranilate isomerase uracil Ο ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΝΗΜΑΤΟΕΙΔΩΝ (Α. nidulans) Μεθοδολογία όμοια αλλά και με σημαντικές διαφορές του μετασχηματισμού ζυμών Επιλογή μετασχηματισμένων: γενετική (λειτουργική) συμπλήρωση μεταλλαγής. Βασική προϋπόθεση: Στέλεχος μεταλλαγμένο στο γονίδιο επιλογής Χ- και πλασμίδιο με φυσιολογικό γονίδιο επιλογής Χ+ . Σπανιότερα χρησιμοποιούνται και γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά όπως η ολιγομυκίνη, φλυομυκίνη, υγρομυκίνη. Διάκριση υπολειπόμενων και κυρίαρχων γενετικών στοιχείων επιλογής μετασχηματισμένων στελεχών Mετασχηματισμός πρωτoπλαστών)σε ισοοσμωτικό περιβάλλον. Το κυτταρικό τοίχωμα καταστρέφεται με ενζυμική πέψη (μέσω λυτικών ενζύμων). Οι πρωτόπλαστες, που μπορεί να προέρχονται από μυκήλιο (πολυπύρηνοι) ή κονιδιοσπόρια (1-2 πυρήνες), απομονώνονται από το μείγμα, προστίθεται DNA (πλασμίδιο) και PEG. Η σύντηξη πρωτόπλαστων οδηγεί σε «είσοδο» του DNA. Αναγέννηση πρωτόπλαστων – μετασχηματισμένων πυρήνων Χαμηλής – Μέσης απόδοσης : 10-104 t/μg DNA. Εξαρτημένη από το πλασμίδιο. Πλασμίδια ενσωμάτωσης: 10-1000 τ/μg Πλασμίδια αυτόνομης αντιγραφής: 100.000 τ/μg Αλλες μέθοδοι: Ηλεκτροδιάτριση, Βιολιστικός βομβαρδισμός. Οχι ιδιαίτερα αποδοτικότεροι των κλασσικών μεθόδων. ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ A. nidulans Πλασμίδια που περιέχουν αλληλουχίες αντιγραφής (OriC) και επιλογής (Αr) σε E. coli και γονίδιο επιλογής στον A. nidulans (ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά ή συμπλήρωση μεταβολικής ανεπαρκείς π.χ. argB, amdS, pyrG) Τα πλασμίδια αυτά ενσωματώνονται στο γονιδίωμα σε ομόλογες ή μη ομόλογες περιοχές. Η ενσωμάτωση τους μπορεί να οδηγήσει σε απλή ή πολλαπλή ενσωμάτωση του πλασμιδίου ή αντικατάσταση ολοκλήρου ή μέρους του γονιδίου από το γονιδίωμα Πλασμίδια τύπου ARS χρησιμοποιούνται αλλά είναι ιδιαίτερα ασταθή και δεν χρησιμοποιούνται ευρέως Η ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΤΟΥΝ A. nidulans Στον S. cerevisiae, πλασμίδια που δεν φέρουν αλληλουχίες 2μ ή ARS ενσωματώνονται κυρίως με ομόλογο ανασυνδυασμό. Ο ετερόλογος (τυχαίος;) ανασυνδυασμός είναι πολύ σπάνιος Στον A. nidulans, τα πλασμίδια ενσωματώνονται με ομόλογο και/ή ετερόλογο ανασυνδυασμό Η ενσωμάτωση μπορεί να είναι απλή ή πολλαπλή Μ γονιδιωματικό αντίγραφο argB τ1 τ2 τ3 Απλή ετερόλογη ενσωμάτωση (μάρτυρας) Απλή ομόλογη ενσωμάτωση Τριπλή ομόλογη ενσωμάτωση Σε όλους τους μύκητες, γραμμικό πλασμιδιακό DNA ενσωματώνεται με διπλό ομόλογο ανασυνδυασμό που συνήθως οδηγεί σε γονιδιακή αντικατάσταση στο γονιδίωμα. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ ΜΥΚΗΤΩΝ Ετερόλογος Ανασυνδυασμός Ομόλογος Ανασυνδυασμός Α Χ Χ απλό cross-over απλό cross-over Α΄ Εάν η θέση ενσωμάτωσης αντιστοιχεί σε γονίδιο = απενεργοποίηση Διπλασιασμός γονιδίου Α Γονιδιακή αντικατάσταση Α Χ Χ Α΄ Α΄ ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ και ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ Σπουδαίο «εργαλείο» για την λειτουργική ανάλυση γονιδίων α) Αντικατάσταση – με γραμμικό ομόλογο DNA, το οποίο «διορθώνει» το μεταλλαγμένο γονίδιο και επιτρέπει την άμεση επιλογή μετασχηματισμένων στελεχών. μεταλλαγή - Α Χ Χ Α+ Α+ β) Στοχευμένη ενσωμάτωση μέσω συγκεκριμένων αλληλουχιών π.χ. ένα πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο επιβολής Α και το γονίδιο υπό μελέτη Β προτιμούμε να ενσωματωθεί μέσω αλληλουχιών Α, ώστε το υπό μελέτη γονίδιο Β να παραμείνει όπως έχει χωρίς να ανασυνδυαστεί – Το γονίδιο Β του πλασμιδίου είναι ελλειπές ή φέρει μεταλλαγή, άλλη από αυτή του γονιδίου Β του γονιδιώματος. Επιλέγοντας στελέχη Β+, επιλέγουμε τους παραπάνω ανασυνδυασμούς... Β- - Β Χ Χ ΒΔ - Β Α Α Β-- Α Β -Δ Α Β+ γ) Στοχευμένη απενεργοποίηση γονιδίου∗ ∗ Σε περίπτωση θνησιγόνων απενεργοποιήσεων ο μετασχηματισμός γίνεται σε διπλοειδή κύτταρα... Α+ 1) Χρησιμοποιόντας γραμμικό DNA που φέρει γονίδιο επιλογής το οποίο «διακόπτει» το Α.Π.Μ. του γονιδίου που θα αντικατασταθεί Χ Β+ Χ Α-, Β+ Α+ x Α- x 2) Χρησιμοποιώντας πλασμίδιο που φέρει μέρος του γονιδίου για απενεργοποίηση. ΧhoI + A 3) Ενσωμάτωση μέσω δράσης περιοριστικού ενζύμου (REMI). Τα άκρα XhoI του πλασμιδίου, παρουσία του ενζύμου XhoI, ανασυνδυάζονται σε θέσεις XhoI στο γονιδίωμα. Αν το γονίδιο μας έχει θέση XhoI οι πιθανότητες απενεργοποίησης του μέσω ενσωμάτωσης του πλασμιδίου είναι μεγάλες. Χ B B+ + «ΔΙΑΣΩΣΗ» ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΑΠΟ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ A. nidulans ή S. cerevisiae Ar Προϋπόθεση της μελέτης γονιδίων που μετασχηματίζουν στελέχη μυκητών και τους προσδίδουν ενδιαφέροντες φαινοτύπους είναι η απομόνωση των πλασμιδίων που εμπεριέχουν τα γονίδια αυτά. Η «διάσωσή» τους γίνεται σε βακτήρια E. coli. x Ar απομόνωση DNA Στον S. cerevisiae όπου χρησιμοποιούνται κυρίως αυτόνομα αντιγραφικά πλασμίδια αυτό είναι απλό. Τα κύτταρα λύονται και μετασχηματίζουμε βακτήρια επιλέγοντας Αr καθώς όλα τα πλασμίδια του S. cerevisiae φέρουν το γονίδιο Αr. μετασχ. βακτηρίων EcoRI EcoRI Ar + T4 λιγάση EcoRI Ar Στον A. nidulans όπου τα πλασμίδια ενσωματώνονται στο γονιδίωμα, η «διάσωσή» τους είναι δυσκολότερη αλλά εφικτή λόγου μιτωτικής ή μειωτικής «εξωσωμάτωσης» (excision) των πλασμιδίων – κυρίως όταν αυτά δημιουργούν διπλασιασμούς γονιδίων. Εναλλακτικά μπορούμε να «αποκόψουμε» την περιοχή ενσωμάτωσης και να την απομονώσουμε ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΣΗ Πλεονεκτήματα Ύπαρξη εκατοντάδων μεταλλαγμένων στελεχών στους μύκητες... Η ευκολία απομόνωσης νέων μεταλλαγμένων στελεχών. Η ευκολία παραγωγής πλήρων γενωμικών βιβλιοθηκών λόγω του μικρού γονιδιώματος και της απουσίας ιντρονίων (ή παρουσίας μικρών ιντρονίων). Η δυνατότητα κλωνοποίησης γονιδίων μικρής ομοιότητας ή μη-ομολόγων γονιδίων από άλλους οργανισμούς. ΑΝΑΓΝΩΡΙΖΟΝΤΑΣ ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙ ΜΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ Ένα μοναδικό εργαλείο για την in vivo μελέτη ενδογονιδιακών ή διαγονιδιακών αλληλεπιδράσεων Κατασταλτικές μεταλλαγές είναι οι μεταλλαγές που τροποποιούν ή καταστέλλουν το αποτέλεσμα (φαινότυπο) που προκαλεί μια αρχική μεταλλαγή Μια κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να είναι: 1.Ενδογονιδιακή 2.Διαγονιδιακή • Οι Ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι: 1.Ανaστροφή της αρχικής μεταλλαγής 2.Μεταλλαγή «Δεύτερης θέσης» Οι μεταλλαγές δεύτερης θέσης μπορεί να είναι: 1. Εξειδικευμένες ως προς την αρχική μεταλλαγή (allele-specific)Υποδηλώνουν «επαφές». 2. Μη-εξειδικευμένες ως προς την αρχική μεταλλαγή (allele non-specific) Υποδηλώνουν εναλλακτικούς μηχανισμούς (by-pass) Οι Διαγονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι: 1. Σε γονίδιο παρόμοιας-εναλλακτικής λειτουργίας (by-pass) 2. Σε γονίδιο που κωδικεύει πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με την αρχικά μεταλλαγμένη πρωτεΐνη Μεταφραστική καταστολή ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΜΕΣΩ ΑΠΛΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΉΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ …..και με με τη βοήθεια του PCR για τις ενδογονιδιακές μεταλλαγές
© Copyright 2024 Paperzz
